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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. FACULTAD DE CIENCIAS.

DEPARTAMENTO
DE QUMICA. LABORATORIO DE PRINCIPIOS DE BIOQUMICA.
PRIMER SEMESTRE 2016

FACULTAD DE CIENCIAS. DEPARTAMENTO DE QUMICA

LABORATORIO DE PRINCIPIOS DE BIOQUMICA

Febrero 2016

EARM

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DE QUMICA. LABORATORIO DE PRINCIPIOS DE BIOQUMICA.
PRIMER SEMESTRE 2016

LABORATORIO No. 0. NORMAS PARA TRABAJO EN LABORATORIO


INTRODUCCIN
El trabajo en el Laboratorio debe ser carente de riesgos, como resultado de cumplir con las
normas exigidas para este fin. La seguridad incluye un conjunto de protocolos de trabajo
que tenga en cuenta no solo el conocimiento de riesgo y las normas de prevencin, sino
tambin la definicin de las normas de accin para cuando ocurra un accidente. En la
seguridad existe un factor objetivo relativo al riesgo, y un factor humano, que es quien lo
maneja y toma las respectivas precauciones.
El trabajo en el Laboratorio de Bioqumica no es un trabajo peligroso, pero si existe la
posibilidad de que se produzcan accidentes por el manejo inadecuado de sustancias
qumicas la falta de precaucin en la manipulacin de fluidos biolgicos potencialmente
infecciosos.
OBJETIVOS

Aplicar el concepto de Seguridad en el Laboratorio.


Reconocer seales y smbolos relacionados con la seguridad en el Laboratorio.
Conocer las normas generales de seguridad en el Laboratorio.
Identificar y aplicar las normas sobre el manejo de reactivos qumicos.

TRABAJO EN EL LABORATORIO
1. SEALIZACIN.
La sealizacin normalizada es necesaria para la seguridad, pues indica de manera
inmediata los posibles peligros de carcter general. Existen mltiples seales
reconocidas internacionalmente que informan aspectos diferentes:

Riesgos para la salud: Color azul


Inflamable: Color rojo
Grado de inestabilidad de compuestos: Color amarillo.

ALGUNOS SMBOLOS Y DESIGNACIN DE LOS PELIGROS

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Atencin, sustancias explosivas.


Materia que aumenta la combustibilidad
Atencin, sustancias inflamables
Veneno
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PRIMER SEMESTRE 2016

Atencin, sustancias agresivas o sustancias radiactivas


Perjudicial para la salud

PRECAUCIONES IMPORTANTES

Llevar guantes puestos


Uso de gafas de laboratorio
No pipetear varias sustancias con el mismo instrumento
Uso de mscara antigs
No mezclar sustancias sin conocimiento de su comportamiento.

2. NORMAS DE SEGURIDAD PARA PERSONAL DE LABORATORIO


La seguridad como prevencin viene definida por una serie de barreras:
Primarias: Localizadas en torno al origen del riesgo. Ej; Hacer la prctica
adecuadamente.
Secundarias: Localizadas en el crculo del practicante. Ej; La relacionada con la
higiene personal (pelo recogido, uas cortas, pipeteadores, etc)
Terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio. Ej; no sacar ningn material
txico del laboratorio.
ALGUNAS NORMAS

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Usar bata blanca durante el trabajo en el laboratorio


Usar gafas de proteccin
Usar guantes
Usar encendedores de chispa por friccin y no fsforos
No pipetear con la boca. Usar dispensadores (pipeteadores) pipetas automticas
para este fn.
No comer, beber, fumar, almacenar alimentos aplicar cosmticos.
Realizar todos los procedimientos tcnicos en la forma indicada.
Usar los gabinetes de seguridad biolgica, como son las campanas de extraccin
cuando se realizan los procedimientos que pueden formar aerosoles infecciosos.
Descontaminar las superficies de los mesones de trabajo inmediatamente despus
del derrame de un material infeccioso.
Secar bien las manos antes de iniciar el trabajo.
No trabajar con equipos elctricos si se ha derramado algo sobre ellos.
Leer la gua correspondiente y seguir las instrucciones estrictamente.
Tener detergente lquido y lavarse las manos al terminar la prctica
Dejar limpio y seco el puesto de trabajo
Tener escobilla (churrusco) para lavado de material durante y al terminar la prctica.

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PRIMER SEMESTRE 2016

3. NORMAS SOBRE EL MANEJO DE REACTIVOS QUMICOS

Leer cuidadosamente la etiqueta de identificacin del reactivo


Verificar que se est usando la sustancia adecuada
Verificar el grado de peligrosidad
Conocer cmo va a reaccionar (al diluir cidos fuertes, aadir siempre cido al agua,
nunca al revs y hacerlo lentamente).
No dejar los frascos abiertos abandonados sobre las mesas de trabajo. Una vez
utilizados cerrarlos y dejarlos en su lugar.
No coger los frascos de los reactivos por el cuello.

4. EVALUACIN DE LOS LABORATORIOS

Los quizzes son evaluaciones cortas que se realizan antes de iniciar la prctica
correspondiente. Son preguntas sencillas que pretenden mostrar el grado de
preparacin del estudiante para la realizacin de la prctica.

El Pre-Informe de Laboratorio. Es un escrito individual en el cual se presenta un


objetivo que el estudiante cree podr alcanzar al desarrollar la prctica y un
diagrama de flujo donde se muestre el procedimiento para realizar la misma. Este
pre-informe ser requisito indispensable para poder ingresar al laboratorio y para
discutir las prcticas correspondientes. No se admiten fotocopias y siempre debe
realizarse a mano, no en computador.

Datos del laboratorio. Al finalizar cada prctica, cada grupo debe entregar (o
presentar ) una tabla con los datos obtenidos durante la prctica, la cual es necesaria
para poder entregar el informe en la siguiente sesin. La no entrega de la tabla de
datos, indica la no obtencin de resultados necesarios para realizar el informe. Esta
tabla de datos debe venir diseada previamente (realizar un formato adecuado y
BIEN PRESENTADO) y se debe presentar con el preinforme.

El informe de Laboratorio. Es un escrito por grupos, en el cual se muestran los


datos de la prctica de laboratorio y se discute y concluye sobre los mismos. Se
entrega a la semana siguiente de la realizacin del Laboratorio. Adicionalmente se
requiere contestar el cuestionario presentado en cada una de las guas. Este informe
puede ser reemplazado por un formato especial que entregar el profesor en el
momento adecuado. Este informe ser requisito para poder ingresar a las sesiones
de discusin de las respectivas prcticas.

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PRIMER SEMESTRE 2016

Las discusiones-evaluaciones de las prcticas. Son sesiones que se realizarn en


el mismo horario de laboratorio, pero en las cuales se busca tener una discusin
directa sobre las prcticas que se han realizado con anterioridad. Se realizarn dos
(2) durante el semestre. Pueden ser orales y/o escritas y se realizarn de forma
individual o por grupos de trabajo.

Examen final. Es una evaluacin escrita prctica que se realizar al culminar la


totalidad de las prcticas de laboratorio y que busca determinar el grado de
entendimiento y de interrelacin alcanzado por los estudiantes durante la realizacin
de este laboratorio. Se evaluar componente terico de las mismas as como el
anlisis realizado en cada una de las prcticas desarrolladas.

CUESTIONARIO
1. Dibuje y explique el significado de smbolos que indican peligro, seales de
prohibicin y precauciones importantes.
2. Explique el funcionamiento de las claves internacionales R-S
3. Indique cules son los riesgos biolgicos ms frecuentes que se pueden presentar en
un laboratorio de Bioqumica.
4. Para reportar datos en el informe es importante realizarlo con un manejo adecuado
de las cifras significativas. Expliqu qu son y cules son las reglas bsicas del
manejo de estas cifras significativas.
5. Realice un esquema (plano) del laboratorio indicando el sitio donde est:
a. Su puesto de trabajo
b. Las balanzas
c. El extintor
d. El lavaojos
e. La nevera
f. Las centrfugas
g. Los recipientes de desechos
h. El botiqun
6. Reconozca los recipientes que hay en el laboratorio para colectar los desechos de las
prcticas. Haga una descripcin de ellos indicando qu sustancias se pueden
desechar en cada uno.

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LABORATORIO No. 1. FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS


PRINCIPALES CONSTITUYENTES: LIPIDOS Y PROTEINAS
OBJETIVOS

Empleo de las solubilidades diferenciales y de la centrifugacin como mtodos para


el fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes.

