Manual de Laboratorio Toxicologia REIMPRESOS

MANUAL DE LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y TOXICOLOGÍA
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Practica # 1: BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

(BPL) Y BIOSEGURIDAD
Objeto
En este documento se registran una serie de directrices básicas sobre seguridad y

los posibles riesgos a los cuales se puede estar expuesto en el laboratorio de
Bioquímica y Toxicología. Con ello se pretende generar un ambiente propicio y seguro
para todas las personas que se encuentran desarrollando alguna actividad en este
espacio y disminuir el impacto directo sobre el entorno.
Objetivos específicos
Los objetivos específicos en materia de bioseguridad involucran una serie de

operaciones que pretenden identificar y disminuir el riesgo que involucran las
actividades a desarrollar, específicamente en este laboratorio. Sin desconocer que
existen otras que no se incluirán en este caso. En estas actividades podemos incluir:
Manipulación de material con riesgo biológico.
Utilización de sustancias y elementos químicos que pueden causar algún efecto
nocivo en el ser humano.
Medidas de protección.
Definiciones
Antimicrobiano: Agente que mata los microorganismos o suprime su

crecimiento y proliferación.
Antiséptico: Sustancia que inhibe el crecimiento y la proliferación de
microorganismos pero no necesariamente los mata.
Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 1 de 8

C:\Documents and Settings\Adres Felipe Zapata\Mis documentos\Dropbox\Laboratorio\Toxicología
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Buenas prácticas de laboratorio
Conjunto de lineamientos, procedimientos operativos y prácticas previamente

establecidas que son de obligatorio cumplimiento para asegurar la integridad de los
individuos, del medio ambiente y la calidad de los datos producidos en los diferentes
procesos que se ejecutan en los laboratorios.
Bioseguridad: Conjunto de directrices que tienen como objetivo principal

garantizar la biocontención mediante la implementación de tecnologías,
practicas y protocolos, para prevenir la liberación accidental y la exposición no
intencional a agentes biológicos, contaminantes y toxinas. Sin desconocer que
la protección no se encuentra delimitada solo a los elementos de origen
biológico sino también a los factores de riesgo de procedencia química y física.
Descontaminación: Cualquier proceso utilizado para la eliminación o muerte de
microorganismos. Sin embargo, desde el punto de vista químico se utiliza para
referirse a la eliminación o neutralización de sustancias químicas peligrosas y
materiales radioactivos.
Desechos no contaminados o no infecciosos: Aquellos que se pueden reutilizar,
reciclar o eliminar como “desecho común”. Estos deben ser dispuestos en la
caneca de color verde si se van a desechar en la ruta de basuras generales, en
la caneca gris si es reciclable o entregados al respectivo monitor si pueden ser
reutilizados en otra práctica.
Desinfección: Proceso que involucra el uso de un medio físico o químico para la
reducción en mayor o menor grado de microorganismos, pero no
necesariamente incluye la destrucción de esporas.
Desinfectante: Sustancia o mezcla de sustancias químicas utilizada para matar
microorganismos, pero no necesariamente esporas. Los desinfectantes suelen
ser de aplicación sobre superficies u objetos inanimados.
Ensayo: Sinónimo de prueba o método de prueba.
Esterilización: Proceso que involucra la muerte o eliminación de toda clase de
microorganismos incluyendo esporas.
Limpieza: Conjunto de operaciones empleadas para eliminar la suciedad
adherida a una superficie.
Material contaminado, anatomopatológicos y biosanitarios: Todo lo
correspondiente a órganos, tejidos o fluidos potencialmente contaminados de
origen animal y humano son considerados desechos anatomopatológicos. A su
vez, los materiales que incluyen: toallas de papel, gasas, algodón etc., que

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entren en contacto con fluidos orgánicos como sangre, suero, plasma, orina,
entre otros son clasificados como desechos biosanitarios.
Material contaminado reutilizable: Es el material que previamente puede ser
destinado a un proceso de desinfección o de esterilización, y luego ser
sometido a una acción de lavado con el fin de ser reutilizado o reciclado. No se
puede efectuar limpieza previa de ningún material contaminado
(potencialmente infeccioso).
Alcance
Este documento debe ser de consulta, conocimiento y aplicación de todo el

personal que ingrese al laboratorio de toxicología a desarrollar actividades de docencia
e investigación.
Consideraciones generales
Durante el trabajo en el laboratorio el estudiante deberá acoger las siguientes

directrices:
Usar la bata de laboratorio solo dentro de las áreas del laboratorio, es decir,
ésta se debe retirar para la circulación por fuera del mismo.
Lavar las manos antes y después cada práctica utilizando el jabón y/o
desinfectante respectivo.
Usar guantes de látex, nitrilo o guantes protectores apropiados para todos los
procedimientos. Una vez utilizados, los guantes se retiran de forma aséptica y
se depositan en el contenedor respectivo a continuación se realiza el respectivo
lavado y desinfección.
Evitar el contacto de los guantes en uso, con la piel de la cara o de los brazos, ni
con las perillas de las puertas, el teléfono, los libros u otras superficies que
posteriormente puedan ser usadas sin guantes.
Usar gafas de seguridad y tapabocas.
No fumar, ni consumir alimentos, ni medicamentos en el interior del
laboratorio.
Realizar desplazamientos con orden y precaución por el espacio del laboratorio.
No conversar, ni realizar actividades diferentes a las prácticas propias del
programa de Laboratorio.
Nunca utilizar los órganos de los sentidos como el gusto para analizar ni probar
ninguna muestra en un laboratorio de toxicología.

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Utilizar siempre los pipeteadores para dispensar los reactivos y muestras

líquidas.
Rotular siempre todo reactivo, solución o muestra que se prepare.
Ubicar y organizar los materiales y equipos que utilice de tal forma que no
representen peligro alguno para usted o para sus compañeros.
Utilizar únicamente las cantidades necesarias de cada reactivo según las
indicaciones del instructivo de la práctica.
Preservar las instalaciones, equipos y utensilios del laboratorio.
Asegurar la eliminación únicamente de material no contaminante por los
pozuelos y bajo la autorización del docente, monitor o tecnólogo del
laboratorio.
Manipular y descartar las muestras biológicas siguiendo las normas de
bioseguridad de la Universidad.
Al finalizar cada sección se debe dejar completamente limpio, desinfectado y
ordenado el material utilizado y el área de trabajo.
Comunicar de inmediato al profesor cualquier inconveniente o dificultad
presentada durante la práctica.
Bibliografía
Medina MM, Torres AH, Rodríguez AG. Normas de Trabajo en el laboratorio de

toxicología. Notas del curso. Laboratorio de Toxicología. Universidad de
Antioquia: Medellín, Colombia.
OMS. Manual de bioseguridad en el laboratorio. 3ª ed. [Internet]. Ginebra:
OMS. 2005. [Citado 27 de Julio de 2011]. Disponible en:
http://fcm.uncu.edu.ar/joomla/downloads/OMS.pdf
Clavijo E, Sierra U, Villamil M. Manual de buenas prácticas de laboratorio para
el registro ante el ICA. 2007: 28 p.
Comisión de Bioseguridad, Universidad Nacional Autónoma de Mexico.Manual
de Procedimientos de Bioseguridad. [Internet].México D.F.: UNAM. [Citado 27
de Julio de 2011]. Disponible en:
http://www.facmed.unam.mx/ci/pdfs/bioseguridad.pdf
Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica. Manual de Normas
de Bioseguridad. 2ª. Ed. [Internet].Chile.: CONICYT. 2008 [Citado 27 de Julio de
2011]. Disponible en: http://www.scribd.com/doc/8980585/Manual-
Bioseguridad-2008

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Practica # 2: ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LOS

MÉTODOS ANALÍTICOS
Características de funcionamiento de los métodos analíticos
Comprenden todos los datos y resultados experimentales generados en el proceso

de aplicación de un protocolo de análisis a una muestra determinada, los cuales
demuestran a su vez, que la metodología aplicada es apta para el uso al que fue
direccionado.
La selección de un método analítico debe ser realizada de forma que abarque todas
las necesidades del análisis y que se ajuste a las condiciones y posibilidades tanto de
infraestructura, como de equipos y de personal. Y debe ser realizada ya sea por la
persona líder del proceso o en consenso con el grupo de trabajo.
El método de análisis elegido debe reflejar de la forma más precisa y exacta el valor
real del parámetro a evaluar. Para la cual se debe conocer la naturaleza del analito de
interés, y su comportamiento en la matriz a utilizar, además de su comportamiento
durante la preparación de la muestra y posterior análisis.
Etapas de la Aplicación de un método analítico
Etapa 1: Preparación: Etapa en la cual se acondiciona la muestra par el análisis.

Muestreo, acondicionamiento, disolución, separaciones, purificación
Etapa 2: Medición: Interpretación de la señal obtenida en el equipo o mediante
la técnica instrumental
Etapa 3: Tabulación: Toma y tratamiento de datos.
Para la obtención de datos confiables y para el éxito de la aplicación del método

analítico se deben aplicar cada una de estas etapas de la mejor forma, de manera que
se garantice poca variabilidad y la poca incidencia de errores operacionales y del
analista.

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Además de todo lo expuesto anteriormente, para la elección de un método

analítico, para el trabajo en el laboratorio y el análisis de muestras, se deben tener en
consideración una seria de factores, los cuales garantizaran o no, la obtención de datos
confiables y ajustados a la realidad de acuerdo a los parámetros establecidos para el
análisis y la condiciones del laboratorio.
Dichos parámetros están enmarcados en la capacidad del método analítico para

mantener los criterios durante el tiempo y el comportamiento del mismo frente a la
presencia o no de analito (característica) de interés.
Parámetros fundamentales del método analítico
Fiabilidad (confiabilidad): Capacidad de un método analítico para mantener los

criterios fundamentales de la validación a lo largo del tiempo.
Rango: Valores o respuesta del instrumento limites (Inferior y superior) dentro
del cual se encuentra el valor deseado o esperado para el análisis. Diferencia
entre el valor mayor y menor permitido para la prueba.
Reproducibilidad: Capacidad que posee una método o prueba de laboratorio
de ser reproducido o replicado, por cualquier analista y obtener los resultados
de la misma calidad y confianza. Desde el punto de vista del instrumento con
esta variable se evalúa su capacidad dar el mismo resultado en mediciones
diferentes realizadas en las mismas condiciones a lo largo de periodos dilatados
de tiempo
Repetibilidad: Fidelidad de los valores experimentales de una misma magnitud
física medidos bajo las mismas condiciones experimentales. Incluyendo el
mismo analista, instrumento de medida, lugar y procedimiento así como la
cercanía en el tiempo.
Robustez: Capacidad de un equipo de no ser afectado por pequeños pero
deliberados cambios de las condiciones del análisis, cuando se evalúa esta
variable, se deben identificar cuales son los puntos críticos del método, además
de observar como la variación de estos afectan el la calidad y veracidad del
resultado final.
Idoneidad: Hace referencia al conjunto de parámetros relacionados con la
verificación del buen funcionamiento de los instrumentos analíticos y métodos
analíticos. Un sistema es idóneo (adecuado) si su respuesta, en el momento de
su utilización se ajusta a los requisitos fijados en la validación del método.

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Especificidad: Propiedad del método de producir una respuesta debido a la sola

presencia o de acuerdo al analito de interés, sin ser afectado o sujeto a
interferencia de otros componentes.
Sensibilidad: Grado de respuesta de un instrumento a un estimulo externo
generado con el fin de relacionar la presencia o concentración del analito con la
misma. Obteniendo un relación proporcional y lineal de respuesta del equipo
con respecto al analito. Por tal siendo lineal y proporcional. A través de la recta
obtenida en la curva de calibración, mediante la pendiente se evalúa el
parámetro para cada equipo
Linealidad: Proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta,
en un rango determinado.
Para el análisis de analitos y metabolitos en fluidos biológicos, se deben considerar

que los niveles deben abarcar todo el rango de concentraciones previstas, entre el 10 y
el 200% de la concentración promedio esperada para ese tipo de análisis en esa
muestra.
Para la valoración de la linealidad de los datos obtenidos, se pueden utilizar diferentes

herramientas (software) estadísticas y mediante el análisis por regresión lineal,
mediante el método de mínimos cuadrados.

