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MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA AGRCOLA

PRCTICA 7.

FIJACIN SIMBITICA DEL NITRGENO ATMOSFRICO

I. INTRODUCCIN
La mayor reserva de nitrgeno se encuentra en la atmosfera; segn Tisdale y Nelson citados por
Castillo (2003) con aproximadamente un 78% y segn, la FAO el aire contiene un 80% de nitrgeno, lo
que equivale a ms o menos 6,400 Kg. del elemento sobre una hectrea. El nitrgeno es un elemento
esencial para todos los seres vivos, adems de ser un componente especifico de las protenas, est
presente en la mayor parte de las combinaciones orgnicas de las plantas y es totalmente voltil por
calcinacin. Los mayores contenidos de nitrgeno en las plantas se encuentran en los tejidos jvenes y
a medida que la planta avanza en edad o etapa fenolgica, la proporcin de celulosa aumenta y el
porcentaje de nitrgeno disminuye y se eleva la relacin C/N. Las hojas suelen concentrar el nitrgeno,
pero su valor disminuye durante la floracin. En la planta, el nitrgeno se encuentra en forma orgnica
en molculas importantes como las purinas, pirimidinas, porfinas, vitaminas, alcaloides y enzimas; y, en
formas inorgnicas como compuestos amnicos, nitritos y nitratos.
Al inicio de este siglo, los depsitos naturales de nitratos en Chile fueron las fuentes principales de
nitrgeno fijado disponible para la agricultura. En 1983, Sir William Crookes, advirti de que los
depsitos estaban agotndose lo que estimulo a la produccin de fertilizantes nitrogenados a travs de
medios industriales los cuales se sintetizan a travs del proceso de Haber-Bosch que consiste en la
sntesis directa del amoniaco a partir del hidrogeno y nitrgeno atmosfrico, reaccin que demanda de
altas tasas de temperaturas y presiones as como de una fuente de H2. Ahora, tres cuartos de siglo
despus a travs de los expertos se conoce que el gas natural y el petrleo necesarios para la
produccin de fertilizantes se estn agotando. Por lo anterior, se requiere de otra alternativa para el
suministro de nitrgeno agrcola para el futuro y entonces tomar ventaja de la fijacin biolgica del
nitrgeno a travs de la simbiosis Rhizobium-leguminosa.
De acuerdo a Alfredo Echegaray Alemn, el nitrgeno es de gran importancia para todas las formas de
vida que se desarrollan en el planeta tierra ya que se considera un elemento biognico que constituye
un elemento esencial de los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, purinas, pirimidinas, alcaloides y
vitaminas.
II. OBJETIVOS
Explicar los mtodos existentes de transformacin de nitrgeno molecular en nitrgeno usado
por las plantas
Analizar de forma individual y grupal la dinmica del nitrgeno en el suelo
Aplicar en un agroecosistema en particular, el efecto sobre el rendimiento de la simbiosis entre
la bacteria Rhizobium y plantas leguminosas en asocio con otras plantas de inters agrcola

Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Agronoma, Proteccin de Plantas, 2016.

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III. FUNDAMENTOS TERICOS

3.1 Fijacin simbitica de nitrgeno


De acuerdo con Viviana Chiocco (2016), las plantas superiores no han podido realizar durante su
evolucin la capacidad de sintetizar el complejo enzimtico nitrogenasa y de fijar nitrgeno
atmosfrico (N2). Sin embargo, varias plantas han desarrollado la estrategia de asociarse
simbiticamente con organismos procariontes capaces de fijar N2. Segn Gins Navarro (2,000) y
Castillo, V (2003), la transformacin del nitrgeno molecular atmosfrico en nitrgeno utilizable
potencialmente por las plantas en el suelo, se realiza principalmente a travs de tres procesos: 1) Por
oxidacin y pasar a la forma de xidos, por accin de las descargas elctricas y luego ser trasladados
por las lluvias y depositado en el suelo como acido nitroso o ntrico en pequeas cantidades. 2)
Industrial, que segn Atlas y Barta fue de 30 millones de toneladas por ao (1975); 100 millones de
toneladas para el ao 2000 y se calcula aumentara aproximadamente a 200 millones de toneladas para
el ao 2025, a travs del proceso de Haber-Bosch y, 3) Fijacin biolgica, que puede ser no simbitica a
travs de microorganismos de vida libre que rodean la rizosfera y simbitica por medio de un conjunto
de reacciones gracias a las cuales los organismos vivos Rhizobium y leguminosas integran el nitrgeno
molecular en sus estructuras como componente de diversos compuestos, para luego fijarlo al suelo y
que se calcula que es de 135 millones de toneladas por ao.
Todos los suelos contienen en su estructura una pequea cantidad de nitrgeno en forma de
compuestos relativamente simples, como aminocidos, sales amnicas y nitratos de los cuales solo de
las sales amnicas y los nitratos es de donde las plantas obtienen su nitrgeno de forma natural. Pero
en los suelos cultivados el nitrgeno puede aparecer por la adicin que el hombre realiza a travs de
los fertilizantes nitrogenados obtenidos sintticamente a partir de nitrgeno atmosfrico o mediante la
adicin de residuos orgnicos de diversa procedencia. El nitrgeno total presente en los suelos
cultivados puede variar entre los lmites entre 0.01 y 0.5%, aunque lo ms frecuente es que se
encuentre en un promedio de 0.1%.
El nitrgeno orgnico se encuentra como protenas, aminocidos libres, aminoazcares y otras
sustancias complejas no identificadas. Mientras que el nitrgeno inorgnico del suelo incluye las
formas: NH4+, NO3-, NO2-, N2O y NO las cuales son asimilables por las plantas. El nitrgeno presente en
suelos cultivables procede diferentes materiales como restos de cultivos, abonos verdes, estircol,
fertilizantes comerciales y nitritos aportados por lluvias, as como por la fijacin del nitrgeno
atmosfrico realizada por ciertos microorganismos.
3.2 Dinmica del nitrgeno del suelo
Esta dinmica est altamente influenciada por tres procesos, en donde cada uno de ellos depende, a su
vez, de un conjunto de secuencias ntimamente ligadas entre s. La distribucin de los procesos se
resume as:
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a) Ganancia del nitrgeno del suelo