Anlisis cualitativo de los lpidos y protenas extrados del tejido

FUNDAMENTO TEORICO
A. Lpidos
Las grasas (o lpidos) son los compuestos con los que el cuerpo humano, as como muchos
otros organismos, almacena energa para las pocas de carencia. Estos se caracterizan por
su poca afinidad por el agua soluciones acuosas. Evolutivamente, el cuerpo humano es
almacenador de energa, es decir, est diseado para acumular parte de la energa que
absorbe por los alimentos para pocas de ayuno. La forma ms eficaz de almacenar esta
energa es en forma de grasas, que son muy ligeras por lo que en poco peso de grasa se
puede acumular mucha energa. Los lpidos se clasifican en dos grupos principales:
simples y complejos. Los lpidos simples ms importantes son las grasas formadas por
cidos grasos y glicerol, dentro de este grupo se encuentran los triglicridos; dentro de los
lpidos complejos se pueden mencionar los fosfolpidos, entre otros, y como compuesto
derivado de los lpidos se encuentra el colesterol. El colesterol est presente en todas las
clulas del organismo. Se presenta en altas concentraciones en la mdula espinal, pncreas
y cerebro pero se sintetiza principalmente en el hgado y en el intestino delgado.
Aproximadamente el 50% de las necesidades de colesterol son sintetizadas en el hgado
mientras que el resto se obtiene de los alimentos de origen animal presentes en la dieta.
En cuanto a solubilidad, los lpidos son insolubles en agua pero solubles en solventes
orgnicos. Se pueden identificar por:
1. Saponificacin
La hidrlisis alcalina de los acilgliceroles produce jabones y glicerol. Si el hidrolizado se
somete a la accin del ter, los jabones sedimentan y en el sobrenadante queda el glicerol.
2. Reaccin de Fiske-Subbarow (prueba de fosfatos)
Los fosfolpidos por accin del NaOH se hidrolizan, produciendo fosfatos inorgnicos, que
con el cido molibdico dan fosfomolibdatos, y stos por accin de reductores como el cido
1,2,4-aminonaftolsulfnico o el cido ascrbico, producen complejos de xidos de
molibdeno de color azul.

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PRIMER SEMESTRE 2016

3. Prueba de Salkowsky (colesterol)


Cuando a las soluciones clorofrmicas de colesterol se les adiciona un volumen igual de
cido sulfrico concentrado y se mezclan suavemente,
se desarrolla
un color rojo caracterstico en la capa clorofrmica.
B. Protenas
En bioqumica es muy comn aislar y purificar molculas para estudiar su composicin, su
estructura y de ser posible su funcin, como es el caso de las protenas. Para dicha
purificacin se emplean mtodos basados en sus propiedades de solubilidad. En el caso
particular de las protenas, cada una de stas tiene una composicin de aminocidos
especfica que las hace diferentes unas de otras y, por lo tanto, su comportamiento en
disoluciones tambin es diferente. Por lo general las protenas fibrosas son insolubles en
agua y resistentes a la degradacin enzimtica, sin embargo, con soluciones de cierta fuerza
inica se pueden solubilizar. Las protenas globulares son relativamente mas solubles en
agua y en soluciones de baja fuerza inica, aunque algunas coagulan cuando se calientan.
Se pueden identificar por:
1. Desnaturalizacin:
Por accin de pHs extremos se destruyen los puentes de hidrgeno que mantienen la
estructura secundaria de las protenas. Las protenas a temperaturas mayores de 50C
precipitan, por formacin de agregados que resultan de la destruccin de la estructura
secundaria.
2. Prueba de Millon:
Las protenas que contiene tirosina reaccionan con mercurio disuelto en cido ntrico,
produciendo nitroderivados mercuriales de color rojo.
3. Prueba de la Ninhidrina:
Los grupos aminoterminales y laterales de las protenas reaccionan con la ninhidrina
caliente, dando complejos de color violeta. En ellos, el amoniaco desprendido reacciona
con una molcula de ninhidrina en estado oxidado y con otra en estado reducido.
4. Prueba de Biuret:
Los nitrgenos del enlace peptdico forman complejos coloreados con los iones cpricos en
medio alcalino.
5. Reaccin Xantoproteica:
Esta reaccin se basa en la nitracin del anillo bencnico por el HNO 3 concentrado, dando
derivados amarillos de nitrobenceno. Las protenas que contienen tirosina y triptfano dan
esta reaccin, pero el color amarillo resultante se transforma en naranja si se le adiciona
NH4OH. Para nitrar la fenilalanina se requiere H2SO4 como catalizador.

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REACTIVOS
Etanol
KOH 2 N
HCl 2 N
Reactivo de Millon
Ninhidrina al 0.2%
Reactvo de Biuret
Acido sulfrico concentrado
HNO3 concentrado
NH4OH concentrado
Eter etlico
NaOH al 15%.
Cloroformo
Colesterol
Acido molbdico
Lecitina
Acido ascrbico (150mg/100ml)
Albmina
Glicina
Floroglucinol
Tirosina
Agua destilada
Etanol:ter (2:1)
Acetona
cido actico 1M
Sulfato de amonio (780g/L)
PROCEDIMIENTO

Obtencin de lpidos y protenas:

Separe la clara de la yema del huevo. La clara se utiliza para obtener protenas (albminas
principalmente) y la yema para obtener lpidos y protenas.
1. Separe la yema y retire la membrana. Tome 1 mL de yema (aproximadamente) y
adicione 10 mL de agua destilada. Agite suavemente. Centrifugue a 5000 rpm
durante 5 minutos. Separe el sobrenadante del precipitado. En el sobrenadante
(muestra M1) se encuentran sustancias solubles en agua (como protenas, vitaminas
hidrosolubles, carbohidratos, etc), mientras que los lpidos se encuentran en la
fraccin insoluble. Tome el precipitado y disulvalo en 5 mL de una mezcla
etanol:ter (2:1). Homogenice hasta no ver precipitado. Adicione 2 mL de acetona

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y mezcle nuevamente. Centrifugue a 5000 rpm por 5 minutos. Separe el


sobrenadante (mrquelo como M2) del precipitado (mrquelo como M3).
a. La fraccin M2 seprela en 3 tubos de ensayo. En uno de los tubos realice la
prueba de saponificacin, separando la fraccin saponificable (residuo
slido) de la insaponificable (resduo lquido). A este resduo
insaponificable adicione agua destilada y deje en reposo por 5 minutos.
Determine si hay formacin de ms de una fase. En otro de los tubos realice
la prueba de fosfatos. En el tercer tubo realice la prueba de colesterol.
b. La fraccin M3 disulvala nuevamente en 2 mL de etanol:ter (2:1) y realice
las pruebas de saponificacin y fosfatos.
2. Colocar la clara de huevo en un vaso de precipitados y tomar 2 mL
aproximadamente en un tubo de ensayo. Adicione 20 gotas de cido actico 1M y
agitar suavemente. Filtrar la mezcla obtenida con gasa (2 capas).Filtrar la albmina
acidificada a travs de cuatro capas de gasa, para separar el precipitado del
sobrenadante obtenido. Mida el volumen del sobrenadante obtenido. A este ltimo
adicione lentamente un volumen igual de solucin de sulfato de amonio (780g/L)
agitando suavemente. Deje reposar por 15 minutos en un bao de hielo. Centrifugue
a 3000 rpm por 5 minutos. Separe el sobrenadante del precipitado. Al sobrenadante
adicinele 2 mL de agua destilada (mrquela como M4) y realice las pruebas de
protenas.

PRUEBAS DE RECONOCIMIENTO. Se indica el procedimiento a realizar


para la sustancia usada como patrn. Realizar el mismo procedimiento con
cada una de las muestras a evaluar

Lpidos:
A. Prueba de Salkowski (patrn Colesterol )
En un tubo seco adicione 1 mL de colesterol ( la muestra a evaluar ), y 1 mL de
cloroformo, luego adicione LENTAMENTE, POR LAS PAREDES DEL TUBO, 1 mL de
cido sulfrico concentrado. Mezcle suavemente y deje en reposo por 3 minutos. Observe
la coloracin y compare los resultados del colesterol con el de la muestra.
B. Saponificacin (Patrn Lecitina).
A una cantidad anloga a la anterior de las fracciones indicadas, agregar 3 ml de NaOH al
15 %. Colocar en la boca del tubo una esfera de vidrio o papel de aluminio y reflujar al
bao mara durante 20 min. Aadir 2 ml de ter y filtrar los jabones resultantes.
C. Fosfatos (filtrados obtenidos en B, u otros mencionados en la metodologa)
A 1 ml del filtrado agregar 10 gotas de cido molbdico, mezclar y dejar en reposo 5 min.
En seguida adicionar 10 gotas de solucin de cido ascrbico. Observe la coloracin. Si no
se desarrolla color colocar el tubo en el bao mara por 5 min.
Protenas:
A. Millon. (Patrones: albmina, y tirosina)
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A una fraccin de las muestras (0.5 ml de cada una) agregar 5 gotas de reactivo de Millon;
calentar durante unos minutos al bao mara ; observar el precipitado.

B. Ninhidrina. (Patrones: albmina y glicina)


A una fraccin de las muestras agregar 1 ml de la solucin de ninhidrina al 0.2%. Calentar
al bao mara durante 10 minutos ; observar el color.
C. Biuret. (Patrn: albmina)
Tomar una fraccin de 0.5 ml de cada muestra, agregar 1 ml de reactivo de Biuret. Mezclar.
Esperar 10 minutos y observar el color.
D. Xantoproteica. (Patrones: albmina y tirosina)
Calentar una fraccin de 0.5 ml de cada una de las muestras con 1 ml de cido ntrico
concentrado, enfriar y observar el color. Agregar cuidadosamente 10 gotas de NH4OH.
Observar la interfase.

