TEMA 3

26/XI

~ ENZIMOLOGA ~
Los enzimas, en su mayora, son protenas, salvo la excepcin de los ribozimas que son ARN
con actividad enzimtica. Los enzimas tienen la funcin de catalizar reacciones sin las cuales la
supervivencia celular sera imposible. Son esenciales en los procesos metablicos, ya que si no
muchos de ellos seran extremadamente lentos.
Los enzimas son altamente especficos. Lo son tanto de la reaccin que catalizan como del
sustrato que utilizan para esa reaccin. No obstante, su especificidad puede variar, ya que
pueden ser especficos de una reaccin en la que slo corten un determinado conjunto de
aminocidos o de procesos en los que reconocen grupos de molculas.
La actividad enzimtica est altamente regulada. Se regula a travs de:
Retroinhibicin: El producto inhibe la ruta. Normalmente es el sustrato final el que
inhibe al primer enzima de la ruta.
Protenas reguladoras: Son protenas que se unen al enzima y regulan su actividad. Por
ejemplo, el Ca es un importante regulador de actividad a travs de una protena, la
calmodulina, que se activa por Ca.
Modificaciones covalentes: Destaca la fosforilacin de protenas. El 99% de las
fosforilaciones ocurren en la treonina o la serina. Slo el 1% en tirosina, pero es muy
importante para regular enzimas.
La fosforilacin funciona como un interruptor, pasando el enzima de activo a inactivo.
Puede haber enzimas activas tanto fosforiladas como sin fosforilar. El proceso de
fosforilacin se regula por las quinasas, que son enzimas que fosforilan, y las
fosfatasas, que son enzimas que defosforilan.
Zimgenos: Son protenas que estn inactivas y al cortarse se activan. Destacan los
enzimas digestivos.

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Energa libre de una reaccin

El incremento de energa libre de una reaccin se sintetiza en la siguiente ecuacin:
G = G B G(A)
G(B) se refiere a la energa del producto mientras que G(A) se refiere a la energa reactiva.
Una reaccin solo ocurre de manera espontnea si su incremento de energa libre es negativo.
La energa libre de los productos debe ser menor a la de los reactivos. Si existe una reaccin en
la que el incremento de energa libre es igual a 0, entonces esa reaccin se encuentra en
equilibrio.
El G es independiente del camino de transformacin. Da igual el nmero de pasos
intermedios. Por otro lado, aunque el G indica si puede ocurrir una reaccin, no da
informacin sobre la velocidad de la misma.

Los enzimas disminuyen la energa de activacin, la energa necesaria para que tenga lugar
la activacin. Al reducir la energa necesaria, aumenta la velocidad de reaccin.

Enzima-catalizador
Ambos aceleran la velocidad de las reacciones qumicas. Se diferencian en tres propiedades
que poseen los enzimas frente al catalizador:
Especificidad por el sustrato.
Se pueden inactivar por desnaturalizacin, la ruptura de su estructura terciaria. El
calor, el pH, la concentracin de sal, etc. desactivan el enzima.
Pueden ser reguladas.

Etapas de catlisis enzimtica

Se distinguen tres etapas en la catlisis enzimtica:
1. Se crea un complejo enzima-sustrato. El sustrato se une al enzima en su centro activo.
2. Se cataliza la reaccin. El complejo se transforma en enzima producto.
3. Se separan enzima y producto.
La existencia de este proceso se ha demostrado a travs de su observacin por microscopio
electrnico. Esta observacin se vale de que, al unirse, cambian sus propiedades
espectroscpicas.
La velocidad de reaccin de un enzima aumento con la concentracin de un sustrato. Sin
embargo, llega a un punto de saturacin en el que la velocidad ya no aumenta. Cada enzima
tiene un centro activo al que se une el sustrato. Despus de la reaccin se separan. Por otro
lado, las molculas enzimticas no cambian con la reaccin.
Los centros activos renen una serie de caractersticas:
Son una porcin pequea del enzima global. El resto de la protena da funcionalidad al
enzima.
Es una estructura tridimensional. Normalmente est formada por aminocidos que
dentro de su estructura primaria se encuentran muy distantes.
La unin del sustrato se produce por numerosas fuerzas dbiles, sobre todo fuerzas de
van der Waals. En consecuencia, el sustrato y el centro activo deben ser
complementarios en forma. De esta manera se forman el mayor nmero posible de
fuerzas atractivas y pocas repulsivas.
Normalmente forman un hoyo o una hendidura. Adems, de esta hendidura queda
excluida el agua. Con lo cual, los centros activos suelen ser apolares. No obstante,
suele haber algn aminocido polar en el centro, muy importante para la funcin del
enzima.

