EL ANTIBIOGRAMA

Por qu realizar un antibiograma?

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana
que se sospecha es la responsable de una infeccin a uno o varios antibiticos. En efecto,
la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un
tratamiento antibitico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones
teraputicas individuales.
El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de las resistencias
bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiolgico, a escala de un servicio, un
centro de atencin mdica, una regin o un pas, es como puede adaptarse la
antibioterapia emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos de los antibiticos y
adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de
prevencin en los hospitales.
Hay pues un doble inters: Teraputico y epidemiolgico.
Cundo realizar un antibiograma?
Siempre que una toma bacteriolgica de finalidad dagnstica haya permitido el
aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infeccin.
Establecer esta responsabilidad exige una colaboracin entre el bacterilogo y el clnico.
En efecto, en ciertas circunstancias, el microbilogo no podr determinar con certeza que
el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clnicos que le aporta
el mdico. Por ejemplo, una bacteria no patgena puede ser responsable de la infeccin
de un enfermo inmunodeprimido o en un lugar determinado del organismo. La presencia
de signos clnicos puede ser tambin determinante para la realizacin de un antibiograma
(por ejemplo: la infeccin urinaria con un nmero reducido de grmenes).
Sensibilidad bacteriana a los antibiticos
La determinacin de la Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) es la base de la medida de
la sensiblidad de una bacteria a un determinado antibitico. La CIM se define como la
menor concentracin de una gama de diluciones de antibitico que provoca una inhibicin
de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que
permite establecer una escala de actividad del antibitico frente a diferentes especies
bacterianas.
Hay diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de
manera semicuantitativa, las CIM (mtodos manuales y mtodos automatizados o
semiautomatizados). Estos diferentes mtodos de rutina permiten categorizar una cierta
cepa bacteriana en funcin de su sensibilidad frente al antibitico probado. Esta cepa se
denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibitco.
Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS:

Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un

tratamiento a la doss habitual.

Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es

de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento.

Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto

teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de
la posologa).

Ciertas molculas son representativas de un grupo de antibiticos. Los resultados (S, I, R)

obtenidos con estas molculas pueden ser ampliados a los antibiticos del grupo, que en
ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina que se
ensaya y las restantes cefalosporinas de 1 generacin que no es necesario probar, ya
que el resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotina).
Este hecho permite ensayar un nmero reducido de antibiticos, sin limitar por ello las
posibilidades teraputicas.
Interpretacin de un Antibiograma
Certos mecanismos de resistencia se expresan dbilmente in vitro, cuando se inscriben
en el DNA bacteriano. Su expresin en el organsmo, en donde las condicones en cuanto
a medios son diferentes, expondra al riesgo de fracaso teraputico. Para evitar esto, el
antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir, a travs de la
comparacin de las respuestas para cada antibitico, un mecanismo de resistencia
incluso dbilmente expresado. As, gracias a la interpretacin, una cepa que aparece
como falsamente sensible ser categorizada como I o R (Ejemplo: Una cepa de Klebsiella
pneumoniae productora de BLSE puede aparecer sensible in vitro a las cefalospornas de
3" generacin. El resultado de Sensible debe ser corregido a Intermedio o Resistente, ya
que la utilizacin de estos antibiticos correra el riesgo de provocar un fracaso
teraputico).
Resistencia bacteriana.Cada antibitico se caracteriza por un espectro natural de actividad antibacteriana. Este
espectro comprende las especies bacterianas que, en su estado natural, sufren una
inhibicin de su crecimiento por concentraciones de su antibitico susceptibles de ser
alcanzadas in vivo. A estas especies bacterianas se les dice naturalmente sensibles a
dicho antibitico. Las especies bacterianas que no se encuentran incluidas dentro de
dicho espectro se denominan naturalmente resistentes.
El antibitico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes eliminando las
sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presin de seleccin. El aumento de la
frecuencia de las cepas resistentes va unido cas siempre al uso intensivo del antibitico
en cuestin.

