Scenarri Terminale Biocarburant Def

BIOTECHNOLOGIES
Terminale STL-Biotechnologies
LES BIOINDUSTRIES
LES AGROCARBURANTS
DOMAINE /
THME
Les Bioindustries / Agro-carburants
REPRE DANS
LANNE
Avril / Mai
AT n1 :
Savoir effectuer un dnombrement direct en cellule de Malassez.
Savoir raliser exprimentalement un suivi de croissance bactrienne
en milieu non renouvel et exploiter une courbe de croissance pour
en dduire les paramtres cintiques.
tre capable de raliser le dosage dune substance dintrt avec
talon.
PR-REQUIS
AT n2 :
Connatre la structure de lADN bicatnaire.
Connatre le mcanisme de la rplication de l'ADN.
Savoir que des modifications du patrimoine gntique dun
organisme permettent de lui confrer de nouvelles potentialits.
Savoir pipeter des microvolumes.
Savoir analyser les risques daltration du matriel biologique.
Savoir prendre des mesures adquates de protection du matriel
biologique.
OBJECTIFS AT1
AT n1 : Suivi de fermentation et de production dthanol

(3 sances)
Problmatique :
La mlasse de la betterave sucrire est-elle utilisable par la
levure comme milieu de culture pour produire de lthanol ?
Mettre en uvre une technique de gnie fermentaire.
Mettre en uvre un suivi de fermentation en conditions anarobies
par des levures et tudier linfluence de substrats diffrents sur le
rendement de la production dthanol.
Mettre en forme et traiter les donnes et rsultats exprimentaux
bruts collects, lors du suivi de croissance de Saccharomyces
cerevisiae, dans le cadre de la problmatique dfinie : la mlasse estelle un bon milieu de culture pour produire de lthanol ?
Veiller la mise en uvre des procdures de scurit lies aux
activits de microbiologie et biochimiques.
Lyce STANISLAS Villers-Ls-Nancy
BIARDEAU DEMOUSSEAU HAZART PELLERIN
BIOTECHNOLOGIES
AT n2 : Mise en vidence dun gne dintrt dans le gnome de

Saccharomyces cerevisiae
(2 sances)
Situation :
OBJECTIFS AT2
Des levures ont t modifies gntiquement par insertion dun

gne leur permettant de produire correctement de lthanol en
prsence des fortes teneurs en substances non glucidiques,
prsentes dans la mlasse. Le but est de vrifier la prsence de ce
gne.
Matriser la ralisation dune PCR.
Identifier le rle des diffrentes molcules impliques (ADN matrice,
amorces, enzyme, nuclotides).
Analyser les rsultats aprs lectrophorse dun amplifiat.
Appliquer les bonnes pratiques de laboratoire.
Investigation pour la mise en place de la problmatique.
DMARCHE
Dductive pour lanalyse des rsultats.
Introduction : 45 minutes.
AT n1 : Sance 1 (3h) + Sance 2 (4h) + Sance 3 (1h)
DURE
AT n2 : Sance 4 (3h) + Sance 5 (1h)

En groupe effectif rduit
Salle quipe pour la microbiologie + salle de biologie molculaire
BIOTECHNOLOGIES
BIOTECHNOLOGIES
LES BIOINDUSTRIES : LES AGROCARBURANTS

INTRODUCTION
FICHE DE PRSENTATION DE LA SANCE D'INTRODUCTION
TEMPS
CONTENUS
ACTIVITS PRINCIPALES DE LENSEIGNANT
Mise en place dune situation

permettant de dboucher sur la
problmatique :
15
minutes
15
minutes
Prsentation de la raction de fermentation

ralise par Saccharomyces cerevisiae pour
produire du biothanol
partir de saccharose.
ACTIVITS PRINCIPALES DE
LLVE
Cible lattention des lves.
Observation de la photo.
Oriente la discussion :
toutes
les
stations-services
possdent-elles
des
pompes
biothanol ?
- quelle est lintrt de ce produit ?
Discussion sur lintrt du

produit :
Le biothanol commence
jouer un rle de plus en
plus important en tant que
source
dnergie
en
remplacement des produits
ptroliers.
Explique
produit.
coute.
comment
le
biothanol
est
O trouver une source carbone telle
que le saccharose, renouvelable,
disponible en grande quantit et bon
march ?
Rflexion
dides.
Recherche
HYPOTHSE :
La mlasse de la betterave sucrire est-elle utilisable par la levure comme milieu de culture pour produire de lthanol ?
- comment vrifier cette hypothse ?
15
minutes
Recherche d'ides.
MISE EN COMMUN DES PROPOSITIONS RETENUES :

tudier la croissance de saccharomyces cerevisiae en prsence de saccharose seul
BIOTECHNOLOGIES
et sur mlasse (= mlange doses, de drivs doses et de substances non glucidiques) brute et plus ou moins purifie.
Comparer les productions de biomasse et dthanol.
BIOTECHNOLOGIES
LES BIOINDUSTRIES : LES AGRO-ARBURANTS

PRODUCTION DTHANOL PAR Saccharomyces cerevisiae EN
FERMENTEUR,
ET TUDE DE LINFLUENCE DU MILIEU DE CULTURE
SUR LA FERMENTATION ALCOOLIQUE
POINTS CONNUS ET MATRISS
NOTIONS THORIQUES
TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES ET
BIOCHIMIQUES
- Culture en milieu non renouvel et culture
- Procdures de scurit inhrentes aux
continue.
manipulations en milieu strile.
- Suivi de croissance bactrienne et
- Dnombrement en hmatimtre.
dtermination des paramtres cintiques.
- Dnombrement en surface par talement.
- Cintique dune raction enzymatique.
- Suivi turbidimtrique de la croissance
- Utilisation des enzymes en biochimie
bactrienne.
analytique.
- Dosage enzymatique de substrats - Mthode
en point final.
POINTS RENFORCS PAR LAT

Techniques microbiologiques :
- Utilisation dun biofermenteur.
Autonomie du travail :
- Dnombrement par la mthode des spots.
- Organiser au sein dune quipe son travail.
- Traitement et exploitation informatiques de
- Mettre en uvre de nouvelles techniques
donnes exprimentales.
microbiologiques et biochimiques.
- Utiliser la documentation disponible.
Techniques biochimiques :
- Dosage enzymatique de lthanol
BIOTECHNOLOGIES
POINTS VALUS
Comptences values
A / EA / NA
Note
Organiser son poste de travail

1.1 Organiser correctement son poste et son temps de travail *
/2
1.2 Ranger correctement son poste de travail *
/1
Mettre en uvre des techniques de gnie fermentaire

2.1 Prparation du biofermenteur et strilisation
/0,5
2.2 Suivi correct des indicateurs de croissance (mesure de densit

optique)
/2
2.3 Transfert strile du milieu de culture dans la cuve fermentaire aprs

autoclavage
/0,5
Mettre en uvre une technique de dosage de lthanol produit au cours de la

fermentation alcoolique
3.1 Autonomie de la ralisation
/0,5
3.2 Rponse adapte aux alas de mise en uvre
/1
Mettre en uvre des techniques de dnombrement (par mthode des spots ou par
hmatimtre)
4.1 Prparer ou ajuster soigneusement une dilution en srie*
/1
4.2 Ensemencer convenablement des milieux Sabouraud lors dun

dnombrement en surface ou raliser une mise en hmatimtre.*
/2
4.3 Bonne conformit des rsultats lis au dnombrement
/2
Analyser, interprter et prsenter les rsultats exprimentaux

5.1 Mise en forme exploitable des donnes et rsultats (tableaux
raliss par informatique, graphes complets)*
/3
5.2 Traitement correct des donnes (calcul de

microbiennes, de concentrations massiques dthanol)
/2
concentrations
5.3 Etablir une liste de matriel*
/0,5
5.4 Pertinence de linterprtation et des conclusions