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Y= bx + a Ecuación de la línea recta

Y Respuesta Equipo (variable dependiente)
X Concentración (variable independiente)
b Pendiente
a Intercepto
Los parámetros estadísticos que nos permiten medir o verificar la linealidad de los
datos son los siguientes:
Coeficiente de correlación: r
2
Coeficiente de determinación: R
2
Coeficiente de regresión: S X
Y Varianza del error experimental total
2
Varianza de la pendiente: S b
Precisión: Se define como el grado de concordancia que existe entre los datos
obtenidos bajo las mismas circunstancias y nos permite cuantificar el error
aleatorio o indeterminado de un análisis o metodología.
Se evalúa por medio de:
 Repetibilidad
 Reproducibilidad
 Desviación estándar
% Desviación Estándar Relativa (DER) (s) x 100

(X)
Desviación Estándar de la serie de datos S
Media aritmética de la serie de datos X
Exactitud: Expresa cual es el grado de acercamiento entre el valor medido o

calculado al aplicar un método con respecto al valor aceptado como referencia.
Indica la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximos
posibles al valor verdadero.
Se evalúa a través del porcentaje de recuperación, que expresa la cantidad de
analito recuperado (detectado) cuando se analizan muestras con
concentraciones conocidas.

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Una de las herramientas estadísticas que se aplica para establecer la precisión y

la exactitud es el “test de t de student”
Para comparar la media de una serie de resultados con respecto al valor
verdadero se analiza una serie de 6-10 veces una muestra de concentración
conocida y se aplica:
x1: valor tomado como referencia ( verdadero )

x2: media de la serie de datos
n: número de muestras analizadas
s: desviación estándar de la serie de resultados experimentales
Luego se lee el valor t tabla de la distribución t de student. Se comparan:
( t exp) y ( t tablas ) para el grado de confianza elegido.
Valores predictivos
La sensibilidad y la especificidad de una prueba solamente indican la proporción de

las muestras que han sido correctamente clasificadas como positivas o negativas pero
no predicen el número de muestras que serán clasificadas correctamente, cifra que
depende de la frecuencia del evento en el grupo de muestras al que se aplica la
prueba.
Valor predictivo positivo: de una prueba es la probabilidad de que una persona

(o muestra) presente el evento (o analito) en estudio cuando al aplicar la
técnica de análisis da un resultado positivo.
Valor predictivo negativo: de una prueba es la probabilidad de que una
persona (o muestra) no presente el evento (o analito) en estudio cuando al
aplicar la técnica de análisis da un resultado negativo.
Se evalúa con un grupo de muestras que contengan el analito buscado (positivas) y

sobre otro grupo de muestras que no lo contengan(negativas)
Los resultados se tabulan en una tabla de 2 X 2 así:

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MUESTRAS
RESULTADOS Positivas Negativas
a b
Positivos
Verdaderos Falsos
Positivos Positivos
c d
Negativos Falsos Verdaderos
Negativos Negativos
Cálculos
Sensibilidad = a/(a+c) es decir, S= (VP) / (VP +FN)
Valor Predictivo Positivo VPP = a/(a+b) es decir, VPP=(VP) / (VP+FP)
Valor Predictivo Negativo VPN= d/(d+c) es decir, VPN=(VN) / (VN+FN)
Limite de detección (ld): Es la mínima cantidad de analito o sustancia de interés

que puedes ser detectada en una muestra con razonable confianza, pero no
necesariamente cuantificada.
Limite de cuantificación (lc): Es la menor concentración o cantidad de analito

que puede ser determinada con aceptable precisión y exactitud bajo las
condiciones experimentales establecidas.
Evaluación:
o LD = 3 a _ De la ecuación: Y= bX + a
b
o LD = 3 S_
b
o LC = 10 S_
b

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BIBLIOGRAFÍA

Mehta AC. The validation criteria for anlytical methods used in pharmacy
practice research. J Clin Pharm Ther. 1989 Dec;14(6):465-73.
Miller JC, Miller JN. Estadística y Quimiometria para Química Analítica. 4ª ed.
España: Pearson Education; 2002. 278 p.
Manrique H. Rubén Darío. “Manual de Referencia para la Validación de
Técnicas Analíticas. Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses.
Medellín, 1995.
Moron, C. Zacarias, I. De Pablo, S. (1997). Instituto de Nutrición y Tecnología de
los Alimentos.(Cap 13) Universidad de Chile.
Martin, JM. (2007). Introducción para estudiantes de la facultad de física.
(Version 2). Sigillum Universitatis Litterariae Hispalensis

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Practica # 3: VALIDACIÓN DE MÉTODOS

CUALITATIVOS
Objeto
Identificar las características y principios de los métodos de análisis cuya respuesta

es la presencia o ausencia de la sustancia de interés. Evaluando su adecuabilidad en
presencia o ausencia de otros analitos que pueden reaccionar y originar resultados
falsos positivos o falsos negativos según el caso.
Objetivos Específicos
Aplicar una estrategia metodológica para validar un método analítico no

cuantitativo que puede ser utilizado en el análisis de un tipo de sustancias
específicas, en este caso fenotiazinas.
Aplicar una metodología de análisis cualitativo para determinar la presencia y/o
ausencia de Fenotiazinas.
Determinar la sensibilidad, especificidad, confiabilidad diagnóstica y límite de
detección del método utilizado para identificar fenotiazinas en un rango
determinado de concentraciones.
Establecer si el método tiene una buena adecuabilidad de acuerdo a los
parámetros anteriormente calculados para cada uno de ellos.
Definiciones
Adecuabilidad: Proceso que consiste en corroborar que los componentes,

reactivos o equipos incorporados en la generación de datos, funcionen de
forma apropiada.
Confiabilidad Diagnóstica: Probabilidad de que en una serie de muestras a
doble ciego, se detecte correctamente el metabolito, reactivo o analito de

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interés, debido a que ocurrió una adecuada reacción o interacción de los

reactivos, generando una respuesta analítica positiva.
Evidencia: Interpretación visible e igual para todos.
Especificidad: Es la probabilidad de que la respuesta analítica resulte negativa
debido a que en la muestra estudiada no existe físicamente el analito de interés
diagnóstico, o se encuentra por debajo del límite de detección.
Resultado Positivo: Respuesta analítica generada cuando la matriz de estudio
contiene una cantidad mínima detectable del analito de interés.
Resultado Negativo: Respuesta analítica no generada cuando se considera que
no esta presente en la matriz de estudio el analito de interés o se encuentra en
una cantidad inferior a la mínima detectable.
Selectividad: Extensión en la que un método puede utilizarse para determinar
analitos particulares en muestras o matrices sin interferencias de otros
componentes con un comportamiento similar.
Sensibilidad: Es la probabilidad de que la respuesta analítica resulte positiva
cuando en la muestra estudiada está realmente presente el analito de interés
diagnóstico, en los límites de detección o por encima de éste.
Validación: Proceso mediante el cual a través de evidencia documentada se
demuestra la adecuabilidad de una metodología analítica que puede ser
Cualitativa o Cuantitativa.
Validación de Método no Cuantitativo: Procedimiento que consiste en aplicar
una prueba diagnóstico en un mismo número de muestras o testigos
verdaderos positivos, que presenten la característica de referencia exacta a
estudiar y en testigos verdaderos negativos ausentes de la característica.
Generalidades
Obtención de pruebas convenientemente documentadas
Las pruebas convenientemente documentadas son evidencia de que un método de

fabricación o análisis es lo suficientemente fiable como para producir el resultado
previsto. Para ello es muy importante seguir las etapas de un proceso de validación y
considerar los parámetros o atributos de calidad de acuerdo al método de análisis:
cualitativo o cuantitativo a utilizar. Por tanto, a continuación se describe un proceso
general de validación y los parámetros a evaluar en la metodología analítica no
cuantitativa que aplicaremos en esta práctica.

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*USP: Farmacopea de Estados Unidos

*ICH: Conferencia internacional de armonización
Parámetros de calidad para métodos analíticos cualitativos
o Adecuabilidad
o Selectividad
o Especificidad y sensibilidad
o Valores predictivos: positivos y negativos
o Confiabilidad Diagnóstica
o Límite de detección
Materiales
Placas de Vidrio 20 x 20
Set de muestras
Contraste para placas
Reactivos
Soluciones de 2 muestras de fenotiazinas en diferentes rangos de

concentración de acuerdo a cada set de muestras.
Reactivo FPN (Reactivo General para Fenotiazinas):
o FeCl3 5 % (w/v)
o HClO7 20%
o HNO3 50%(v/v).

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o Se mezclan en una relación de 1 : 9 : 10
Nota: Cada semestre se utilizarán 2 fenotiazinas diferentes, por tanto, el color

considerado positivo para cada metodología deberá ser indicado al inicio de cada
práctica.
Sección Experimental
Para la realización de la práctica y validar el método analítico para la determinación

de la fenotiazina indicada por el profesor, por medio de la reacción con el reactivo
FPN, proceder de la siguiente forma:
Ubicar la placa de vidrio de 20 x 20 sobre el contraste.

Tomar una gota de cada una de las muestras (viales) contenidos en el set. Cada
vial contiene aproximadamente 1 ml de muestra desconocida por el analista.
Adicionar una gota del reactivo FPN a la gota de muestra en la placa de vidrio.
Este procedimiento se debe realizar muestra por muestra, no se deben
dispensar todas las muestras simultáneamente.
Observar el comportamiento de la muestra al reaccionar con el reactivo.
Registrar el resultado como positivo (+) o negativo (-), para la presencia de la
fenotiazina de acuerdo a las indicaciones del profesor.
Recomendaciones
Tener presente que cada muestra posee su propia pipeta para su dispensación,
para no contaminar las mismas y alterar los resultados.
Cada grupo de trabajo debe realizar como mínimo este procedimiento con 7
set´s diferentes la metodología.
Cuando finalicen la totalidad de las pruebas, cada grupo de trabajo debe de
entregar un pre-informe con los resultados para cada muestra.
Al final se les informara las concentraciones de cada una de las muestras, con el
fin de que los estudiantes realicen un comparativo con sus resultados y
obtengan el número de resultados Verdaderos positivos, Falsos positivos,
Verdaderos negativos y Falsos negativos, datos con los cuales elaboraran un
cuadro 2 x 2 para el informe final.

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Bibliografía

Trullols E, Ruisánchez I,Rius FX. Validation of qualitative analytical methods.
TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2004 Feb; 23(2): 137-145.
Ellison SL,Fearn T. Characterising the performance of qualitative analytical
methods: Statistics and terminology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2005
Jun; 24 (6): 468-476.
Sánchez JF, Tejada ME, Koch W, Mora JLA, Marroquín R, Hernández V, et al.
Validación de métodos analíticos no cuantitativos. Revista Méxicana de
Ciencias Farmacéuticas. 2010 Abr-Jun; 41 (2): 15-24.

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Practica # 4: Determinación de Monóxido de

Carbono y Cianuro
Objeto
Desarrollar habilidades y destrezas en la detección y confirmación de tóxicos
volátiles de importancia en el ámbito clínico-terapéutico, patológico, analítico,
ambiental, laboral, bromatológico y forense.
Detectar y confirmar la presencia de Monóxido de Carbono en una muestra de
sangre.
Realizar pruebas de orientación y confirmación necesarias para establecer la
presencia de cianuro en una muestra.
Generalidades
El estudio de los tóxicos en general puede enfocarse desde diferentes campos:

clínico-terapéutico, patológico, analítico, ambiental, laboral, bromatológico y forense.
En el campo clínico-terapéutico se estudiará la sintomatología y los tratamientos; en el
patológico, los fenómenos que perturban o perturbaron la función y morfología de uno
o varios órganos; en el analítico, las diferentes opciones a implementar como
metodología de análisis; en el ambiental, los riesgos ocasionados por contaminantes
derivados de procesos industriales, tecnológicos y/o domésticos; en el campo de la
medicina laboral, las intoxicaciones profesionales y los riesgos inherentes a la
manipulación de ciertas sustancias; en el bromatológico, los contaminantes presentes
en alimentos y en el forense, el que ha de tener en cuenta todas las ramificaciones
anteriores y explicará ante la justicia las lesiones personales que se causan por los
venenos, o los homicidios resultantes de la exposición o ingestión de sustancias
venenosas.

