UNIVERSIDAD VERACRUZANA

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

DE ORIZABA

LICENCIATURA EN INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

Protocolo del trabajo a desarrollar

TTULO

Caracterizacin Molecular de especies de Vainilla (Vanilla spp.) con diferentes

centros de origen y pertenecientes al banco in vitro del Laboratorio de
Biotecnologa y Criobiologa Vegetal

Propuesto por:

Serafn Prez Contreras

Director del Trabajo:

Mara Teresa Gonzlez Arnao

Universidad Veracruzana

Responsable de la E.E:

Dra. Tania Garca Herrera

FCQ-Orizaba

Orizaba, Veracruz

No. Matrcula
S13003683

Septiembre, 2016

INDICE
1.
2.

Pgina

INTRODUCCIN .......................................................................................................... 3
MARCO TERICO ........................................................................................................ 4

2.1. Marcadores Moleculares .............................................................................................. 4

2.2. Propiedades Marcadores Moleculares ......................................................................... 5

2.3 Distintos Marcadores Moleculares ............................................................................... 5

2.3.1. RFLP ..................................................................................................................... 5

2.3.1 RAPD ..................................................................................................................... 6

3.
4.

5.
6.

2.3.2 ISSR ....................................................................................................................... 6

JUSTIFICACIN............................................................................................................ 7
OBJETIVOS.................................................................................................................... 8

4.1. Objetivo General .......................................................................................................... 8

4.2. Objetivos Especficos .................................................................................................. 8

HIPTESIS ..................................................................................................................... 8

METODOLOGA ........................................................................................................... 9

6.1 Material biolgico ......................................................................................................... 9

6.2. Extraccin del material gentico (DNA) ..................................................................... 9

6.3 Cuantificacin del material gentico .......................................................................... 10
6.4 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) .............................................................. 10
7.
8.
9.

6.5 Electroforesis .............................................................................................................. 11

FACTIBILIDAD DEL PROYECTO ............................................................................ 12

CRONOGRAMA DE TRABAJO................................................................................. 13
REFERENCIAS ............................................................................................................ 14

1. INTRODUCCIN
A finales del siglo pasado, el surgimiento de la reaccin en cadena de la polimerasa caus

un gran impacto en la biologa molecular, esta nueva tecnologa permiti el desarrollo de

tcnicas basadas en el principio de la replicacin del ADN, lo que ampli el panorama y

diversific la forma en que se estudia la evolucin y los cambios genticos de los
organismos.

Los marcadores moleculares o marcadores genticos, son segmentos de ADN identificables

dentro del genoma, con una ubicacin fsica, denominada locus. Los marcadores

moleculares se pueden basar en la hibridacin del ADN o en la PCR, cada uno con
caractersticas distintas. Los marcadores basados en la PCR se basan en la replicacin de

secuencias de inters, en esta categora encontramos los marcadores RAPD (Random

amplification of polimorphic DNA) e ISSR (inter simple sequence reapeat), que comparten

ciertas ventajas, como el hecho de no ser necesario conocer parte de la secuenciacin

neclotdica del individuo en estudio. Otra ventaja de gran importancia de los marcadores
ISSR, es su alto grado de repetitividad con respecto a los RAPD.

La caracterizacin de las especies basada en el anlisis del ADN mediante el uso de

mtodos moleculares, a diferencia de los marcadores morfolgicos y bioqumicos, no estn
influenciados por las condiciones ambientales en las que se encuentre el organismo, adems

tampoco se requiere el desarrollo completo del mismo para poder llevar a cabo esta
metodologa.

La caracterizacin de las especies resguardadas en un banco de germoplasma o de una

coleccin activa mantenida por cultivo de tejidos, es fundamental, pues resulta

indispensable conocer con exactitud el material que se almacena y/o con el que se trabaja, y
la opcin ms confiable para realizar esta tarea es mediante el uso de marcadores

moleculares. Por consiguiente, se propone la caracterizacin molecular de los diferentes

genotipos de vainilla (Vanilla spp.) pertenecientes a la coleccin de plntulas del

LADISER: Biotecnologa y Criobiologa Vegetal de la Facultad de Ciencias Qumicas,

adscrita a la Universidad Veracruzana.

