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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE – UFS

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE


DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA

RELATÓRIO
ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE DA
AMILASE EM DETERGENTE EM PÓ E EM SALIVA

ALUNOS: FELIPE PIMENTEL E THIAGO HENRIQUE


CURSO: FARMÁCIA
TURMA: C1
PROFESSOR: Dr. HUMBERTO REIS MATOS

SÃO CRISTÓVÃO – SE
M AIO 2 01 0
OBJETIVOS:
o Verificar a atividade enzimática da amilase do
detergente em pó (ASSIM) de uso comum usando
amido solúvel como substrato.

o Verificar a atividade enzimática das amilases da saliva


usando amido solúvel como substrato.

o Fazer o uso do espectrofotômetro para a obtenção das


absorbâncias que comprovam a atividade enzimática.

o Observar as temperaturas e pHs adequados para se


atingir uma atividade ótima.

INTRODUÇÃO:
As enzimas, catalisadoras de sistemas biológicos, são
notáveis dispositivos moleculares que determinam o perfil
de transformações químicas. As características mais
impressionantes das enzimas são o seu poder catalítico e a
sua especificidade. A catálise ocorre em um local particular
na enzima, chamada de centro ou sítio ativo.

Assim quase todas as funções biológicas são


sustentadas por reações químicas catalisadas por enzimas,
os catalisadores biológicos. Um metabolismo eficiente é
controlado por vias metabólicas ordenadas seqüencial e
ramificadamente. A maioria das enzimas aceleram as
reações químicas sob condições fisiológicas, temperatura de
37°C e pH neutro. No entanto uma enzima não pode alterar
o equilíbrio da reação, mas somente acelerar sua
velocidade, diminuindo sua energia de ativação. As enzimas
são envolvidas na maioria das formas de metabolismo e a
regulação de suas atividades permite ao metabolismo uma
adaptação a condições em rápida alteração.

Os princípios básicos de uma reação catalisada por uma


enzima são os mesmos de uma reação química. Quando
ocorre uma reação química o substrato deve ganhar uma
energia de ativação até atingir o ponto denominado estado
de transição da reação no qual o nível de energia é o
máximo. Como o estado de transição da reação catalisada
pela enzima tem uma energia menor do que aquela da
reação não-catalisada, a reação pode ocorrer mais
rapidamente.

A maior parte das enzimas são proteínas, com exceção


da molécula de RNA que possui propriedades catalíticas.

As propriedades enzimáticas são também aproveitáveis


na área da biotecnologia industrial, essas são largamente
aplicadas em produtos de uso comum na limpeza doméstica
como sabão em pó e detergentes lava-louça.

Fatores que influenciam as reações enzimáticas

• Efeito da temperatura:

Em catalisadores inorgânicos, a velocidade da reação


aumenta com o aumento da temperatura do sistema. No
caso das enzimas a temperatura ideal de atuação é a
temperatura corporal, porém como muitas enzimas podem
ter atuação extra corpórea essas exibem uma temperatura
ótima in vitro, pois a estrutura tridimensional de uma
proteína envolve ligações fracas como pontes de hidrogênio,
que pode ser rompidas em temperaturas muito elevadas.

• Efeito do pH:

Da mesma forma as enzimas apresentam um pH ótimo,


uma vez que o pH do organismo encontra-se entre 6,8 e 7,4,
muitas enzimas funcionam otimamente nessa faixa. Existem
algumas enzimas com propriedades específicas, com um pH
ótimo entre 1,5 e 2,0, como a pepsina, secretada pelas
células gástricas e com funções nos sucos gástricos. As
modificações no pH interferem com as cargas iônicas das
cadeias laterais dos aminoácidos das enzimas, podendo
resultar em um efeito drástico na atividade catalítica da
enzima.

Além destes, várias moléculas, inclusive substratos,


produtos intermediários e moléculas reguladoras também
interferem com a atividade das reações enzimáticas. Alguns
compostos que podem diminuir a atividade da enzima são
chamados de inibidores enzimáticos. A inibição pode ser
reversível (inibição competitiva, não competitiva e
incompetitiva) ou irreversível (envenenada).