Notation en tout ou rien*
A, acquis / EA, en cours dacquisition / NA, non acquis
/2
Scurit :
Bonus :
/20
BIOTECHNOLOGIES
LES BIOINDUSTRIES : LES AGRO-ARBURANTS

PRODUCTION DTHANOL PAR Saccharomyces cerevisiae EN
FERMENTEUR,
ET TUDE DE LINFLUENCE DU MILIEU DE CULTURE
SUR LA FERMENTATION ALCOOLIQUE
Introduction :
Les fermenteurs et leurs applications :
Le domaine des biotechnologies utilise les capacits de synthse des micro-organismes produire
industriellement de nombreuses substances. Les applications sont diverses : production de mdicaments, de
vaccins, dadditifs alimentaires, dinsecticides biologiques, de levures de boulangerie.
Une application plus rpandue ces dernires annes, concerne la valorisation des dchets, telle que la mlasse
produite partir de la betterave sucrire. Le but de notre tude est :
de montrer que des levures, telles que Saccharomyces cerevisiae, sont capables de se
multiplier en utilisant ces dchets ;
de montrer linfluence de la prsence ou non dimpurets ou de produits non glucidiques
dans la mlasse, sur la croissance de Saccharomyces cerevisiae ;
de montrer linfluence de la prsence ou non dimpurets ou de produits non glucidiques
dans la mlasse, sur la production de produits finaux obtenus, tel que le biothanol,
forms au cours de la fermentation alcoolique.
Le procd batch, ou culture discontinue :

Ce procd utilis pour ces travaux pratiques, prsente un mme volume de milieu de culture.
On parle galement de milieu non renouvel. Les micro-organismes sy multiplient
(augmentation de la population cellulaire) et y accumulent leurs produits. Le milieu est ensuite
retir du fermenteur pour subir les traitements visant la purification des substances
recherches (dans notre cas, le biothanol). Il y a arrt du fermenteur entre chaque culture do
le terme batch.
Les activits exprimentales proposes sont organises en 3 sances :

- Lors de la premire sance, les lves se rpartissent par groupe de 4. Le groupe
travaille avec un milieu de culture base de saccharose pure, de mlasse plus ou
moins compose dimpurets ou de mlasse brute (MS, M20, M40, MB).
- Lors de la deuxime sance, chaque membre dun groupe travaille sur un atelier A,
B, C ou D diffrent. Chaque lve doit avoir abord les 4 ateliers proposs au cours
de cette 2ime sance.
- Lors de la troisime sance, une mise en commun de lensemble des rsultats est
ralise avec lensemble de la classe. Une rflexion pourra tre mene par la classe
entire, par groupe de 4 lves travaillant sur un mme milieu ou individuellement.
BIOTECHNOLOGIES
1. PRINCIPE
Saccharomyces cerevisiae est place dans des conditions de croissance particulires, favorisant
la fermentation alcoolique selon la raction globale :
Glucose
2 thanol + CO2
Quatre milieux diffrents et riches en nutriments assimilables ou non sont tests.

Les conditions de tempratures sont convenables.
Les conditions doxygnation sont favorables.
La production dthanol est favorise lorsque la biomasse est suffisante, la souche tant place
en anarobiose.
Diffrentes mesures permettront de suivre lvolution de la biomasse :
- la mesure turbidimtrique du milieu au spectrophotomtre une longueur donde de 650
nm ;
- le dnombrement en hmatimtre, par comptage en cellule de Malassez ; ce
dnombrement permet de dterminer la biomasse totale et la biomasse viable aprs coloration
diffrentielle
- le dnombrement en surface sur milieu Sabouraud, par la mthode des spots ; ce
dnombrement permet de confirmer les rsultats obtenus par lhmatimtre.
Un dosage enzymatique de lthanol produit sera effectu en parallle.
2. MODE OPRATOIRE
Lorganigramme incomplet ci-dessous rsume les principales tapes des oprations effectuer
sur les trois jours.
BIOTECHNOLOGIES
Cette manipulation ncessite un suivi de fermentation pendant 3h. La prparation des

chantillons prlevs, lestimation par turbidimtrie de la biomasse et la numration en
hmatimtre doivent tre raliss sans retard, ds lobtention des prlvements. Le
dnombrement par mthode des spots ainsi que le dosage dthanol peuvent tre raliss
ultrieurement.
- laide des modes opratoires proposs par le professeur, complter le diagramme
dorganisation des travaux effectuer.
2. MONTAGE EXPRIMENTAL ET STRILISATION DU MATRIEL

2.1. ANALYSE DU MONTAGE ET DES MILIEUX DE CULTURE
Le fermenteur a pour fonction dassurer un environnement favorable la croissance des microorganismes et la production des biomolcules. Il doit donc tre capable de rsister aux actions
corrosives des substances quil est susceptible de contenir, aux variations de pression et aux
contraintes mcaniques conscutives lagitation.
La fermentation alcoolique par Saccharomyces cerevisiae seffectue dans une srie de petits
bioracteurs de 750 mL de volume total. Ces racteurs dans lesquels seront ralises les
cultures en anarobiose, sont disposs sur une rampe dagitation dans une tuve 30C.
2.2. PRPARATION DU FERMENTEUR STRILISER

Un groupe de 4 lves travaille avec un bioracteur (P1 P8).
Les petits bioracteurs (P) sont quips dun systme de prlvement par le bas.
BIOTECHNOLOGIES
Fermer lextrmit du tuyau de prlvement laide dun coton card puis quiper le
systme dune pince de Mohr.
Couvrir lensemble du systme de prlvement avec du papier aluminium.
2.3. PRPARATION DUN MILIEU DE CULTURE STRILISER

Le tableau ci-dessous rappelle les caractristiques des racteurs et des milieux utiliss :
COMPOSITIONS DES
MILIEUX
(Source principale de
carbone)
S
Milieu saccharose pur
4 en salle P1 P4 en salle
RACTEUR
M2 Milieu mlasse + 20 %
202
202
750 mL
0
dimpurets
EN
Milieu mlasse + 40 %
4 en
ANAROBIOS
P5 P8 en salle M40
dimpurets
salle
E
203
203
MB
Milieu mlasse brute
MATRIEL et
CONDITIONS
NOMBRE
S
IDENTIFICATIO
N DES
BIORACTEURS
CONDITIONS
Faible agitation
Milieu recouvert
dhuile de vaseline
Tculture = 30C
Un groupe de 4 lve travaille avec un milieu de culture initial (S, M20, M40, MB).
Couvrir les milieux de culture prsents sur chaque paillasse avec du papier aluminium.
Porter le milieu et le bioracteur jusqu lautoclave, accompagn du professeur. La
strilisation des milieux et des bioracteurs seffectue pendant 1h30, 120C grce la
technique dautoclavage.
BIOTECHNOLOGIES
2.4. PRPARATION DUNE PRCULTURE

- laide dune pipette Pasteur ferme, prlever 5 colonies de Saccharomyces cerevisiae
isoles sur Sabouraud et ensemencer 100 mL de bouillon (milieu Sabouraud). Ceci constitue
une prculture.
- Sachant quune unit dabsorbance (UA) quivaut 1,3.10 7 cellules.mL-1, estimer la concentration de
cellules.mL-1 prsentes dans la prculture par mesure dabsorbance 650 nm.
- Afin de respecter la limite de linarit (0,7 UA), ajuster la suspension par dilution en milieu Sabouraud.
2.5. VOLUME DE PRCULTURE INTRODUIRE DANS LE BIO

FERMENTEUR
partir de cette premire valuation, dduire le volume dinoculum ajouter dans le fermenteur en Jour 2.
Pour une fermentation alcoolique, le volume dinoculum doit tre compris entre 5 et 10 % du
volume total du bouillon de culture et le nombre de levure doit tre en dbut de fermentation, de
lordre de 1,5.106 cellules.mL-1.
BIOTECHNOLOGIES
3. MISE EN PLACE DES GROUPES DE TRAVAIL