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Recomendaciones
Las características químicas de ambos compuestos hacen que sean tóxicos
volátiles.
Para su correcta manipulación deben de ser almacenados en recipientes que
permitan su manejo pero que eviten su perdida por volatilización.
Poseen alta capacidad de causar lesiones ya que son fácilmente absorbibles por
vía respiratoria.
Monóxido de Carbono (CO)
Resulta de la combustión incompleta de la materia orgánica, y por eso en muchos

incendios es una de las causas de muerte, también en minas de socavón, o en recintos
cerrados, como en garajes de automóviles en los que por accidente se olvida el motor
en marcha; fue utilizado en gas de alumbrado y a veces en calefacción. Los decesos son
por lo general suicidas y en ocasiones accidentales.
En este ámbito hay diversas profesiones y ocupaciones que se encuentran más
afectadas por los nocivos efectos de este producto químico, uno de los más
representativos son los agentes de tránsito y las personas que tienen como sitio de
trabajo las calles y las avenidas de la ciudad.
Además de estos existen actividades no centralizadas en la ciudad que también se
convierten en escenarios de riesgo para las personas, los cuales serian actividades
como la minería, en la cual la presencia de CO se puede determinar por medio de un
canario, el cual es altamente sensible.
Esta sustancia tiene una afinidad 200 veces superior por la hemoglobina en sangre,
que el O2 y por eso forma carboxihemoglobina. El cual es el principal riesgo de muerte
en los recintos cerrados.
Desde el proceso fisiológico, el intercambio gaseoso es el siguiente:
HB-Fe + O2 HB-Fe-O + CO2

(hemoglobina + Oxígeno) (oxihemoglobina + dióxido de carbono)
En la intoxicación por CO, el intercambio es:

HB-Fe.O2 + CO HBFeCO + O2
(Hemoglobina + monóxido de carbono) (Carboxihemoglobina)

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La sintomatología depende de la concentración de la carboxihemoglobina, y así se

establecen estos grados, cuando la exposición es mínimo de una hora:
GRADO % CARBOXIHEMOGLOBINA SINTOMATOLOGÍA

I 10-20% Cefalea ligera.
II 20-30% Cefalea, mareo, embotamiento.
Confusión, visión borrosa, cefalea
III 30-40%
intensa, taquicardia e hipotensión.
Trastornos de la memoria,
IV 40-50% confusión mental severa,
incoordinación, disnea.
Coma y muerte, si no es retirado
V 50% ó más
rápidamente del ambiente tóxico.
En la práctica, se determina el % de Hb saturada con CO. La ventaja de la unión Hb-

CO es fácilmente reversible por medio de un alto bombeo de O 2. Para la determinación
del CO solo se emplean muestras de sangre.
Cianuro (CN)
Algunos plaguicidas y aun el cianuro de potasio y de sodio, son usados por joyeros,
en galvanoplastia, en laboratorios fotográficos, en la industria química; se conoce
también como azul de Prusia. Se absorbe rápidamente por cualquier vía; los
compuestos alcalinos de las sales de cianuro en el estómago, son desdoblados por el
HCl gástrico en HCN, que es excesivamente tóxico, y al entrar a la circulación ataca los
citocromos oxidasas, produciendo la muerte por anoxia histotóxica. La sintomatología,
en la intoxicación aguda, es de algunos segundos a pocos minutos e inicialmente hay
convulsiones, pero rápidamente sobrevienen la inconsciencia y la muerte. En la
necropsia, la piel tiene livideces de un color rojo cereza, semejante al ocasionado por
el CO, y puede haber cianosis; cuando es ingerido, la mucosa gástrica en fresco es rojo
cereza, y al medir el pH del estomago, este reacciona al medio alcalino, lo que es una
gran pista para el diagnóstico; el estomado tiene también olor a almendras amargas.
En personas que se lo inyectan con fines suicidas, las vísceras aparecen de color rojo
cereza, por la cianohemoglobina b que se forma en la sangre, porque el ión CN
reacciona con el radical férrico de la hemoglobina; en la inhalación, tal como sucede en

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la cámara de gases, el color de las vísceras es también rojo rosado. En el laboratorio,

por su volatilidad, el análisis debe de realizarse rápidamente. Además, en vísceras en
descomposición hay producción de cianuro.
La identificación directa del ácido cianhídrico se realiza en los mismos recipientes

que contienen las muestras, preferiblemente estómago y su contenido, porque el
ácido cianhídrico se libera fácilmente a la temperatura ambiente debido a su elevada
presión de vapor.
El fundamento de la liberación del ácido cianhídrico se explica por la siguiente

reacción:
CN- + H2O HCN + OH-
Sección experimental
Reacciones de orientación: Son aquellas que permiten detectar la presencia de un

analito en la muestra problema, sin generar un valor cuantitativo.
Monóxido de Carbono
Método de dilución
La sangre normal debe presentar un color rojo amarillento, mientras que la
sangre que contiene CO presentará un color carminado, por el contenido de
carboxihemoglobina.
 Tomar 1 ml de sangre de la muestra problema en un tubo de ensayo grande

y adicionar 10 ml de H2O destilada o desionizada.
 Tomar 1 ml de sangre NO CONTAMINADA en un tubo de ensayo y adicionar
10 ml de H2O destilada o desionizada.
Sangre normal rojo amarillento

Sangre con CO rojo carmesí (intenso)
Hematina Alcalina
Mediante este método se produce la formación de la Hematina alcalina por la
reacción de la hemoglobina y el hidróxido de sodio. En presencia de la

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carboxihemoglobina ésta reacción ocurre más lentamente por lo cual se puede

observar la diferencia de color en un ensayo con sangre normal.
o A los mismos tubos del ensayo anterior agregar 5 gotas de NaOH al 10 %
Observar si la solución problema mantiene su color carminado durante algún

tiempo, si es asi, entonces la muestra contiene carboxihemoglobina (presencia
de CO). La solución de sangre normal cambiara rápidamente hasta adquirir un
color castaño (hematina alcalina).
(+)_Si permanece el color rojo carmesí por un tiempo

(-)_Aparición de un color castaño (cambio inmediato)
Cianuro
Shombein
Se basa en el aumento del potencial de reducción de las sales cúpricas al pasar
a sales cuprosas, las cuales son insolubles o poco disociadas. La transformación
del cobre (II) a cobre (I), se da a expensas del ión cianuro. Todo compuesto que
pueda transformar por reducción el cobre (II) a cobre (I) y origine un
compuesto coloreado, puede utilizarse para la prueba, en lugar de la resina de
guayaco.
8 HCN + 8 Cu +2 + C22H26O6 + H2O 8 CuCN + C22H24O9 +16H+

Ácido alfa guayaconíco Azul de guayaco
Compuestos alternos: BENCIDINA, FENOLFTALEINA, ORTOTOLIDINA.
 Tomar una tira reactiva impregnada de sulfato de cobre (II) (CuSO 4).
 Tomar la tira reactiva preparada en solución de CuSO 4 e impregnarla con la
solución de Bencidina en metanol recién preparada.
 Colocar el papel reactivo dentro del frasco que contiene la muestra para
análisis. Sin que esta roce las paredes del recipiente o el material de
análisis.
 La aparición de un color azul, indica que la prueba es positiva.

5-324
Esta prueba es altamente sensible (0.25 µg de cianuro), pero no es específica. Un

resultado positivo debe ser confirmado con una prueba de mayor especificidad.
Guignard
Formación de isopurpurato de sodio a expensas del ión cianuro sobre el picrato
sódico.
 Tomar una tira reactiva impregnada de Ácido pícrico
 Tomar 2.0 ml de la muestra problema y acidificarla con 0.5 ml de H 2SO4
concentrado.
 Colocar el papel reactivo dentro del vial que contiene la muestra
acidificada sin que esta roce las paredes del recipiente o el material de
análisis.
 En presencia del ácido cianhídrico el papel se torna rojo después de 15
minutos de exposición.
 Si no aparece la coloración esperar hasta 30 minutos o calentar a baño
maría a 70 °C, durante 15 minutos.
 Después de este tiempo si no se produce el cambio de color la prueba se
considera negativa.
INTERFERENCIAS: aldehidos, cetonas, anhidrido sulfuroso, ácido sulfúrico.
Reacción de confirmación: Este tipo de pruebas permiten determinar la presencia de

un analito y sus resultados pueden ser utilizados para la cuantificación del analito.
Monóxido de Carbono
Técnica de Feldstein y klendshoj

El monóxido de carbono liberado por acción del ácido sulfúrico al 10% en una
celda de microdifusión, se capta sobre una solución de Cloruro de Paladio, en la
cual el Monóxido de carbono reduce el ión paladio (+2) a paladio (0) y esto es
observado como una película plateada.
Pd 2 + + C O + H 2O C O2 + Pd 0 + 2 H +
 En una celda de Microdifusion (Conway), colocar en el compartimiento

interno 2 ml de la solución de cloruro de paladio 0.005 N

5-324
 En el compartimiento externo 2.0 ml de sangre de la muestra problema y 1

ml de ácido sulfúrico al 10 %, en puntos opuestos del compartimiento.
 Tapar y sellar la celda herméticamente con agua.
 Mezclar suavemente el agente liberador y la muestra en la celda.
Esquema de la prueba de microdifución con cloruro de paladio (PdCl 2)
 Dejar difundir durante 30 minutos en la estufa de secado (baño maría), Si

en la sangre hay monóxido de carbono se observa en la superficie del
compartimiento central una fina película de plata.
(+) Formación de película de plata

(-) No hay formación de película
Cianuro
Indirecto: Formación del azul de prusia

El ión cianuro reacciona con las sales de hierro para formar el Azul de Prusia
característico.

5-324
Reacciones:
Fe(OH)2 + 2 KCN Fe(CN)2 + 2 KOH

Fe(CN)2 + 4 KCN K4(Fe(CN)6)
3 K4(Fe(CN)6) + 4 FeCl3 12 KCl +
Fe4(Fe(CN)6)3
Azul de Prusia
 En una celda de Microdifusión (Conway) colocar en el compartimiento

interno 2 ml de Hidróxido de sodio al 10%.
 En el compartimieno externo depositar 2.0 ml de la muestra y 1 ml de
ácido sulfurico al 10%. En puntos opuestos del compartimiento.
 Tapar y suavente mezclar la muestra y el agente liberador.
 Dejar difundir durante 30 minutos a temperatura de 70°C en la estufa de

sacado (baño maria). Una vez transcurrido el tiempo de microdifusión, tomar
2.00 ml del compartimiento interno y traspasarlo a un tubo de ensayo grande.
 Agregar dos (2) gotas de sulfato ferroso (FeSO 4) al 10% y dos (2) gotas de
una solución de cloruro férrico (FeCl 3) al 10%.
 Agitar y calentar suavemente hasta ebullición en el baño maria.
 Enfriar con agua del grifo y luego adicionar Ácido clorhídrico concentrado
con precaución hasta pH ácido 0.5 - 1 (medir con tirillas).
 La positividad de la reacción estará dada por la aparición de un precipitado
–verde-azul.
Si existe poco ácido prúsico la solución toma primero un color entre el verde y el
azul, se necesitará un tiempo prolongado de reposo (hasta doce horas) para observar
algunos copos azules los cuales pueden ser filtrados y conservarse como prueba de la
presencia de cianuro.

5-324
BIBLIOGRAFÍA

Guatelli, Manuel. Intoxicación Oxicarbonada. Estudio Bioquímico y Metodología

analítica. Manuales EUDEBA, Editorial Universitaria de Buenos Aires. 1971.
Gisbert Calabuig Juan A. Medicina Legal y Toxicología. Ed. 4ta. Salvat Editores,
S.A. Barcelona. Pag 617.
Giraldo C. Medicina Forense. XIII edición. Medellín: Colombia, 2009. P. 422-

423.

5-324
Practica # 5: Determinación de Etanol
Objeto
Desarrollar habilidades y destrezas en la detección, confirmación y cuantificación
espectrofotométrica de etanol, sustancia reductora de importancia en el ámbito
clínico-terapéutico, patológico, analítico, laboral, bromatológico y forense.
Detectar y confirmar la presencia de Etanol en una muestra de sangre.
Realizar una curva de calibración para la cuantificación de Etanol en una muestra
problema.
Generalidades
El alcohol Etílico es un compuesto orgánico, fácilmente oxidable, su nombre común

mas utilizado es el alcohol, corresponde a un liquido incoloro e inflamable cuyo punto
de ebullición es de aproximadamente 78 °C
Este compuesto es el principal componente de las bebidas alcohólicas, algunos

productos cosméticos y de higiene. El alcohol etílico puede obtenerse industrialmente
por medio de varios procesos, los más utilizados debido a su rendimiento y facilidad
son la fermentación y la destilación.
El porcentaje de alcohol etílico presente en estos productos es variable de acuerdo

a las especificaciones de cada producto (ver tabla 1).

5-324
Tabla 1. Contenido de Alcohol en algunas bebidas alcohólicas
CONTENIDO DE ETANOL EN BEBIDAS ALCOHÓLICAS

Cerveza nacional 3-6 % v/v
Cerveza importada 4-7 % v/v
Vinos 10-12 %
Coñac, Whisky,
35-45%
Aguardiente, Ron
Ginebra 40-51 %
Vodka 50 %
Tequila 35-60 %
Desde el ámbito toxicológico es de gran importancia, dada su acción farmacológica

depresora del sistema nervioso central (SNC) y el abuso creciente del consumo de
bebidas alcohólicas. Esto último se encuentra asociado a su vez, a una gran cantidad
de accidentes donde se encuentran involucrados individuos en estado de embriaguez.
En la ingestión aguda de alcohol etílico la sintomatología varía de acuerdo con la
concentración de esta sustancia en sangre y por ende la concentración que alcanza
nivel del sistema nervioso central.
Metabolismo del Etanol
Las vías de penetración posibles de los alcoholes son la digestiva, la respiratoria, y la

absorción a través de la piel. En el caso del etanol, la intoxicación más frecuente ocurre
cuando el individuo ingiere cantidades excesivas de esta sustancia por el consumo de
bebidas alcohólicas fermentadas y/o destiladas.
El alcohol se absorbe, de ordinario, por la vía digestiva. Se inicia en el estómago, en

donde tiene lugar en su mayor proporción, y se continúa en el intestino delgado. La
rapidez de esta absorción depende de varios factores:
La cantidad de alcohol ingerido.