RESULTADOS, DATOS Y DISCUSIN


Discuta sobre la utilizacin de diferentes soluciones o solventes para la separacin y
obtencin de las fracciones.
Realice una tabla de datos indicando el nombre de las pruebas y los resultados obtenidos
para cada una de las fracciones (indique coloraciones cambios fsicos obtenidos y si es
considerado como positivo negativo)
Indique las reacciones ocurridas en cada una de las pruebas realizadas.

BIBLIOGRAFIA
1. Martnez J. C. Guas de Anlisis Orgnico. Universidad Nacional de Colombia., 1996
2. Shriner R.L. Fuson R.C. Identificacin sistemtica de compuestos orgnicos. Limusa
Noriega editores , 1995.
3. Vogels A. Textbook of practical Organic Chemistry. Fourth Ed., 1978
4. Durst H.D. Gokel G.W. Qumica Orgnica experimental. Ed. Revert, 1985
5. Alemany M, Font S. Prcticas de Bioqumica.1983. Primera edicin. Edit Alhambra,
Espaa

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LABORATORIO No. 2. FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS


PRINCIPALES CONSTITUYENTES: CARBOHIDRATOS Y CIDOS
NUCLEICOS
OBJETIVO
Comprobar la presencia de carbohidratos y cidos nucleicos en los tejidos empleados,
utilizando para ello reacciones caractersticas de cada uno de los componentes anteriores.
FUNDAMENTO TEORICO
A. Carbohidratos:
Los organismos vivos contienen carbohidratos que pueden estar formando polisacridos de
reserva, pueden ser componentes estructurales o pueden estar participando en el
metabolismo en forma monomrica. Las propiedades qumicas de tales compuestos
permiten diferenciarlos as:
1. Reaccin de Lugol
Los polisacridos son solubles en soluciones acuosas cidas, pero insolubles en etanol.
Los polisacridos como el almidn- amilosa y amilopectina-, el glicgeno y los dextranos,
forman compuestos coloreados caractersticos cuando se combinan con yodo molecular. A
pesar de que la naturaleza de estos complejos no esta bien definida, evidencias indican la
formacin de complejos de absorcin entre las cadenas helicoidales del polisacrido y el
yodo. Para que haya estructura helicoidal se necesita por lo menos una cadena de 8
monosacridos. Los polisacridos que a todo lo largo de su molcula muestran estructura
helicoidal, dan coloracin azul intensa (amilosa). Aquellos que son ramificados con hlices
ininterrumpidas producen coloraciones menos intensas (amilopectina). Los altamente
ramificados con segmentos cortos de ramificacin, producen color pardo o rojizo
(glicgeno).
2. Reaccin de Molish.
Un carbohidrato tratado con alfa-naftol y cido sulfrico concentrado produce una
coloracin violeta. Se presume que el cido sulfrico acta como deshidratante formando
derivados furfurales que reaccionan con el alfa-naftol para dar productos coloreados.
3. Reaccin de Benedict.
Azucares reductores tratados con soluciones cpricas en medio alcalino suave (citratocarbonato de sodio) reducen el in cprico a in cuproso de color ladrillo.
B. cidos Nucleicos:
Los cidos nucleicos junto con algunas enzimas dirigen la biosntesis de las protenas
celulares, son responsables tanto de la replicacin de las clulas, para dar clulas hijas
idnticas, como de las mutaciones naturales o inducidas en la constitucin gentica de un
organismo y de la inmensa variedad de organismos individuales dentro de una especie. Los
dos tipos de cidos nucleicos encontrados en todos los organismos vivientes son el cido
ribonuclico (RNA) y el cido desoxirribonuclico (DNA). Los cidos nucleicos tienen
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como unidades monomricas los nucletidos. Estos se componen de una base nitrogenada
heterocclica, derivada de purina o de pirimidina, una pentosa y cido fosfrico, unidos
entre si mediante enlaces fosfodister a travs de la pentosa. Las bases nitrogenadas se unen
en forma covalente al esqueleto azcar-fosfato.
El DNA est constituido por dos cadenas polinucleotdicas complementarias mantenidas
por puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas, estructura conocida como doble
hlice. Sus bases nitrogenadas son adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T) , la
pentosa es la 2-desoxi-ribosa y el grupo fosfato. La mayor parte del DNA se encuentra en el
ncleo, dando lugar a unidades ms pequeas llamadas cromosomas. El nmero de
cromosomas es caracterstico de cada especie. Las clulas procariticas no contienen
ncleo y el DNA forma un solo cromosoma circular.
El RNA se encuentra principalmente en el citoplasma y participa directamente en la
biosntesis de las protenas. El RNA tiene como bases nitrogenadas la adenina (A) guanina
(G) citosina (C) y uracilo (U) , como pentosa la ribosa y el grupo fosfato. Tanto el DNA
como el RNA absorben eficientemente luz ultravioleta por tanto este es un mtodo preciso,
rpido y no destructivo para determinar su presencia.. Las bases nitrogenadas de los
nucletidos presentan un mximo de absorcin a una longitud de onda de 260 nm mientras
que las protenas, por la presencia de aminocidos aromticos, absorben a 280 nm. La
relacin Abs260/Abs280 es una medida de la pureza del DNA y debe tener un valor de 1.65
a 1.85. Valores ms bajos indican contaminacin con protenas. Cuando el DNA se somete
a desnaturalizacin trmica su efecto puede evaluarse por medicin de la absorcin a 260
nm, la cual aumenta debido a que las dos cadenas se separan quedando las bases
nitrogenadas ms expuestas a la interaccin con la radiacin incidente. Este efecto se
conoce como efecto hipercrmico. Si el sistema se enfra rapidamente las cadenas
permanecen separadas pero si la temperatura desciende lentamente, las cadenas se
reasocian volviendo a la forma de doble hlice.
El DNA puede tambin desnaturalizarse a pHs fuertemente alcalinos (pH mayor de 11),
fuerzas inicas bajas, accin del metanol 3.5M, accin de la rea, con prdida de su
actividad biolgica. Las protenas unidas al DNA pueden disociarse desnaturalizndolas
por accin de detergentes aninicos y/o con sales concentradas. Los cidos nucleicos
puedes identificarse por medio de algunas pruebas sencillas como las siguientes:
1. Hidrlisis alcalina
Los lcalis diluidos (0.3 a 1.0 N), hidrolizan los enlaces ster del cido ribonucleico,
mientras que los enlaces ster del cido desoxirribonucleico son relativamente estables, lo
mismo que los enlaces N-glicosdicos de ambos cidos. La facilidad de hidrlisis en el
RNA parece estar asociada a la presencia de OH en los carbonos 2 y 3, lo cual permite la
formacin de intermediarios cclicos 2 y 3 fosfonucletidos, que finalmente dan los
monofosfonucletidos 2 3. Como la desoxirribosa del DNA no forma tales
intermediarios, es relativamente estable en presencia de lcali diluida. La acidificacin de la
solucin despus del tratamiento alcalino precipita las molculas de DNA intactas.
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MATERIALES Y REACTIVOS
Mortero
Vasos de precipitados
Erlenmeyer pequeo
Tubos de ensayo
Pipetas
Termostato
Centrfuga
Espectrofotmetro
Bao de hielo
Levadura
Buffer de extraccin: Tris 100mM , EDTA 50mM , NaCl 500mM, pH 8.0
Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 20%
Acetato de potasio 5M
Isopropanol
Solucin de citrato de sodio 0.0015M-NaCl 0.015M
Acido molbdico
Acido ascrbico 100 mg/100 ml recin preparado
HCl concentrado
HCl 2 N
Reactivo de Millon
Solucin de Lugol
Reactivo de Molish
Acido sulfrico concentrado
Reactivo de Benedict
Eter etlico
Glucosa
Acido molbdico
Acido ascrbico (150mg/100ml)
HCl 6 N

PROCEDIMIENTO

Obtencin de Carbohidratos

1. Pele una papa de tamao mediano y ryela con un rallador de queso para obtener una
pulpa fina (esto debe hacerse lo ms rpido posible para evitar las reacciones de
oscurecimiento).

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2. Agregue a la pulpa ms o menos el doble de su volumen de agua destilada, agite


fuertemente unos minutos.
3. Filtre con una gasa, para eliminar la parte gruesa del tejido.
4. Deje que el filtrado se decante, lo que se deposita en el fondo es el almidn. Una vez que
haya terminado de decantarse, elimine el agua sobrenadante. Agregue nuevamente una
suficiente cantidad de agua destilada y agite fuertemente por unos minutos. Deje reposar y
decante nuevamente. Marque esta mezcla como M1.

Obtencin de cidos nucleicos:

Pese 0.5 g de levadura y colquelos en un mortero previamente enfriado en la nevera.