RPARTITION DES LVES PAR GROUPE DE TRAVAIL :
Groupe 1
Suivi sur milieu S
Suivi de fermentation de Saccharomyces cerevisiae

Groupe 2
Groupe 3
Suivi sur milieu M20
Suivi sur milieu M40
Groupe 4
Suivi su milieu MB
RPARTITION DES LVES PAR ATELIER :
prlvement
Suivi de fermentation de Saccharomyces cerevisiae

Atelier A
Atelier B
Atelier C
Atelier D
Prlvement
Dosage dthanol
Dnombrement des levures

en cellule de Malassez
Dnombrement en surface des

levures sur glose Sabouraud
Suivi de biomasse
par mesure de DO
1
1
1
1
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
2
2
2
2
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
3
3
3
3
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
4
4
4
4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
Gr1
Gr2
Gr3
Gr4
BIOTECHNOLOGIES
DOCUMENT PROFESSEUR
BIOTECHNOLOGIES

AT N1 : PRODUCTION DE BIOTHANOL
FICHE DE PRSENTATION DE LA SANCE N1
TEMPS
LENSEIGNANT
CONTENUS
ACTIVITS PRINCIPALES DE LLVE
Prsentation de la situation :
On se propose de suivre, laide de
5
plusieurs bioracteurs, linfluence de
minutes sources carbones (saccharose, mlasse)
sur la fermentation alcoolique par une
levure, Saccharomyces cerevisiae.
40
minutes
10
coute.
Distribue
un
contextualis.
coute.
Complte
un
diagramme
dorganisation
spatio-temporelle
(plan de travail des sances sur deux
jours), fonctionnelle et pratique.
Complte des documents.
mode
opratoire
Sorganise en groupe de travail :

Oriente
les
lves
dans
la - Sance 1 : 1 groupe de 4 lves travaille
Distribution et lecture du protocole du AT
constitution de groupes datelier
sur 1 milieu de culture prdfini.
n1
(manipulations ralises en sance - Sance 2 : 1 groupe de 4 lves travaille
2) :
sur 4 ateliers diffrents. Au
- Atelier A : Prlvement - Dosage
cours de la culture, 4 5
dthanol.
prlvements sont effectus.
- Atelier B : Dnombrement de levures par
Les lves dun mme groupe
cellules de Malassez.
change datelier.
- Atelier C : Dnombrement de levures en
surface - Mthode des spots.
- Atelier D : Suivi de la biomasse par
turbidimtrie.
Manipulations :
Prsente les fermenteurs de 750 mL

Prpare le fermenteur :
BIOTECHNOLOGIES
prparer avant lautoclavage.

minutes
Prparation du fermenteur
et des annexes
TEMPS
CONTENUS
110
minutes
Manipulations :
Vrifie lutilisation conforme des

matriels de strilisation et le
respect des procdures de scurit.

Accompagne les lves jusqu lautoclave.
Prparation de
linoculum
Ferme les entres et sorties du

bioracteur.

Accompagn du professeur, strilisation par
autoclavage du dispositif et du milieu de culture
du fermenteur, pendant 1h30.
Contrle le respect de la limite de linarit lors de

Prparation linoculum :
la mesure de labsorbance ...
- mise en suspension la levure et valuation de la
concentration par absorptiomtrie (ceci constitue une
subculture).
- ajustement de la suspension par dilution.
- dtermination partir de cette premire valuation du
volume dinoculum ajouter dans le fermenteur en
Oriente les lves en donnant des consignes deuxime sance.
supplmentaires concernant :
Elaboration de lorganisation pratique des
activits proposes et des calculs effectuer :
- Atelier A : la recherche de la longueur donde de
travail laide du spectre dabsorption de lthanol.
- Atelier A : prendre connaissance de la dmarche
Identification des ractions principales intervenant dans suivre pour raliser le dosage dthanol ;
le protocole de dosage de lthanol.
rpond aux questions poses ;
dresse une liste de matriel.
- Atelier B : les prcautions lors de la mise en
hmatimtre ; les caractristiques de lhmatimtre - Atelier B : laborer la formule littrale de la
ncessaires llaboration lexploitation.
concentration en levures du milieu de culture partir
dune numration en cellule de Malassez.
- Atelier C : le rappel de la mise en forme exploitable
des donnes, des rsultats et ltablissement des
formules littrales.
- Atelier C : effectuer le choix des dilutions de la culture
effectuer en pour un dnombrement en surface par
dpt de spots de 15 L, au cours du suivi de croissance
- Atelier D : le rappel des diffrentes phases de des levures.
croissance en milieu non renouvel.
BIOTECHNOLOGIES
- Atelier D : dterminer des paramtres de la croissance

microbienne expo et G dans le cas dune culture en
milieu non renouvel.
BIOTECHNOLOGIES
TEMPS
10
minutes
CONTENUS
Manipulation :

Donne des consignes et des conseils.
Mise en place du
fermenteur
Manipulation :
5
minutes
limination du milieu de
culture
et du matriel biocontamins
value llimination conforme des cultures et

du matriel et la remise en ordre correct de
lespace de travail.

Remplit le fermenteur, une fois strilis, avec
le milieu de culture appropri.
limine les cultures et le matriel biocontamin.
Range le poste de travail.
BIOTECHNOLOGIES

TEMPS
LENSEIGNANT
CONTENUS
Rappel de la sance n1 :
10
minutes
La fermentation alcoolique par une

levure Saccharomyces cerevisiae,
sous linfluence de diverses sources
carbones est suivie dans plusieurs
bioracteurs diffrents.
Echange et coute.
Distribue des grilles de suivi de

croissance.
Complte des documents.
Prcise la composition des groupes

dlves.
220
minutes
Manipulation (sance 2) :
Atelier A :
Suivi du pH - Dosage dthanol
Manipulations (sance 2) :
Ralise un prlvement toutes les 40

minutes, suivant les bonnes pratiques de
microbiologie (soit 4 5 prlvements au
cours de la sance).
Suit
les
dmarches
oprationnelles
proposes pour le dosage dthanol du
prlvement.
Atelier B :
Dnombrement des levures
Prlve strilement un chantillon de la

suspension provenant de latelier A.
Ralise une dilution
suspension valuer.
arbitraire
Ralise la mise en hmatimtre.

Dnombre les cellules.
de
la
BIOTECHNOLOGIES
value la biomasse (concentration de

levures).
BIOTECHNOLOGIES
TEMPS
LENSEIGNANT
CONTENUS

Prlve strilement une fraction de la
culture provenant de latelier B.
Atelier C :
Dnombrement des levures en
surface Mthodes des spots
Dpose les spots de 4 dilutions

successives (2 essais par dilution).
220
minutes
Mettre les milieux incuber.