El grado alcohólico de la bebida ingerida.
La presencia, y su naturaleza, de los alimentos que haya en el estómago.
La habituación del sujeto.
Inmediatamente después de la ingestión, se inicia la absorción a través de la

mucosa digestiva, pasa a la vena porta, atraviesa el hígado y alcanza la circulación

5-324
general sanguínea y linfática. Se trata de un simple proceso de difusión en el que se

continúa cediendo el alcohol de la sangre a los tejidos. En este proceso se observa
como la concentración del alcohol en la sangre aumenta rápidamente después de la
ingestión; aumento que se mantiene, pues aunque en virtud de la difusión lo va
cediendo a los tejidos, tal cesión viene compensada con el nuevo paso del alcohol que
sigue absorbiéndose. Llega, no obstante, un momento en que se equilibran la
absorción y la difusión, con lo que la concentración se mantiene uniforme. En este
momento, llamado de equilibrio de difusión, la difusión del alcohol en el organismo es
bastante uniforme, con diferencias entre los diversos tejidos que dependen de su
riqueza en agua.
Conforme va llegando el alcohol a los tejidos se inicia el proceso de detoxicación,

constituido por oxidaciones sucesivas que transforman inicialmente el alcohol en
acetaldehído, después en ácido acético, para terminar en bióxido de carbono y agua;
en este proceso se desprenden 7.2 calorías por gramo de alcohol. Desaparecido parte
del alcohol de los tejidos, la sangre lo difunde nuevamente hasta volver a alcanzar
nuevamente el equilibrio de difusión que se rompe una vez más por destrucción
oxidativa, con paso acto seguido de alcohol sanguíneo. Este factor, oxidación tisular, se
añade a la estructura de cada tejido (con su respectiva riqueza en agua) para
determinar la cantidad de alcohol que presenta en un momento determinado. Según
su concentración alcohólica a los largo de todo el proceso metabólico, los tejidos
pueden clasificarse en un orden:
Sangre > Cerebro y riñones > Pulmones y corazón > Paredes duodenales > Músculos
estriados > Hígado
En un lugar sensiblemente distanciado figuran dos tejidos: el tejido adiposo y el

tejido óseo, cuya proporción en alcohol es mínima.
El proceso metabólico del alcohol se reduce en tres pasos: absorción, difusión,

oxidación. El elemento intermediario es la sangre, cuya concentración alcohólica, una
vez establecido el equilibrio de difusión, indica la marcha del proceso, e
indirectamente el estado clínico del sujeto. Dicho de otra forma, si los efectos clínicos
del alcohol dependen de la cantidad de éste presente en los tejidos y la misma
determina la alcoholemia existente en cada momento, el estudio de la concentración
del alcohol en sangre y la curva de alcoholemia tendrán un evidente valor diagnóstico
médico legal.

5-324
Su eliminación se realiza en un promedio de 10 a 15 mg% de la cantidad circulante

por hora, en una persona de 70 kg.
Fundamentos toxicológicos
Aspectos clínicos
Cantidades mínimas de alcohol normalmente son detectables, aun sin antecedentes
de ingestión, resultado de los procesos metabólicos. A continuación se describen
cuáles son las manifestaciones principales de acuerdo a la concentración encontrada
en sangre (ver tabla 2).
Tabla 2. Manifestaciones de toxicidad en ingestión aguda de alcohol.
mg% alcohol Manifestaciones

Hasta 20 No existe ninguna alteración
Entre 20-50 Puede existir alguna locuacidad y disminución de reflejos
Entre 50-85 Disminución de los reflejos y alteración en la percepción
85-100 En una tercera parte de las personas ya pueden existir síntoma de
embriaguez, y las inhibiciones sociales se encuentran disminuidas; las
respuestas se tornan lentas y se presenta incoordinación
100-155 La mitad de las personas están ebrias y existe una diminución definida de
reflejos y de la coordinación motora. Llevan a alteraciones sicomotrices
incompatibles con el manejo adecuado de un vehículo.
150-200 El 80% está francamente ebrio
200 Cualquiera está completamente ebrio
Mayor a 400 Llevan a coma, hipotermia e hiporreflexia, anestesia y colapso, y ya son
frecuentemente fatales
Mayor a 500 Sobreviene depresión del centro respiratorio y vasomotor y rápidamente
la muerte.
600-700 Coma profundo con muerte rápida
Mayor a 700 Incompatibles con la vida
Importancia en el sistema médico legal

El diagnóstico de la embriaguez agua es de crucial importancia, puesto que en
Colombia no permite la excarcelación de personas que causen lesiones u homicidios en
accidentes de tránsito. Además, es importante en otros campos. Homicidios en riña,
como potencializador de otros fármacos y drogas, y en siquiatría forense.

5-324
Ley 1548 del 05 de julio 2012 “Por la cual se modifica la Ley 769 de 2002 y la Ley
1383 de 2010 en temas de embriaguez y reincidencia y se dictan otras disposiciones”.
mg% alcohol Sanción

20-39 Suspensión de la licencia de conducción entre 6 y 12
meses
40-99 Primer grado-Suspensión de la licencia de conducción
entre 1 año y tres años.
100-149 Segundo grado-Suspensión de la licencia de conducción
entre 3 años y 5 años.
≥ 150 Tercer grado-Suspensión de la licencia de conducción
entre 5 años y 10 años.
Nota: 51 a 99 mg% se debe realizar examen clínico, para determinar si está bajo los
efectos del alcohol. A partir de 100 mg%, cualquier persona está impedida para
conducir un vehículo automotor.
Análisis de etanol
La determinación del alcohol etílico tiene importancia en el ambiente regulación de

circulación y tránsito, como en la conducción de vehículos públicos y privados, medios
de transporte masivo como aviones, trenes y barcos.
En la actualidad se cuenta con métodos de determinación rápidos que se aplican en
aire expirado, en las carreteras y vías por parte de los funcionarios de control de
tránsito.
Algunos de estos equipos determinan agentes volátiles reductores entre ellos el
etanol, otros son más específicos y determinan la molécula de etanol y no otros
volátiles. Los equipos se conocen con los nombres de borrachímetros, alcosensores,
alcotest, etc.
El dato obtenido en aire expirado, si se encuentra cerca o en el valor

contravencional de 50 mg%, debe ser confirmado en la muestra de sangre, por otro
método de otra categoría confirmativa y cuantitativa.
Existen métodos químicos, enzimáticos e instrumentales para la determinación de

etanol en fluidos biológicos.

5-324
En el país, 50mg% es el valor a partir del cual se infligen las normas de transito.
Los tipos de muestras generalmente usados para estas determinaciones son: sangre
(alcoholemia), orina, otros fluidos biológicos, vísceras, alimentos, etc.
Fundamento
El etanol es una sustancia volátil reductora que puede ser valorada en reacciones de
oxidorreducción y medir la intensidad de los complejos coloreados formados, con
propósitos cuantitativos.
Muestra
Sangre entera total anticoagulada. La toma de la muestra debe garantizar que el
etanol determinado es exclusivamente de origen exógeno. La adecuada preservación
para inhibir la formación de alcohol por microorganismos se logra con fluoruro de
sodio, el ión mercúrico y almacenamiento en frío. El etanol se pierde por volatilización
y destrucción por microorganismos. La oxidación de la hemoglobina puede ser
inhibida por azida sódica.
SECCIÓN EXPERIMENTAL
Método cualitativo
Tomar 2 ml de la muestra a analizar en un tubo de ensayo pequeño.

Adicionar 3 gotas de Dicromato de Potasio al 5% directamente en la muestra.
Agitar suavemente hasta garantizar completa homogenización de la muestra.
Agregar por las paredes del tubo Acido Sulfúrico concentrado (tratar que los
dos líquidos no se mezclen).
La aparición de un anillo verde o azul por la reducción del cromo en la zona de
contacto, es una prueba positiva para una sustancia volátil.
Los compuestos de interés toxicológico que también reducen la mezcla
sulfocrómica son: metanol, acetaldehído, acetona, formaldehído y en general
otros solventes orgánicos.

5-324
Método Feldstein y klendshoj-Microdifusión
La microdifusión se realiza en cámaras de Conway, en las que se deposita en el

compartimiento externo la muestra y agente liberador (CaC03) y en el interno el
agente fijador, la mezcla sulfocrómica: K2Cr207/H2SO4. El Etanol se oxida a acido acético
en presencia de dicromato de potasio. La reacción de oxido-reducción completa se da
a temperatura ambiente (25°C) en 3 horas.
Dispensar en el compartimiento interno de la celda de microdifusión (conway)

2 ml de la mezcla sulfocrómica (Reactivo de Feldstein).
Tomar 2.0 ml de la muestra problema y dispensarla en uno de los extremos del
compartimiento externo de la celda de microdifusión (conway).
Agregar 1 ml de la solución saturada de carbonato de calcio, en el extremo
opuesto a la muestra en el compartimiento externo.
Sellar la celda de microdifusión con agua destilada.
Mezclar suavemente el agente liberador y la muestra en la celda.
Dejar 3 horas la difusión a temperatura ambiente o en el baño maría o estufa
de secado a 70° C durante 30 minutos.
Pasado el tiempo de microdifusión, continuar con la cuantificación
espectrofotométrica de Etanol.
Nota: Esta prueba se le debe realizar a cada una de las muestras y a cada una de las
soluciones calibrantes y se debe preparar un blanco procesado bajo las mismas
circunstancias de las muestras.

5-324
Cuantificación espectrofotométrica (mg%)
Transferir el contenido del compartimiento interno con pipeta pasteur a un

balón de 10.0 ml y lavar con agua destilada este compartimento para retirar
toda la muestra. Finalmente, completar a volumen con agua destilada.
Leer la absorbancia de cada una de las soluciones asignadas a una longitud de
onda de 450 nm (si es posible realizar un barrido previo).
Como referencia para la lectura en el espectrofotómetro usar agua destilada.
Con las absorbancias corregidas y las concentraciones de cada una de las
soluciones calibrantes, se debe construir la grafica y determinar la ecuación de
la recta.
Nota: La dilución de cada estándar se debe realizar en un balón volumétrico de 50 ml
Curva de Calibración
Absorbancia
Calibrante C (mg%) Absorbancia
corregida
1 25
2 50
3 100
4 150
5 200
6 250
Blanco 0 mg %
Muestra # ____

5-324
Cálculos
Obtener mediante interpolación sobre la curva realizada la concentración (mg %) de

Etanol en la dilución. Recuerde tener en cuenta esta última para determinar la
concentración en la muestra original y expresarlo en mg%.
Bibliografía

Gisbert Calabuig Juan A. Medicina Legal y Toxicología. Ed. 4ta. Salvat Editores,
S.A. Barcelona. Pag 617.

491.
República de Colombia. “Por la cual se modifica la Ley 769 de 2002 y la Ley

1383 de 2010 en temas de embriaguez y reincidencia y se dictan otras
disposiciones”

5-324
Practica # 6: Determinación de Metanol
Objeto
Desarrollar habilidades y destrezas en la detección, confirmación y cuantificación
espectrofotométrica de metanol, sustancia reductora de importancia en el ámbito
clínico-terapéutico, patológico, analítico, laboral, bromatológico y forense.
Detectar y confirmar la presencia de Metanol en una muestra problema.
Realizar una curva de calibración para la cuantificación de Metanol en una muestra
problema.
Generalidades
El metanol es un alcohol primario, el cual es utilizado ampliamente en diferentes

industrias como solvente o en la elaboración de pinturas y barnices, soluciones
congelantes, también es utilizado para la desnaturalización del etanol y para la
adulteración de bebidas embriagantes. Lo que ha dado lugar a numerosas
intoxicaciones de carácter masivo dado el uso fraudulento de estas mezclas en bebidas
alcohólicas.
Metabolismo
El alcohol metílico es rápidamente absorbido en el tracto gastrointestinal y también

puede hacerlo por piel y vía respiratoria. Una vez absorbido se distribuye rápidamente
por los tejidos. Se pueden encontrar niveles de metanol en sangre 30 a 90 minutos
después de ser ingerido y su vida media se ha calculado en promedio de 2 a 24 horas,
pero en presencia de etanol puede prolongarse hasta 30 o 52 horas. El metanol es
eliminado en un 3 a 10% inmodificado por orina y en menor proporción por el aire
espirado.