2. MARCO TERICO

2.1. Marcadores Moleculares

Los marcadores moleculares son una herramienta necesaria en muchos campos de la

biologa como evolucin, ecologa, bio-medicina, ciencias forenses y estudios de

diversidad. Adems, se utilizan para localizar y aislar genes de inters. En la actualidad

existen varias tcnicas moleculares que nos permiten conocer cmo se encuentran las
proporciones de genes en las poblaciones naturales. Los diferentes tipos de marcadores se
distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci nicos o mltiples y son de
tipo dominante o co-dominante (Simpson, 1997; Eguiarte et al., 2007).

La principal fuente de informacin acerca de la diversidad gentica se basa en el uso de

marcadores morfolgicos, sin embargo, este mtodo presenta la desventaja de verse

afectado en gran medida por las condiciones ambientales en que se desarrolle el individuo
(Semagn, 2006; Onamu y Legaria, 2014)

Con el desarrollo de la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), los

anlisis moleculares han cobrado mucha importancia, al desarrollarse nuevos mtodos para
clasificar y diferenciar especies sin recurrir a los aspectos fenotpicos y centrndose ahora

en el uso del ADN como principal fuente de informacin (Oliva-Hernndez et al., 2007;
Avise, 2012). Adems, los marcadores moleculares son una alternativa complementaria

para realizar estudios de biodiversidad, ya que los resultados obtenidos, no se ven

influenciados por las condiciones ambientales. Los marcadores tipo RAPD e ISSR son
simples, econmicos y rpidos (Onamu y Legaria, 2014)

2.2. Propiedades Marcadores Moleculares

No existe un marcador molecular definitivo, es decir, no hay un marcador que revele toda
la informacin o la verdad absoluta del ADN, cada tipo de marcador tiene su alcance, y se
especializa en ciertas regiones de ADN (Zambrano-Blanco, 2015).

sin embargo, existen caractersticas que se espera cumplan en mayor medida todos los
marcadores. En primer lugar, los marcadores moleculares deben ser capaces de mostrar un
alto grado de polimorfismo del ADN, deben ser reproducibles en cualquier experimento de

laboratorio. Segn el tipo de aplicacin, el marcador debe ser capaz de presentar

codominancia, es decir, la capacidad de distinguir entre un homocigoto y un heterocigoto.
Entre mayor sea la distribucin y la densidad de cobertura del genoma, mejor ser la
evaluacin del polimorfismo (De Vicente y Fulton, 2004).

2.3 Distintos Marcadores Moleculares

2.3.1. RFLP
El Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin o RFLP es una tcnica

usada en los programas de investigacin desde los aos 1970. Inicialmente fue empleada
para el mapeo fsico de los adenovirus (Grodzicker et al., 1974) y en la construccin de un
mapa gentico de ligamiento para humanos (Botstein et al., 1980; Azofeifa-Delgado, 2006)

Los RFLP se definen como la variacin en la longitud de los fragmentos de ADN

producida por una endonucleasa de restriccin especfica a partir de ADN genmicos de

dos o ms individuos de una especie. Los RFLP se generan por re-arreglos o mutaciones

que dan lugar a la creacin o delecin de sitios de reconocimiento para las endonucleasas
especficas. Estas variaciones tambin pueden deberse a la presencia de ADN repetido con

diferente cantidad de copias sobre una regin cromosmica especfica, por ejemplo,
nmero variable de repeticiones en serie (Valadez y Kahl, 2000; Azofeifa-Delgado, 2006).

2.3.1 RAPD
La tcnica para detectar polimorfismo en el ADN amplificado al azar (RAPD) de las siglas

en ingls de Random amplification of Polymorphic DNA, es un mtodo basado en la PCR,

en el que se emplea un cebador corto (generalmente, de 10 bases) para amplificar porciones
annimas de ADN. Esta tcnica no busca ningn fragmento de ADN especfico, debido a
que el cebador se adherir al ADN patrn en secuencias complementarias de ubicacin

desconocida, consecuentemente, no es posible conocer la naturaleza de los productos

obtenidos. Los fragmentos de ADN as generados se separan y se detectan mediante

electroforesis.