Fijacin del nitrgeno atmosfrico por microorganismos que viven libremente en el suelo
(Clostridium, Azotobacter y Amylobacter)
Fijacin del nitrgeno atmosfrico por Rhizobium u otras bacterias simbiticas
Aportes por el agua de lluvia
Aporte en fertilizantes, estircol y plantas verdes
b) Transformaciones del nitrgeno en el suelo
Aminificacin, o degradacin bioqumica de las protenas y otros compuestos complejos
nitrogenados en aminocidos y aminas
Amonificacin, o transformacin bioqumica de los aminocidos y aminas en amoniaco
Nitrificacin, u oxidacin bioqumica del amoniaco en acido ntrico
Sntesis proteicas de los microorganismos del suelo, a partir de los compuestos que se originan
en el transcurso de los anteriores procesos
c) Prdidas de nitrgeno en el suelo

Desnitrificacin, o reduccin bioqumica de los nitratos bajo condiciones anaerbicas


Reacciones qumicas de los nitritos bajo condiciones aerbicas
Volatilizacin del amoniaco, principalmente en suelos alcalinos, clidos y hmedos
Lixiviacin de los nitratos
Asimilacin de los nitratos por las plantas superiores
Fijacin del amonio por las arcillas y en suelos con alto contenido de materia orgnica