5-324
La mayor parte del metanol que ingresa al organismo es metabolizado en el hígado

en un 90 a 95%, es oxidado por la enzima alcohol deshidrogenasa para ser
transformado en formaldehido, el cual es rápidamente convertido en ácido fórmico
por la enzima aldehído deshidrogenasa. Éste último se convertirá en anhídrido
carbónico (CO2) y agua mediante una oxidación dependiente del folato. El
formaldehído y el ácido fórmico son los metabolitos causantes del cuadro clínico
presente en la intoxicación. La administración de folatos durante el tratamiento ejerce
una acción protectora, estimulando la transformación del ácido fórmico en CO2.
La afinidad de la alcohol deshidrogenasa por el etanol sobre el metanol es 20 veces

mayor. Por tanto, en este principio radica el principal tratamiento de la intoxicación
por este último.
La eliminación del metanol puede darse desde diferente órganos y en diferentes

proporciones, a través del pulmón puede eliminarse cerca del 10-20% sin metabolizar,
cerca del 3 % por riñón y hasta el 60% es oxidado a formaldehído que no se encuentra
en orina, el ácido fórmico presente en orina puede ser del 2 al 5 %. La acumulación de
ácido fórmico es responsable de la acidosis metabólica y de las demás complicaciones
subsecuentes a la intoxicación por metanol. La acidosis láctica también se puede
presentar debido a la inhibición de la citocromo-oxidasa por parte del acido fórmico y
la hipoxia tisular.
Fundamentos Toxicológicos
Aspectos Clínicos
La susceptibilidad a los efectos tóxicos del metanol es variable, pero la ingesta de

una pequeña cantidad (15 a 30 ml al 100%), puede dar lugar a una intoxicación grave.
La dosis tóxica de metanol presenta variaciones individuales; para un adulto es de 60-
250 ml de metanol al 40%, aunque se ha reportado sobrevida con 500-600 ml y muerte
con tan sólo 15 ml.
El intervalo entre la ingesta y la aparición de las manifestaciones clínicas es variable

(de pocos minutos hasta 72 horas). En la mayoría de los casos los síntomas iniciales
(embriaguez, somnolencia y vértigo) se siguen de un periodo asintomático,
especialmente si el metanol se ingiere mezclado con etanol. Concentraciones de
etanol entre 100 y 150 mg/ml pueden retrasar la instauración de los síntomas hasta
que se haya metabolizado una cantidad suficiente de etanol como para que el metanol

5-324
empiece a transformarse en sus metabolitos tóxicos. Sin embargo, incluso si el

metanol se consume solo, pueden transcurrir de 12 a 24 horas hasta que se produzcan
concentraciones de metabolitos tóxicos en cantidad suficiente como para producir
síntomas. Debe tenerse en cuenta que la ausencia de clínica inicial no excluye el
posterior desarrollo de toxicidad importante.
Para una mejor comprensión en la evolución del cuadro clínico de la intoxicación por
metanol, se han caracterizado tres períodos.
Se distinguen usualmente 3 fases en la intoxicación por metanol:
Periodo latente
Periodo en el cual los pacientes pueden presentarse asintomáticos a la
intoxicación y puede estar en un lapso de 6 a 36 horas luego de la ingestión o
exposición.
Fase narcótica
Presentarse síntomas de embriaguez como en la intoxicación por etanol, ligera
depresión del sistema nervioso central, confusión, ataxia. La irritación
gastrointestinal puede dar como resultado náuseas, vómitos, y dolor
epigástrico. Todos estos síntomas se pueden presentar hasta 8 horas después
de la intoxicación por metanol.
Acidosis/neurotoxicidad
Puede producir dolor de cabeza, mareos, vómitos, respiración periódica, y
coma con fallo respiratorio, que conduce eventualmente a la muerte. Los
trastornos visuales son inmediatos al ataque de la acidosis metabólica. La
retina se congestiona, pupilas dilatadas y no reactivas y visión borrosa, el daño
en el nervio óptico puede conducir a la ceguera permanente. Todos los
síntomas asociados a la acidosis son dependientes al grado de ésta y por
consecuencia a mayor acidosis mayor toxicidad y daño funcional. Se pueden
presentar a su vez más daños en diferentes órganos asociados a su eliminación
y metabolismo.
Sistema Sintomatología
Aparato Respiratorio Taquipnea-Fallo respiratorio
Sistema Cardiovascular Bradicardia-Hipotensión-Fallo cardiaco
Sistema Gastrointestinal Dolor abdominal-Anorexia-Nauseas-Vomito
Sistema Neurológico Convulsiones-Coma-“Guayabo” como por etanol
Sistema Ocular Visión borrosa-Disminución del campo visual-
Atrofia óptica-Nistagmos-Pupilas dilatadas fijas-
Ceguera

5-324
Diagnóstico
Antecedente o sospecha de exposición a la sustancia Cuadro clínico compatible con la
intoxicación aguda por metanol Presencia de alteraciones visuales.
Aparición de acidosis metabólica.
Anión Gap osmolar elevado (>10-12 mOsm/kg H20)
La confirmación se obtiene mediante la determinación de niveles de metanol en
sangre o niveles de formaldehido y acido fórmico en orina/sangre
• Niveles séricos> 20mg/dl son tóxicos

• Niveles séricos> 40 mg/dl son letales
• Niveles séricos bajos o ausentes de metanol no descartan la intoxicación
Método Cualitativo
Corresponde a una reacción de oxido-reducción con K2Cr2O7. Este tipo de reacción
es general para alcoholes primarios y secundarios, por lo cual no es considerada una
reacción confirmatoria, sino presuntiva.
2 ml de muestra + 3 gotas de K2CrO7 al 5%

Homogenizar
Adicionar por las paredes 1 ml de H2SO4 concentrado y homogenizar
nuevamente.
(+) Aparición de anillo verde-azul (Cr+3)

5-324
Método Feldstein y klendshoj-Microdifusión

La microdifusión se realiza en cámaras de Conway, en las que se deposita en el
compartimiento externo la muestra problema y el agente liberador (CaCO3) y en el
interno el agente fijador (H2SO4 10%). El Metanol se oxida a acido fórmico en presencia
de dicromato de potasio. La reacción de oxido-reducción completa se da a
temperatura ambiente (25°C) en 3 horas.
Dispensar en el compartimiento interno de la celda de microdifusión (conway)

2 ml de ácido sulfúrico 10%.
Tomar 2.0 ml de la muestra problema y dispensarla en uno de los extremos del
compartimiento externo de la celda de microdifusión (conway).
Agregar 1 ml de la solución saturada de carbonato de calcio, en el extremo
opuesto a la muestra en el compartimiento externo.
Sellar la celda de microdifusión con agua destilada.
Mezclar suavemente el agente liberador y la muestra en la celda.
Dejar 3 horas la difusión a temperatura ambiente o en el baño maría o estufa
de secado a 70° C durante 30 minutos.
Transcurrido el tiempo de microdifusión, tomar el contenido del
compartimiento interno y llevarlo a un tubo de ensayo.
Luego, agregar 2 gotas de Permanganato de potasio 3% en ácido fosfórico 15%
(agente oxidante).
Esperar un minuto a que se de la oxidación del metanol.
Adicionar:
a. 1-2 mg de bisulfito de sodio para decolorar el exceso de permanganato.
b. 1-2 mg de ácido cromotrópico para formar un complejo coloreado con el
producto de la oxidación del metanol.
c. 2 mL de ácido sulfúrico concentrado, por las paredes del tubo para revelar
el color.
Observar el anillo de color morado que se forma en la interfase si la muestra
contiene metanol.
Esperar 20 minutos a que se complete la reacción y leer en el
espectrofotómetro a 570 nm.

5-324
Cuantificación espectrofotométrica (mg/ml) (Curva de calibración)
Tomar en un tubo de ensayo 1.0 ml de muestra problema o de la solución

calibrante.
Adicionar 2 ml ácido sulfúrico 10 % para precipitar las proteínas.
Tomar 1.0 ml de la solución sobrenadante con la micropipeta y llevarla a otro
tubo de ensayo.
Agregar:
o 2 gotas de Permanganato de potasio 3% en ácido fosfórico 15% y esperar
un minuto.
o 1-2 mg de bisulfito de sodio para decolorar.
o 1-2 mg ácido cromotrópico
o 2.0 ml de ácido sulfúrico concentrado por las paredes (volumétricos)

5-324
observar el anillo formado en la interfase.

Agitar y esperar 20 minutos el desarrollo del color.
Tomar 1.0 ml y llevar a un balón de 25 ml y aforar
Leer en el espectrofotómetro a 570 nm (si es posible realizar un barrido previo).
Nota: Esta prueba se le debe realizar a cada una de las muestras y a cada una de las
soluciones calibrantes y se debe preparar un blanco procesado bajo las mismas
circunstancias de las muestras.
Si la muestra presenta una absorbancia por encima de las registradas en la curva de

calibración, esta se debe diluir. Se recomienda diluciones 1/2 y luego 1/5 y
sucesivamente.
Interpretación
Iguales cantidades de color en ambos filtrados oxidados y sin oxidar deben ser
consideradas como negativos.
El método es sensible y detecta aproximadamente 10 mg de metanol /100 ml de
sangre.
Se debe hacer control negativo el cual no debe presentar ninguna coloración.

5-324
Interferencias
Falsos positivos: formalina, heparina, metenamina y EDTA.
El efecto deshidratante del ácido sulfúrico concentrado puede producir formaldehído a
partir de determinados compuestos orgánicos y obtenerse falsos positivos. Esta
interferencia se observa ocasionalmente en pacientes con severa acidosis. Por esta
razón se debe realizar un ensayo con filtrado no oxidado.
Cálculos
Representar la curva de calibración para la determinación de metanol y determinar
por el método gráfico y matemático la concentración (mg/ml) de metanol en la
muestra problema.
Bibliografía
Medina MM, Torres AH, Rodríguez AG. Notas del curso. Laboratorio de
Toxicología. Universidad de Antioquia: Medellín, Colombia.
491.
CLARKE’S ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS. In
Pharmaceuticals, body fluids, and post-mortem material. Second edition.
Senior Consulting Editor. A. C. Moffat. London the Pharmaceutical Press.
1986. The Pharmaceutical Society of Great Britain. Pág. 593-594.
Suárez LA, Arellano R, Bernal E. Metanol como marcador de abuso en el
consumo de alcohol en muestras forenses. Revista de Toxicología. 2009;
26(2-3):137-140.

5-324
Practica # 7: Determinación de Psicofármacos en

Muestras No Biológicas
Objeto
Comprender las características de las pruebas presuntivas y confirmativas utilizadas a

nivel de toxicología para la identificación de psicofármacos presentes en muestras no
biológicas.
Realizar una marcha para establecer la presencia o ausencia de algunos
psicofármacos en muestras no biológicas.
Aplicar las pruebas cualitativas más comunes que direccionan el proceso de
identificación de algunos psicofármacos en muestras no biológicas.
Pruebas de orientación
Las pruebas de tamizaje permiten orientar los análisis de una determinada muestra.
Permite saber si en una determinada muestra hay o no la presencia de un analito de
interés. Estas pruebas se caracterizan por su fácil realización y rapidez de los
resultados.
Existen una serie de factores que pueden afectar los resultados obtenidos cuando
se aplica una prueba de orientación a una muestra, entre ellos tenemos la apariencia
física, concentración de la sustancia activa, cantidad o tamaño de la muestra (ej. LSD ),
presencia de adulterantes coloreados o sustancias naturales ( opio, cannabis ),
presencia de mezclas de drogas.

5-324
Pautas a seguir para obtener la máxima fiabilidad en las pruebas
Si la cantidad de muestra es muy pequeña, mejor realizar las pruebas de

confirmación
Para muestras en polvo, utilizar hasta miligramos
Tabletas u otros materiales sólidos o resinosos (hachís, opio), reducir a polvo
una pequeña porción de la muestra a analizar.
Cápsulas: utilizar una pequeña cantidad de polvo de la muestra.
Vegetales: Moler una cantidad y realizar el ensayo.
Cigarrillos: Abrirlos, tomar una pequeña cantidad de sustancia vegetal, molerla
y analizar.
Sustancias vegetales que den resultados negativos con análisis usuales y que
parezcan haber sido tratados con otros productos químicos o drogas, hacer
pruebas de confirmación.
Pruebas de campo
Son pruebas de orientación que se realizan en el lugar donde se han encontrado

alguna sustancia sospechosa de ser un psicofármaco.
Normalmente pueden realizarse:
En placa de gotas
En tubos de ensayo
En papel filtro
Tiras de papel indicador
Reactivos previamente envasados en un recipiente ( ampollas )
Mínimo dos ensayos rápidos para cada sustancia o grupo de sustancias a
investigar.
Interpretación de los ensayos
Un resultado positivo de la prueba sólo significa la posible presencia de la(s)

sustancia(s) detectada, se debe realizar una prueba de confirmación.
Si el resultado de la prueba de orientación es dudoso, se debe realizar una
prueba de confirmación.
Un resultado negativo, indica la ausencia del analito que se busca en la
muestra, para el límite de detección de dicha prueba.

