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PRACTICA N 1

Determinacin de aminocidos terminales con grupo alfa amino libre


Mtodo de Sanger.

INTRODUCCIN
El mtodo de Sanger para la determinacin de
aminocidos terminales es un mtodo til y
tardado para determinar el N-terminal de los
polipeptidos, fue descrito por Sanger, quien
encontr el grupo alfa amino libre de la
insulina.
El
1-fluoro-2,4-dinitrobenceno
(DNFB) reacciona con pptidos protonados ,
formando
derivados
2,4-dinitrofenilados.
Cuando tales derivados de un pptido se
someten a hidrlisis con HCl 6N, todos los
enlaces peptidicos se hidrolizan, pero el
enlace entre el grupo 2,4-dinitrofenilo y el
grupo alfa amino del aminocido N-terminal es
estable frente a la hidrlisis acida, por lo
consiguiente, el hidrolizado del pptido
dinitrofenilado contiene todos los restos de
aminocidos de la cadena peptidica en forma
de aminocidos libres, a excepcin del resto
N-terminal, el cual aparece como derivado
2,4-dinitrofenilado, de color amarillo, este
resto puede separarse e identificarse por
medio de una cromatografa en papel en
donde se hace la comparacin con los
aminocidos conocidos.
OBJETIVO
Identificar el aminocido alfa-amino terminal
de las cadenas de la molcula de
hemoglobina mediante el mtodo de Sanger.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
En la determinacin de Aminoacidos
terminales se usa el DNFB para que pueda
reaccionar con el N-terminal, acondicionando
el medio, el cual se le agrega NaHCO3 para
tener
condiciones
alcalinas
y
poder
desprotonar el grupo amino,
el cual al
enlazarse con
el DNFB
genera la
dinitrofenilacion, el HCl protonara al grupo
amino y reforzara el enlace del DNFB con la
hemoglobina, se elimina el exceso de reactivo
con las extracciones de ter y el bao maria,
el tercer paso es la hidrlisis y se lleva a cabo

con el HCl al 6N ya que rompe los enlaces


peptidicos aplicando temperatura y presin.
En la cromatografa, se comparar los
aminocidos conocidos con nuestro problema
para llevar a cabo la identificacin de Nterminal, al igual se coloca DNFB para
autenticar que el problema quedo sin residuos
de este reactivo.
RESULTADOS

Fig.1.1 Esquema de la Cromatografa en papel


de aminocidos conocidos comparados con la
muestra problema y DNFB.

CALCULOS
Resultados de los valores de Rf obtenidos
Distancia del frente = 31cm
Frmula:

Rf =

Distancia recorrida de Fase movil


Distancia recorridadel producto

PRACTICA N 1
Determinacin de aminocidos terminales con grupo alfa amino libre
Mtodo de Sanger.
Sustitucin

ANLISIS DE RESULTADOS

En el esquema de la cromatografa podemos


observar que los patrones de los aminocidos
se ven con una sola banda a cierta distancia,
en el problema se observan 2 bandas, una a
nivel del DNFB, lo cual indica que no se llevo
correctamente las extracciones con ter, y por
ello, quedaron residuos del reactivo, la otra
banda esta a nivel de la Valina y se
comprueba que el N-terminal de Hemoglobina
es este aminocido, adems con los datos
tericos y con los clculos de Rf obtenidos,
queda comprobado.

DNP-PHE

Rf =

20.2cm
31cm

Rf = 0.65

Rf =

DNP-ALA

21.4 cm
31 cm

CONCLUSINES

Rf = 0.69

Rf =

DNP-VAL

21.9 cm
31cm

El mtodo de Sanger es un mtodo


inespecfico y tardado para la
determinacin de a.a terminales

La determinacin de aminocido Nterminal con el mtodo de Sanger se


resume en 4 pasos.

En la dinitrofenilacion, el reactivo de
Sanger se une a la protena

El HCl al 3N refuerza el enlace del


DNFB con la hemoglobina adems
detiene la reaccin de dinitrofenilacion

El HCl al 6N hidroliza la protena

El aminocido N-terminal encontrado


en hemoglobina fue valina.

Rf = 0.70

16.5 cm
Rf =
31.5 cm

Rf =

Problema

21.8 cm
30 cm

Compuesto

Rf

Rf = 0.70

BIBLIOGRAFA
DNP-PHE

0.65

DNP-ALA

0.69

DNP-VAL

0.70

PROBLEMA

0.70

DNFB

0.49

GRANT Gregory A., Crankshaw Mark


W., Gorka John.; Edman sequencing
as tool for characterization of syntretic
peptides. Methods in Enzimology.
(1997). Pags. 289:395-414
Lehninger, Albert, Nelson, David L.
(1993). Principios de bioqumica.
Segunda edicin, ediciones Omega,
Barcelona, Espaa.