Macere fuertemente hasta obtener un polvo homogneo. Adicione 8 ml de buffer de
extraccin (Tris 100mM, EDTA 50 mM, NaCl 500mM pH 8.0) fro y macere de nuevo.
Pase la suspensin a un erlenmeyer pequeo y adicione 0.5 ml de SDS 20%; mezcle con
agitacin vigorosa por 2 min. e incube a 65C por 10 min. Adicione 3 ml de acetato de
potasio 5M , agite vigorosamente por 2 min. e incube a 0C (bao de hielo) por 10 min.
Pase la suspensin a 2 tubos de ensayo pequeos y centrifugue a 4500 rpm por 10 min. a
4C. Rena los sobrenadantes, mida 0.3 ml y adicinelos a un tubo de ensayo que contiene
3 ml de isopropanol. Enfre el tubo en bao de hielo por 15 min. y centrifugue a 4500 rpm
por 10 min. a 4C. Redisuelva el precipitado en 20 ml de solucin de citrato de sodio
0.0015M-NaCl 0.015M y filtre si observa partculas en suspensin (SOLUCION A). Lea la
absorbancia de la solucin A a 260 nm, utilizando como blanco la solucin de citrato de
sodio 0.0015M-NaCl 0.015M. Mida tambin la absorbancia a 280 nm. Determine la pureza
del cido nucleico obtenido.

Pruebas de Reconocimiento

1. Carbohidratos:
Patrones de glucosa y almidn.
A. Lugol.
A una fraccin de cada una de las muestras y de los patrones (0.5 ml de cada una) agregar 4
ml de agua y 1 gota de solucin de Lugol. Observar las coloraciones. Si la solucin es muy
oscura diluir con ms agua y observar nuevamente. A otras porciones iguales de estos
compuestos adicionar 1 ml de HCl 2 N y colocarlos en bao mara durante 15 min. Dejar
enfriar y agregar nuevamente Lugol. Observe los resultados y explquelos en el informe.
B. Molish.
A una nueva fraccin (0.5 ml de cada uno) de los compuestos anteriores agregar 2 gotas de
reactivo de Molish. Mezclar cuidadosamente y con los tubos inclinados agregar 1 ml de
H2SO4 concentrado de manera que se forme una capa de cido debajo de la fase acuosa.
No agitar los tubos. Observe el color del anillo formado en la interfase.
C. Benedict.
Colocar al bao mara durante 2 minutos, fracciones de las muestras y patrones (0.5 ml de
cada una), con 1 ml de solucin de Benedict. Observe los resultados y contine calentando
por 15 min. De nuevo observe los tubos.
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2. Acidos nucleicos: (patrn de xilosa, para pruebas de pentosas)


Pruebas de caracterizacin del DNA
En 3 tubos de ensayo adicione en cada uno 3 ml de la solucin A, que contiene el DNA,
para realizar las pruebas de caracterizacin.
Efecto hipercrmico.
Coloque uno de los tubos que contiene solucin A en el termostato a 75C durante 15 min.
Enfre rapida y completamente la solucin en un bao de hielo y mida en seguida la
absorbancia a 260 nm. Utilice como blanco la solucin de citrato de sodio-NaCl.
Prueba para fosfatos
Adicione 1 ml de cido molbdico a otro de los tubos que contiene solucin A y agite. Deje
en reposo por 5 min. y en seguida adicione 1 ml de solucin de cido ascrbico. Mezcle. La
obtencin de una coloracin azul indica la presencia de grupos fosfato. Caliente si es
necesario para ayudar al desarrollo del color.
RESULTADOS, DATOS Y DISCUSIN
Discuta sobre la utilizacin de diferentes soluciones o solventes para la separacin y
obtencin de las fracciones.
Realice una tabla de datos indicando el nombre de las pruebas y los resultados obtenidos
para cada una de las fracciones (indique coloraciones cambios fsicos obtenidos y si es
considerado como positivo negativo).
Calcule la cantidad de ADN obtenido (g/ml), teniendo en cuenta que 1 unidad de
absorbancia a 260 nm equivale a una solucin de 50 g/ml de ADN usando una cubeta de
cuarzo de 1 cm.
Haga la relacin entre las absorbancias obtenidas a las dos longitudes de onda de 260 y 280
nm. Concluya si el ADN est contaminado con protenas. Explique su respuesta.
Compare el valor de la absorbancia a 260 nm antes y despus del calentamiento y si hay
diferencias explique la razn de sus resultados.
CUESTIONARIO
1. Escriba las reacciones de las diferentes pruebas realizadas en esta prctica.
2. Qu se requiere para que un carbohidrato tenga poder reductor y por qu la sacarosa es
negativa para la prueba de Benedict?
3. Por qu las protenas no dan la reaccin con Ninhidrina? En qu condiciones debera dar
positivo esta prueba?
4. En la prueba de fosfatos, por qu es necesario adicionar el cido molibdico antes del
agente reductor?
5. Cmo se pueden identificar los cidos grasos que no se encuentren esterificados?
6. Qu caractersticas tienen las protenas asociadas al ADN.
7. Por qu los cidos nuclicos absorben a 260 nm.
8. Qu es el efecto hipercrmico y por qu se presenta.
9. Qu es el Tm del ADN (temperatura de fusin) y cmo puede determinarse.
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PRIMER SEMESTRE 2016

10.En la extraccin del ADN qu funcin cumplen el EDTA, el SDS y el acetato de Potasio.

BIBLIOGRAFIA
1. Martnez J. C. Guas de Anlisis Orgnico. Universidad Nacional de Colombia., 1996
2. Shriner R.L. Fuson R.C. Identificacin sistemtica de compuestos orgnicos. Limusa
Noriega editores , 1995.
3. Vogels A. Textbook of practical Organic Chemistry. Fourth Ed., 1978
4. Durst H.D. Gokel G.W. Qumica Orgnica experimental. Ed. Revert, 1985

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LABORATORIO No. 3. CUANTIFICACIN DE CIDO ASCORBICO


OBJETIVO:
Conocer y aplicar un mtodo simple para determinar el contenido de cido ascrbico en
frutas y verduras.
FUNDAMENTO TERICO
El cido ascrbico es una cetolactona de seis carbonos, que tiene relacin estructural con la
glucosa y otras hexosas, se oxida de modo reversible en el organismo hacia cido
deshidroascrbico. Este ltimo compuesto posee actividad completa de vitamina C. Las
frmulas estructurales del cido ascrbico y del cido deshidroascrbico son las siguientes:

Los seres humanos y otros primates, as como los conejillos de indias y algunos
murcilagos, son los nicos mamferos conocidos que son incapaces de sintetizar cido
ascrbico; en consecuencia requieren vitamina C en la dieta para la prevencin del
escorbuto. Como es caracterstico en animales que no requieren vitamina C en la dieta, la
rata sintetiza cido ascrbico a partir de glucosa por medio de la formacin intermediaria de
cido D-glucuronico, cido L-glucornico, y L-gluconolactona. Los seres humanos, monos
y conejillos de indias carecen de la enzima heptica necesaria para llevar a cabo esta ltima
reaccin, es decir, la conversin de L-gluconolactona en cido L-ascrbico.
El cido ascrbico se obtiene a partir de frutas ctricas, tomates, fresas, verduras verdes, col
(repollo) y papas. Los jugos de naranja y limn son fuentes con alto contenido de la
vitamina y contienen alrededor de 0.5 mg/ml (2.8 mM). El cido ascrbico se destruye con
facilidad por calor, oxidacin y lcalis. Adems de su participacin en la nutricin, el cido
ascrbico suele utilizarse como un antioxidante para proteger el sabor y color naturales de
muchos alimentos (ej., fruta procesada, verduras y productos lcteos). En los materiales
vegetales puede presentarse en forma libre (cido ascrbico) o en forma combinada
(ascorbgeno). En esta forma no es susceptible de ser detectado por los mtodos corrientes
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de anlisis a menos que se hidrolice a cido ascrbico, hirviendo el material con solucin
de cido oxlico.
REACTIVOS
2-nitro anilina 0.16% en cido actico glacial- HCl 10% (relacin 9:1)
Nitrito de sodio 0.08 % en agua
HCl 1%
Etanol Absoluto
cido oxlico 0.15%
Solucin stock de Vitamina C 0.2 mg/ml
2 FRUTAS DIFERENTES PARA EXTRAER ZUMO (Deben traerlas los estudiantes,
preferiblemente CTRICOS)
PROCEDIMIENTO:
Tomar 1 ml de zumo de la fruta a estudiar y agregar 4 ml de cido oxlico 0.15%; mezclar
y filtrar si es necesario. Cuando trabaja con frutas que no se puedan exprimir, pesar 1g de
fruta y macerarlo con 4 ml de cido.
En tubos de ensayo marcados agregar los siguientes reactivos (adicione ms tubos si es
necesario de acuerdo a las muestras problema a analizar):
BLANCO T - T - T - T - T - T - T - T1
2
3
4
5
6
7
8
2-NITROANILINA
0.1
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
NITRITO DE SODIO
0.1
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
AGITAR Y OBSERVAR DECOLORACIN,
SI NO SE PRODUCE, ADICIONAR 0.1 ml DE NITRITO Y AL FINAL
RESTARLO DEL AGUA
ETANOL ABSOLUTO
1.0
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
SLN VITAMINA C
0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0
0
CIDO OXLICO
0.6
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0
0.3 0
MUESTRA
0.3 0.6
PROBLEMA
MEZCLAR Y DEJAR EN REPOSO 5 Min
NaOH
0.6
0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
AGUA DESTILADA
2.6
2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6

T9
0.1
0.1

1.0
0
0.3
0.3

0.6
2.6

Mezclar bien el contenido de cada tubo y leer en el espectrofotmetro a 540nm.