5-324
Toda muestra que llega al laboratorio debe ser correctamente descrita desde su
empaque, hasta el aspecto de la muestra. Luego, se procede a hacer el pesaje de la
misma para obtener su peso neto.
Generalidades de las muestras
Marihuana
Cannabis sativa L.
Su principal componente activo es el 9-tetrahidrocanabinol
Productos del cannabis:
o Planta de cannabis
o Resina de cannabis: la resina separada, en bruto o purificada, obtenida de la
planta de cannabis.
o Aceite de cannabis: concentrado de cannabis obtenido por extracción de la
planta o de la resina que contiene generalmente un aceite vegetal.
Coca
“Arbusto de coca" es cualquier especie del género erythroxylum.
Productos de la coca:
o Hojas de coca
o Pasta de coca: es un extracto de las hojas del arbusto de coca. Contiene
alcaloides de la coca y también se denomina cocaína base. Purificándola se
obtiene la cocaína.
o Cocaína: alcaloide extraído de la hoja de coca o sintetizado a partir de la
ecgonina.
o Crack: es la cocaína base " base libre " obtenida a partir del clorhidrato de
cocaína por un procedimiento especial de transformación para poderla
fumar.
Opiáceos
En sentido estricto, las drogas derivadas inmediatas del opio tales como la morfina y la
codeína.
o Morfina base
o Heroína: opiáceo semisintético obtenido a partir de la morfina.

5-324
Fármacos
o Anfetaminas y otras drogas de diseño: sustancias sintéticas,
químicamente afines con efectos estimulantes sobre el sistema nervioso
central.
o Anfetaminas de diseño: Se diferencian de las anfetaminas
convencionales en la rapidez del comienzo de efectos, su duración y su
potencia; y pueden actuar como alucinógenos.
 MDA: Tenanfetamina
 MDMA: 4,4- metilendioximetanfetamina
 MDE: N-etil-3,4-metilendioxianfetamina
Se presentan en forma de polvo blanco o marrón claro o en tabletas y cápsulas de

formas y colores diferentes, con logotipos sugestivos impresos.
Alucinógenos
LSD ( Dietil amida del ácido lisérgico )
Droga semisintética derivada del ácido lisérgico, alcaloide que se encuentra en el
Claviceps purpurea, hongo del centeno y otros cereales (cornezuelo). Es incolora,
insabora, inodora, cristalina, soluble en agua o alcohol.
Benzodiacepinas
Depresores del sistema nervioso central.
Diazepam, Clordiazepóxido, Flunitrazepam, Oxazepam, Medazepam, Clonazepam.
Se presentan en tabletas o cápsulas de diversos tamaños y colores y en preparados
farmacéuticos listos para inyección o ingestión.
Fenotiazinas
Depresores del sistema nervioso central. Tranquilizantes.
Clorpromazina, Levomepromazina (methotrimeprazine), trifluoperazina. En tabletas o
en otras formas farmacéuticas.
Antidepresivos triciclicos
Amitriptilina, Imipramina, Nortriptilina. En tabletas o en otras formas farmacéuticas.
Barbitúricos
Depresor del sistema nervioso central.
Fenobarbital, Tiobarbital, Pentobarbital. En tabletas o en otras formas farmacéuticas.

5-324
Análisis de muestras para detectar e identificar marihuana – cannabis
Examen Microscópico
Se refiere a la determinación de características botánicas de la planta de cannabis
por observación al estereomicroscopio o al microscopio.
Muestra: Material vegetal pulverizado o desmenuzado.
Procedimiento
o Colocar una pequeña cantidad del material vegetal desmenuzado sobre
un portaobjetos.
o Observar al microscopio bajo aumento de 10 X
o Observar la presencia de estructuras de carbonato de calcio como
tricomas y cistolitos, en forma de uña de gato.
Prueba de Duquenoise - Levine

Es una prueba de coloración que evidencia la presencia de fluoroglucinol en la
muestra.
Reactivo Duquenoise-Levine.
Disolver 2 gramos de vainillina en 100 ml de etanol al 95 %. Agregar seguidamente 2.5
ml de acetaldehído.
Acido clorhídrico concentrado.
Procedimiento
o Colocar una pequeña cantidad de muestra en un tubo de ensayo.
o Agregar 20 gotas del reactivo de Duquenoise y agitar durante un
minuto.
o Agregar 10 gotas de ácido clorhídrico concentrado. Dejar en reposo
durante un minuto la muestra así tratada.
o Observar la aparición de un color en la gama del azul al violeta oscuro
en la parte inferior del tubo, este indica la posible presencia de
cannabis.
Prueba de confirmación
Se realiza por separación por cromatografía de capa delgada comparando con
patrones o por HPLC

5-324
Análisis de muestras para detectar e identificar cocaína
Prueba de tanred
Es una prueba general para la identificación de alcaloides. Es una prueba de
orientación basada en la precipitación de los alcaloides presentes en una muestra,
evidenciado por la aparición de un precipitado amarillo lechoso.
Muestra: Mínima cantidad de sustancia sólida triturada hasta polvo fino.
Reactivo Tanred
Mezclar 20 ml de ácido acético con 1.3 gramos de cloruro mercúrico y 3.3
gramos de yoduro de potasio, completando con agua hasta un volumen de 64
ml.
Procedimiento
o Colocar una mínima cantidad de muestra en un tubo de ensayo.
o Agregar 1 ml de agua destilada
o Agitar y agregar 2 gotas del reactivo de Tanred.
Prueba de Scott
Prueba del Tiocianato de cobalto modificada. Es una prueba de precipitación que
detecta desde 1 % de cocaína. Como se realiza en secuencia, sólo muy pocas
sustancias diferentes a cocaína presentan la secuencia de color similar.
Reactivo de Scott
Tiocianato de cobalto (II) en 50 ml de ácido de ácido acético al 10 5 y agregar
seguidamente 50 ml de glicerina.
Acido clorhídrico concentrado.
Cloroformo
Procedimiento
o Colocar una fracción de muestra en un tubo de ensayo.
o Agregar cinco gotas del reactivo de Scott.
o La formación de un precipitado azul turquesa indica prueba
parcialmente positiva.
o Agregar máximo dos (2) gotas de ácido clorhídrico concentrado, al
mezclar, el color azul turquesa desaparecerá y la solución toma
coloración rosada.

5-324
o Agregar varias gotas de cloroformo para observar la separación de las

fases. La capa clorofórmica adquiere color azul intenso si la muestra
contiene cocaína.
NOTA: Realizar la prueba con un blanco simultáneamente con la muestra.
Prueba espectrofotométrica
La cocaína en solución ácida diluida exhibe un espectro en la región
ultravioleta con un máximo de absorbancia a 233 nm y otro de menor
intensidad a 275 nm.
Reactivos
Solución diluida de ácido sulfúrico 0.5 N.
Procedimiento
o Colocar una pequeña cantidad de la muestra a disolver en solución

diluida de ácido sulfúrico 0.5 N.
o Correr un espectro de la muestra entre 325 y 200 nm.
o Registrar el espectro de absorbancia y comparar con el de un patrón de
cocaína.
Análisis de muestras para detectar e identificar opiáceos (opio, morfina,

codeína, heroína)
Prueba de Tanred
o Colocar una mínima cantidad de muestra en un tubo de ensayo.
o Agregar 1 ml de agua destilada
o Agitar y agregar 2 gotas del reactivo de Tanred.
Prueba de Marquis
Una 1 gota de formaldehído mezclada con 1 ml de ácido sulfúrico.
Procedimiento
o Colocar una mínima cantidad de una placa de pruebas a la gota.
o Dejar caer sobre la muestra 2 gotas del reactivo de Marquis.
o La aparición de un color violeta oscuro se considera prueba de orientación
positiva para opiáceos.

5-324
NOTA: Es una prueba de coloración de alcaloides opiáceos.
En solución ácida diluida, exhiben los siguientes máximos de absorbancia:
En solución ácida En solución alcalina
Codeína: 285 nm
Heroína: 279 nm 299 nm
Morfina: 285 nm 298 nm
Reactivos
Procedimiento
o Colocar una pequeña cantidad de la muestra a disolver en solución

diluida de ácido sulfúrico 0.5 N
o Registrar el espectro de absorbancia y comparar con el de un patrón.
Análisis de muestras para detectar e identificar anfetaminas
Prueba de marquis
Es una prueba de coloración para anfetaminas en la que varía el color producido en la
reacción según la estructura química de cada una.
Reactivos Marquis
Una 1 gota de formaldehído mezclada con 1 ml de ácido sulfúrico.
Procedimiento
o Dejar caer sobre la muestra 2 gotas del reactivo de Marquis.
o La aparición de colores naranja, amarillo, marrón sugiere la posible
presencia de anfetaminas en la muestra. La aparición de color negro es
prueba de orientación que indica la posible presencia de anfetaminas
con sustitución en el anillo.

5-324
Prueba de coloración de Simon

Es una prueba de coloración para anfetaminas con sustitución en N - como MDMA y
otros derivados.
Reactivo de Simon
A - Disolver 0.9 gramos de nitroprusiato sódico en 90 ml de aguay agregarle 10
ml de acetaldehído.
B - Solución de carbonato de sodio al 2 % en agua.
Procedimiento
o Dejar caer sobre la muestra 2 gotas del reactivo de Simon A.
o Agregar 2 gotas de Simon B
o La aparición de un color azul se considera prueba de orientación positiva
para metanfetamina.
Las anfetaminas metiladas, en solución ácida diluida exhiben un espectro en la
región ultravioleta con máximos de absorbancia a 275 nm y a 235 nm.
Reactivos
Procedimiento
o Colocar una pequeña cantidad de la muestra a disolver en solución diluida
de ácido sulfúrico 0.5 N
o Registrar el espectro de absorbancia y comparar con el de un patrón de
anfetaminas.
Análisis de muestras para detectar e identificar benzodiacepinas
Prueba de coloración con el reactivo formaldehido - acido sulfúrico.

Es una prueba de orientación por precipitación de benzodiacepinas en general.
Reactivo Formaldehído - ácido sulfúrico

A cuatro volúmenes de ácido sulfúrico agregar seis volúmenes de solución de
formaldehído, utilizando una pipeta con la punta sumergida en el ácido, con
agitación y enfriamiento apropiado.

5-324
El reactivo puede permanecer claro por cerca de una hora

Si se desarrolla turbidez, esta puede eliminarse calentando en baño de agua a
100°C por un minuto aproximadamente.
Este reactivo es diferente del reactivo de Marquis.
Procedimiento
o Colocar una pequeña cantidad de la muestra en un tubo de ensayo
o Mezclar con el reactivo de formaldehido - acido sulfúrico 2 gotas.
o Si es necesario, calentar a 100° C por un minuto.
Psicofármacos en muestras no biológicas
Las sustancias pueden ser:
10 gotas de Cloroformo

5-324

5-324
Recomendaciones generales:
Examen microscópico si corresponde a un material vegetal
Confirmación con CCD con patrones, HPLC y demás técnicas analíticas que
ofrecen mayor confiabilidad.
Pruebas Resultado
Solubilidad en agua
Alcaloides (Tanred)
Scott directa
Scott completa
Marquis
Morfina-Heroína
Simon`s
FPN
Acido Sulfúrico
Libermann`s

5-324
Bibliografía
Clarke’s isolation and identification of drugs. In pharmaceuticals, body fluids,
and post-mortem material. Second edition. Senior consulting editor. A. C.
Moffat. London the pharmaceutical press. 1986. The pharmaceutical society of
great britain. Pág. 3-34.
Fanny Cuesta y otros. Manual de toxicología. Universidad de Antioquia.
Medellín.
Luz Amparo Arenas de Arenas y Esperanza Vesga Torres. Toxicología analítica.
Universidad industrial de Santander. Departamento de ciencias fisiológicas.
Páginas 154-1995.
Liu Ray H. Daniel E. Gadzala. Handbook Of Drug Analysis. Applications In
Forensic And Clinical Laboratories. American Chemical Society. Washington,
Dc.1997. Pág. 35-50.