La resistencia natural es un carcter constante de todas las cepas de una misma

especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales permite prever la
inactivdad de la molcula frente a bacterias identificadas (despus del
crecimiento) o sospechosas (en caso de antiboterapia emprica). En ocasiones,
constituye una ayuda para la identificacin, puesto que certas especies se

caracterizan por sus resistencias naturales. Ejemplos: Resistencia natural del

Proteus mirabilis a las tetraciclinas y a la colistina. Resistencia natural de la
Klebsiella pneumoniae a las penicilinas (ampicilina, amoxicilina).

La resistencia adqurida es una caracterstica propia de ciertas cepas, dentro de

una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio gentico ha sido
modificado por mutacin o adquisicin de genes. Contrariamente a las resistencias
naturales, las resistencias adquiridas son evolutivas, y su frecuencia depende a
menudo de la utilizacin de los antibiticos. En el caso de numerosas especies
bacterianas, y teniendo en cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas, el
espectro natural de actividad no es ya suficente para guiar la eleccin de un
tratamiento antibitico. En ese caso, se hace indispensable el antibiograma.

Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de

resistencia. En general, afecta a varios antibiticos dentro de una misma familia
(Ejemplo: La resistencia a la oxacilina en los estafilococos se cruza con todas los
-lactmicos). En ciertos casos, puede afectar a antibiticos de familias diferentes
(Ejemplo: La resistencia por impermeabilidad a las ciclinas se cruza con la
resistencia al coloranfenicol y al trimetoprima).

Una resistencia asociada es cuando afecta a varios antibiticos de familias

dferentes. En general, se debe a la. asociacin de varios mecanismos de
resistencia (Ejemplo: La resistencia de los estafiolococos a la oxacilina va
frecuentemente asociada a las quinolonas, aminoglicsidos, macrolidos y ciclinas).

Con el fin de tener en cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas y, por

consiguiente, proporcionar a los mdicos datos tiles cuando deben proceder a la
eleccin emprica de una antibioterapia, la nocin de espectro clnico completa la de
espectro natural. Definido para cada antibitico, este espectro clnico se incluye en el
Resumen de las Caractersticas del Producto (RCP). Este espectro integra no solamente
datos bacteriolgicos (espectro natural, frecuenca de las resistencias adquiridas), sino
tambin datos farmacocinticos y clnicos (las especies descritras en el espectro son
aquellas para las que se ha demostrado la actividad clnica del producto). El espectro
clnico se revisa regularmente para tener en cuenta la evolucin de las resistencias
adquiridas.

Mecanismos de la resistencia adquirida

El mecanismo gentico de adquisicin de una resistencia puede ser:

- La mutacin de un gen implicado en el modo de accin de un antibitico: Este

mecanismo afecta preferentemente a ciertos antibiticos: quinolonas, rifampicina, cido
fusdico, fosfomicina, antituberculosos y a veces cefalosporinas (Ejemplo: La resistencia a
las quinolonas por modificacin del ADN grasa en las enterobacterias).
- La adquisicin de genes de resistencia transferidos a partir de una cepa perteneciente a
una especie idntica o diferente: Ciertos Antibiticos estn particularmente afectados por
este mecanismo: -lactmicos, aminoglicsidos, tetraciclinas; cloranfenicol, sulfamidas
(Ejemplo: Resistencia a la ampicilina E. coli y del Proteus mirabilis).

El mecanismo bioqumico de la resistencia puede ser:

- una produccin por la bacteria de enzimas que inactivan el antibitico. Ejemplo:

