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27/11/2013

Cultivo de microrganismos
Disciplina: Microbiologia Geral

1) Inoculao

2) Isolamento

CULTIVO DE MICRORGANISMOS
EM LABORATRIO
3) Preservao

Inoculao

Cultivo em meio lquido

Semear ou inocular: introduzir artificialmente uma


quantidade de amostra (inculo) em um meio de
cultura adequado, com a finalidade de iniciar um
cultivo microbiano.
Incubao: Aps a inoculao, o meio de cultura
mantido a uma temperatura adequada para o
crescimento.
A inoculao pode ser realizada em meio lquido,
slido ou semi-slido, utilizando-se uma ala ou
pipeta estril.
Fig. 1 Tubo direita, meio BHI sem semeadura; tubo esquerda, meio BHI
aps crescimento bacteriano. Observar turvao indicativa de multiplicao
microbiana.

Cultivo em meio slido


Pode ser conduzido em tubos ou placas

Isolamento
Consiste na obteno da sua cultura pura;
essencial para se ter o microrganismo disponvel
para estudos de morfologia, taxonomia, reproduo
e fisiologia.

(A)

(B)

Fig. Distribuio de meio de cultura pelas placas de Petri (A) e


Inoculao dos meios de cultura slidos (B).

As operaes de isolamento so executadas sob


rigorosa assepsia, em ambiente prprio, usando-se
ferramentas
e
material
desinfestados
ou
esterilizados.

27/11/2013

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

IMPORTNCIA
Diversidade de microrganismos

Encontrados em culturas mistas com muitas espcies


diferentes ocupando o mesmo ambiente
Estudo das propriedades de um determinado
microrganismo em particular necessrio isol-lo em
cultura pura, isenta dos demais organismos.

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS
-Importante: conhecimento prvio da
necessidades nutricionais do microrganismo

ecologia

-Condies de cultivo: Luz, Temperatura, Umidade,


Oxignio

Contaminantes presentes no ar correspondem ao principal


problema, pois o ar sempre contm partculas de poeira, que
em geral apresentam uma grande comunidade de
microrganismos
Quando recipientes so abertos, estes devem ser
manipulados de maneira a impedir a entrada de ar
contaminado

-Condies do material a ser analisado: rgos de


plantas, solo, sementes

Procedimentos:
a.) Flambar a ala;
b.) remover o tampo de algodo;
c.) introduzir a ala na cultura de bactria;

Procedimentos:
d.) Mergulha a ala na cultura de bactria;
e.) Flamba a boca do tubo;
f.) Introduzir a ala no tubo contendo meio de cultura;

27/11/2013

Condies de incubao
- Sucesso do isolamento depende das condies de incubao
(temperatura, luminosidade e umidade);
- Temperatura: entre 20-25C favorece a maioria dos fungos
fitopatognicos; TC tima varia com a espcie envolvida;

- A luminosidade pode estimular ou inibir o desenvolvimento


do microrganismo, principalmente a produo de esporos
(importante na identificao das espcies);

MTODOS DE ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS
-Cmara mida para induo da esporulao;
-Isolamento de microrganismos do ar;
-Isolamento de microrganismos do solo;
-Isolamento direto;
-Isolamento monosprico;
-Isolamento de tecidos e rgos de plantas
infectadas;

- Microrganismos que ocorrem em condies de alta umidade,


requerem, no perodo de incubao, um ambiente adequado
para concretizao do processo;

Isolamento de microrganismos do
ar (anemfilos)

Isolamento de microrganismos do solo

-Mtodo da sedimentao em placas de Petri


contendo meio de cultura;

-As placas so abertas e expostas no ambiente por


30 minutos
-Anlise do ambiente interno e externo

Isolamento de tecidos e rgos de


plantas infectadas

Isolamento de fungos fitopatognicos

- Material deve apresentar boas condies e


exibir sintomas tpicos da doena;
- Deve ser retirado da regio de transio, entre
o tecido doente e o sadio

27/11/2013

Tcnica de semeadura em meio slido

Tcnica da semeadura
A escolha da tcnica de cultivo de
microrganismos varia de acordo com o tipo de
meio de cultura e a finalidade do cultivo
Tcnica de semeadura em meio lquido