5-324
Practica # 8: Determinación de psicofármacos en

muestras biológicas
Objeto
Analizar y seleccionar la metodología de extracción de psicofármacos presentes en

muestras biológicas, de acuerdo a sus características ácidas, básicas o anfóteras.
Determinar el efecto del pH en los procesos de extracción líquido-líquido de
diferentes psicofármacos.
Determinar el efecto del pH en la solubilidad de diferentes psicofármacos.
Establecer cuál de los métodos tiene mejor adecuabilidad de acuerdo a los
parámetros anteriormente calculados para cada uno de ellos.
Análisis de drogas en fluidos biológicos
Para analizar las drogas y sus metabolitos en los fluidos biológicos se debe tener en
cuenta la estructura de las moléculas, su carácter ácido o básico, sus constantes de
disociación coeficientes de partición, solubilidad y todos los demás parámetros
fisicoquímicos necesarios que garanticen la completa recuperación de los analitos
desde las matrices biológicas.
Teniendo en cuenta los grupos funcionales que afectan los coeficientes de partición
en los solventes orgánicos, las drogas de interés toxicológico se agrupan en cuatro
grupos fundamentales: ÁCIDAS, BÁSICAS, ANFOTÉRAS Y NEUTRAS. Una clasificación
adicional la constituyen el grupo de los VOLÁTILES.
Durante el análisis, el control del pH permite el paso de las drogas desde el fluido
biológico hacia el solvente de extracción. Por ejemplo, las drogas alcalinas como
cafeína, cocaína, escopolamina, anfetaminas, imipramina, codeína, morfina, heroína,

5-324
efedrina, fenotiazinas, deben extraerse en medio BÁSICO, para así insolubilizar la

sustancia en el medio acuoso y hacerla soluble en los solventes orgánicos.
En el caso de drogas como barbitúricos, salicilatos, difenilhidantoína, Fenitoina,

Paracetamol, se debe ACIDIFICAR el medio para ser extraídas de las muestras
biológicas.
Las sustancias anfoteras se comportan como ácidas y básicas y el control de pH es
crítico porque su forma no polar se logra en el punto isoeléctrico. Ejemplo la
Fenilefrina.
Sustancias como Meprobamato, Clordiazepóxido, Flurazepam, se extraen en medio

neutro.
Los alucinógenos son considerados por muchos como otro grupo, pero realmente su
comportamiento es alcalino, por lo cual serán extraídos en el sistema BÁSICO.
Métodos de extracción
Extracción líquido / líquido (l/l)

Implica la transferencia de una sustancia desde una fase líquida a una segunda fase
también líquida inmiscible con la primera. El compuesto que va extraerse debe ser
soluble o parcialmente soluble en un solvente, pero muy insoluble en el otro solvente.
Generalmente el agua es uno de los solventes porque la mayoría de los compuestos
orgánicos son insolubles en ella, pero disuelve los compuestos iónicos polares.
Entre los solventes orgánicos más utilizados se tienen: Éter etílico, Hexano,
Diclorometano, Cloroformo, Éter de Petróleo, Pentano, Tetracloruro de Carbono.
La extracción liquido / liquido es un proceso de partición que esta basado en las

solubilidades relativas de los compuestos en dos solventes inmiscibles.
Una de las utilidades más importante de la técnica es la separación de sustancias

ácidas o básicas de muestras y fluidos biológicos. El método utiliza diferentes pH y
diferentes características de solubilidad de los analitos. Un compuesto básico estará en
su forma no ionizada en medio alcalino, será insoluble en el agua del medio biológico y
soluble en el solvente orgánico. Los compuestos ionizados y las proteínas
permanecerán en la fase acuosa mientras que las drogas básicas no ionizadas pasaran
al solvente orgánico. Igualmente sucede con un compuesto ácido en medio ácido.

5-324
La mayoría de los procedimientos de extracción emplean proporciones de solvente

orgánico mayor que la fase acuosa para disminuir la formación de emulsiones. Lo ideal
es una proporción de 10:1 solvente: muestra. La selección del solvente requiere
considerar los parámetros de densidad, volatilidad, polaridad, selectividad y
solubilidad de las drogas que se van a extraer. Obviamente los solventes muy tóxicos
para la propia salud y para el medio ambiente no deben ser utilizados y en lo posible
reemplazarse por otras alternativas de mezclas con solventes menos dañinas.
Las extracciones se realizan por lo general en embudos de separación de

manipulación manual que permiten manejar volúmenes relativamente grandes de
muestras; pero la operación se puede llevar a cabo en tubos de centrífuga, tubos de
tapa rosca de capacidades desde 10, 20, 50 ml que facilitan la automatización.
Extracción sólido / liquido (SPE)
Está basada en la interacción de los analitos con una fase sólida y la matriz de las
muestras. Estas interacciones pueden ser para retener y concentrar los analitos o los
componentes que interfieren en los análisis y se encuentran en la matriz de la
muestra. Las principales ventajas de la SPE son: menor cantidad de solventes
orgánicos, no hay problemas de emulsiones, menor tiempo en la preparación de la
muestra, fácil adaptación para automatizar el proceso y obtención de extractos más
limpios.
La SPE tiene los mismos fundamentos de la cromatografía liquida de baja presión.

Los mecanismos de separación son debidos a interacciones intermoleculares entre las
moléculas del analito y los grupos funcionales de la fase sólida. Estas pueden ser:
fuerzas iónicas, puentes de hidrógeno, fuerzas Dipolo-Dipolo, fuerzas Dipolo-Dipolo
inducido, fuerzas de dispersión o de Van der Waals.
Un material convencional es el Extrelut (E. Merck) a partir de tierras diatomeas es

usado con tres técnicas de elución: 1) Elución diferencial a pH 2 para drogas ácidas y a
pH 10 para drogas básicas, 2) elución única a pH 9 para todas las drogas no conjugadas
y 3) Hidrólisis y elución a pH 9 para drogas conjugadas. Actualmente se cuenta con
numerosas fases sólidas a partir de sílica o sílica modificada disponible en cartuchos o
columnas, de diferentes polaridades y marcas que permiten elegir la mejor opción
para la necesidad analítica que se tenga.

5-324
Existen otras metodologías de extracción con las cuales se optimizan los porcentajes
de recuperación de los analitos presentes en muestras complejas y/o se logran
extractos más limpios:
Microextracción en fase sólida (SPME), Extracción con fluidos supercríticos,

Extracción Headspace.
Esquemas y metodologías de extracción de drogas en fluidos biológicos
Sustancias Alcalinas
Analgésicos, antidepresivos tricíclicos (Amitriptilina, nortriptilina, imipramina),

Fenotiazinas (levo-clor), anfetaminas,(MDMA-MDA), alcaloides (cocaína, morfina,
heroína, tramadol, lidocaína, procaina).
La mayoría de los alcaloides son removidos rápidamente de la sangre, por esto la

muestra de ORINA es la adecuada para el análisis de metabolitos y droga sin
biotransformar.
Prueba de color para fenotiazinas
Medir 2 mL de orina en un tubo de ensayo

Adicionarle 5 gotas del reactivo F.P.N. (Cloruro Férrico al 5%, ácido Perclórico al
20%, ácido Nítrico al 50%)
Observar el color inmediatamente:
o Violeta: Levomepromazina
o Rosa: Clorpromazina
o Azul: Trifluorperazina
Determinación de sustancias básicas:
Servir 10 ml del material biológico (sangre, plasma, orina, contenido gástrico)

en un embudo de separación.
Adicionar 10 ml de solución saturada de carbonato de sodio
Verificar un pH entre 8-9 con papel indicador.
Realizar la primera extracción con 20 ml de la mezcla Hexano:Acetato de etilo
(1:1).
Agitar por 1 minuto.

5-324
Observar la formación de las dos fases; orgánica y acuosa.

Separar la fase orgánica en un Erlenmeyer.
Realizar dos extracciones adicionales, con volúmenes iguales de la mezcla
Hexano:Acetato de etilo (1:1).
Reunir las fases orgánicas y adicionar 1-2 g de Sulfato de Sodio anhidro. La fase
acuosa se descarta.
Filtrar y recibir directamente en una cápsula de porcelana.
Dejar evaporar el solvente en cámara de extracción de vapores o bajo corriente
de nitrógeno.
Esquema general de extracción alcalina en fluidos biológicos

5-324
Sustancias Acidas
Pentobarbital, secobarbital, amobarbital, alobarbital, fenobarbital, acido acetil

salicilico, fenitoína, carbamazepina, meprobamato, ibuprofeno, Ac Valproìco,
Acetaminofén.
Prueba de color: parri-koppanyi
Servir 2 ml de orina en una capsula de porcelana y acidificar con H 2SO4 al 10 %

hasta un pH de 4-5.
Extraer con éter y filtrar.
Evaporar la solución etérea y redisolver el residuo con 1 ml de cloroformo.
A esta solución agregar 2 gotas de solución de acetato de cobalto, seguido de
solución de hidróxido de litio gota a gota. La presencia de un anillo azul en la
unión de las dos capas es prueba preliminar positiva para barbitúricos.
Prueba de color para salicilatos
Servir 2 ml de orina en una cápsula de porcelana

Adicionar 5 gotas de cloruro férrico al 10%
Un color violeta es prueba presuntiva para salicilatos, un color rosa débil es
presuntiva para Fenotiazinas
Adicionar una gota de Acido sulfúrico al 50%
El color violeta de los salicilatos desaparece, y la coloración debida a
Fenotiazinas se intensifica
Determinación de sustancias ácidas:

Ajustar pH de 3-4 con ácido sulfúrico 0.5 N.
Verificar con papel indicador.
Agregar 20 ml de cloroformo y agitar por 1 minuto.
Observar la formación de las dos fases: orgánica y acuosa.
Realizar dos extracciones adicionales, con volúmenes iguales de cloroformo.
acuosa se descarta.

5-324

de nitrógeno.
Esquema general de extracción acida en fluidos biológicos

5-324
Sustancias Conjugadas
Lorazepam, diazepam, flunitrazepam, bromazepam (BDZ), M- Ac. Glucurónico
Durante el proceso de biotransformación algunas drogas pueden sufrir reacciones

catalizadas enzimáticamente y formar conjugados con sustancias endógenas como el
ácido glucurónico. El glucuronido de morfina y el de las benzodiazepinas son los
ejemplos más conocidos.
El conjugado no es extraído dentro de la fase orgánica y tampoco es fácilmente

manipulable en los métodos de análisis, debe ser hidrolizado para dejar la molécula de
droga libre y fácilmente extraíble con los solventes orgánicos.
La hidrólisis se lleva a cabo generalmente con HCl en condiciones rigurosas, que causan
la descomposición de otros compuestos concomitantes y se generan una mezcla de
reacciones.
El uso de enzimas para realizar la hidrólisis actualmente está bien documentado y se

disponen de varias preparaciones que ofrecen efectividad y altos porcentajes de
recuperación. Por ejemplo la β-glucoronidasa de la Patella vulgate es activa a 65 °C, es
muy efectiva y produce rendimientos del 90% o más con dos horas de incubación.
La hidrólisis ácida convencional es efectiva y tiene altos porcentajes de recuperación y
consume menos tiempo, pero tiende a causar descomposición de algunos compuestos
ácidos lábiles.
Determinación de benzodiazepinas
Su toxicidad es relativamente baja, porque no producen depresión importante del

centro respiratorio, son usadas como hipnóticos y en la actualidad son los fármacos de
mayor importancia en los casos de lesiones personales y de abuso en la
automedicación y adicción. En el proceso de excreción se encuentran como
glucuronidos en la orina, para su análisis deben ser antes hidrolizadas.
Determinación de sustancias conjugadas:

Adicionar 3 ml de HCl concentrado.
Colocar al baño maría a 100 °C por 15 minutos.

5-324
Dejar enfriar a temperatura ambiente.

Alcalinizar con NaOH al 20 %, 10-12 ml deben ser suficientes.
Verificar pH 9-10 con papel indicador.
Adicionar 20 mL de la mezcla Diclorometano:Isopropanol (85:15).
Realizar dos extracciones adicionales, con volúmenes iguales de.
Diclorometano:Isopropanol (85:15).
acuosa se descarta.
de nitrógeno.
Esquema general de extracción conjugada en fluidos biológicos

5-324
Bibliografía
CLARKE’S ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS. In Pharmaceuticals,
body fluids, and post-mortem material. Second edition. Senior Consulting
Editor. A. C. Moffat. London the Pharmaceutical Press. 1986. The
Pharmaceutical Society of Great Britain. Pág. 3-34.
FANNY CUESTA Y OTROS. MANUAL DE TOXICOLOGÍA. Universidad de Antioquia.
Medellín.
LUZ AMPARO ARENAS DE ARENAS y ESPERANZA VESGA TORRES. TOXICOLOGÍA
ANALÍTICA. Universidad Industrial de Santander. Departamento de Ciencias
Fisiológicas. Páginas 154-1995.
LIU RAY H. DANIEL E. GADZALA. HANDBOOK OF DRUG ANALYSIS. APPLICATIONS
IN FORENSIC AND CLINICAL LABORATORIES. American Chemical Society.
Washington, DC.1997. Pág. 35-50.