Penicilinasa de los estafilococos, lactamasa de amplio espectro (BLAE) de las
enterobacterias.
- una modificacin del blanco del antibitico. Ejemplo: Modificacin de las Protenas de
Enlace con la Penicilina (PBP) de los estafilicocos resistentes a la oxacilina (llamados
estafilococos "Meti-R"). Neumococos resistentes a la penicilina.
- una impermeabilidad de la pared bacteriana por modificacin o por disminucion
cuantitativa de las porinas. Ejemplo: Pseudomonas aeruginosa resistente a la imipenem.
- un mecanismo de efusin: expulsin de la molcula por un transporte activo. Ejemplo:
Estafilococos resistentes a las tetraciclinas.
Pruebas de sensibilidad bacteriana in vitro
En la poca posterior al descubrimiento de las sulfonamidas y de la penicilina rara vez se
probaba la sensibilidad de los microorganismos a las drogas. Los pacientes eran tratados
en forma emprica y los microorganismos generalmente eran sensibles. Slo tras el
surgimiento de las cepas resistentes, poco despus de la introduccin de estos agentes,
los microbilogos comenzaron a probar la sensibilidad de un microorganismo infectante
frente a los agentes antimicrobianos.
En un primer momento, el mtodo estndar utilizado para las pruebas in vitro fue el de
dilucin en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo de la concentracin de
agente antimicrobiano necesaria para inhibir el desarrollo de un organismo dado.

Mtodo base de dilucin en caldo

En los mtodos de dilucin en caldo, base de casi todos los mtodos utilizados en la
actualidad, se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano,
generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendr el desarrollo
del microorganismo. El caldo ms comnmente usado para estas pruebas es el de
Mueller-Hinton suplementado con los cationes magnesio y calcio.

Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se

diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Luego
de la incubacin adecuada (usualmente de un da para el otro) se observa la turbidez de
los tubos que indicar desarrollo bacteriano. El microorganismo crecer en el tubo control
y en todos los otros que no contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir
su desarrollo. La concentracin de antibitico que presente ausencia de crecimiento,
detectada por falta de turbidez (igualando al control negativo), se designa como la
Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) (ver esquema ampliado).
Para medir la capacidad de un antimicrobiano para matar a un microorganismo (CMB) se
debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo sistema de dilucin
en caldo que para medir la sensibilidad.

Mtodo de difusin en agar

Una vez demostradas las grandes ventajas de las tcnicas de dilucin en caldo, el paso
siguiente, pensando sobre todo en poder realizar fcilmente pruebas de sensibilidad de un
microorganismo frente a mltiples antibiticos a la vez, consisti en buscar la manera de
aplicar la idea directamente a las placas de agar.
Las primeras pruebas se realizaron inoculando la superficie de una placa de agar con el
microorganismo en estudio, colocando pequeas cubetas (de metal o vidrio) sobre el agar
y agregando las soluciones de los diferentes antimicrobianos dentro de dichas cubetas.
Los agentes antimicrobianos difundan en el medio en forma radial alrededor de la cubeta
e inhiban el desarrollo del microorganismo en la zona donde su concentracin era
suficientemente alta. Las reas de inhibicin grandes indicaban una actividad
antimicrobiana ms efectiva.
Este mtodo fue modifcado en 1947 por Bondi y col. incorporando el agente
antimicrobiano a discos de papel de filtro. Fue un paso adelante gigantesco ya que el uso

de los discos de papel permita preparar un gran nmero de pruebas idnticas y

almacenarlas para uso futuro.
En 1966, despus de los estudios realizados por Bauer, Kirby, Sherris y Turk, ensayando
diferentes cepas bacterianas, el empleo de los discos de papel de filtro para las pruebas
de sensibilidad fue estandarizado y correlacionado definitivamente con las CMI
correspondientes.
Durante muchos aos, y a pesar de ser una tcnica puramente cualitativa, el mtodo de
difusin por disco (o mtodo Kirby-Bauer), en funcin sobre todo de su comodidad,
economa y fiabilidad, ha sido, y aun es, uno de los ms utilizados en los laboratorios de
todo el mundo.
El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su
superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibiticos. Se incuban las
placas durante 16-24 horas a 35C y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en
ellas. Se valora el dimetro de la zona de inhibicin que se forma alrededor de cada disco
y se compara con las referencias oportunas publicadas por el NCCLS. Con esta
referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente
(S, I, R) a cada uno de los antibiticos ensayados en las placas.
Antibiograma realizado por el mtodo de difusin en agar
En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el mtodo de
difusin en agar por medio de discos.
En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento
bacteriano y con seis discos de antibiticos. La zona de color claro que ocupa la mayor
parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Los crculos
negros que rodean a cinco de los seis discos marcan las zonas en que los respectivos
antibiticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a
estudio. El sexto disco (AM-10) no tiene a su alrededor halo de inhibicin lo que indica la
resistencia del microorganismo a ese antibitico.
La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad superior de la placa, permite
observar con ms detalle lo sealado en el prrafo anterior. Puede verse adems, con
gran claridad, la especial disminucin de la intensidad de crecimiento del microorganismo
en la zona interior del halo de inhibicin del disco de CTX-30, debido probablemente a la
aparicin de mutantes resistentes de dicho microorganismo capaces de soportar en
mayor medida que el resto el efecto inhibitorio del antibitico.