Tcnica de semeadura em meio slido inclinado

Tcnica de semeadura em meio slido - utilizando


placas de Petri - Esgotamento

Tubos de ensaio com cultura de


microrganismos

Colnia bacteriana

27/11/2013

Importncia

Preservao
-Manuteno de uma coleo de microrganismos
-Permite que a pesquisa cientfica possa ser
realizada em qualquer poca do ano
-Armazenamento da cultura por longos perodos e
utilizao peridica
-Garantia da sobrevivncia, estabilidade e pureza

Escolha do mtodo de preservao

Manuteno da viabilidade: perda de clulas no

Armazenamento de culturas por longos perodos e


utilizao peridica para pesquisa e/ou produo

Evitar Contaminao
Perda de viabilidade
Mutao (perda das caractersticas fisiolgicas)
Mtodo adequado para um microrganismo pode no ser
adequado para outro;
Meios usados para um grande nmero de fungos (BDA,
malte-gar, V8-gar, aveia-gar, Czapeck, cenoura
gar).

Escolha do mtodo de preservao


Tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido
anteriormente e posterior manipulao; espao disponvel para
armazenamento;

processo de preservao e durante o armazenamento

Manuteno das propriedades originais: perda de


caractersticas de interesse cientfico ou industrial

Pureza: evitar chances de contaminao do microrganismo

Importncia do acervo: conseqncia de sua eventual perda;


culturas com potencial biotecnolgico preservao por mais de um
mtodo;
Necessidade de acesso e uso da cultura: rplicas em quantidades
adequadas; facilidade de reativao; preservao adequada para
embalagem de envio e condies de transporte

Custos de preservao e manuteno


Disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e
financeiros

MTODOS DE PRESERVAO DE
MICRORGANISMOS
Curto prazo
repique contnuo

Curto Prazo Repicagens Peridicas


Consiste na repicagem de microrganismos, em tubos de
ensaio contendo meios adequados (4 a 5 vezes ao ano), de
modo que o microrganismo seja transferido para outro tubo
antes que o substrato esteja completamente consumido.

Mdio prazo

Preservao em leo mineral


Preservao em gua
Congelamento a -20C
Secagem em slica, solo

Longo prazo
Liofilizao
Congelamento a -70C
Criopreservao em nitrognio lquido

Fatores a serem considerados


Meio adequado para manter a cultura
Temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 23 meses; geladeira (4 a 7 C) de 4-6 meses
Freqncia entre as transferncias: determinao
emprica
minimizar o n de repiques evitar a seleo de
mutantes
examinar a pureza em cada transferncia
conservar em duplicata

27/11/2013

Curto Prazo Repicagens Peridicas

Curto Prazo Repicagens Peridicas


Vantagens
Baixo custo
No requer equipamentos especializados
O manuseio simples
Desvantagens
Riscos de contaminao e possvel perda do material;
Perda de caractersticas morfolgicas, fisiolgicas ou
patogenicidade;
Seleo de clulas atpicas (variantes ou mutantes);
Superviso especializada;
Mo-de-obra;
Espao relativamente grande para o armazenamento;

Mdio Prazo Preservao em leo mineral

leo mineral deve ter pureza elevada; deve ser autoclavado


por duas horas;

Superfcie inclinada da cultura precisa ser totalmente recoberta


pelo leo, pois o miclio em contato com o ar drena a gua do
meio para o exterior, levando desidratao total da cultura;
A temperatura do ambiente de armazenamento deve ser
ajustada s necessidades individuais dos microrganismos a
serem preservados;
Repicagens provenientes de culturas em leo devem ser feitas
para o mesmo meio sobre o qual a espcie esta sendo
preservada e isso deve ser feito aps a drenagem total do leo.

Mdio Prazo Preservao em leo mineral


Consiste em recobrir culturas jovens, desenvolvidas
pelo mtodo clssico em tubos de ensaio, com uma
camada de leo mineral esterilizado;
Previne-se a desidratao do meio de cultura,
reduzindo a atividade metablica dos organismos
preservados;
Reduo do oxignio disponvel, uma vez que o leo
permite uma lenta difuso de gases;
Reduo da atividade metablica evidenciada pelo
retardamento do crescimento e da esporulao;

Mdio Prazo Preservao em leo mineral


Vantagens
- custo de equipamento;
- evita contaminao por
caros;
Desvantagens
- necessidade de mais
transferncias
at que a cultura revigore;
- requer espao para
amazenamento;
Armazenamento em geladeira ou em ambiente