Unin del sustrato

Es muy especfica. Tiene dos tipos de complementariedad: geomtrica y de cargas. Tiene
que encajar de forma y de cargas. Existen diversas teoras o modelos sobre cmo se realiza
esta unin:
Llave-cerradura: El centro tiene unas cargas y el sustrato las complementarias. El
centro activo est preparado para recibir al sustrato. Se acoplan de forma
estereospecfica.
Ajuste inducido: El sustrato y el centro activo sufren una modificacin al encajar.
Estabilizacin del estado de transicin: Lo que es complementario es el estado de
transicin, no el sustrato en s. Es decir, es complementario el paso de enzima-sustrato
a enzima-producto.
Un enzima puede unir ms de un sustrato a su centro activo, para ello necesitara ser
complementario a varios sustratos.

Clasificacin de enzimas
Hay tres tipos de clasificaciones para las enzimas. En realidad, estas clasificaciones son
diferentes maneras de denominar a un mismo enzima.
Nombre comn Es la clasificacin ms habitual. Recoge el nombre del sustrato acabado
en -asa. Prcticamente no informa de nada.
Nombre sistemtico Se forma mediante el donador, el aceptor y la reaccin. No se utiliza
mucho.
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Nmero de la Enzyme Comission Otorga un nmero al enzima que aporta mucha

informacin sobre su tipo, sustrato, etc. El primer nmero indica 6 grandes grupos de
enzimas. Los otros tres nmeros especifican ms. Cada nmero es nico a un enzima. La
primera clasificacin se hace en funcin de su actividad:
1. Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de xidoreduccin. tomos de O y de H son
trasladados entre molculas. Siempre hay un dador y un aceptor.
2. Transferasas
Transfieren un grupo de una molcula a otra.
3. Hidrolasas
Son los enzimas que catalizan una reaccin de hidrlisis, es decir, la ruptura
de una molcula con agua.
Un caso especial son las pptido hidrolasas que tienen una clasificacin:
- Segn la situacin del enlace que atacan:
Exopeptidasas Cortan extremos de la cadena. Peptidasas.
Endopeptidasas Cortan el interior. Proteinasas.
- Segn el mecanismo cataltico, el conjunto que forma el centro activo:

Serin proteasas (serina)

Tiol proteasas (grupo azufre)
Aminocido dirige la ruptura
Aspartil proteasas (aspartato)
Metaloproteinasas (importante en transmisin) Metal dirige

4. Liasas
Rompen las molculas, pero sin valerse de agua para ello.
5. Isomerasas
Catalizan reacciones de isomerizacin. Dentro de los enzimas son los ms
especficos en cuanto a sustratos.
6. Ligasas
Catalizan la unin de grupos qumicos aprovechando la hidrlisis de un
nucletido trifosfato (ATP, GTP, etc.)

Cintica enzimtica
Es el anlisis cuantitativo de cada uno de los factores que intervienen en la actividad
enzimtica y que se evalan a travs de la velocidad de reaccin. Se mide la velocidad de
formacin de un producto a partir de los sustratos que la regulan. Se expresa en
concentraciones de moles por segundo.
Existen una serie de variables que afectan a la velocidad de reaccin catalizada:

Concentraciones de enzima, sustrato y producto (incluyendo inhibidores y activadores)

pH
Temperatura

Un sustrato se transforma en producto con un enzima. La velocidad mide en qu medida

aparece un producto en el tiempo. La siguiente ecuacin muestra que la velocidad es la
relacin entre la variacin de un producto o sustrato en el tiempo.

