Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
deteccin se realiz por deteccin UV-vis en lnea (Waters 2487 Dual detector de
absorbancia) y la fecha se proces utilizando Empower Pro 2. Ingredientes para la fase
mvil A y B para HPLC (40 mM Bis-Tris + KCN 2 mM, pH 6,5 y 40 mM Bis-Tris + KCN 2
mM + NaCl 200 mM, pH 6,8) se obtuvieron de Sigma Aldrich.
El anlisis de ADN para la deteccin de -talasemia por GAP-PCR se realiz en un
termociclador Peltier (Biorad). Se aplicaron cinco cebadores para eliminaciones: 3.7,
4.2, 20.5, MAR y MED, que representan el 80% de -talasemia [23]. La cuantificacin
se realiz por imago Imaging (B & L sistemas)
Los espectros UV-vis para la determinacin de la concentracin de hemoglobina se
registraron en un Perkin Elmer Lambda 25
Los espectros de masas se adquirieron a partir de una Waters Xevo G2-S Q-TOF con
ESI conectado a un sistema de clase I Aquity UPLC. El funcionamiento de la
configuracin se realiz con el paquete de software MassLynx.
2.2. preparacin de la muestra
Para las mediciones de HPLC, 100 l de sangre entera de heparina se lav con 1 ml de
0,9% de NaCl. Despus de la agitacin, el material se centrifug durante 5 min a
15000G. El sobrenadante se retir mediante una pipeta y se aadi 200 l de agua
doble ionizado. Las clulas se lisaron por 5 min y el material se almacen en el
congelador (-20 C).
Para las mediciones de EM, se aadieron 20 l de lisado para HPLC a un 1,000 l de
tampn de formiato de amonio (10 mM en agua a pH = 4,5). La concentracin
aproximada de las soluciones fue de 20 M segn lo establecido por UV-vis. Despus
de mezclar por vrtice, las muestras se almacenaron a 10 C en carrusel de muestras
de la MS.
2.3. Condiciones de espectrometra de masas
Para la inyeccin, 0,2 l de muestra se inyectaron mediante inyeccin en bucle parcial
en un flujo isocrtico (0,2 ml / min) de 90/10 v / v de agua / acetonitrilo con cido
frmico al 0,1%. Las muestras se analizaron por FIA (sin columna), en el que se
estableci el tiempo de ejecucin en 1,5 min.
Para la formacin de iones de ESI, se aplicaron los siguientes ajustes optimizados:
tensin capilar = 1.0 kV, cono de muestreo = 20 V, cono de extraccin = 4,0 V,
temperatura Fuente = 100 C de temperatura, desolvatacin = 500 flujo de gas C,
Cono = 10 l / h, el flujo de gas de desolvatacin = 650 l / h.
Para la adquisicin de los espectros de masas en el modo de resolucin positiva, la MS
se calibr con cido fosfrico. Dentro de la correccin de la masa de gestin se logr
utilizando LockSpray con una leucina-encefalina (Tyr-Gly-Leu-Glyphe, 556,2771 Da)
estndar cada 10 s. Se obtuvo el sobre de masa en el rango de entre 150 y 2000 m / z
en un tiempo de ciclo de 0,1 s. Un perfil optimizado del primer cuadrupolo se mantuvo
a MASS1 (300 m / z en un 10% el tiempo de exploracin para la permanencia y el
tiempo de rampa), Mass2 (700 m / z en el instante 20% de exploracin para el tiempo
de permanencia) y Mass3 (1200 m / z ).
Procesamiento de datos
Un espectro de masas en bruto se obtuvo a partir del cromatograma de iones totales
de corriente (TIC) entre 5,0 y 12,0 s. Este espectro acumulativa, en base a 70 espectros
de masa individual, se proces por la secuencia de comandos de deconvolucin
entropa mxima (MaxEnt1) en el software MassLynx. Se utiliz el sobre de masa entre
650 y 1200 m / z fue procesado y los siguientes parmetros de script: Deconvolucin
rango de masas de salida: 14,000-17,000 Da, resolucin de salida de deconvolucin:
0,1 Da, Ajustes para el modelo de simulacin de daos patrn de istopos: anchura a
media altura : 0,25 Da y mnimas relaciones de intensidad: 33%. Deconvolucin a la
convergencia tom 25 s.