Prlve strilement une fraction de la
culture provenant de latelier B.
Vrifie le relev des indicateurs de

suivi de croissance et les rponses
techniques apportes pour la mise en
uvre.
Atelier D :
Suivi de la biomasse par
turbidimtrie
10
minutes
Ralise des dilutions en sries dcimales

suivant les calculs effectus lors de la
numration en cellule de Malassez.
Manipulation :
limination du milieu de culture
et du matriel bio-contamins
Vrifie llimination conforme des

cultures et du matriel et la remise en
ordre correcte de lespace de travail.
value la concentration de levure par

turbidimtrie.
Ajuste sa mesure, si ncessaire, par
dilution de la suspension afin de
respecter la limite de linarit lors de la
mesure spectrophotomtrique.
limine les cultures et le matriel biocontamin.
Range le poste de travail.
BIOTECHNOLOGIES
SEANCE N2 : SUIVI DE FERMENTATION PAR LA LEVURE Saccharomyces cerevisiae (document fourni chaque lve)
Atelier A
Atelier B
Atelier C
Atelier D
Prlvement - Dosage dthanol
Dnombrement direct des levures

- Prlever 10 mL de milieu de culture.
Dnombrement en surface des levures

Mthode des spots sur glose Sabouraud
Suivi de population de levures

Mthode par turbidimtrie
4 mL
-
- Bien homogniser et conserver 3 mL en

microtube ; le reste, plong dans un bac
glace, est transmis latelier B :
2 mL
Garder le prlvement dans la glace

et bien homogniser
Garder le prlvement dans la glace

et bien homogniser
7 mL
1 mL
glace
2 mL
3 mL
glace
- Placer les 3 mL dans un bain Marie 80C,

pendant 15 minutes pour stopper toutes
ractions
enzymatiques
(recouvrir
correctement le tube car lthanol est volatil).
- Centrifuger les 3 mL pendant 5 minutes
2500 tours.min-1.
- Doser lthanol dans le surnageant dilu par
la mthode enzymatique lalcool
dshydrognase en Annexe
500 L
- Ajouter lchantillon 500 L de bleu de
mthylne ou bleu de Funk dans un tube
hmolyse.
- Effectuer la numration des cellules en suivant les
instructions de lAnnexe
- Compter toutes les cellules et les levures viables
(non colores). Les cellules mortes sont colores en
bleues. On doit compter entre 10 et 50 cellules par
rectangle unitaire de la chambre de comptage, pour
une lecture correcte au microscope.
- Raliser une dilution si ncessaire au 1/5 ou 1/10
ou 1/20 en eau physiologique de la suspension
initiale, en tube hmolyse, sous un volume final
de 1 mL.
- A partir des rsultats obtenus grce la

numration par cellule de Malassez, calculer quatre
dilutions successives que lon peut tester par
dnombrement en surface (mthode des spots) ; des
spots dnombrables contiennent de 1 50 colonies.
- Raliser les dilutions en cascade adquates de
raison 10 ; le diluant est leau physiologique ; la
dilution est ralise en tubes hmolyse, sous un
volume final de 1 mL.
- Dposer
successives
disposition
dilution se
Sabouraud.
10 L de chacune des dilutions

tester, suivant le canevas mis votre
en Annexe. Les dpts de chaque
font en double essai, sur une glose
- Laisser scher
bonnes min.
pendant
- Incuber 30C, 24 48h.

Exemple de canevas
- Recommencer la numration jusqu
10
- Prparer des dilutions en tube hmolyse, en

srie du 1/2 au 1/32 en milieu Sabouraud
strile, sous un volume final de 1 mL.
- Mesurer labsorbance 650 nm et garder la
valeur la plus haute mais infrieure 1.
- le zro de lappareil est rgl avec le milieu
de culture test de dpart (Attention ! le
garder durant tout le temps de la
manipulation).
BIOTECHNOLOGIES
obtenir un bon rsultat.
SEANCE N2 : ANNEXES (document fourni chaque lve)

Atelier B
Atelier A
Dosage dthanol - Mthode enzymatique
Dnombrement des levures Cellule de Malassez
Principe de la mthode
Lthanol est oxyd en prsence de lalcool
dshydrognase (ADH) par le Nicotinamide Adnine
Dinuclotide (NAD), suivant la 1ire tape ractionnelle :
Prsentation gnrale de la cellule de

Malassez
Rigole
Plancher (Quadrillage)
10-6
ADH
Al-DH
Exemple
de
rpartitions
de
4
dilutions successives
par mthode des spots
(2 essais par dilution)
Plateau
latral
Ethanol + NAD+ Actaldhyde + NADH,H+

Lquilibre de la raction rversible est dplac vers la
formation dthanol et de NAD+.
La raction peut tre dplace dans lautre sens, dans des
conditions alcalines et en pigeant lactaldhyde form,
suivant la 2ime tape ractionnelle :
Atelier C
Dnombrement en surface des levures - Mthode des spots sur glose Sabouraud
10-5
Lamelle plane
10-4
Cellule de Malassez
10-7
Lhmatimtre de Malassez
Actaldhyde + NAD+ + H2O Acide actique +

NADH,H+
Lactaldhyde est quantitativement oxyd en prsence de
laldhyde dshydrognase (Al-DH).
La prsence de NADH,H+ est rvle par mesure
dabsorbance 340 nm.
Mode opratoire
Blanc (mL)
Essai (mL)
Ractifs 2*
1,000
1,000
Eau redistribue
0,033
Solution essai
0,033
Homogniser.
Aprs approximativement 3 min. lire labsorbance
(A1) 340 nm des solutions
Ractifs 3**
0,017
0,017
Homogniser ; la raction est complte, aprs
approximativement 5 10 min.
Lire labsorbance (A2) 340 nm des solutions,
immdiatement les unes aprs les autres.
Remarques
*Tampon diphosphate de potassium, pH approx. 9,0 ; NAD+,
approx. 4 mg ; ADH, approx. 0,8 U
** Al-DH, approx. 7000 U
Les ractifs sont ports 20C avant utilisation.
Longueur de la cuve : 1 cm
Volume ractionnel final : 1,05 mL
Les lectures du blanc et des essais se font contre lair (sans cuve)
ou contre leau
10-6
Pose de la lamelle
- Poser la lamelle sur les plateaux en prenant soin de ne
pas la graisser avec les doigts. Pour quelle sadapte
exactement sur les plateaux, passer un doigt lgrement
humide leur surface et appuyer fortement avec les
pouces sur la lamelle tout en faisant lgrement glisser.
Remplissage de lhmatimtre
- Prlever la suspension de cellules avec une pipette, aprs
lavoir pralablement homognise correctement.
Amener la pointe de la pipette au bord de la lamelle (tenir
la pipette et appuyer obliquement sur le plancher).
Lespace compris sous la lamelle doit tre totalement
rempli avec le liquide et ne doit pas dborder.
- Attendre 10 minutes afin que les cellules sdimentent.
Observation au microscope
- Poser lhmatimtre sur la platine du microscope.
- Vrifier l'objectif 10 lhomognit de la rpartition
dans le grand rectangle. Choisir un rectangle situ dans un
coin extrme du quadrillage et observer lobjectif 40.
- Compter toutes les cellules lintrieur du rectangle et
celles situes sur deux cts voisins. Compter de la mme
faon les cellules contenues dans les rectangles situes
10-7
Poser la boite
lenvers sur le canevas,
est
marqu
dune
croix, chaque dpt
effectuer, au dos de la
boite.
10-5
10-4
Atelier D
Suivi de la population de levures Mthode par turbidimtrie
Pour que labsorbance 650 nm reste proportionnelle la concentration

cellulaire, les mesures doivent seffectuer dans la zone de validit de la loi
Beer-Lambert.
A650nm < 0,7 U

On peut donc tablir une correspondance entre la valeur de A 650nm lue et le
nombre de microorganismes rels prsents dans le milieu de culture.
BIOTECHNOLOGIES
aux quatre coins du quadrillage
BIOTECHNOLOGIES
Atelier A
SEANCE N2 : TRAITEMENT DES RESULTATS COLLECTES (document fourni chaque lve)