La velocidad inicial de la reaccin relaciona la concentracin con el tiempo cuando tiende a

0 (t0). El incremento de la velocidad se reduce conforme aumenta la concentracin de
sustrato. Este fenmeno se puede explicar por las siguientes causas:

La inactivacin por su inestabilidad.

Por retroinhibicin. El producto del enzima inhibe su actividad.
Saturacin del enzima con el sustrato. Cuando la concentracin de sustrato es mucho
mayor a la de enzima.
Si la reaccin es reversible, conforme se acumule producto, ste se ir convirtiendo en
sustrato.

En el enzima existe un nmero limitado de espacios para fijar sustrato. Por ello, por mucho
que se aada sustrato, la velocidad permanecer constante, tendiendo a un valor asinttico.

Esta es una ecuacin muy compleja. No permite solucin analtica, slo aproximaciones y
simulaciones.

Hiptesis de Michaelis-Menten
Segn esta hiptesis, la primera parte de la ecuacin, la formacin de ES, ocurre mucho
ms rpidamente que la conversin de ES en E+P. Por lo tanto, el factor limitante es el k+2. De
esta manera, la velocidad de la reaccin se corresponde con la siguiente ecuacin:
=

= 1 /+1

Hiptesis del estado estacionario

Indica que hay un tiempo en el que la concentracin de ES permanece inalterada. Al igual
que en el caso de la hiptesis de Michaelis-Menten, se llega a la ecuacin:
=

Pero en este caso, el significado de Km es diferente:

= (1 + +2 )/+1

10/XII

Significado de Km

Constante de equilibrio de disociacin del complejo ES.

Concentracin del sustrato para la cual la velocidad de reaccin es igual a la mitad de
la velocidad mxima.
Se define para una pareja enzima-sustrato. En cada pareja hay una Km diferente.
Se mide en unidades de concentracin, normalmente mol.

Significado de Vmax

La velocidad que tienen a una asntota conforme se acerca a la concentracin de

sustrato mxima.
Es directamente proporcional a la concentracin del enzima. Contra ms enzimas, ms
sustrato es unido y ms reacciones tienen lugar.
Se expresa en unidades de velocidad mol/seg o molseg-1.

Hay una relacin entre Vmax y Km. A mayor Km, la afinidad del enzima por el sustrato es
menor y viceversa. Es decir, una Km baja indica que se necesita poca concentracin de sustrato
para funcionar a la mitad de la velocidad mxima.

Representacin Lineweaver-Burke
Permite extraer directamente los valores de Vmax y Km, algo que es difcil de hacer en la
representacin directa. Para ello, se representan los inversos de la velocidad y del sustrato, de
modo que salen una recta. El punto en el que corta la recta con el eje y es el equivalente a
1
/Vmax. Cuando corta con el eje x, es -1/Km.

Representacin Hanes
Representa el cociente entre S/V frente a S. Tambin se obtiene una recta, pero en este
caso el corte con el eje x nos dar Km y la pendiente de la recta ser 1/Vmax.

Representacin Eadie-Hofstee
Representa la velocidad frente al cociente V/S. Nuevamente obtendremos una recta. El
corte de sta con el eje y nos dar Vmax, mientras que la pendiente de la recta ser Km.

Regulacin de la actividad enzimtica

pH
Cada enzima tiene un pH ptimo al cual su velocidad es mxima. La mayora de los enzimas
funcionan a un pH fisiolgico (7,2-7,6).

El pH modifica la protonacin de las cadenas laterales presentes en el centro activo. Si un

centro activo necesita estar protonado, no puede funcionar a pH altos. De igual manera, al
bajar el pH aumenta el nmero de cargas y deja de ser complementario al sustrato el centro
activo. Hay enzimas que funcionan slo en entornos muy cidos, lo que hace que estn activos
slo en determinados lugares. Un ejemplo caracterstico es la pepsina, que funciona en
entornos con pH bajos como el estmago.
El pH puede actuar tanto sobre la carga del sustrato como del centro activo. Tambin
puede actuar directamente sobre la capacidad cataltica del enzima y no sobre la capacidad de
unir. Y, por ltimo, aunque es poco frecuente, el pH afecta a la estructura y se desnaturaliza la
protena enzimtica. Pero esto slo ocurre en pH extremos.