Despus de deconvolucin, deconvoluted masas exactas se obtuvieron mediante el
centrado pico en MassLynx (1, parte superior centroide 80%, espectro de rea). El
anlisis estadstico de la - y -media de la masa y la -relacin / se realiz mediante
Analizar-it en Microsoft Excel usando un mtodo paramtrico.
Seleccin de muestras
No se aplic la seleccin de pacientes y las muestras se utiliza partir de personas
adultas que fueron consentidos para el anlisis hemoglobinopata. En nuestro
laboratorio, esto incluye un anlisis total de hemograma, HPLC y ADN; proporcionando
de este modo un diagnstico basado en la rutina necesaria para esta comparacin, en
el que se realizaron mediciones paralelas por un perodo de 3 meses.
Las caractersticas basales de los sujetos se muestran en la Tabla 1. En lugar de
seleccionar a un subgrupo sana, una poblacin de controles negativos (o sujetos sin
enfermedad) sirvi de referencia. Los sujetos fueron considerados negativos en
ausencia de un diagnstico de la talasemia y una variante de hemoglobina. Talasemia
se diagnostica mediante una prueba de ADN positivo para -talasemia y los criterios
diagnsticos para un -talasemia son una fraccin HbA2-N3.5% con MCV b 80 fl y un
nivel de hierro normal. Este ltimo trastorno se diagnostica por un HbA1-fraccin B95%
y la presencia de otras variantes de la hemoglobina en HPLC.
estudio de optimizacin
Antes de la medicin de las muestras de pacientes, un estudio de optimizacin se
realiz para las condiciones apropiadas para la preparacin de muestras, la inyeccin,
la ionizacin, la adquisicin de la masa y de deconvolucin espectral. Para estas
investigaciones, se emple una muestra de hemoglobina de un sujeto sano en una
concentracin optimizada de 20 mM. La forma y el rea bajo la TIC-cromatograma se
utilizan para acceder a la eficiencia de ionizacin, que se considera ptimo cuando
estaban en forma de Gauss y el rea relacionada linealmente con la cantidad de
muestra inyectada. Con el fin de obtener las condiciones adecuadas, se variaron el
volumen y velocidad de flujo de inyeccin entre 0,1 y 0,3 ml / min y 0,1 a 0,3 l,
respectivamente. En este proceso, los parmetros de ionizacin tales como
desolvatacin flujo de gas / temperatura, el flujo de gas del cono, voltaje del cono de
muestra / extraccin, voltaje capilar y temperatura de la fuente se optimizaron
tambin. A un caudal de 0,2 ml / min y 0,2 l de la muestra inyectada, se recogieron los
espectros de masas entre 5.0 y 12.0 s resultantes en el espectro de masas en bruto
(Fig. 1A).
Los iones moleculares producidos por el espectrmetro y el patrn de iones de fragmentos registrados son nicos en
cada compuesto y se configuran como una huella dactilar para diferenciar e identificar compuestos y molculas.
Como se us la espectrometra
Mediante el anlisis de inyeccin de flujo y despus de del anlisis espectral, la relacin de intensidad de la - y subunidad, as como su masa especfica se usaron como parmetros de deteccin. Deducimos las distribuciones de
masas de la - y de cadena y la relacin / - de una poblacin que comprende de los adultos libres de la enfermedad
que sirven como referencia.
Resultados obtenidos
La relacin alfa/beta es un marcador pobre para los pacientes con talasemia, pero sirve en los pacientes con una
variante de hemoglobina. se encontraron desviaciones entre la relacin alpha/beta para los pacientes con variantes de
hemoglobina. La incorporacin de un aminocido diferente provoca un desplazamiento de masa del pico de globulina;
por ejemplo, en caso de HbS, la -globulina es menos abundante
Conclusiones
A pesar de que no se detectaron pacientes con talasemia leve, todos los pacientes con una variante de hemoglobina se
resolvieron por espectrometra de masas utilizando la masa media globulina y la -relacin / como parmetros de
seleccin