Nota: Si las muestras presentan coloracin debe prepararse un tubo blanco problema donde
se adicionan todos los reactivos (incluyendo el problema) menos el NaOH. Al hacer los
clculos su valor de absorbancia se descuenta del valor de la absorbancia del problema.
Graficar los datos obtenidos para la curva de calibracin e interpolar la absorbancia
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encontrada en los tubos problema teniendo en cuenta las diluciones, calcular los mg de
cido ascrbico en 100 ml de jugo y en 100g de fruta.
DATOS, RESULTADOS Y DISCUSIN
1. Realice una tabla de datos de nmero de tubo y absorbancia a 540nm.
2. Realice una curva de calibracin con los datos de concentracin de patrn de cido
ascrbico contra absorbancia de la solucin a 540 nm.
3. Determine la concentracin de cido ascrbico en las muestras problema.
4. Determine el porcentaje de cido ascrbico en la fruta (tenga en cuenta el peso de la
fruta antes de partirla.
CUESTIONARIO
1. Cul es la funcin del cido oxlico en la prctica?
2. Explique cules son las reacciones que ocurren durante la prctica.
3. Qu pasara si se hiciera la determinacin de cido ascrbico a un zumo de fruta en
diferentes tiempos de haberse obtenido (inmediatamente, 1 hora despus, 10 horas
despus)? Por qu se presenta este fenmeno?
BIBLIOGRAFA:
ROCHE. Compendio de vitaminas. Propiedades de las vitaminas y su importancia en la
alimentacin humana. F. Hoffmann-LaRoche & Cia. 1972
MARKs, J. A guide of vitamins. Their role in health and disease. MTP, 1975
PLUMBER, D. Bioqumica Prctica. Bogot: Editorial Mc Graw Hill. 1981

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LABORATORIO No. 4. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA


CATALASA
OBJETIVO
1. Determinar la actividad enzimtica de la catalasa sobre el perxido de hidrgeno
2. Observar el efecto de los iones cianuro (CN- ) sobre la actividad enzimtica.
3. Observar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica
FUNDAMENTO TERICO
La catalasa es un enzima que est presente en casi todas las clulas animales, en rganos
como: eritrocitos, hgado y rin. Est presente tambin en todos los materiales vegetales y
en casi todos los microorganismos diferentes de los anaerobios obligados. En todos los
casos, la catalasa impide la acumulacin de perxido de hidrogeno (H2O2) que se forma por
la oxidacin aerbica de las flavoprotenas reducidas en muchas oxidaciones biolgicas.
Las catalasas son enzima ferro-porfirinicas, tienen un peso molecular de 230000-250000 y
contienen cuatro grupos hemo por molcula de enzima. Sus subunidades no tienen
actividad y la velocidad de recambio para este enzima es una de las ms altas conocidas;
una molcula de catalasa puede descomponer 44000 molculas de H2O2 por segundo y su
pH optimo es 7.0.
La catalasa es muy especfica y cataliza la siguiente reaccin:

La actividad de los preparados de catalasa se miden de diversas formas; en la experiencia se


har mediante la titulacin con permanganato de potasio, del perxido de hidrgeno no
atacado (residual) despus de detener la reaccin con cido sulfrico. La reaccin de
titulacin es la siguiente:

La presencia de inhibidores como los iones cianuro que forman complejos muy estables
con enzimas que tienen hierro frrico, lo inactivan. Los citocromos y la catalasa contienen
hierro frrico por tanto el cianuro las inhibe de manera no competitiva.
MATERIALES Y REACTIVOS.
Solucin de sangre fresca o extracto de habichuela
Buffer de fosfatos 0.02 M, pH 7.0 (Buffer pH 4,0, 5,0, 6,0 y 8,0)
Solucin de perxido de hidrgeno (H 2O2) 0.05 M, recin preparada en el buffer fosfato pH
7,0).
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Solucin de NaCN 0.05 nM


Solucin de H2SO4 6 N
Solucin de KMnO4 O.OO5 M
PROCEDIMIENTO.
Para el mejor desarrollo de esta prctica se deben tener en cuenta dos aspectos importantes:
1. Todos los tubos deben estar perfectamente lavados para evitar las interferencias
2. La experiencia debe realizarse a una temperatura de 4 C (bao de hielo), por tanto los
reactivos que se van a utilizar y los tubos deben encontrarse a esta temperatura. Esta
condicin es necesaria debido a la alta velocidad de accin de la enzima.
A. Preparacin de la enzima(catalasa) a partir de la habichuela:
En un mortero coloque 5g de habichuela bien lavada y picada en trozos pequeos. Adicione
5 mL de agua destilada fra. Macere hasta obtener un extracto coloreado uniforme.
Centrifugue por 5 minutos a 5000 rpm. Separe el sobrenadante y complete con agua a 20
mL. Agitar suavemente y colocar en el bao de hielo. Este extracto contiene la ENZIMA a
ensayar. Conserve en el bao de Hielo
I. Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
En un vaso de precipitados con hielo picado colocar 6 tubos de ensayo rotulados y agregar
los siguientes reactivos:
REACTIVOS TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6
B. pH= 4,0 (mL)
10
B. pH= 5,0 (mL)
10
B. pH= 6,0 (mL)
10
B. pH= 7,0 (mL)
10
10
B. pH= 8,0 (mL)
10
H2O2 (mL)
2
2
2
2
2
2
Enzima (mL)
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0
Despus de adicionar la enzima y agitar los tubos, deje reaccionar 5 min. y adicione:
H2SO4

Transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer o un vaso de precipitados (utilice uno


para cada tubo) y titule el perxido remanente, con KMnO 4. El punto final de la titulacin
se alcanza cuando aparezca un color rosado claro permanente.

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II. Efecto de la Concentracin de la Enzima


En un vaso de precipitados con hielo picado colocar 5 tubos de ensayo rotulados y agregar
los siguientes reactivos:
REACTIVOS TUBO 1
B.
Fosfatos
10,0
seleccionado en I

TUBO 2
9,5

TUBO 3
9,0

TUBO 4
8,5

TUBO 5
8

(mL)

H2O2 (mL)
Enzima (mL)

2
2
2
2
2
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Despus de adicionar la enzima y agitar los tubos, deje reaccionar 5 min. y adicione:
H2SO4

Transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer o un vaso de precipitados (utilice uno


para cada tubo) y titule el perxido remanente, con KMnO4. El punto final de la titulacin
se alcanza cuando aparezca un color rosado claro permanente.
III.Efecto de la Concentracin del sustrato
En un vaso de precipitados con hielo picado colocar 4 tubos de ensayo rotulados y agregar
los siguientes reactivos:
REACTIVOS TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
TUBO 4
B.
Fosfatos
11,5
11
10,5
10
seleccionado en I
(mL)

H2O2 (mL)
Enzima (mL)

0,5
1,0
1,5
2
0,5
0,5
0,5
0,5
Despus de adicionar la enzima y agitar los tubos, deje reaccionar 5 min. y adicione:
H2SO4

Transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer o un vaso de precipitados (utilice uno


para cada tubo) y titule el perxido remanente, con KMnO 4. El punto final de la titulacin
se alcanza cuando aparezca un color rosado claro permanente.
IV. Efecto de inhibidores sobre la actividad de la enzima
En un vaso de precipitados con hielo picado colocar 3 tubos de ensayo rotulados y agregar
los siguientes reactivos:

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REACTIVOS TUBO 1
B.
Fosfatos
9,5
seleccionado en I

TUBO 2
9,5

TUBO 3
9,5

(mL)

H2O2 (mL)
NaCN (gotas)
Enzima (mL)

2
2
2
5
10
15
1,0
1,0
1,0
Despus de adicionar la enzima y agitar los tubos, deje reaccionar 5 min. y adicione:
H2SO4

Transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer o un vaso de precipitados (utilice uno


para cada tubo) y titule el perxido remanente, con KMnO 4. El punto final de la titulacin
se alcanza cuando aparezca un color rosado permanente.
DATOS, RESULTADOS Y DISCUSIN
1. Con los datos obtenidos, en cada uno de los puntos desarrollados durante la prctica (I,
II, III y IV), complete el siguiente cuadro:
TUBO

mL
KMnO4
gastados

Micromoles
H 2O 2
Iniciales

Micromoles
H2O2
residuales

Micromoles
Micromoles
H 2O 2
descompuestas/min/
descompuestas mL enzima

1
2
3
4
5
6
7

2.
3.
4.
5.

Construya una grfica de pH contra actividad de la enzima.


