Pirognio

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Pirognios so produtos do metabolismo de organismos, como bactrias e fungos, que
podem causar febre.[1] So lipdeos associados a molculas transportadoras que podem
ser polissacardeos ou peptdeos. Existem pirognios endgenos, geralmente produzidas
pelos leuccitos.
Na produo de medicamentos injetveis proibida a presena de pirognios, por isso
so realizados testes de controle de qualidade in vitro e in vivo.[1]

Ao
Ao passarem pelo hipotlamo aumentam o set point da temperatura corporal. s vezes,
pirognios exgenos estimulam os leuccitos a produzirem pirognio endgeno.
As endotoxinas so complexos de alto peso molecular, associado membrana
externa de bactrias Gram-negativas e constituem a mais significativa fonte de
pirognio para a indstria farmacutica. As endotoxinas podem conter lipdeos,
carboidratos e protenas, porm quando purificadas so denominadas de
lipopolissacardeos (LPS), para enfatizar a sua natureza qumica. Por isso, como nos
produtos farmacuticos podem ser encontradas unidades no purificadas nas fases
de processo ou nos produtos terminados, prefere-se a terminologia de endotoxinas.
Na edio atualizada do livro abordado de forma clara o conceito de pirognio, em
que se considera que todas as endotoxinas so pirognios, mas nem todos os
pirognios so endotoxinas. Os pirognios incluem qualquer substncia capaz de
provocar a resposta febril proveniente de um injetvel, que se encontra em noconformidade ou de uma infeco por Gram-negativo. O conceito tambm da
pirogenicidade apresentado como uma resposta sistmica do hospedeiro e
descritas as interaes que ocorrem na forma celular e molecular. O livro trata da
endotoxina proveniente de produtos parenterais no aspecto: estrutura e funo
biolgica, propriedades, presena no meio ambiente e deteco; o refinamento e
automatizao dos ensaios de LAL ("Limulus amebocyte lysate"), incluindo o
desenvolvimento e a validao dos testes; abordagem clnica de septicemia, alm
da produo e aspectos regulatrios da industria farmacutica americana. Os
captulos so organizados de forma cronolgica e apresenta-se bem ilustrado,
tornando fcil a compreenso do texto. O primeiro captulo detalha o histrico do
conhecimento da febre, do pirognio e da endotoxina. No segundo captulo so
apresentadas descrio geral, conceito e classificao de pirognio, de endotoxina e
da febre. A estrutura, funo biolgica e atividade da endotoxina so descritas
detalhadamente no captulo trs. No captulo quatro focada a resposta do
hospedeiro frente endotoxina. No quinto captulo abordam-se pirognios
microbianos, diferentes de endotoxina, os quais so provenientes de constituintes
de bactrias, fungos, vrus e outros, mas que, no entanto, so capazes de provocar
a febre no hospedeiro. No sexto captulo, o assunto anterior expandido e incluese frmacos que alteram os mecanismos termo-regulatrios. A filosofia e a prtica

de preveno da contaminao nos processos de produo de produtos parenterais

so discutidas no captulo sete. O oitavo captulo apresenta o captulo contexto
histrico do desenvolvimento da endotoxina como padro, incluindo discusso
ampla sobre o assunto e limitaes do padro. No nono captulo, apresenta-se a
atualizao do teste de pirognio "in vivo". O dcimo captulo descreve o histrico
da descoberta do teste LAL, seu mecanismo e sua aplicao, dando nfase
diversidade de testes que esto sendo pesquisados. No captulo 11 so descritos o
desenvolvimento do teste de LAL, sua validao e aspectos regulatrios. Nesse
captulo detalhado teste de endotoxina bacteriana, segundo os rgos oficiais,
como a Farmacopia Americana (USP) e a FDA ( Food Drug Administration), e
aspectos da harmonizao. O captulo dcimo segundo aborda a automao do
teste de LAL e as consideraes de dados cinticos. A importncia futura de
mtodos que podero substituir ou mesmo suplantar o teste de LAL so descritas
no captulo 13. No penltimo captulo so descritas a validao do processo de
despirogenizao, "pyroburden" e a remoo de endotoxinas nos processos de
fabricao de produtos farmacuticos. O captulo 14 discute as terapias atuais
frente septicemia oriunda de bactrias Gram-negativas. O livro dirigido aos
farmacuticos, pesquisadores e profissionais, que atuam no controle de qualidade.
Pela forma didtica que apresentado o assunto, essa publicao tambm
adequada como introduo ao conhecimento para alunos de graduao e psgraduao.

BLOG > Comparando o mtodo de LAL com o ensaio de pirognio em coelhos

Comparando o mtodo de LAL com o

ensaio de pirognio em coelhos
20th February 2015
O mtodo LAL (Lisado de amebcitos de Limulus) substituiu o ensaio de pirognios
que se realizava utilizando coelhos, tanto em experincias que ocorrem em pesquisas,
como na indstria farmacutica, alimentcia e outras, quando se quer comprovar o
contedo de endotoxinas que existe em uma amostra. As endotoxinas bacterianas
recebem este nome por serem substncias que formam parte da parede celular das
bactrias Gram-negativas que causam toxicidade nos humanos e em muitos animais.
Como veremos neste artigo, existem varias razes pelas quais o mtodo de LAL
utilizado para a deteco de endotoxinas bacterianas, preferencialmente ao mtodo com
coelhos.
O ensaio de pirognios em coelhos se baseia na medida do aumento da temperatura do
coelho ao ser injetado com um produto que pode conter um agente contaminante do tipo
pirognico. Os pirognios, como seu nome indica, so todas aquelas substncias que
causam o aumento da febre, tambm chamada pirexia. Os coelhos apresentam uma
elevao de temperatura ao entrar em contato com os pirognios, similar dos seres
humanos. Por este motivo e por serem animais utilizados nos laboratrios com diversas
finalidades foram escolhidos para se realizar este teste.