A especificidade enzimática:
A maioria das enzimas são altamente específicas tanto
para os tipos de reação catalisada quanto para a natureza
do substrato. A especificidade da reação e a reação que a
enzima catalisa são determinadas quimicamente pelos
resíduos de aminoácidos no centro catalítico da enzima. De
modo geral, o sítio ativo da enzima é composto por sítio
catalítico e pelo sítio de ligação do substrato. A
especificidade do substrato é determinada pela estrutura,
pelas cargas, pela polaridade e pela hidrofilia do sítio de
ligação do substrato. Isto se dá pelo fato de que o substrato
deve se ligar ao sítio ativo como primeiro passo da reação,
preparando a catálise. Enzimas altamente específicas, como
a catalase e a uréase, que degradam o H 2 O 2 e a uréia,
respectivamente, catalisam apenas um tipo de reação;
entretanto, existem algumas enzimas com uma
especificidade mais ampla pelos substratos e as serinas-
proteases são um exemplo típico deste grupo de enzimas.

Utilização de enzimas em produtos industriais:

A aplicação industrial mais larga das enzimas é a da


produção de detergentes. Elas substituem os produtos
cáusticos, ácidos, solventes e tóxicos tendo ainda a
vantagem de serem biodegradáveis.

As enzimas usadas com maior freqüência são as


proteases (degradam ligações peptídicas), lipases
(decompõem lipídeos), celulases (degradam celulose e
atuam nas fibras do tecido) e as amilases (degradam o
amido e outros glucídios de outros carboidratos).

O substrato amido:

O amido é um polissacarídeo de reserva em maior


quantidade nas plantas de duas formas: a α-amilose e a
amilopectina em uma proporção aproximada de 4:1. Na
digestão o amido é decomposto pelas enzimas amilases
presentes na saliva e no suco pancreático por meio de
hidrólise em carboidratos menores. O rompimento das
ligações glicosídicas α-1,4 da amilose origina uma mistura
de maltose, amilopectina e glicose. Essa amilopectina
também é rompida formando polissacarídeos chamados de
dextrinas. O amido é encontrado na forma de grãos nas
sementes, caules, raízes, entre outros, de algumas plantas
como trigo, feijão, arroz, milho, mandioca e outras.

Espectrofotômetro e análise especrtofotométrica:

Os espectrofotômetros são instrumentos que permitem


selecionar o comprimento de onda (lâmbda) da radiação
adequado à análise de um determinado componente e medir
a intensidade I do feixe emergente que corresponde a um
determinado feixe incidente Io, convertendo o sinal
recebido no detector em medida de absorbância para o
comprimento de onda da análise e desse modo determinar a
concentração de uma espécie em solução a partir do gráfico
da variação de absorbância (ou transmitância) em função da
concentração de várias soluções-padrão.

Este tipo de análise baseia-se nos princípios da


espectroscopia de absorção, na qual a concentração de uma
solução é determinada a partir do número de moléculas
presentes capazes de absorver luz em um determinado
comprimento de onda. O equipamento utilizado para essa
determinação é o espectrofotômetro que é capaz de fazer
medições nas regiões ultravioleta e visível, obtendo os
valores das absorbâncias.

A precisão dos comprimentos de onda para análise é


chamada de banda de passagem, mais comum na ordem de
10nm. O espectro da análise mais comum é de 360nm a
1000nm para a faixa visível.
METODOLOGIA:

MATERIAIS UTILIZADOS:

 Cubeta;

 Pipetas de 2 e 10 mL graduadas;

 Erlenmeyer de 100 mL;

 Bastão de vidro;

 Bomba de sucção (pêra);

 Tubos de ensaio;

 Estante;

 Espectrofotômetro a 550 nm;

 Banho Maria a 42°C e a 96°C;

 Solução de detergente enzimático (ASSIM) a 2%;