Construya una grfica de concentracin de sustrato contra actividad de la enzima
Construya una grfica de concentracin de enzima contra actividad de la enzima
Construya una grfica de cantidad de inhibidor contra actividad de la enzima

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CUESTIONARIO
1. En la prctica Ud. estudi algunos factores que afectan la actividad de la enzima. Qu
otros factores tendra que evaluar para completar el estudio cintico de la catalasa?
EXPLIQUE.
2. Compare la accin de la catalasa con la accin de la peroxidasa.
3. Cul es el papel del H 2SO4 en esta prctica? Por qu no se aplica al tiempo con los
dems reactivos?
4. Se podra sustituir el cido sulfrico por otro reactivo como el hidrxido de sodio
(NaOH)? Justifique su respuesta.
5. Qu pruebas adicionales tendra que realizar para determinar si sta es una enzima
michaeliana alostrica? Justifique su respuesta.
BIBLIOGRAFA
BOHINSKI R. Bioqumica. Ed. Fondo Educativo Interamericano, 1992
HARPER H. y cols. Bioqumica. Ed. El Manual Moderno, 1995

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LABORATORIO No. 5 y 6. PROTENAS


OBJETIVO:
Comparar dos mtodos de determinacin cuantitativa de protenas (Biuret y Kjeldahl)
desde el punto de vista de sensibilidad y rapidez.
FUNDAMENTO TEORICO
Las protenas son un grupo de biomolculas caracterizadas por su variedad estructural y
enorme diversidad de funciones biolgicas. En las diferentes especies, las protenas
presentan ligeras variaciones estructurales a pesar de que desempeen la misma funcin.
Qumicamente pueden diferenciarse en protenas simples, constitudas primordialmente de
aminocidos y protenas complejas que contienen material adicional como carbohidratos,
lpidos o cidos nuclicos.
Solubilidad y precipitacin de las protenas
La solubilidad de una buena cantidad de protenas es funcin de la fuerza inica, el pH y la
concentracin de solventes orgnicos. A bajas concentraciones salinas de solvente, las
protenas como electrolitos multivalentes que son, se comportan de manera muy similar a
los iones simples, es decir cumplen la teora de Debye-Hckel, o sea en esta regin de
concentracin de sal, el aumento de sta estabiliza los grupos cargados sobre la protena y
por lo tanto aumenta la solubilidad (solubilidad por salado: Salting in). El fenmeno
contrario (precipitacin por salado: Salting out) que se observa a altas fuerzas inicas es
probablemente el resultado de la competencia entre la protena y los iones de la sal por las
molculas de agua del medio, para solvatarse. La solubilidad de la mayora de las protenas,
a una fuerza inica constante, presenta un mnimo cerca del punto isoelctrico. A este pH,
las repulsiones electrostticas intermoleculares entre las molculas de soluto estn en su
mnimo.
La mayora de los solventes orgnicos son buenos precipitantes, pues en general tienen baja
constante dielctrica. Con base en la solubilidad, las protenas pueden clasificarse en:
Albminas: son fcilmente solubles en agua y coagulan por accin del calor. Precipitan por
adicin de sulfato de amonio al 80% de saturacin. Ej: ovoalbmina, seroalbmina.
Globulinas: son insolubles o muy poco solubles en agua pero su solubilidad aumenta
notablemente por la adicin de pequeas cantidades de sales neutras como NaCl. Precipitan
de una solucin por la adicin de sulfato de amonio al 50% de saturacin. Ej:
seroglobulinas, globulinas de semillas.
Prolaminas: presentes solo en plantas. Son solubles en alcohol del 70-80%, insolubles en
agua y etanol absoluto. Por hidrlisis liberan gran cantidad de prolina y amonaco. Ej:
gliadina del trigo, zena del maz.
Glutelinas: presentes en granos de cereales. Son insolubles en solventes neutros,
soluciones salinas y alcohlicas pero solubles en cidos y lcalis diluidos. Ej: glutelina del
trigo, orizena del arroz.
Escleroprotenas: son protenas animales fibrosas, insolubles en agua y muy resistentes a
las enzimas proteolticas. Ej: las queratinas de la lana, el cabello, las uas.
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Espectrofotometra
Espectrofotometra es el sistema de anlisis basado en las medidas de la intensidad de la luz
que pasa a travs de una solucin utilizando un estrecho intervalo de longitudes de onda.
Se define como la distancia entre dos picos cuando la luz recorre un camino en forma
ondulatoria, se mide en Amstrongs (A)= 108 cm, milimicras o nanmetros (nm) = 10-7 cm
Fundamentos de la colorimetra
Cuando un rayo de luz de longitud de onda especfica pasa a travs de una solucin, parte
de la luz es absorbida. La cantidad de luz absorbida por dicha solucin depende de dos
factores: la distancia que debe recorrer el haz luminoso dentro del lquido y de la
concentracin de la sustancia que absorbe en la solucin. Las leyes que relacionan estos
factores con las medidas colorimtricas de las sustancias son:
A. Ley de Lambert: Establece una relacin entre la intensidad de la luz trasmitida y el
espesor de la celda o camino recorrido por la radiacin luminosa. La expresin matemtica
es:
I = Io e-K1L
Donde: I = Intensidad de la luz transmitida
Io= Intensidad de la luz incidente
e = Base de logaritmos naturales
L = Espesor de la celda atravesada por la luz (cm)
K1= Constante caracterstica de la sustancia coloreada.
B. La ley de Beer: Relaciona la intensidad de la luz trasmitida con la concentracin de la
sustancia coloreada dentro de la solucin, mediante la siguiente ecuacin:
I = Io e-K2C
Donde I, Io y e son los mismos de la primera ecuacin.
C = Concentracin de la solucin coloreada (M).
K2 = Constante de la sustancia coloreada.
Las dos leyes pueden combinarse en una, conocida como la Ley de Lambert-Beer, cuya
expresin matemtica es:
I = Io e-KCL
Despejando y pasando a logaritmo decimal tenemos:
Log Io/I = 0.4343 KCL
El log Io/I es el valor conocido como absorbancia (A) o densidad ptica. El valor 0.4343K
se conoce como coeficiente de extincin ptica y se representa como ae. Reemplazando en
la ecuacin tenemos:
A = aeCL
La transmitancia (T) se ha definido como:
T = I/Io
%T = I/Io x 100
Io/I = 100 / %T
Log Io/I = log 100 log %T
La frmula que relaciona la transmitancia con la absorbancia es:
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A = 2 log %T
Anlisis de protenas
Para la determinacin de protenas no existe un mtodo totalmente satisfactorio; por tanto
la escogencia del mtodo depender de la naturaleza de la protena y de otros componentes
de la muestra, de la exactitud y sensibilidad deseadas y de la rapidez con que se requieran
los resultados.
Mtodo de Biuret.
Los compuestos que tienen ms de dos enlaces peptdicos, dan un color rosado o lila
caracterstico, cuando se tratan con sulfato de cobre en solucin alcalina. El color es debido
al complejo de coordinacin del tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno
provenientes de los enlaces peptdicos (dos de cada pptido) . La estructura del complejo a
la cual se debe la coloracin es la siguiente:

Los espectros de absorcin de los complejos de cobre formados por diferentes protenas son
similares y por consiguiente es posible utilizar una protena cualquiera como patrn de
coloracin. Para obtener coloracin se requieren cantidades relativamente grandes de
protena (1-20 mg/mL).

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Mtodo de Kjeldahl.
El mtodo de Kjeldahl, diseado para la determinacin de nitrgeno total (nitrgeno
proteico y nitrgeno no proteico), puede aplicarse al anlisis de protena de una muestra. El
contenido de protena verdadera puede determinarse haciendo una extraccin previa de sta
o tambin determinando el nitrgeno no proteico. Las reacciones que ocurren durante el
proceso son :

El porcentaje de nitrgeno total (Nt) se puede calcular a partir del volumen de cido
clorhdrico ( de concentracin conocida) gastado, de acuerdo a la siguiente frmula:

El mtodo es reproducible, requiere el tratamiento de muestras con un contenido de


protenas mayor de 3 mg, y es dispendioso.

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REACTIVOS
Mezcla catalizadora
cido brico 4%
H2SO4 concentrado
NaOH 50%
HCl 0.01N valorado
Indicador de Tashiro
Reactivo de Biuret
NaCl 1%
Patrn de protena (albmina de huevo o casena) de 5mg/ml
METODOLOGIA
1. Preparacin de la muestra.
Pesar 2 gramos de la harina respectiva y distribuirla en dos tubos plsticos. Adicionar 10 ml
de NaCl 1% a cada uno, agitar durante 10 minutos, centrifugar a 2800 rpm, y recibir el
sobrenadante en un matraz aforado de 25 ml y llevar a volumen con NaCl 1%. Descartar el
residuo. Aqu se obtiene un extracto de protenas que contiene albminas y globulinas, las
cuales se cuantificarn por el mtodo de Kjeldahl y el mtodo de Biuret.
2. Mtodo de Kjeldahl.
a. Digestin
Tome dos matraces Kjeldahl para digestin y adicione en uno de ellos entre 2 mL del
extracto de la harina obtenida en el paso 1 y en el otro 3 ml de agua destilada (ste ser el
blanco del procedimiento y solo lo realizar un grupo). A cada matraz adicione en su orden:
100 mg de mezcla catalizadora
30 gotas de H2SO4 concentrado.
Coloque los balones en el digestor (consulte el profesor), calentando suavemente al inicio y
aumentado la temperatura hasta que la solucin tome una coloracin verde esmeralda.
b. Destilacin y adsorcin.
Transferir a un matraz de boca esmerilada la solucin digerida. Lavar dos veces con 1 ml
de agua destilada y transferir la solucin de lavado al mismo baln. Consulte al profesor el
manejo del destilador. En un erlenmeyer de 100 ml, medir 10 ml de cido brico 4% y
adicionar 2 gotas del indicador Tashiro. Recoger el destilado sobre esta solucin y observar
el cambio de coloracin a medida que se recoge ste.
c. Titulacin.
Titular el destilado recibido sobre el cido brico, con HCl de normalidad conocida, hasta
obtener la coloracin inicial.