Pruebas de sensibilidad bacteriana in vitro

Mtodo de E-test

Es uno de los mtodos ms recientes que se han presentado en el mercado y resulta de

una curiosa combinacin de caractersticas de los mtodos anteriores. Se trata de una
tcnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en g/ml, ya
que se emplean tiras plsticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibitico
indicadas en una escala graduada sobre la propia tira.
Una de sus grandes ventajas, dadas sus caractersticas, es que resulta un mtodo ideal
para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio, incluyendo aquellos
llamados "fastidiosos" o los que tengan requerimientos especiales para crecer.
El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del
antibitico (o antibiticos) a ensayar. Tras la incubacin de 16-24 horas a 35C se
observan las placas y se valora la zona de inhibicin, de forma elptica, alrededor de cada
tira. La CMI se lee directamente observando el punto ms bajo de la elipse que presente
crecimiento.
Antibiograma realizado por el mtodo de E-test
En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el mtodo de Etest.
En la fotografa de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento
bacteriano y con dos tiras de E-test. La zona de color ms claro que ocupa la mayor parte
de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Las elipses ms
oscuras que rodean la parte superior de las tiras E-test marcan las zonas en que los
respectivos antibiticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del
microorganismo a estudio.
La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad inferior de la placa, permite
observar con ms detalle lo sealado en el prrafo anterior. Se aprecia perfectamente
como el pico de la zona ms estrecha de la elipse en la tira de MZ coincide, en la escala
graduada, con la franja entre las marcas de 1.5 y 2, lo que nos indicara que la CMI de
este antibitico (MZ) para este microorganismo sera de 2 g/ml.

Mtodos automatizados.-

La mayora de estos novedosos mtodos utilizan sistemas de microdilucin en medio

lquido sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en
los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador (mediciones por turbidez o
fluorescencia) o, en el caso de los sistemas ms sencillos, por simple lectura ptica del
tcnico a travs de un visor invertido de espejo.
Su manipulacin suele ser fcil y rpida, generalmente automatizada o semiautomatizada,
lo que los convierte en mtodos ideales para grandes volmenes de trabajo. Una de sus
grandes limitaciones es que slo ofrecen garanta para investigar microorganismos de
crecimiento rpido y que no tengan requerimientos especiales.
Antibiograma realizado por mtodo automtico
En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por un mtodo
automatizado.
En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una microplaca para
autoanalizador que incluye fase de identificacin y fase de antibiograma (panel
microScan). Las tres filas superiores de la microplaca son la zona de "identificacin" del
microorganismo, las cinco filas inferiores son el apartado "antibiograma".
La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad inferior izquierda de la
microplaca, permite observar con ms detalle algunas filas de pocillos con diluciones
seriadas de algunos antibiticos. La dosificacin de cada antibitico aumenta, en cada fila,
de izquierda a derecha (obsrvese los rtulos bajo cada pocillo: 8-16 ... 1-2-8-16 ... 2-832). Los pocillos que en la imagen muestran un color verde intenso tienen crecimiento
bacteriano, o sea, el antibitico en cuestin no impide el desarrollo del microorganismo a
estudio. Los pocillos transparentes marcaran los puntos de inhibicin de cada antibitico.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm
http://www.slideshare.net/maceya/sensibilidad-y-resistencia-bacteriana