El uso de esta tcnica es una alternativa sencilla, que requiere bajos costos por ensayo y que
no requiere de grandes cantidades de ADN para llevarse a cabo. Sin embargo, nicamente

presenta problemas en la reproductividad de los ensayos y solo denota informacin acerca

de la herencia dominante (De Vicente y Fulton, 2004).

2.3.2 ISSR
Los ISSR son una clase de marcadores genticos que permiten encontrar niveles de
variacin en regiones microsatlite que se encuentran distribuidas por todo el genoma.

Estas regiones consisten en repeticiones consecutivas de unidades de bases nitrogenadas

como (CT) o (CA), ubicadas entre secuencias no repetidas del genoma. La longitud de las

secuencias microsatlite suele ser altamente variables entre individuos debido a la alta tasa
de mutacin que sufren estas regiones (Zietkiewicz et al., 1994; Hammami et al., 2014).

Entre las ventajas de los marcadores de tipo ISSR, encontramos que al igual que con los

marcadores RAPD, estos tienen la capacidad de amplificar muchas regiones polimrficas

del DNA, inclusive en especies poco estudiadas, debido a que no se requiere conocer
secuencias especficas del organismo en cuestin, adems en comparacin con el RAPD, el
mtodo ISSR presenta una mayor repetitividad (Bornet y Branchard, 2001; Dje et al, 2010).

3. JUSTIFICACIN
El uso de tecnologas basadas en marcadores moleculares para la caracterizacin de

especies ha cobrado mucha importancia en los ltimos aos y complementado a los

mtodos morfolgicos que solan ser la alternativa con mayor incidencia para llevar a cabo
esta tarea. Los marcadores moleculares ofrecen una alternativa ms sofisticada en la
diferenciacin genotpica, en la evaluacin de la estabilidad gentica en material sometido a

la conservacin y en especial, a la conservacin in vitro, la cual se basa en el uso del cultivo

de tejidos y puede inducir variacin somaclonal. Por consiguiente, los marcadores

moleculares constituyen una herramienta de gran ayuda en el proceso de evaluacin de
distintos mtodos de conservacin. Adicionalmente, los marcadores moleculares sirven

para la caracterizacin de especies mantenidas en bancos de germoplasma y /o

pertenecientes a colecciones activas.

Los marcadores ISSR son una opcin de gran realce con respecto a otros debido a que su
uso es relativamente sencillo y rpido, adems de ser de bajo costo, y presentar una
cantidad de informacin (polimorfismos del ADN) considerablemente alta.

La identificacin de especies de vainilla pertenecientes a la coleccin activa del LADISER:

Biotecnologa y Criobiologa Vegetal, tiene como principal fin la obtencin de perfiles

electroforticos de las distintas especies que se mantienen sistemticamente a travs del

cultivo de vitroplantas, algunas con diferente centro de origen y/o de obtencin. La
informacin obtenida ser de gran impacto y se requiere como auxiliar de identificacin del
material que se usa en las investigaciones que actualmente se realizan en este laboratorio.

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo General

Caracterizar molecularmente material in vitro de vainilla (Vanilla spp.) perteneciente a la

coleccin de plntulas del LADISER: Biotecnologa y Criobiologa vegetal.

4.2. Objetivos Especficos

Realizar la extraccin de DNA de las distintas especies y genotipos de vainilla

Realizar la multiplicacin de las secuencias inter satlite (ISSR) mediante la

reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Analizar el resultado de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa

Procesar la informacin y crear una base de datos

5. HIPTESIS
Los perfiles electroforticos obtenidos con la aplicacin de marcadores moleculares ISSR,

permitirn caracterizar las diferencias entre las especies de vainilla (Vanilla planifolia) a
partir de los porcentajes de polimorfismos identificados.