As desvantagens do teste de pirognios usando coelhos, para a determinao de

endotoxinas bacterianas so numerosas:

um ensaio demorado, pois se deve medir a temperatura do animal durante as 3

horas seguintes, depois da injeo, em intervalos aproximados de 30 minutos.

Devem ser usados 3 animais para cada soluo de teste, e estes no devem
apresentar elevao da temperatura nas duas semanas anteriores e no deve se
utilizar os mesmos animais at terem passado dois dias do ensaio. Alm disso,
devem-se escolher vrios animais para o grupo de controle que tenham uma
temperatura estvel j que se deve ter disposio uma grande quantidade de
coelhos para desenvolver o teste, sobretudo nas indstrias com grande volume
de produo e se pode considerar um teste trabalhoso.

Se for considerado que muitas outras substncias, tanto endgenas quanto

exgenas podem causar a elevao da temperatura nos coelhos, este um ponto
bastante limitante para se utilizar este ensaio como determinao de endotoxinas
em uma amostra. Embora seja difcil que este teste tenha como resultado um
falso positivo devido a substncias endgenas, pelo grande nmero de sujeitos
usados para o ensaio, muito comum que se oferea resultados errados quando
as amostras se encontram contaminadas por vrus, fungos ou outro tipo de
substncia que pode causar febre em todos os animais do ensaio.

um mtodo inadequado para determinar pirognios em medicamentos como os

esteroides, os utilizados em quimioterapia e outros que pertencem ao grande
grupo de substncias que quando so administradas ao organismo podem
responder com mecanismos que causam o aumento da temperatura, sendo esta,
outras dos grandes limitadores deste ensaio quando se esto fazendo pesquisas
com medicamentos ou se trata do controle de endotoxinas na indstria
farmacutica.

Uma desvantagem muito grande o fato de no poder quantificar o contedo de

endotoxinas presentes em uma amostra mediante este ensaio, que oferece
somente um resultado qualitativo.

Existem produtos, como aqueles que contm plasma sanguneo, onde as

endotoxinas se encontram em uma forma inativa que no produzem febre ao
serem inoculadas, porm, com o passar do tempo, devido aos processos
metablicos que o plasma sofre dentro do organismo aparece a toxicidade.
Nestas ocasies, o mtodo de pirognios em coelhos oferece um resultado falso
negativo.

Mtodo LAL
O mtodo LAL tem seu nome devido hemolinfa do caranguejo ferradura, cujo nome
cientfico Limulus Polyphemus. A hemolinfa deste caranguejo sofre um processo de
coagulao em presena de endotoxina bacteriana, que o pirognio que com uma
maior probabilidade pode contaminar os reagentes e o material de laboratrio. A
coagulao da hemolinfa do caranguejo Limulus foi descoberta na dcada de 60 e com o

decorrer dos anos, a mesma equipe de pesquisadores desenvolveu um ensaio para a

determinao qualitativa e quantitativa de endotoxinas usando um lisado de amebcitos
de caranguejo ferradura. Este ensaio rapidamente comeou a se impor como mtodo de
determinao de endotoxinas bacterianas, tendo como vantagens um limite baixo de
deteco, maior especificidade, um menor custo, uma menor variabilidade dos
resultados e a possibilidade de quantificar o contedo de endotoxinas. Ainda que este
ensaio tambm faa uso de animais, com suas consequncias ticas, a extrao da
hemolinfa no afeta a vida dos caranguejos.
Por todas as razes discutidas anteriormente, o ensaio de LAL o mtodo
recomendado atualmente pelas principais empresas farmacuticas e organismos
internacionais que regulam o controle de qualidade dos medicamentos e alimentos.
Existem casos com a vacina da hepatite B onde se continuou com o uso do ensaio de
pirognios em coelhos para a deteco de endotoxinas, porm se observou que
realizando o ensaio de LAL pelo mtodo gel clot e preparando as amostras de vacinas
de maneira adequada, mais conveniente utilizar o mtodo de LAL, inclusive nas
amostras onde existem interferncias que levam a resultados falsos. Enquanto o ensaio
de LAL especfico para endotoxinas e no detecta outras substncias pirognicas, em
vrios medicamentos as endotoxinas so o pirognio mais comum e o mais nocivo,
assim um resultado negativo do ensaio de LAL suficiente para determinar que a
amostra est apta para uso.
Desde que a necessidade de reagentes e kits para fazer o ensaio de LAL comeou,
diversas empresas em todo o mundo tm trabalhado nesta linha. A marca Pyrostar de
Wako se dedica exclusivamente a oferecer aos pesquisadores todos os reagentes,
equipes e materiais de laboratrio necessrios para a determinao de endotoxinas
bacterianas mediante o ensaio de lisado de amebcitos de Limulus. Para isso oferece
kits para a realizao do teste pelos diferentes mtodos de deteco que so gelificao,
mtodo turbidimtrico e mtodo colorimetria, tanto de maneira qualitativa, como
quantitativa

LINHA DE PRODUTOS LAL

Teste de Limulus PS

Toxinometer Srie ET- PYROSTAR ES-F/Plate com

6000
CPE