 Tampão fosfato a 0,1M, pH = 7,0;

 Amido solúvel;

 Água destilada;

 Reagente DNS;

 Amostra de saliva.
MÉTODOS:

o Preparar uma solução de detergente em pó (ASSIM)


a 2%;

o Preparar soluções de saliva enzimática substituindo-


se o detergente pela saliva nas soluções;

o Montar tubos de ensaio conforme as tabela


seguintes:

Reagentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5


Detergente 2% 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Tampão fosfato a 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL
0,1M
Amido solúvel 2 mL 2 mL2 mL 2 mL 2 mL
Incubação a 42°C 0 min. 5 min.
10 20 30 min.
min. min.
Reagente DNS 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mL
Incubação a 96°C 5 min. 5 min. 5 min. 5 min. 5 min.
Resfriamento Resfri Resfri Resfria Resfri Resfria
ar ar r ar r
Água destilada (H 2 O) 14 mL 14 mL 14 mL 14 mL 14 mL
TABELA DAS SOLUÇÕES COM O DETERGENTE.

o Foram feitas as leituras da amostra (3 mL) em 550


nm após adições, os tempos de incubação e a
diluição das amostras;

o Obtém-se uma amostra de saliva;

o Desta vez preparam-se tubos de ensaio contendo


saliva ao invés do detergente.

Reagentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3


Amostra de saliva 1 mL 1 mL 1 mL
Tampão fosfato a 3 mL 3 mL 3 mL
0,1M
Amido solúvel 2 mL 2 mL 2 mL
Incubação a 42°C 5 min. 10 min. 30 min.
Reagente DNS 1,5 mL 1,5 mL 1,5 mL
Incubação a 96°C 5 min. 5 min. 5 min.
Resfriamento Resfriar Resfriar Resfriar
Água destilada (H 2 O) 14 mL 14 mL 14 mL
TABELA DAS SOLUÇÕES COM A SALIVA.

o Fazer as leituras da amostra (3 mL) em 550 nm


após as adições, os tempos de incubação e a
diluição das amostras.

RESULTADOS E DISCUSSÕES:

No dado experimento verificou-se a ação da enzima


amilase sobre o substrato amido, produzindo uma mistura
de maltose, amilopectina, glicose e uma mistura de
polissacarídeos denominados dextrinas. Sendo as enzimas
biocatalizadores com grande especificidade tanto com
relação ao substrato quanto ao pH e a temperatura, foram
reproduzidas as mais próximas possíveis, as condições de
manutenção da integridade da enzima em análise. Tais
condições foram proporcionadas pelo uso do tampão fosfato
de pH 7,0 e um banho-maria na temperatura de 42°C.

Ao sair do aquecimento a 42°C foi adicionado ao tubo


de ensaio o reagente DNS que proporcionou a coloração
alaranjada na solução essencial na determinação
espectrofotométrica, visto que não há absorção alguma de
luz em substâncias incolores. A segunda etapa de incubação
tinha como objetivos paralisar a ação da enzima por meio
de desnaturação protéica e fixar a cor nos produtos da
reação favorecendo assim a identificação no aparelho da
espécie que se quer determinar.

O detergente em pó utilizado que continha a amilase foi


o da marca ASSIM que após as fases do teste apresentou os
resultados que foram obtidos através do espectrofotômetro
e representa a avaliação da atividade da amilase em função
do tempo de contato com o substrato amido solúvel
gelatinizado. (TABELA 1) E (GRÁFICO 1)

Absorbâncias dos produtos resultantes da ação da amilase


medidas no espectrofotômetro
Tub Tempo de incubação a Absorbância a 550 nm
o 42°C
1 0 minutos 0,091
2 5 minutos 0,090
3 10 minutos 0,030
4 20 minutos 0,046
5 30 minutos 0,021
TABELA 1: RESULTADOS DA ABSORBÂNCIA COM A UTILIZAÇÃO DO DETERGENTE ASSIM
EM FUNÇÃO DO TEMPO OBTIDOS COM AUXÍLIO DO ESPECTROFOTÔMETRO.
RESULTADOS DAS ABSORBÂNCIAS EM FUNÇÃO DO
TEMPO
Linha de absorbância