Atelier B
Atelier C
Dosage dthanol
Mthode enzymatique


Mthode des spots sur glose Sabouraud
Dterminer les diffrences

dabsorbance
(A2-A1) de lessai et du blanc ractif.
Soustraire la diffrence dabsorbance du blanc
de celle de lessai :
Longueur dun rectangle :

mm
Largeur dun rectangle :
mm
Surface dun rectangle :
mm2
Volume dun rectangle :
mm3
Profondeur (hauteur lamelle - quadrillage) :
1/5 mm
Surface totale dune chambre de
comptage :
mm2
Volume total de la chambre de comptage :
mm3
Dnombrement de levures
au cours de la fermentation
A = (A2-A1)essai (A2-A1)blanc
Cette
diffrence
dabsorbance
devrait tre au moins de 0,100
units dabsorbance pour parvenir
des rsultats suffisamment prcis.
Dterminer la concentration en
thanol
-1
Calcul de (Ethanol) = c, exprime en (g.L )
c=
(V.MG.A.F)
(.d.v.2 x 1000)
avec
V = volume ractionnel final.
v = volume de la prise dessai.
M = Masse molaire molculaire de
lthanol ; Mthanol = 46,07 g.mol-1
d = trajet optique dans la cuve
(cm).
= coefficient dextinction de NADH
340 nm ; = 6,3 (L.mmol-1.cm-1).
F = facteur de dilution au cours de la
prparation de lessai.
Complter la grille ci-aprs, de
lensemble des rsultats du
groupe.
Dtermination de la
concentration
de la suspension cellulaire
- Dterminer le nombre total de
cellules comptes dans les 4
rectangles unitaires.
- Rapporter le nombre de cellules au
volume de la chambre de comptage
(1 mm3 soit 1 L).
- Prendre en compte l'ventuel
facteur de dilution de la suspension
cellulaire initiale.
- Exprimer le rsultat du nombre
total de levures. mL-1, en puissance
de
dix
avec
deux
chiffres
significatifs.
Dtermination du %
ou taux de viabilit cellulaire
- Indiquer le nombre de cellules
mortes et de cellules totales
comptes.
- Compter le nombre de colonies pour chaque

dilution sur les botes, sachant quun nombre
de 1 50 colonies par dpt ralis, peut tre
considr comme exploitable.
- Prciser les dilutions retenues.
- En dduire les concentrations de levures
obtenues :
N = n.F.F
Vi
avec
N = concentration cellulaire.mL-1.
n = nombre de colonies comptes.
Vi = volume de linoculum dpos
sur la boite.
F = facteur de dilution dont on doit
obligatoirement tenir compte lors des dilutions
en srie.
F = facteur de dilution dont on doit
ventuellement tenir compte lors de la
prparation de linoculum.
Atelier D

Labsorbance
650
nm
est
proportionnelle la concentration
cellulaire dans un certain intervalle
de concentration.
La
formulation
de
cette
proportionnalit est ressemblante
la loi de Beer-Lambert sappliquant
aux milieux troubles :
A650 nm = k.c.d
A650 nm : absorbance mesure =
650 nm.
c, concentration cellulaire de la
suspension.
d, trajet optique de la lumire dans
la cuve.
k, coefficient de proportionnalit.
A
partir
des
rsultats
de
dnombrement obtenus en cellule de
Malassez ou par la mthode des
spots, tablir une correspondance
entre la valeur de labsorbance 650
nm et le nombre de microorganismes
rellement prsents par mL de milieu
de culture initial.
Complter la grille ci-aprs, de lensemble

des rsultats du groupe.
- En dduire le taux de viabilit (Tv)

des levures :
Tv = N1x 100 / NT
N1 = nombre de cellules vivantes.

BIOTECHNOLOGIES
NT = nombre de cellules totales.
groupe.

groupe.
Expression des rsultats

Calcul de la concentration massique dthanol :
g dthanol.mL-1 de milieu de initial
Calcul de la concentration cellulaire :

levures total.mL-1 de milieu
et le % de viabilit.
Calcul de la concentration cellulaire :

levures revivifiables.mL-1 de
milieu de culture.
Dtermination de labsorbance par mL de milieu de

culture initial et dtermination du logarithme nprien - ln
(A650nm)
BIOTECHNOLOGIES
DOCUMENT A REMPLIR PAR GROUPE DELEVES (ET FOURNI A CHAQUE ELEVE DUN MEME GROUPE)
SEANCE N2 : MISE EN FORME DES DONNEES BRUTES ET DES RESULTATS MILIEU SACCHAROSE PUR (S)
P1
P2
P3
P4
Exemples de
calcul
Calcul de cthanol produit au cours de la Calcul du Nlevures :

culture :
Calcul du Nlevures :
Calcul du taux de
viabilit :
Calcul de A650nm relle :
Ln (DO650 nm)
DO650 nm relle
Dilution retenue
Levures.
mL-1
Atelier D
= 650 nmDensit optique
Levures.mL-1
Dilutions retenues
C thanol
g.L-1
Dilutions effectuer et dduites du

dnombrement direct
A340 nm
Atelier C
levures
Mthode des spots
Taux de viabilit
EssaiA340 nm 2
BlancA340 nm 2
EssaiA340 nm 1
BlancA340 nm 1
Volume prlev
Temps de culture
Heure du prlvement
Prlvement
Dosage dthanol
Mthode enzymatique
Atelier B
Dnombrement direct des
levures
4 rectanglesLevures totales comptes dans
Atelier A
BIOTECHNOLOGIES
BIOTECHNOLOGIES
SEANCE 2 - MISE EN FORME DES DONNEES BRUTES ET DES RESULTATS MILIEU MELASSE + 20 % DIMPURETES
(M20)
P1
P2
P3
P4
Exemples de
calcul

culture :
Calcul du taux de
viabilit :
Calcul de A650 nm relle :
Ln (DO650 nm)
DO650 nm relle
Dilution retenue
Levures.
mL-1
Atelier D
Levures.mL-1
Dilutions retenues
C thanol
g.L-1

dnombrement direct
A340 nm
Atelier C
levures
Mthode des spots
Taux de viabilit
EssaiA340 nm 2
BlancA340 nm 2
EssaiA340 nm 1
BlancA340 nm 1
Volume prlev
Temps de culture
Heure du prlvement
Prlvement
Dosage dthanol
Mthode enzymatique
Atelier B
levures
Atelier A
BIOTECHNOLOGIES
BIOTECHNOLOGIES
SEANCE N2 : MISE EN FORME DES DONNEES BRUTES ET DES RESULTATS MILIEU MELASSE + 40 % DIMPURETES
(M40)
P1
P2
P3
P4
Exemples de
calcul

culture :
Calcul du taux de
viabilit :
Ln (DO650 nm)
DO650 nm relle
Dilution retenue
Levures.
mL-1
Atelier D
Mthode par opacimtrie
Levures.mL-1
Dilutions retenues
C thanol
g.L-1

dnombrement direct
A340 nm
Atelier C
levures
Mthode des spots
Taux de viabilit
EssaiA340 nm 2
BlancA340 nm 2
EssaiA340 nm 1
BlancA340 nm 1
Volume prlev
Temps de culture
Heure du prlvement
Prlvement
Dosage dthanol
Mthode enzymatique
Atelier B
levures
Atelier A
BIOTECHNOLOGIES
BIOTECHNOLOGIES
SEANCE N2 : MISE EN FORME DES DONNEES BRUTES ET DES RESULTATS MILIEU MELASSE BRUTE (MB)
P1
P2
P3
P4
Exemples de
calcul

culture :
Calcul du taux de
viabilit :
Ln (DO650 nm)
DO650 nm relle
Dilution retenue
Levures.
mL-1
Atelier D
Levures.mL-1
Dilutions retenues
C thanol
g.L-1

dnombrement direct
A340 nm
Atelier C
levures
Mthode des spots
Taux de viabilit
EssaiA340 nm 2
BlancA340 nm 2
EssaiA340 nm 1
BlancA340 nm 1
Volume prlev
Temps de culture
Heure du prlvement
Prlvement
Dosage dthanol
Mthode enzymatique
Atelier B
levures
Atelier A
BIOTECHNOLOGIES
BIOTECHNOLOGIES
Temps de culture Milieu MB
Temps de culture Milieu M40
Temps de culture Milieu M20
Temps de culture Milieu S
Prlvement
DOCUMENT A REMPLIR PAR LENSEMBLE DE LA CLASSE (ET FOURNI A CHAQUE ELEVE)