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3. Mtodo de Biuret.
Para la determinacin de protenas por el mtodo de Biuret se realiza una curva de
calibracin utilizando patrn de albmina o de casena de una concentracin de 5 mg/ml.
Rotular 8 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos:

Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o por 10 minutos a
30 C para el desarrollo del color. Leer en cada tubo el porcentaje de transmitancia a 540
nm usando el tubo B para ajustar el 100 % de transmitancia.
CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION
A. Kjeldahl: Empleando la frmula calcule el porcentaje de protena presente en la harina.
B. Biuret: Trace en papel milimetrado la grfica de calibracin (Absorbancia vs
concentracin en mg/ml). Calcule la concentracin de albminas y globulinas presentes en
el extracto.
C. Comparar los resultados obtenidos por los dos mtodos y con la literatura consultada.
CUESTIONARIO
1. Al efectuar la extraccin de protenas con base en la solubilidad, por error usted us agua
en lugar de NaCl al 1%. Qu obtuvo en el sobrenadante? Qu protenas quedaron en el
residuo? EXPLIQUE.
2. Que tcnicas se aplican para desnaturalizar protenas? Cules de esos agentes son
reversibles?
3. Usted realiz la curva de calibracin de Biuret (valores de absorbancia entre 0,17 y 1,54)
y al leer la Absorbancia de los tubos que contienen la muestra a analizar, se obtuvo un valor
de 2,10. Qu hara Ud. en este caso con la muestra? EXPLIQUE.
4. Que diferencia hay entre protena bruta y protena verdadera? EXPLIQUE.
5. Indique cul es la composicin de la mezcla catalizadora usada en el mtodo de Kjeldahl.
6. Qu es y cmo funciona el Indicador de Tashiro?
BIBLIOGRAFIA
1. Acevedo F., Estudio de las protenas presentes en las semillas de algunas leguminosas
Colombianas., Tesis de Qumica 1972.
2. Surez G., Sastre Marco F. Comparacin de cuatro mtodos para la determinacin
cuantitativa de protenas Tesis de Qumica, 1982
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LABORATORIO No. 7, 8 Y 9. EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE LA FAVINA


OBJETIVOS
1. Extraer protenas presentes en la semilla de Vicia faba
2. Realizar un procedimiento sencillo de purificacin de la lectina presente en la
semilla de Vicia faba.
3. Guardar fracciones de diferentes estados de purificacin para la realizacin de
electroforesis SDS-PAGE.
FUNDAMENTO TERICO
La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren la purificacin, al menos
parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un gran esfuerzo ya
que una clula contiene miles de sustancias diferentes, la molcula que buscamos puede ser
extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas. En este tema se
presenta una visin general de las tcnicas ms usuales empleadas para la purificacin de
protenas, aunque muchas de ellas son aplicables a la separacin de la mayora de las
molculas biolgicas.
El conocimiento del proteoma, conjunto de protenas de un organismo, ha pasado a ser el
reto de la comunidad cientfica y de las empresas biotecnolgicas, una vez que ya se ha
completado la secuenciacin del genoma de varios organismos incluyendo el genoma
humano. El conocimiento de las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene
un gran valor, si no se identifica cual es la funcin de dichos genes, en su caso, para que
protenas codifican. El programa proteoma busca la caracterizacin de todas las protenas
de la clula humana, identificando su secuencia de aminocidos. Cuando se obtenga toda la
secuencia de aminocidos del proteoma humano se podr relacionar mediante potentes
programas informticos la secuencia de aminocidos de una protena con el gen que la
codifica. Los mtodos de secuenciacin tradicionales (basados en la degradacin de
Edman) son demasiado lentos para abordar esta ingente tarea, la secuenciacin de los
pptidos debe hacerse por espectometra de masas. Naturalmente las tcnicas de
purificacin y aislamiento de protenas son esenciales para abordar toda esta tarea.
Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas
El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura celular, para posteriormente
poder extraer la protena con un tampn adecuado. El mtodo de rotura a elegir depende de
las caractersticas mecnicas del tejido o clulas de donde se va a aislar la protena, as
como de su localizacin. Entre los distintos mtodos ellos estn:

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Lisis celular. Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos
animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias. Consiste en
suspender las clulas en una solucin hipotnica (ms diluida que el interior celular).
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Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de la clula, causando su


hinchamiento y rotura.

Destruccin mcanica. Entre estos mtodos se encuentran la homogenizacin


(hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan casi
totalmente); moler en un mortero con arena o almina; molino con perlas de vidrio,
la prensa de French (que hace pasar las clulas a gran velocidad a travs de un
pequeo orificio), la sonicacin (someter las clulas a vibraciones de ultrasonido).

Congelacin-descongelacin. La rotura se produce al someter las clulas a un


cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno
lquido) y pasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C). Tras la rotura o
bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extraccin
para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de
tampones especficos para protenas solubles o bien que contengan adems
detergentes si se pretende purificar protenas asociadas a membranas, si bien en este
caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice. Una vez que la protena se
ha extrado de su entorno natural est expuesta a muchos agentes que pueden
daarla. Los cambios bruscos de pH, cidos y bases fuertes, temperaturas extremas
y la accin de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptdicos) son los
principales factores que pueden desnaturalizar las protenas. Para evitar o minimizar
estos factores la manipulacin de las protenas durante el proceso de purificacin
suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se
procura que el proceso sea lo ms corto posible, adems en ocasiones es necesario
aadir el tampn de extraccin agentes protectores de grupos funcionales
especficos de la protena o bien inhibidores de proteasas. El resultado de todos
estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas,
membranas y clulas rotas. Esta preparacin se somete a centrifugacin (10.000
15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que
contiene las protenas solubles, del precipitado que adems de restos celulares
tambin contienen protenas asociadas a membranas y que para solubilizarlas
requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble
(con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la protena de
inters objeto de la purificacin. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta
que la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los
rotores estn fijos.

Para purificar una protena es imprescindible tener un mtodo para detectar


cuantitativamente su presencia. Es deseable que este mtodo sea especfico y fcil de llevar
a cabo. En este sentido es mucho ms cmodo trabajar con enzimas, pues se detectaran
mediante su ensayo de actividad, en caso de purificar protenas no enzimticas, se requieren
mtodos de seleccin ms especficos.

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Mtodos cromatogrficos para separacin de protenas


Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga, tamao o afinidad de
las diferentes protenas. Uno de los mtodos ms habitualmente utilizados para la
separacin de protenas es la cromatografa en columna, aunque tambin existe la
cromatografa en papel y en placa. La columna est rellena con un material slido con las
caractersticas qumicas adecuadas (fase estacionaria), y una solucin tamponada se hace
pasar a travs de la columna (fase mvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de
la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase mvil. Cada protena
migrar a distinta velocidad segn su grado de afinidad por la fase estacionaria.
Generalmente estas cromatografas se realizan de una forma semiautomtica, la fase mvil
se hace pasar a la columna a travs de una bomba peristltica y un colector de fracciones va
recogiendo el eluyente que sale de columna. Este colector hace que el tubo vaya
cambiando cada cierto nmero de gotas o de volumen. Despus hay que localizar en que
tubo o tubos est la protena que se pretende purificar.
Existen distintos tipos de cromatografas en tres ellos:
La filtracin o exclusin molecular
El cromatografa de intercambio inico
La cromatografa hidrofbica
La cromatografa de afinidad

Filtracin en gel o cromatografa de exclusin molecular. La fase estacionaria est


constituida por partculas de polmeros de diferente porosidad. La separacin se basa en
el tamao de las partculas. Las protenas ms grandes que no pueden penetrar en los
poros de las partculas de la matriz de filtracin son eluidas con ms rapidez que las
protenas ms pequeas que penetran por los poros de las partculas y siguen un camino
ms tortuoso y ms largo. El tamao de los poros internos depende de la naturaleza del
polmero en cuestin, y permite la entrada a protenas por debajo de un determinado
peso molecular.