6. METODOLOGA

6.1 Material biolgico

Se emplearn brotes de vainilla obtenidos in vitro de distintas especies (Vanilla Planifolia,

V. Insignis y V. Odorata). Estos brotes se generaron despus de varios subcultivos de las

vitroplantas en el medio de multiplicacin MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado

con 2 mg L-1 de BAP (bencilamino purina, Sigma). Adicionalmente, se analizar material
proveniente de diferentes lugares de origen (Costa Rica, El Salvador y el suministrado por
el Banco de germoplasma de Puebla perteneciente a la Red Vainilla), as como se

compararn dos formas de obtencin de plantas: germinacin in vitro de semillas

inmaduras o propagacin vegetativa por el cultivo de microestacas.

6.2. Extraccin del material gentico (DNA)

Para la extraccin del ADN se usar el siguiente protocolo, que es una modificacin del
protocolo original creado por Doyle y Doyle (1987).

1. Precalentar Buffer a 65C y agregar 1000uL a un tubo nuevo

2. En un mortero, triturar alrededor de 0.2 g de tejido con nitrgeno lquido hasta

obtener un polvo fino.

3. Agregar 1 ml de buffer CTAB y vaciar a un tubo nuevo, agregar 5uL de

mercaptoetanol.

4. Incubar a 80C por 60 min, mezclar a intervalos de 10 min.

5. Centrifugar 10 min a 10,000 RPM.

6. Rescatar sobrenadante (aproximadamente 600uL), pasar a tubo nuevo, agregar

700uL cloroformo-alcohol isoamilico (24:1), mezclar durante 10 min.

7. Centrifugar 10 min a 10,000 RPM. Extraer 500uL de sobrenadante y volver a lavar

con 700uL de cloroformo-alcohol isoamilico, mezclar durante 5 min.

8. Centrifugar por 10 min a 10,000 RPM. Transferir a un tubo nuevo 400uL de

sobrenadante y agregar 600uL de etanol absoluto frio (-20C) y colocarlos a -20C

durante 2 horas.

9. Centrifugar por 10 min a 10,000 rpm, decantar evitando perder la pastilla.

9

10. Lavar con isopropanol al 70% (600uL) centrifugar por 10 min a 10,000rpm
11. Decantar y dejar secar la pastilla por 80 min a temperatura ambiente
12. agregar 100uL de agua de ampolleta

13. Cuantificar mediante espectrofotometra

Tabla 1 Composicin del buffer de extraccin (200ml)
Reactivo

Concentracin

Cantidad (g)

NaCl

1.42 M

16.37

Tris HCl (pH 8)

100 mM

2.42

cido Ascrbico

5 mM

0.176

CTAB

EDTA (pH 8)
PVP

2%

20 mM
2%

1.49
4

6.3 Cuantificacin del material gentico

Despus de la purificacin, el ADN ser cuantificado usando un espectrofotmetro Genesys

10S UV-VIS (Thermo Scientific) y su calidad ser evaluada por electroforesis sobre un

gel de 1% agarosa en una solucin buffer 1 Tris borate EDTA (TBE) en 90 V por 90 min

para permitir una resolucin adecuada. El gel ser teido con bromuro de etidio (SigmaAldrich) con una concentracin final de 0.5 g/ml, visualizado bajo luz UV y fotografiado

usando un fotodocumentador system AlphaImager EC (Alpha Innotech Corporation,

ChemiImager Ready).

6.4 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Se utilizarn un total de diez cebadores ISSR para evaluar la diversidad gentica (Tabla 2).
Las amplificaciones de PCR se realizarn en una reaccin de 25 l que contendr: 10 PCR

buffer (Biotools, B&M Labs, SA, Madrid, Spain), 50 mM MgCl2 (Biotools, B&M Labs,

SA), 10 mM dNTPs (Promega, Madison, WI), 1 U de Taq DNA polymerase (Biotools,

B&M Labs, SA), 5 mM primer (UBC), y 50 ng DNA. La amplificacin de ADN se llevar
a cabo en un Termociclador (Axygen, Maxygene II) y la PCR consistir en 35 ciclos

10

comprendiendo ciclos de desnaturalizacin a 94C por 4 min, extensin a 94C por 50 s,

alineamiento a 72C por 1.3 min, y extensin step a 72C por 10 min.
Tabla 2. Cebadores ISSR a utilizar para la caracterizacin molecular.
Cebador