SEANCES N2 ET 3 : MISE EN FORME DES DONNEES BRUTES ET DES RESULTATS
SUIVI DE FERMENTATION DANS LES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE ETUDIES
Atelier A
Dosage dthanol
Mthode enzymatique
Atelier B
Atelier C
Mthode des spots
C thanol
(g.L-1)
Levures.mL-1
Taux de viabilit
Levures.mL-1
Ln (A650 nm)
Milieux tudis
Milieux tudis
Milieux tudis
Milieux tudis
M20
M40
MB
M20
M40
MB
M20
M40
MB
Atelier D
M20
M40
MB
P1
P2
et
c
Comparer la production de biothanol
produit lors de la fermentation dans
les diffrents milieux de culture :
Comparer lvolution des taux de

viabilit cellulaire obtenus au cours
de la fermentation dans les diffrents
milieux de culture :
Comparer laccroissement de levures

produites lors de la fermentation dans
les diffrents milieux de culture et les
rsultats obtenus grce aux deux
dnombrements raliss :
Interprtations
Comparer les rsultats obtenus par

turbidimtrie de ceux obtenus par
dnombrement
vrai,
dans
les
diffrents milieux de culture :
BIOTECHNOLOGIES
DOCUMENT FOURNI A CHAQUE ELEVE

SEANCE N3 : REPRESENTATIONS ADAPTEES DES RESULTATS COLLECTES ET CONCLUSIONS
Atelier A
Atelier B
Atelier C
Atelier D
Dosage dthanol
Mthode enzymatique


Mthode des spots

Objectifs
Saisir sous Excel v2010 (Systme dexploitation Windows 7) des donnes brutes, les calculs effectuer partir des
coordonnes de cellules du classeur. Utiliser le tableur Excel permettant de refaire les calculs un grand nombre de fois sans
retaper les formules, aprs avoir saisi ou acquis les donnes.
Dmarches
- Ouvrir le logiciel Excel.
- Crer une feuille de calculs permettant de dterminer d'aprs
les numrations effectues en hmatimtre de Malassez, la
concentration cellulaire totale.
- Dans la cellule A1, saisir un titre gnral. On peut facilement
fusionner plusieurs cellules : Slectionner les cellules A1 A6.
Par un clic droit, suivre la commande Format de cellule. Dans
longlet Alignement, cocher la puce Fusionner les cellules.
- Dans les cellules A3 F3, entrer les intituls dans lordre :
Prlvement / Temps de culture / Cellules vivantes / Cellules
totales /
Taux de viabilit / Concentration cellulaire totale (levures.mL -1)
- Saisir les valeurs obtenues de numrations au cours des
diffrents prlvements et donc aux diffrents temps de culture
de Saccharomyces cerevisiae.
Numration d'une suspension cellulaire
Prlvement
1
2
3
4
Temps de culture
(min)
240
280
320
360
Cellules
vivantes
Cellules totales
170
186
197
256
ZONE DE SAISIE
Taux de
viabilit (%)
Concentration
cellulaire totale
(levures.mL-1)
182
194
233
287
ZONE DE CALCUL
- Ne rentrer quune formule de calcul (correspondant au Taux de viabilit) ; puis la recopier vers le bas, afin d'obtenir l'ensemble des rsultats. Le principe est de rentrer non
pas la valeur mais les coordonnes de la cellule ncessaires au calcul, le tableur se chargeant de la copie incrmente : c'est dire l'adaptation des coordonnes des
cellules, lors de la translation de la formule, au moment de la copie.
Temps de
Prlvement culture
(min)
Cellules
vivantes
240
170
280
186
Taux de
viabilit
(%)
93,406593
182
4
95,876288
194
7
Cellules
totales
3
4
5
Temps de
Prlvement culture
(min)
Cellules
vivantes
Cellules
totales
Taux de
viabilit (%)
240
170
182 =C4*100/D4
280
186
194 =C5*100/D5
Le numro
de ligne
est
incrment
de 1, lors
de la copie
vers le bas
BIOTECHNOLOGIES
Retrouver la formule incrmenter par copie pour dterminer la concentration totale en cellules.mL -1 de suspension de dpart.

Atelier A
Atelier B
Atelier C
Atelier D
Dosage dthanol
Mthode enzymatique


Mthode des spots

Objectifs
Saisir sous Excel v2010 (Systme dexploitation Windows7) des donnes brutes et raliser des histogrammes.
Dmarches
- Travailler sur une nouvelle feuille du logiciel Excel.
- Crer une feuille permettant de prsenter et traiter les
donnes brutes obtenues et calcules, lors du dnombrement,
par la mthode des spots.
- Dans la cellule A1, saisir un titre gnral.
- Fusionner les cellules C3 F3.
- Dans les cellules A3 F3, entrer les intituls dans lordre :
Prlvement / Temps de culture / Concentration cellulaire totale
(levures.mL-1)
- Fusionner les cellules A3 et A4. Et fusionner les cellules B3 et
B4.
- De C4 F4, entrer les intituls dans lordre :
Milieu S / Milieu M20 / Milieu M40 / Milieu MB
Dnombrement de levures
Prlvement
1
2
3
4
Temps de
culture (min)
Concentration cellulaire totale (levures.mL-1)

Milieu S
240
280
320
360
- Activer loutil graphique : Choisir le type de graphiques Histogramme 3D.

- Prciser les titres (du graphique, de chaque axe, de chaque srie de donnes).
- Raliser les histogrammes pour chacun des milieux tudis. Insrer les graphiques sur la feuille
Milieu M40
1,7.106
3,4.106
6,8.106
1,4.107
ZONE DE SAISIE
- Saisir les valeurs de concentrations cellulaires obtenues au

cours des dnombrements en surface et pour les diffrents
milieux de culture tudis. (Atelier C)
- Slectionner les plages de donnes qui doivent tre exploites.
(la 1re colonne slectionne correspond laxe des abscisses, la 2 me laxe des ordonnes).
de calcul.
Milieu M20
Milieu MB
BIOTECHNOLOGIES
En saisissant les donnes brutes et calcules de lexemple, on obtiendrait ce type dhistogramme :
Daprs vos illustrations, en dduire le milieu permettant une croissance optimale de Saccharomyces cerevisiae.
Expliquer les diffrences observes entre les diffrents milieux de culture.

Atelier A
Atelier B
Atelier C
Atelier D
Dosage dthanol
Mthode enzymatique


Mthode des spots

Objectifs
Saisir sous Excel v2010 (Systme dexploitation Windows7) des donnes brutes, les calculs effectuer partir des
coordonnes de cellules du classeur, des graphes illustrant la fois, le suivi de la production en thanol dans diffrents
milieux de culture et le suivi dune population de levure.
Dmarches
- Travailler sur une nouvelle feuille du logiciel Excel.
- Crer une feuille permettant de prsenter et traiter les
Suivi de la production dthanol et de la biomasse
donnes brutes obtenues et les donnes calcules, lors du suivi
en fonction du temps de culture
de la biomasse par dtermination de labsorbance et lors du
suivi de la production dthanol.
Concentration en thanol
- Dans la cellule A1, saisir un titre gnral.
- Fusionner les cellules B3 E3. Et fusionner les cellules F3 et
G3.
- Dans les cellules A3 G3, entrer les intituls dans lordre :
Temps de culture / Concentration en thanol (g.L -1) / Biomasse
- Fusionner les cellules A3 et A4.
- De B4 G4, entrer les intituls dans lordre :
Milieu S / Milieu M20 / Milieu M40 / A 650 nm / Ln (A650 nm)
Temps de culture
(min)
240
280
320
360
Biomasse
(g.L-1)
Milieu
S
Milieu
M20
Milieu
M40
Milieu
MB
Ln (A650nm)
1,7.106
3,4.106
6,8.106
1,4.107
ZONE DE SAISIE
- Saisir les valeurs de concentrations dthanol au cours des

dosages enzymatiques et pour les diffrents milieux de culture
tudis (Atelier A) ainsi que les valeurs dabsorbance (Atelier
D).
- Rentrer en G5 une formule de calcul (correspondant Ln Abs) ; puis la recopier vers le bas, afin d'obtenir l'ensemble des rsultats.
- Slectionner les plages de donnes qui doivent tre exploites.
(la 1re colonne slectionne correspond laxe des abscisses, la 2 me laxe des ordonnes)
- Activer loutil graphique : Choisir le type de graphiques Nuage de points avec courbe lisse.
A650nm
CALCUL
BIOTECHNOLOGIES
- Prciser les titres (du graphique, de chaque axe, de chaque srie de donnes).
- Raliser un 2me graphe de la fonction Ln (A650 nm) = f (Temps de culture). Insrer les graphiques sur la feuille de calcul.
En saisissant les donnes brutes et calcules de lexemple, on obtiendrait le type de graphe ci-contre :
Daprs les graphes, en dduire le milieu favorisant la production dthanol au cours de la fermentation
alcoolique par Saccharomyces cerevisiae.
Expliquer les diffrences observes lors du suivi de la biomasse en fonction du temps dans les divers milieux de culture.