Cromatografa de intercambio inico. En ella, la columna est rellena con un soporte


al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aninico) o
negativamente (intercambio catinico). Estos grupos cargados normalmente estn
neutralizados por iones del tampn. Estos iones son reversiblemente reemplazados por
las protenas con ms tendencia a unirse al soporte. Las protenas cargadas pueden por
lo tanto unirse a intercambiadores catinicos o aninicos dependiendo de su carga neta.
Las protenas ms cargadas se unirn ms fuertemente al intercambiador y por lo tanto
sern ms difciles de eluir. La afinidad con la que una protena se une a un
intercambiador inico depende de la fuerza inica del medio, debido a la competencia
entre los grupos cargados de la protena y los iones de la fase mvil. Una vez pegadas
las protenas, para eluirlas (retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza
inica de la fase mvil (aumentando la concentracin de sal, NaCl), de esta forma se

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eluyen primero las protenas mas dbilmente retenidas y cuando la fuerza inica sea
mayor saldrn las protenas ms cargadas y por lo tanto ms retenidas.

Cromatografa hidrofbica. Se trata de un mtodo similar al anterior con la nica


diferencia de que la fase estacionaria es apolar (hidrofbica), es decir, la protena se
pega al soporte por los resto de aminocidos apolares, cuanto ms residuos de este tipo
tenga en su superficie, ms apolar ser, ms se retendr en la columna y se eluir ms
tarde. En este caso a elusin se realiza aumentando la apolaridad de fase mvil.

Cromatografa de afinidad. Muchas protenas tienen la capacidad de unirse


especficamente a ciertas molculas, mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En
esta tcnica la molcula que se une especficamente a la protena se conoce con el
nombre de ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando el extracto con
la mezcla de protenas se aplica a la columna, la protena buscada se unir al ligando
inmovilizado mientras que las dems saldrn de la columna con el tampn. En este caso
tambin se utiliza el incremento de fuerza inica para eluir las protenas.

Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas cromatogrficos tales como
el FPLC, en el que se hace uso de bombas de alta presin (100-400 bares) y columnas con
materiales que soportan altas presiones. Este sistema reduce notablemente los tiempos de
purificacin y utilizan fases estacionarias con mayor poder de retencin, lo que incrementa
los porcentajes y rendimiento de las purificaciones.
PROCEDIMIENTO
PARTE I

EXTRACCIN DE PROTENAS

En un erlenmeyer coloque 10 g de harina de haba y adicione 30 mL de NaCl al 1%, agite


vigorosamente durante 1 hora con agitador mecnico magntico. Centrifugue a 4000 rpm
(4C) durnate 10 minutos para obtener un sobrenadante claro. Descarte el residuo. Ajuste el
pH del extracto proteico a 4,65 y mida el volumen total del extracto obtenido. Este es el
extracto crudo y contiene albminas y globulinas. Mantener sobre hielo en nevera.
Guarde una alcuota de este extracto para pruebas posteriores.

PRECIPITACIN CON SULFATO DE AMONIO

En un vaso de precipitados coloque 5 mL del extracto crudo y agregue lentamente sulfato


de amonio slido, previamente molido, en la cantidad necesaria para lograr una
concentracin final del 50%s. Disuelva la sal antes de una nueva adicin, teniendo la
precaucin de no formar espuma.
Deje en reposo, sobre hielo, durante 15 minutos. Centrifugue 15 minutos a 4000 rpm (4C).
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El precipitado contiene las globulinas y el sobrenadante las albminas. Determine el


contenido de protena en el sobrenadante y guarde una alcuota para pruebas posteriores
(aglutinacin y electroforesis).
Redisuelva el precipitado en NaCl 1% y complete en baln volumtrico a 25 mL. Reserve
una alcuota para pruebas posteriores (aglutinacin y electroforesis).
PARTE II

PURIFICACIN DE LA FAVINA POR CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

A cada grupo se le entregar una columna previamente montada de Sephadex G-100 y


equilibrada en la solucin con la que realizar la corrida de la columna. Este soporte
tradicionalmente se usa para cromatografa de filtracin en gel, pero en esta ocasin se
usar aprovechando su estructura qumica, para cromatografa de afinidad, ya que la Favina
tiene especificidad por la glucosa que es el monmero constituyente de este soporte. SIGA
LAS INSTRUCCIONES DEL PROFESOR PARA REALIZAR ESTA PURIFICACIN.
o APLICACIN DE LA SOLUCIN DE GLOBULINAS. Aplique 10 mL de la
solucin de globulinas sobre la superficie del soporte. Si es necesario, retire
permita que eluya previamente la solucin que se encuentra sobre ste. Despus
de aplicada la muestra, permita que sta ingrese en el soporte, mediante la
apertura del paso de solucin por la parte inferior de la columna.
o CORRIDA DE LA COLUMNA. Una vez la muestra haya ingresado en su
totalidad al soporte, inicie la elucin de la muestra con solucin de NaCl 1%.
Adicione solucin de NaCl 1% en la parte superior de la columna y recoja
fracciones eludas en la parte inferior de la columna en tubos de ensayo
pequeos. Cada fraccin se debe recolectar en ms o menos 2 minutos. Adicione
constantemente solucin de NaCl 1% sobre la columna para continuar con la
elucin hasta cuando se observe que ya se ha eludo completamente la fraccin
que no interactu con el soporte (fraccin no retenida). Para determinar la
presencia de protenas en cada una de las fracciones, debe hacerse seguimiento
de su absorbancia a 280 nm, teniendo como blanco la solucin de NaCl 1%.
Una vez se haya alcanzado la elucin completa de la fraccin no retenida
(evidenciada con una absorbancia de 0), debe iniciarse la elucin con la solucin
que permitir liberar las protenas que fueron retenidas por el soporte. Esta
solucin es NaCl 1%-glucosa 5%. Contine recogiendo fracciones cada 2
minutos y haciendo seguimiento de absorbancia a 280 nm. De esta fraccin
retenida (favina interactuando con glucosa) rena los tubos que presentaron
mayor absorbancia y forme un pool de stos. Conserve una alcuota de este pool
para pruebas posteriores (aglutinacin y electroforesis).
o ELIMINACIN DE LA GLUCOSA UNIDA A LA FAVINA. Sobre una
columna de Sephadex G-25, equilibrada previamente con NaCl 1%, aplique la
fraccin de favina-glucosa obtenida en la cromatografa anterior. Eluya esta
muestra con solucin de NaCl 1% y realice el seguimiento de la absorbancia a
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280 nm. Las fracciones con absorbancias altas, correspondern a la favina pura
y libre de glucosa. Rena estas fracciones en un pool y guarde una alcuota para
pruebas posteriores (aglutinacin y electroforesis).
PARTE III

PRUEBAS DE AGLUTINACIN

Empleando una caja de microtiter para aglutinacin se evala la presencia de la Favina


determinando la aglutinacin de cada una de las fracciones conservadas del proceso de
purificacin (extracto crudo, precipitado de sulfato de amonio, fracciones retenidas y no
retenidas de las columnas de cromatografa), adems de un control que no posee protenas
presentes.
En cada uno de los pozos de la placa, coloque 1 gota de muestra de protena (1 pozo por
muestra del proceso de purificacin), 1 gota de NaCl 1% y dos gotas de suspensin de
eritrocitos al 4% (preparados poco tiempo antes de la prctica) y deje en reposo por 1 a dos
horas. La formacin de aglutinados se observa directamente por comparacin con el control.
El control o blanco se prepara simultneamente mezclando 2 gotas de NaCl 1% y dos gotas
de suspensin de eritrocitos.

CUANTIFICACIN

Realice cuantificacin de las fracciones obtenidas mediante el empleo del reactivo de


Biuret (metodologa de las prcticas 5 y 6)

RESULTADOS, DATOS Y DISCUSIN


Para la presentacin del informe tenga en cuenta los siguientes aspectos:
Protena en mg encontrada en cada uno de los pasos de purificacin.
Perfiles de elucin de las cromatografas de afinidad (volumen de elucin Vs A280 nm).
Resultados de las pruebas de aglutinacin.
Porcentaje de favina en la harina de haba.
CUESTIONARIO
1. Cul es el principio de la utilizacin del sulfato de amonio como agente para
purificar protenas? Qu otro agente se podra utilizar?
2. Por qu se utiliza la absorbancia a 280 nm como medio de determinar la presencia
de protenas en cada una de las fracciones obtenidas en los pasos de purificacin?
3. Por qu se presenta la aglutinacin de eritrocitos con la favina?
4. Qu procedimiento debe hacerse a cada una de las fracciones obtenidas en esta
purificacin para que puedan ser utilizadas en electroforesis?
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BIBLIOGRAFA

Asensio, E. Estudio comparativo de la actividad hemaglutinante de algunas leguminosas


colombianas. Purificacin y caracterizacin de la hemaglutinina del haba (Vicia faba).
Tesis de grado en Qumica. Univrsidad Nacional de Colombia. Bogot. 1975
Allen, A., Desai, R., Neuberger, A. The purification of the glycoprotein lectin from the
broad bean (Vicia faba) and a comparison of its properties with lectins of similar specificity.
Biochem J. 155. 1976.
Lpez E., Anzola, C. Guas de Laboratorio [Bioqumica para la carrera de Qumica].
Universidad Nacional de Colombia. Bogot. Pp. 149-165. 2005.

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