Temperatura
Tiene dos componentes. El primero es que los enzimas se aceleran con la temperatura,
pero hay un factor limitante, que sera el segundo componente, la desnaturalizacin de la
protena. A 37oC estn casi en el lmite antes de desnaturalizarse. No obstante, la temperatura
ptima del enzima vara segn su especie.
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Organismos termfilos
El PCR (polymerase chain reaction) es una tcnica que permite amplificar pequeas
cantidades de ADN. Emplea una ADN polimerasa de un organismo termfilo. Cuando se
calienta, las cadenas del ADN se separan, pero no el enzima al ser de un organismo termfilo.
De este modo se logra duplicar la cadena de ADN con cada ciclo de aumento de temperatura.

Coenzimas y factores enzimticos

Las coenzimas son pequeas molculas orgnicas que se unen al enzima. El enzima no
funciona sin el coenzima. Su funcin es, normalmente, recibir de forma transitoria a un grupo
qumico para transmitrselo a un sustrato. Un ejemplo importante es el NADH. El enzima une
NADH y un sustrato oxidado y, a travs del enzima, se transfiere H al sustrato.
Los enzima sin el coenzima reciben el nombre de apoenzimas.
Los cofactores son tomos inorgnicos. Tambin son imprescindibles.

Isoenzimas / Isozimas
Son formas moleculares ligeramente diferentes del mismo enzima. Todos catalizan la
misma reaccin, pero difieren mnimamente en su actividad, ya que hay reguladores que
actan sobre un isozima y no sobre otro.

Ejemplo de isozima es la lactato deshidrogenasa. Segn el isozima catalizar la reaccin en

una u otra direccin (Lactato + NAD+ Piruvato + NADH). Se usa mucho en clnicas para
identificar daos en distintos tejidos. Segn el isozima que se encuentre, se puede saber qu
tejido est afectado, por estar asociado al isozima.

Inhibidores enzimticos
Es un efector que inhibe la actividad enzimtica. Puede ser por interaccin con el centro
activo u otros centros (alosterismo). Los inhibidores excluyen a los agentes que desnaturalizan
el enzima. Por otro lado, los inhibidores que actan sobre el centro activo se denominan
isostricos. Los alostricos son los que se unen a otros centros.
Dentro de los inhibidores isostricos se pueden distinguir dos grandes grupos:

Inhibidor irreversible: Lo cambian de tal forma que ya no funciona. Se incluyen los

inhibidores que se unen de forma irreversible.
Inhibidor reversible: Se establece un equilibrio con el enzima libre o con el complejo
enzima sustrato.

Inhibidores reversibles
Hay tres subgrupos:
Inhibicin competitiva: El inhibidor se une al centro activo e impide la unin
del sustrato.
Inhibicin no-competitiva: No se une exactamente al centro activo, pero
dificulta la unin del sustrato.
Inhibicin anticompetitiva: Se une exclusivamente al complejo enzimasustrato.

Inhibidor competitivo
Compite con el sustrato por el centro activo del enzima. Si hay poco sustrato, quedar
desplazado y viceversa. Los inhibidores con gran afinidad necesitan mayores concentraciones
de sustrato para ser desplazados. El sitio de unin de inhibidor y sustrato es el mismo.
Los inhibidores competitivos no modifican la Vmax, pero provocan un aumento de la Km. Esto
quiere decir que la afinidad del enzima por el sustrato disminuir, lo que repercutir en que
sern necesarias mayores concentraciones de ste para alcanzar la mitad de la Vmax. Sin
embargo, una vez la concentracin de sustrato desplace al inhibidor, se podr alcanzar la
misma Vmax. Cada inhibidor tiene una Ki (constante de inhibicin) para cada enzima. Responde
a su afinidad.