TEMPS
CONTENUS
LENSEIGNANT

Reporte les valeurs dabsorbance, de
numrations et les dosages effectus
dans un tableau.
55
minutes
Exploitation des rsultats
Reprsente graphiquement les diffrents

paramtres du suivi de croissance laide
de loutil informatique.
Calcule les concentrations en thanol
dans chaque essai et conclut.
BILAN :
- La production dthanol par Saccharomyces cerevisiae cultive sur la mlasse de betterave sucrire est dautant plus
importante que le milieu de culture contient du saccharose pur.
- Les substances non glucidiques prsentes dans la mlasse semblent perturber la production dthanol par Saccharomyces
BIOTECHNOLOGIES
cerevesiae.
BIOTECHNOLOGIES
LES BIOINDUSTRIES : LES AGRO-CARBURANTS

AT N2 : MISE EN VIDENCE DE LA PRSENCE DU GNE DINTRT DANS LE GNOME DE
TEMPS
CONTENUS

15
minutes
LLVE
Discussion
dides.
et
recherche
Comment augmenter le rendement de

production
d'thanol
par
Saccharomyces
cerevisiae
sans
apporter de traitements la mlasse,
ce qui
ne serait pas intressant
conomiquement ?
Introduction
MISE EN COMMUN DES PROPOSITIONS RETENUES :

Utiliser des levures, Saccharomyces cerevisiae, transformes gntiquement pour quelles puissent supporter de fortes
teneurs en substances non glucidiques.
15
minutes
Prsentation de la situation :
Des
levures
ont
t
modifies
gntiquement par insertion dun gne
leur
permettant
de
produire
correctement de lthanol en prsence
des fortes teneurs en substances non
glucidiques, prsentes dans la mlasse.

Prsente le
modifie.
gnome
Le but est de vrifier la prsence de ce

gne.
de
coute.
la
levure
Pose des questions.
BIOTECHNOLOGIES
Prsentation de la dmarche :
- amplification du gne dintrt par PCR ;
- vrification par lectrophorse.
10
minutes
Distribution et lecture du protocole du AT n2
Prsente le protocole.
Lit le protocole.
Ecoute et pose des
questions.
BIOTECHNOLOGIES

AT N2 : MISE EN VIDENCE DE LA PRSENCE DU GNE
DINTRT
DANS LE GNOME DE Saccharomyces cerevisiae
Une solution dADN est prpare partir dune souche de levures Saccharomyces cerevisiae modifie
gntiquement pour quelle surexprime lalcool-dshydrognase ; ainsi les levures supportent de fortes teneurs
en substances non glucidiques et peuvent utiliser la mlasse comme milieu de culture pour produire le
biothanol.
Ltude consiste en la vrification de linsertion du gne dintrt dans le gnome de la levure.
Pour cela, il faut raliser :
dans un premier temps, lamplification du gne dintrt par PCR ;
dans un deuxime temps, lanalyse du produit de lamplification par lectrophorse sur gel dagarose.
COMPTENCES :
Je suis capable... :
de restituer le principe de la PCR et identifier le rle des diffrentes molcules impliques.
de mettre en uvre une amplification dun fragment dADN.
de dposer lchantillon dADN sur gel dagarose.
de respecter les consignes de scurit lors de la manipulation de produits biologiques.
d'identifier les dangers lis au BET et mettre en uvre les quipements de protection individuelle et
collectifs adquats.
d'exploiter un lectrophorgramme.
de grer les dchets biologiques.
1. MATRIEL ET RACTIFS
1.1. MATRIEL
- micropipettes (0,5-10 / 10-100 / 100-1000) + cnes striles
- 1 chronomtre
- 1 microtube de 0,2 mL strile spcial PCR
- 1 microtube de 0,5 mL strile
1.2. RACTIFS
- 100 L deau dsionise
- 3 L de Taq polymrase 0,5 U/L, not Taq
- 3 L de tampon de travail pour la Taq 10x concentr, not Tampon Taq
- 2 L de MgCl2 25 mmol.L-1, not MgCl2
- 3 L damorce 5 5 mol.L-1, not amorce 5 (amorce du brin sens)
- 3 L damorce 3 5 mol.L-1, not amorce 3 (amorce du brin antisens)
- 3 L de dNTPs 2,5 mmol.L-1, not dNTP
- 15 L dADN de Saccharomyces cerevisiae modifi 0,2 ng/L, not ADN matrice
- marqueur de taille
BIOTECHNOLOGIES
- tampon de charge 6x concentr
BIOTECHNOLOGIES
2. MODE OPRATOIRE
2.1. PRPARATION DU MLANGE RACTIONNEL
Tous les ractifs doivent tre placs dans la glace ainsi que le microtube contenant le mlange ractionnel.
Introduire dans un microtube spcial PCR tous les ractifs ci-dessous et dans lordre :
- 2 L deau dsionise strile
- 2,5 L de tampon damplification Taq 10X concentr
- 1,5 L de MgCl2 25 mmol.L-1
- 2 L de dNTPs 2,5 mmol.L-1
- 2,5 L de lamorce 5 5 mol.L-1
- 2,5 L de lamorce 3 5 mol.L-1
- 2 L de Taq polymrase 0,5 U/L
- 10 L de lADN matrice 0,2 ng/L
2.2. AMPLIFICATION DU GNE DINTRT INSR DANS LE GNOME DE

Introduire le tube dans le thermocycleur en prenant soin de noter la position de votre tube sur la feuille de
gestion.
Les caractristiques de lamplification sont les suivantes :
- cycle dentre : 5 min. 94C,
- 30 cycles de 3 min. (1 min. 94C ; 1 min. 50C ; 1 min. 72C),
- cycle de sortie : 5 min. 72C.
2.3. CONTRLE DE LA PRSENCE DU GNE DINTRT

Le contrle de la prsence du gne dintrt est ralis par une analyse lectrophortique sur gel dagarose.
Dans un microtube, introduire :
- 25 L de lamplifiat,
- 5 L de tampon de charge 6X concentr.
Dposer 10 L de la solution prpare ci-dessous dans un gel dagarose 1,5 %.
3. EXPLOITATION DES RSULTATS

3.1. Annoter llectrophorgramme obtenu :
-
placer lanode (ple +) et la cathode (ple -) ;

flcher le sens de migration ;
placer la ligne de dpts ;
identifier les puits avec les marqueurs de taille et avec lamplifit.
3.2. partir de llectrophorgramme obtenu, conclure quant la prsence ou non du gne dintrt dans le
gnome de Saccharomyces cerevisiae.
3.3. Estimer la taille de la bande laide des marqueurs de taille. Pour cela tracer, laide de loutil
informatique, le graphique reprsentant le Log de la masse molculaire de chaque marqueur de taille en
fonction de la distance de migration de chacun des marqueurs de taille.
3.4. Conclure.
BIOTECHNOLOGIES