UBC-809

Temp. de

alineamiento (C)
45

T06

50

UBC-836

50

UBC-840
UBC-812
UBC-825
UBC-808

50
50
51
52

TO5

54

UBC-857

57

CO7

56

6.5 Electroforesis

Los fragmentos de ADN sern separados en un gel al de 3% agarosa (United States

Biochemicals) usando buffer TAE 1x y teido con bromuro de etidio. La electroforesis se

realizar a 90 mV por 90 min. Los geles sern fotografiados usando un fotodocumentador
system AlphaImager EC (Alpha Innotech Corporation, ChemiImagerTM Ready).

11

7. FACTIBILIDAD DEL PROYECTO

Recursos humanos: Serafn Prez Contreras, M.C. Miriam

Cristina Pasteln Solano, Mara Teresa Gonzlez Arnao.
Insumos varios:

Factibilidad tcnica

Factibilidad financiera

Material biolgico: distintas especies de vainilla

Instrumentos: micropipetas, agitadores magnticos,

pinzas, etc.

Utensilios de plstico: tubos de microcentrifuga, tubos

falcon, puntas, etc.

Desechables: guantes, cubrebocas, servitoallas, etc.

Origen de los recursos para el trabajo: adquiridos por el

proyecto CONACT 166332 y con recursos propios
Equipo

Autoclave (FELISA FE-399)

Campana

de

(LABCONCO)

flujo

Espacio de trabajo

laminar Laboratorio 101

Potencimetro (DENVER UB-10)

Factibilidad de

Infraestructura

Laboratorio 101

Balanza analtica (VELAB)

Microondas

Incubadora (BENCHMARK B2100)

Laboratorio 101

Laboratorio 101

Laboratorio 101

Laboratorio 101

Espectrofotmetro UV/VIS (Genesys Laboratorio 101

10S)

Micro centrfuga

Laboratorio 101

Cmara electrofortica (BIO-RAD)

Laboratorio 101

Termociclador (Maxygene II)

Transiluminador

Laboratorio 101

Laboratorio 101

12

8. CRONOGRAMA DE TRABAJO
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Actividades
Ao

1. Revisin

Bibliogrfica

Oct

Nov

Dic

Ene

Feb

10

Cuantificacin

4. PCR

5. Electroforesis

7. Redaccin

8. Entrega borrador
9.Preparacin

May

10

10

Disertacin

10

15

Disertacin

__________________
Director de TR. Dra. Mara Teresa
Gonzlez Arnao

Abr

6. Edicin de geles

Oral

Mar

Sep

DNA

10.

2016

Valor estimado

Ago

2. Extraccin DNA
3.

2015

Meses

20

5
x

Total

30 de septiembre, 2016
Fecha de Entrega

10
100

____________________
Serafn Prez Contreras

13

9. REFERENCIAS

Avise, J. C. 2012. Molecular Markers, Natural History and Evolution. Springer Science
& Bussines Media. 511p.

Azofeifa-Delgado A. (2006). Uso de marcadores moleculares en plantas; aplicaciones

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Bornet, B., Branchard, M., 2001. Nonanchored intersimple sequence repeat (ISSR)
markers: reproducible and specics tools for genome ngerprinting. Plant Mol.
Biol. Rep. 19, 209215.

Botstein, D.; White, R.; Skolnick, M.; Davies, R. 1980. Construction of a genetic
linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American
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temperature sensitive mutations of adenoviruses. In: Cold Spring Harbor

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N.Y., USA. Cold Spring Harbor Press. 39:439-449.

14

Hammami, R., Jouve, N., Soler, C., Frieiro, E., Gonzlez, J. M., 2012. Genetic diversity
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its close relatives B. stacei and B. hybridum (Poaceae). Plant Systematics and
Evolution. Pgs. 2029-2040.

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Hernndez, J. (2007) importancia de la caracterizacin gentico-molecular en

levaduras en bebidas alcohlicas: el caso del mezcal. Aprovechamiento
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