Los inhibidores competitivos suelen ser muy similares al sustrato, pero con alguna
modificacin qumica que impide que el enzima acte sobre l. Son ms especficos que el
sustrato.
En las representaciones de Lineweaver-Burke, si se compara la recta del enzima en
presencia de inhibidor y sin l, ambas coincidirn en el punto de corte con el eje y (1/Vmax),
mientras que la recta que representa al enzima inhibido tendr un punto de partida del eje x (1
/Km) ms alejado de 0.

Inhibidor no competitivo
Se une al enzima en un lugar distinto al sitio activo. No compite con el sustrato por unirse al
centro activo. Se puede unir al centro activo o a un sitio prximo. Adems, se puede unir tanto
al enzima libre como al complejo ES.
El inhibidor siempre se une independientemente de la concentracin de sustrato, por lo
que la Vmax disminuye a la vez que se mantiene Km. El enzima mantiene la misma afinidad por
el sustrato, slo que el inhibidor no permite alcanzar la misma velocidad de reaccin. Los
equilibrios que se establecen en estos inhibidores son ms complejos.
A la hora de representar esta situacin en la recta de Lineweaver-Burke, a mayor presencia
del inhibidor, mayor ser 1/Vmax, mientras que Km seguir igual. Si se compara el
funcionamiento de un enzima en presencia de inhibidor o sin inhibidor, ambas rectas partirn
del mismo punto en el eje x, pero la recta con inhibidor tendr una pendiente ms
pronunciada, es decir, cortar con y en un valor superior.

Inhibidor anticompetitivo / incompetitivo

El inhibidor slo tiene capacidad para unirse al complejo ES, no puede unirse al enzima solo.
Cuando el sustrato se une al enzima, es el cambio conformacional lo que permite la unin del
inhibidor.
El enzima siempre estar inhibido. No puede alcanzar la velocidad mxima. Km disminuye
porque el equilibrio se desplaza a la formacin ES desde E+P. Es decir, aumenta Km y disminuye
Vmax.
En la representacin Lineweaver-Burke, se aprecia que la recta del enzima inhibido
presenta puntos de corte tanto al eje x como al eje y ms alejados de 0. Es una recta paralela a
la del enzima no inhibido.

Inhibicin irreversible
Este tipo de inhibicin se da cuando reacciona con un grupo qumico del enzima y realiza
una unin covalente. La unin no se define por una constante de equilibrio (Ki) sino por una de
velocidad (ki) que define: E + I E. Esto implica que el efecto de los inhibidores irreversibles
depende del tiempo de actuacin del inhibidor.
Por lo general, estos inhibidores suelen ser muy txicos. Suponen la inactivacin definitiva
del enzima e interfieren en una va metablica.
Algunos tipos de inhibidores irreversibles son:

Reactivos de grupos SH. Es muy fcil que rompan enlaces S-S y desestructuren la
protena.
Organofosfricos.
Ligandos de metales.
Metales pesados.

Inhibicin enzimtica alostrica

Se da en enzimas formados por varias subunidades. Necesitan estructura cuaternaria. No se
rigen por la cintica enzimtica de Michaelis-Menten. Se caracterizan por tener sitios
reguladores o centros alostricos al margen del centro activo.
La curva que describen estos inhibidores, en lugar de ser hiperblica, tiene forma
sigmoidea. Esto implica que la unin del sustrato es cooperativa. La unin de un sustrato a uno
de los sitios alostricos provoca cambios conformacionales que facilitan la unin del sustrato a
otro centro activo. Hay dos modelos de unin cooperativa: secuencia y concertado.
Los reguladores alostricos pueden ser activadores o inhibidores. Se unen al sitio alostrico
en la misma subunidad del centro activo o a otra subunidad. Provocan un cabio
conformacional que afecta al centro activo.

Resumen de enzimologa
Los enzimas son protenas que van a catalizar reacciones biolgicas. Catalizan
reacciones que, si no, no tendran lugar.
Presentan muy alta especificidad por su sustrato.
Cada enzima se define por su Vmax y la Km. Estos valores son exclusivos de un enzima
para un determinado sustrato. Adems, Vmax y Km dependen de factores externos
como son el pH y la temperatura.
La actividad enzimtica puede estar inhibida.
Muchos enzimas requieren coenzimas y cofactores para su actividad.