TP N2 : MISE EN VIDENCE DE LA PRSENCE DU GNE
DINTRT
DANS LE GNOME DE Saccharomyces cerevisiae
MATIRE D'OEUVRE
MATRIEL PAR LVE
RACTIFS PAR LVE
Micropipettes (0.5-10 / 10-100 / 100-1000) + 1 microtube contenant 100 L deau distille strile
cnes striles
1 micro-tube de 0,2 mL strile spcial 1 micro-tube contenant 3 L de Taq polymrase 0,5 U/L
PCR + portoir
not Taq
1 micro-tube contenant 3 L de tampon de travail pour la Taq
1 micro-tube de 0,5 mL strile
10x concentr, not Tp Taq
1 microtube contenant 2 L de MgCl2
1 chronomtre
25 mmol.L-1 not MgCl2
1 micro-tube contenant 3 L damorce 5 5 mol.L-1 not
Gels dagarose 1.5% avec Bromure amorce 5
dthydium (BET)
amorce 5' (amorce du brin sens) :
5 GGG ATT CAG TAA CAT TCA CG 3
1 micro-tube contenant 3 L damorce 3 5 mol.L-1 not
amorce 3
1 bac glace
amorce 3' (amorce du brin antisens)
5 TGC TGG TAT CTA TGA CAA GG 3
2 gels dagarose 1,5% avec GelRed.
1 micro-tube contenant 3 L de dNTPs 2,5 mmol.L -1 not

dNTP
1 micro-tube contenant 15 L dADN de Saccharomyces
cerevisiae modifi 0,2 ng/L not ADN matrice (ADN
du phage lambda)
Ractifs communs : Par salle

- Marqueur de taille : 100bpDNA Ladder.
- Tampon de charge 6X concentr (2 microtubes).
BIOTECHNOLOGIES
ANNEXE :
PRINCIPE DE LA PCR (Polymerase Chain
Reaction)
La PCR est une technique damplification en chane dacides nucliques par polymrisation. Elle a
t mise au point en 1985, par Karry MULLIS (prix Nobel en 1993).
La PCR a reprsent un progrs mthodologique dcisif. De ce fait, elle a conquis une place
prpondrante en biologie molculaire.
La PCR permet de reprer un fragment d'ADN ou de gne prcis, mme prsent en quantit infime
dans un mlange, puis de le multiplier rapidement.
1. LES DIFFRENTES MOLCULES IMPLIQUES AU COURS DE LA PCR

MOLCULES
ADN matrice double brin
RLES
Contient le fragment amplifier.
S'hybrident de faon spcifique, grce la complmentarit
Amorces sens et anti-sens (20 des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complmentaire.
nuclotides environ)
Les amorces sont choisies de faon encadrer la squence
d'ADN amplifier.
Enzyme : Taq polymrase
Permet la polymrisation de chacun des brins de lADN.
(enzyme thermorsistante)
Nuclotides : dGTP, dATP,
dTTP, dCTP
lments de base utiliss par la Taq polymrase pour
(DsoxyNuclotides-Trisynthtiser les brins complmentaires.
Phosphates)
2. LES DIFFRENTES TAPES DE LA PCR

Une raction de PCR correspond la succession d'une trentaine de cycles comportant chacun 3
tapes :
- une dnaturation,
- une hybridation,
- une longation.
Tous les lments ncessaires la raction sont regroups dans un tube qui sera soumis aux
diffrentes tempratures correspondant chaque tape. Ces cycles de temprature sont raliss
automatiquement dans un thermocycleur.
2.1. LA DNATURATION
La dnaturation consiste sparer les 2 brins de lADN par chauffage quelques secondes 94C.
La double hlice de lADN est ainsi ouverte.
BIOTECHNOLOGIES
BIOTECHNOLOGIES
2.2. LHYBRIDATION
La temprature est rapidement abaisse 55C, afin que les amorces reconnaissent leur
squence complmentaire sur les brins d'ADN cibles et puissent s'hybrider chacune sur leur brin
respectif. Cette tape dure une minute afin de laisser le temps aux amorces de s'hybrider
correctement. L'ADN total tant plus long, n'aura pas le temps de s'hybrider nouveau.
2.3. LLONGATION
La temprature du tube est ensuite augmente 72C, ce qui permet la Taq Polymrase d'ajouter
des nuclotides aux amorces hybrides, dans le sens 5' vers 3'. Les nuclotides ne sont pas
incorpors de faon alatoire mais en fonction de la squence cible (nuclotide complmentaire).
Cette tape dure 1 minute.
Un nouveau brin d'ADN, dont la squence est complmentaire de celle du brin cible, vient d'tre
synthtis.
3. RSULTATS OBTENUS LA FIN DE CHAQUE CYCLE DAMPLIFICATION

3.1. LE PREMIER CYCLE
Il a permis de synthtiser autant de brins complmentaires (plus courts puisque borns par une
amorce) que de brins cibles prsents dans le tube. Ils deviennent leur tour des ADN cibles.
BIOTECHNOLOGIES
3.2. LE DEUXIME CYCLE

La quantit d'ADN continue de doubler et les premiers brins, dont la taille est limite par les deux
amorces, font leur apparition.
3.3. LE TROISIME CYCLE

Les premiers amplicons apparaissent. Les amplicons sont des molcules dADN double-brin bornes
par les amorces, correspondants au fragment d'ADN recherch. La taille des fragments varie
gnralement de 50 paires de bases (pb) 2 kilobases (kb).
Au fil des cycles la quantit d'amplicons va augmenter de faon exponentielle. On obtient, en thorie 2n
copies pour n cycles. Dans la pratique, pour un rendement classique de 85 %, une PCR de 30 cycles produit
environ 106 copies (amplicons de taille attendue).
BIOTECHNOLOGIES
4. VISUALISATION DES PRODUITS DAMPLIFICATION

Les produits d'amplification sont soumis une lectrophorse en gel d'agarose additionn de
bromure dthidium (BET), ou de GelRed, ou de SybrGreen.
Les acides nucliques vont ainsi migr au travers du gel, en fonction de leur masse molculaire,
donc du nombre de bases de l'ADN test. La vitesse est inversement proportionnelle leur masse
molculaire donc du nombre de nuclotides prsents.
Le BET est un produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucliques. Lorsqu'elle est
intercale, cette molcule prsente une fluorescence orange sous illumination par des UV.
La prsence et la taille des amplicons pourront tre vrifies sur un lectrophorgramme, tel que
celui-ci-dessous :
1 : Amplicon lve 1.
2 : Amplicon lve 2.
3 : Marqueur de tailles (fragments dADN ayant un nombre de paires de bases connu).
2
1
1
a
Ligne de dpts
Sens de migration
cathode
anode
Grce au marqueur de tailles, la taille des amplicons visualiss peut tre dtermine
graphiquement, partir du graphique reprsentant le log du nombre de paires de base de chaque
marqueur de taille en fonction de la distance de migration de chaque marqueur de taille.
BIOTECHNOLOGIES

AT N2 : MISE EN VIDENCE DE LA PRSENCE DU GNE DINTRT DANS LE
GNOME DE Saccharomyces cerevisiae
TEMPS
CONTENUS

Rdige le compte-rendu.
Exploitation des rsultats

+
Rdaction du compte-rendu
Conseille.
Rpond aux questions ventuelles.
Analyse llectrophorgramme sur photo

et dtermine la taille de lamplifit obtenu
en utilisant loutil informatique.
Conclut sur la prsence ou non du gne
dintrt.
55
minutes
Bilan et Perspectives
Oriente la discussion
perspectives :
- comment vrifier
dintrt ?
- existe-t-il dautres
biothanol ?
- les biocarburants
davenir ?
pour largir sur des

lefficacit du gne
Recherche dides en utilisant les TIC.
biocarburants que le
sont-ils une solution
OUVERTURE :
Les biocarburants obtenus partir de la biomasse constituent-ils une nergie renouvelable ?

Scenarri Terminale Biocarburant Def

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