Margem de erro
0,1
Absorbância em 550 nm

0,09 0,091 0,09


0,08
0,07
0,06
0,05 0,046
0,04
0,03 0,03

0,02 0,021

0,01
0
0 5 10 20 30

Tempo (min)
GRÁFICO 1: RESULTADOS DAS ABSORBÂNCIAS COM AS RESPECTIVAS MARGENS
DE ERRO.

O ideal seria se os valores das absorbâncias


assumissem uma ordem crescente juntamente com o passar
do tempo (em relação à incubação a 42°C – atividade ótima)
o que indica um maior aproveitamento da ação enzimática.
Os maiores tempos de permanência na incubação a 42°C
proporcionam uma coloração mais intensa por motivos já
vistos, o que reflete na adição do reagente DNS e
posteriormente na incubação a 96°C a qual vai desnaturar
as proteínas, ou seja, quanto maior o aproveitamento
enzimático mais produtos serão formados e
conseqüentemente mais intensa a coloração ao desnaturar.

No gráfico foi feita uma regressão linear para a


obtenção da reta que mais se adaptava aos pontos que
estão deslocados e não mantinham uma constância de
crescimento.

A incoerência dos dados obtidos podem ter sido


decorrentes de alguns erros na execução do experimento,
como pipetagem e a imprecisão das temperaturas do banho-
maria. Além de problemas menores, como a não
solubilização total dos reagentes.

Nos tubos onde a fonte de enzima (amilase) passa a ser


a saliva obteve-se resultados esperados, ou seja, constante
crescimento comprovando a ação enzimática esperada.
(TABELA 2) E (GRÁFICO 2).

Absorbâncias dos produtos resultantes da ação da amilase da


saliva medidas no espectrofotômetro
Tub Tempo de incubação a 42°C Absorbância a 550 nm
o
1 5 minutos 0,110
2 20 minutos 0,208
3 30 minutos 0,295

RESULTADOS DAS ABSORBÂNCIAS EM FUNÇÃO DO


TEMPO
Linha de absorbância

0,3 0,295
Absorbância em 550 nm

0,28
0,26
0,24
0,22
0,208
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,11
0,1
5 20 30

Tempo (min)
TABELA 2: RESULTADO DA ABSORBÂNCIA DA SALIVA EM FUNÇÃO DO TEMPO.
GRÁFICO 2: RESULTADO DAS ABSORBÂNCIAS SEM NECESSIDADE DAS MARGENS DE
ERRO PELA OBTENÇÃO DE UM RESULTADO PRECISAMENTE LINEAR.

CONCLUSÃO:

A partir do experimento pode-se constatar a


indispensabilidade de enzimas nas atividades biológicas,
além de avaliar a veracidade de informações contidas nos
rótulos das embalagens dos detergentes comercializados,
garantindo assim, a presença das enzimas indicadas.

Pode-se confirmar também a presença de enzimas na


saliva, a partir dos resultados obtidos com o experimento,
percebendo uma maior ação enzimática em relação ao
detergente em pó devido a uma maior concentração de
enzimas na saliva que formaram mais produtos e,
conseqüentemente, após a medição no espectrofotômetro
verificamos que os valores das absorbâncias assumiram
valores maiores que os valores das absorbâncias dos tubos
com detergente em pó.
BIBLIOGRAFIA:

 LEHNINGER, Albert L. Lehninger princípios de bioquímica.


4ª Ed. – São Paulo – SAVIER, 2006;

 MARZZOCO, Anita e TORRES, B. Baptista; Bioquímica


básica, 2ª Ed.; Editora Guanabara Koogan – Rio de
Janeiro, 1999;

 BAYNES, John; DOMINICZAK, Marek H. Bioquímica Médica.


1ª Edição brasileira: Editora Manole