27/11/2013

Mdio Prazo Preservao em gua


(Castellani)

Geladeira

Blocos de gar de 4-6 mm3

Mdio Prazo Preservao em gua


(Castellani)

Preservao em gua

Vantagens
- boa taxa de viabilidade
- evita contaminao por
caros

Desvantagens
- dificuldade da retirada
dos cubos na reativao
(Castellani)
- requer espao p/
armazenamento
- riscos de contaminao

10-15 mL gua destilada esterilizada

Mdio Prazo Preservao em solo ou areia


Foi idealizado e empregado por muito tempo para a
conservao de bactrias;
Teve tambm aceitao ampla em diversos laboratrios para
conservao de fungos;
Inoculao de um pequeno volume de solo seco e estril ou
areia estril, com pequena quantidade de suspenso de
esporos do fungo que se deseja manter, seguindo-se a
imediata secagem;
No permite o crescimento do fungo e preserva os condios
ou esporos inicialmente introduzidos no solo;

armazenamento em geladeira

Mdio Prazo Preservao em solo ou areia

Mdio Prazo Preservao em slica

Vantagens
Permitir longos perodos de preservao (ao redor de 5 ou mais anos);
Modificaes morfolgicas ou fisiolgicas so reduzidas ou praticamente
eliminadas;
Obteno de inculo por longos perodos, repicando-se pequenas pores
de solo quando se necessita reativar a cultura;
Manter a capacidade esporulao do fungo.

Desvantagens
Funciona apenas para um nmero reduzido de fungos (capacidade de
produzir esporos, ex. esclerdios, clamidsporos, microesclerdios, etc)
Dificuldade de se perceber contaminaes (so notadas quando se repica
o inculo para obteno de subculturas.

Recomendado para aqueles organismos que no toleram


liofilizao e Nitrognio lquido.
Organismos esporulados so estocados em slica gel
protegidos atravs do leite desnatado.
Slica gel fina sem corante esterilizada (90 min a 180 oC);
Suspenso esporos/clulas em leite desnatado a 10% e a 40 C;
Resfriar a slica a 4 oC;
Adicionar 0,5 ml em 4 g e acondicionar em vidros;
Deixar os vidros a 4 oC por 30 min;
Estocar por 1 a 2 semanas com as tampas frouxas;
Testar a viabilidade;
Vedar os vidros;

27/11/2013

Longo Prazo Liofilizao


- Recomendado para preservao de vrios microrganismos, por
longo perodo (20 a 30 anos);

A liofilizao remove a gua e outros solventes do produto


congelado pelo processo de sublimao.
A sublimao ocorre quando a gua no estado slido
convertida directamente em vapor de gua, sem passar
pelo estado lquido.
-

Longo Prazo Liofilizao


Vantagens

vedao total da amostra


longa viabilidade
estabilidade elevada em muitas espcies
produo em larga escala
no requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz)
fcil distribuio e transporte

Desvantagens

muitas espcies no sobrevivem ao processo


viabilidade ocasionalmente insatisfatria
mo-de-obra especializada
requer equipamentos sofisticado

Longo Prazo Congelamento em Nitrognio


Lquido

Processos:
precongelamento;
centrifugao-desidratao-congelamento e
desidratao a vcuo;
Tecnicamente mais complicado (habilidade e equipamento
dispendioso).

Longo Prazo Congelamento em Nitrognio


Lquido
princpio
induo da dormncia do microrganismo
armazenamento a - 196C

fatores a serem considerados

tipo de microrganismo
idade da cultura
agente crioprotetor
condies de estocagem
mtodo de descongelamento

Longo Prazo Congelamento em Nitrognio


Lquido
vantagens
condies estveis por longos perodos
vedao completa, evitando contaminao
utilizao para esporulados e no esporulados

desvantagens

viabilidade ocasionalmente insatisfatria


requer equipamento sofisticado
suprimento contnuo de N2
boa infra-estrutura caso de acidentes de vazamento

27/11/2013

CONSIDERAES FINAIS
O trabalho com microrganismos:
-Identificao
-Diagnose
-Caracterizao
Conhecimento prvio de caractersticas
Leitura, referncias bibliogrficas, busca por
mais informaes
Adequao dos mtodos com a estrutura do
laboratrio