3.3 La enzima Nitrogenasa y su bioqumica de fijacin


La molcula base en la fijacin biolgica del nitrgeno es la enzima nitrogenasa, la cual se logro aislar
por primera vez en 1960 a partir de Clostridium pastorianum en los Estados Unidos. Actualmente ya se
ha obtenido nitrogenasa de un gran nmero de microorganismos, incluido Rhizobium. Esta enzima est
formada por dos coprotenas distintas y complejas siendo la primera la dinitrogenasa (protena que
contiene Molibdeno y Hierro) y la segunda la dinitrogenasa reductasa (protena que solo contiene
hierro) y que a su vez ninguna se activa sin la presencia de la otra. Es de importancia saber que la vida
media de la enzima en contacto con el aire (oxigeno) es muy corta.
Una de las caractersticas de la enzima es que para poder actuar necesita de trifosfato de adenosina
(ATP), el cual es hidrolizado en difosfato de adenosina (ADP) con produccin de energa. Esta energa
producto del metabolismo de la glucosa obtenida en la fotosntesis, es utilizada para el rompimiento
del triple enlace existente entre tomos de nitrgeno, adems la enzima requiere la presencia de Mg+2
que se cree acta como puente de unin entre el componente II y el ATP.
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En la actualidad se conoce que la reaccin qumica completa de la fijacin del nitrgeno que se realiza
en una clula viva es la misma que la del proceso Haber-Bosch, ya que primero debe romperse el triple
enlace de la molcula de N2, para despus unirse los tres tomos de hidrgeno a cada tomo de
nitrgeno. En el proceso de Haber-Bosch, el hidrogeno se presenta en forma de gas molecular;
mientras que en la mayora de bacterias fijadoras de nitrgeno se extrae de molculas orgnicas como
la glucosa, que es el principal azcar producido en la fotosntesis. Los tomos de hidrgeno son
transferidos de la glucosa al nitrgeno a travs de una red de molculas intermedias.
3.4 Caractersticas de un organismo para fijar nitrgeno
Que la nitrogenasa represente de 1-2% de la protena total de la clula en una bacteria, la
enzima posee una alta demanda de hierro (Fe) y tambin requiere azufre (S) y molibdeno (Mo)
adicional. Cuando las bacterias fijadoras de nitrgeno se encuentran en ambientes carentes de
Mo, es obvio que no producirn nitrogenasa activa.
El requerimiento de energa es de 12 a 24 molculas de ATP para cada nitrgeno fijado,
impuesto energtico adicional del organismo
3.5 Ndulos y su funcin
Los ndulos son los encargados de crear un ambiente adecuado para los rizobios que consiste en la
resistencia a la desecacin y competencia con otras bacterias del suelo, adems los rizobios se rodean
con leghemogoblina (Fuchsman et al., 1976) y se benefician con los productos de la fotosntesis, en
consecuencia el nitrgeno fijado se elimina de los ndulos una vez realizada la fijacin. Segn
Bergersen y Briggs, 1958, las clulas de Rhizobium en el ndulo estn encerradas por membranas
derivadas de la planta
3.6 Simbiosis Rhizobium-Leguminosas (Fabceas) y Lectinas
Para Mara Jos Valarini, citada por Itamar y Lucio (1998); un gran nmero de plantas dicotiledneas
con diferentes familias, establecen asociaciones simbiticas especificas con bacterias fijadoras de
nitrgeno atmosfrico (N2). Las asociaciones mas estudiadas incluyen aquellas entre plantas de la
familia Fabaceae (Leguminosas) y bacterias gram negativas de la familia Rhizobiaceae.
Adems de Rhizobium; Bradyrhizobium y Azorhizobium tambin son capaces de inducir a la formacin
de ndulos en races de plantas de la familia Fabaceae. Algunas especies de Rhizobium nodulan en una
leguminosa especifica (Fred et al., 1932). Ejemplos: Rhizobium japonicum infecta a la soya; R. meliloti
especifico para la alfalfa y R. trifolii nodula en trboles. Las leguminosas especficas poseen protenas
propias de sus semillas -las Lectinas-. Segn hallazagos de Bohlool y Schmidt, 1974; Dazzo y Hubbell,
1975; Wolpert y Albersheim, 1976; la lectina de las semillas de soya que se encuentra tambin en la
punta de los pelos radiculares -sitio inicial de la infeccin- (Dazzo y Brill, 1977) se enlazaran con la
mayora de las cepas de R. japonicum.
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Las Fabaceae (lelguminosas) no son las nicas plantas que pueden obtener todo su nitrgeno de las
bacterias simbiticas que fijan N2, otros pequeos rboles y arbustos leosos presentes en nuestro
pas que nodulan incluyen a especies como Alnus (Aliso,) y Casuarina (Bond, 1974), aqu los organismos
responsables de la formacin de ndulos y la fijacin de N2, parece ser Frankia que tienen como
caracterstica la no formacin de leghemogoblina en los ndulos.
IV. METODOLOGA
Identificar a nivel de campo un asocio de una leguminosa de inters con una bacteria fijadora
de nitrgeno atmosfrico a travs de la presencia de ndulos
A nivel de laboratorio aislar en cultivo puro la bacteria encontrada en la simbiosis
A nivel de campo, sembrar a travs de semilla una planta de leguminosa inoculada con
Rhizobium como asocio; luego a travs del tiempo observar y discutir resultados
V. TAREA
Segn grupos organizados por afinidad, presentar en tubo a su auxiliar de laboratorio el cultivo puro de
la bacteria fijadora de nitrgeno aislada e identificada segn material proporcionado en el laboratorio
VI. BIBLIOGRAFA
1. Carlson, Peter S. 1990. Biologa de la productividad de los cultivos. 1. Edicin. Traduccin: Mercedes
de la Garza Curcho. AGT Editor, S.A. Mxico, D.F. 413 p.
2. Castillo Diaz, V.H. 2003. Aporte de nitrgeno al suelo por tres leguminosas nativas, en el ambiente
de invernadero. Tesis Ingeniero Agrnomo, Guatemala, Universidad de San Carlos. 55 p.
3. Chiocco, Viviana Mnica. 2016. Gua de Microbiologa Agrcola y Ambiental. Universidad de Buenos
Aires, Facultad de Agronoma. (en lnea) Argentina. Consultado 17 de mayo 2016. Disponible en
https://sites.google.com/a/agro.uba.ar/microbiologia-agricola-y-ambiental/
4. Ferrera Cerrato, Ronal; Alarcon, Alejandro. 2001. La microbiologa del suelo en la agricultura
sostenible. (en lnea) Ciencia Ergo Sum 8 (2) 175-183. Consultado 18 mayo 2016. Disponible en
https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=10402108
5. Ferrera Cerrato, Ronal; Prez Moreno, Jess. 1995. Agromicrobiologa: Elemento til en la
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Mxico. 233 p.
6. Molina Llarden, Mario. 1957. Microbiologa de suelos y tcnicas fitopatolgica. Editorial
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7. Navarro Blaya, Simon; Navarro Garca, Gins. 2000. Qumica Agrcola: El suelo y los elementos
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8. Soares de Melo, Itamar.; Lcio de Azevedo, J. 1998. Ecologa microbiana. 1. Edicin. Jaguarina:
Embrapa-CNPMA. SP. Brasil. 488p.
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