5-324
Practica # 9: Cromatografía de sustancias

psicoactivas
Objeto
Realizar un perfil cromatográfico con el objeto de evaluar la presencia de sustancias

psicoactivas en muestras biológicas y no biológicas.
Cromatografía de capa delgada
Es una técnica de separación cormatográfica donde la fase estacionaria corresponde

a una capa uniforme de un material absorbente, el cual se soporta sobre una placa,
que puede ser de diversos materiales como vidrio, aluminio u otro material y la fase
móvil es líquida.
En cromatografía fase normal, la fase estacionaria es polar y el eluente será apolar o

de polaridad intermedia, de forma que los componentes que se desplacen con mayor
velocidad serán los menos polares.
Existen algunos aspectos importantes a considerar para el desarrollo de la

cromatografía:
Las muestras se deben procesar de acuerdo a su procedencia (biológica ó no

biológica), de acuerdo a las directrices de las prácticas 8 y 9. Posteriormente, se debe
redisolver la muestra en solventes orgánicos, con bajo punto de ebullición, facilitando
así su evaporación luego de la aplicación.
Elegir el tipo de eluente a utilizar, por ende es necesario considerar la polaridad de

los solventes. A continuación, se describe el orden creciente de polaridad de los
solventes más utilizados a nivel de laboratorio.

5-324
Eter de petróleo < Hexano <Diclorometano< Cloroformo<Acetato de etilo < Etanol

<Metanol<Agua
Así mismo, en el caso del eluente se deben considerar los siguientes factores:
Precio
Pureza (Evitar trazas de metales,catalizadores)
Laboratorio fabricante
La elección del eluente se realiza de forma empírica. Es necesario estudiar la
polaridad del componente.
Al aplicar en primer lugar eluentes poco polares, podemos seguir utilizando la

misma placa para aplicar otros eluentes más polares, hasta encontrar el más
apropiado.
Cromatografía de sustancias alcalinas
Redisolver el residuo con 1 ml de metanol y aplicar sobre una placa de sílica gel.
Sembrar los patrones (ejm: cocaína, escopolamina, cafeína, levomepromazina,
clorpromazina, morfina, codeína, anfetamina, imipramina) y las muestras
utilizadas en la prueba.
Utilizar como Eluente: metanol:acetona (80:20) o MeOH: NH3 (100:0.5).
Dejar correr la placa.
Observar con la lámpara UV.
Aplicar el revelador en la siguiente placa.
o Ácido Sulfúrico al 5%.
 Secar la placa.
 Verificar la formación de manchas de color violetas, rosas y
azules, lo que indica que la muestra corresponde a una
fenotiazina.
o Dragendorff
 Secar la placa.
 Verificar la formación de manchas de color naranja, café, marrón
y ocre, lo que indica que la muestra corresponde a un alcaloide
tipo: cocaína, escopolamina, morfina, codeína.
Determinar y comparar los RF con los patrones y color de las manchas.

5-324
Cromatografía de sustancias ácidas
Disolver el residuo con 1 ml de cloroformo y aplicar sobre una placa de sílica

gel.
Sembrar los patrones (ejm: Fenobarbital, Pentobarbital, Secobarbital,
Fenitoina, Ácido Acetilsalicílico, Meprobamato) y las muestras utilizadas en la
prueba.
Eluentes prueba: Hexano:Acetato de etilo (50:50), Diclorometano:acetato de
etilo (35:15) y Cloroformo: Metanol (95:5)

5-324

Aplicar el revelador en la siguiente secuencia:
o Nitrato de mercurio
 Secar la placa.
 Verificar la formación de manchas blancas lo que indica que la
muestra puede contener barbitúricos.
o Difenilcarbazona 0.01%
 Secar la placa
 Verificar la formación de manchas color rosa lo que indica que la
muestra puede corresponder a Fenitoina, ASA, ibuprofeno,
Carbamazepina o Acetaminofén.

5-324
Segunda etapa conjugadas (benzodiacepinas)
Disolver el residuo con 1 ml de Metanol y aplicar sobre una placa de sílica gel.
Sembrar los patrones (ejm: Diazepam, Lorazepam, Bromazepam,
Flunitrazepam, Oxazepam, y Nitrazepam) y las muestras utilizadas en la prueba.
Eluentes prueba Hexano:Acetato de etilo (50:50) y Diclorometano:Acetato de
etilo (35:15) y Cloroformo:Metanol (95:5).
Aplicar el revelador en la siguiente secuencia:
o Nitrito de Sodio al 1%.
(1) Dejar secar la placa.
o Clorhidrato de N-naftiletilendiamina 0.04%
o Verificar la formación de manchas de color violeta, rosa y amarillas lo
que indica que la muestra corresponde a benzofenonas, para visualizar
mejor el Flunitrazepam aplicar solución de KOH al 20% y calentar la
placa en estufa a 100 °C por 15 minutos. La benzofenona del
flunitrazepam se apreciará de color amarillo y las otras se tornaran de
color rojo naranja.

5-324
Bibliografía
CLARKE’S ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS. In Pharmaceuticals,
body fluids, and post-mortem material. Second edition. Senior Consulting
Editor. A. C. Moffat. London the Pharmaceutical Press. 1986. The
Pharmaceutical Society of Great Britain. Pág. 3-34.
FANNY CUESTA Y OTROS. MANUAL DE TOXICOLOGÍA. Universidad de Antioquia.
Medellín.
LUZ AMPARO ARENAS DE ARENAS y ESPERANZA VESGA TORRES. TOXICOLOGÍA
ANALÍTICA. Universidad Industrial de Santander. Departamento de Ciencias
Fisiológicas. Páginas 154-1995.
LIU RAY H. DANIEL E. GADZALA. HANDBOOK OF DRUG ANALYSIS. APPLICATIONS
IN FORENSIC AND CLINICAL LABORATORIES. American Chemical Society.
Washington, DC.1997. Pág. 35-50.

5-324
Practica # 10: Extracción de plaguicidas en

muestras biológicas y no biológicas
Objeto
Seleccionar el pretratamiento de la muestra de acuerdo a la complejidad de la matriz, con el

objeto de extraer plaguicidas.
Introducción
En nuestro medio los plaguicidas son comercializados para su uso en diferentes áreas como:
jardinería, cultivos agrícolas, control de roedores; los cuales son comercializados con los
siguientes nombres: DDT, Bin Laden, Gamezan, Malation, Neocid 50%, Folidol, Baygon,
Matarapido, Racumin, Zelio, El zorro, Campeón y El Demoledor. Los plaguicidas se clasifican de
acuerdo a su estructura química y se dividen en:
Herbicidas
• Organofosforados o Paracuat (altamente alcalino
o Paratihion pH ~14)
o Malathion o Diquat
o Clorpirifos o Glifosfato (son sales)
o Roxion
Carbamatos
o Baygon
o Carbaryl
o Lannate
o Carbofurano
Piretrinas y Piretroides
o Deltametrina
o Cipermetrina
o Flunipiretrina

MANUAL DE LABORATORIO DE
TOXICOLOGIA
5-324
El análisis de plaguicidas puede clasificarse en diversas áreas:
Forense
Diagnóstico de urgencia
Control de poblaciones expuestas y no expuestas.
Contaminación ambiental.
Si el plaguicida fue causa de muerte, estará en alta concentración, al igual que en una
intoxicación aguda grave. En las dos últimas áreas se trabaja con muestras con niveles muy bajos
de plaguicidas (menores de 0,1 ppm), se habla de “residuos” de plaguicidas. De todos ellos
estudiaremos los insecticidas organofosforados y carbamatos, por ser los más utilizados
actualmente y producir efectos tóxicos muy característicos. Además, la comercialización de los
organoclorados en Colombia se encuentra prohibida.
Los métodos para extraer plaguicidas deben ser aplicables a matrices complejas, como es el
caso de fluidos biológicos (orina, suero, sangre y contenido gástrico), preparaciones comerciales,
alimentos, bebidas y muestras ambientales. Algunos de estos métodos corresponden a
destilación, extracción líquido-líquido, extracción en fase sólida, extracción sólido-líquido.
Al producto del destilado, se pueden aplicar pruebas de orientación como la del p-nitrofenol y
la prueba de Marquis.
La prueba del p-nitrofenol se utiliza para detectar metabolitos de los fosforados orgánicos.
Consiste en tratar una porción de la muestra destilada con NaOH para hidrolizar a un pH 9.9 el
parathion que esté presente en la muestra, produciendo la sal sódica del ácido dietilfosfórico y p-
nitrofenol. El p-nitrofenol en medio alcalino produce nitroderivados de color amarillo.
La Prueba de Marquis se basa en una reacción de orientación para hidrocarburos que se utilizan
como solventes y vehículos en los preparados comerciales de plaguicidas como los carbonatos y
otros.
En la Extracción Líquido-Líquido, se hace la transferencia de analito(s) de la muestra en fase

líquida del destilado a una segunda fase líquida de polaridad adecuada para extraerlo.
Otra alternativa para la extracción de plaguicidas en fluidos biológicos, corresponde a la

extracción en fase sólida, en la que se disminuye el uso de solventes y es más fácil de automatizar.
Solo se requiere la elección del adsorbente apropiado que permita retener los plaguicidas.
Posteriormente con el uso del eluente apropiado se eluye el respectivo analito.
Fecha Elab: 05/03/2013 Feche Rev: 05/03/2013 Versión 1 Página 73 de 85

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TOXICOLOGIA
5-324
Técnicas de análisis
En caso de intoxicaciones agudas por ingestión, la muestra ideal es el contenido gástrico, y en

ella se aplican con muy buenos resultados las pruebas de coloración, seguidas de las demás
técnicas, puesto que se cuenta con altas concentraciones de los analitos. Esto no ocurre igual con
las muestras de vísceras que si requieren técnicas de mayor sensibilidad y especificidad, así como
de tratamientos de la muestra más cuidadosos para extraer los analitos de la matriz.
La orina es una muestra indicada en algunos casos como en intoxicación con herbicidas como el
Paraquat y Diquat, dependiendo eso sí, del tiempo transcurrido entre la entrada del tóxico al
organismo y la toma de la muestra, así como de la conservación de ésta y la rapidez del análisis.
Las muestras no biológicas como los preparados comerciales se asemejan al contenido gástrico
en intoxicaciones agudas, en cuanto a su alta concentración de analito.
Entre las pruebas de coloración utilizadas en la detección de plaguicidas están: Acido sulfúrico-
ácido nítrico para dicofano (clorado), Prueba de fósforo para compuestos organonofosforados,
ditionito de sodio para diquat y paraquat, ácido sulfúrico/acido sulfúrico fumante para los
organoclorados dieldrin, aldrin y endrin, entre otras.
Parte experimental
Destilación de volátiles en mezclas acuosas
Tomar 40 mL de muestra en un balón de cuello esmerilado y fondo redondo.

Llevarlo al montaje de destilación.
Adicionar un volumen equivalente a la muestra de agua caliente.
Si se desconoce por completo la composición de la muestra agregar 30 mL de Acido
Tartárico al 20% para evitar la hidrólisis del parathion que pueda estar presente en la
muestra.
Agregar suficientes perlas de ebullición.
Destilar en el equipo apropiado hasta obtener mínimo 40 mL de destilado.
Si es necesario analizar para cianuro, se deben recibir los 5 primeros mL del destilado
sobre 1 mL de NaOH al 5%.

TOXICOLOGIA
5-324
Pruebas de orientación
Prueba del Paranitrofenol

o Tomar 3 mL del destilado en un tubo de ensayo y adicionar 2 perlas de NaOH.
o Calentar al Baño María durante 2 minutos.
o Observar si ocurre un cambio de color al amarillo canario de la muestra, que
persista; esto en el caso de contener parathion.
o Hacer el análisis simultáneo a un control positivo y uno negativo.
Prueba de Marquis.
o Tomar 3 ml del destilado en un tubo de ensayo de capacidad 20 mL y agregarle 3
mL de tetracloruro de carbono.
o Agitar para extraer y separar llevando a otro tubo la fase orgánica.
o Repetir la extracción con una segunda porción igual de tetracloruro de carbono.
o Reunir la fase orgánica con la obtenida primero y aplicarles el Reactivo de Marquis.
o La formación de un color rojo-café indica la presencia de hidrocarburos en la
muestra.
o Realizar la prueba simultáneamente con un control positivo y otro negativo.

TOXICOLOGIA
5-324
Extracción liquido-liquido
Tomar alrededor de 30 mL del destilado y llevarla a un embudo de separación.

Realizar la primera extracción con 60 ml de la mezcla de éter de petróleo:acetato de etilo
(4:1)
Realizar si es necesario otra(s) extracción(es) adicionales, con volúmenes iguales de la
mezcla de éter de petróleo.
Reunir las fases orgánicas y adicionar 1-2 g de Sulfato de Sodio anhidro. La fase acuosa se
descarta.
Dejar evaporar el solvente en cámara de extracción de vapores o bajo corriente de
nitrógeno.
NOTA: Cuando la cantidad de muestra es del orden de 10 mL o menos, se comienza el proceso

directamente en la extracción liquido-liquido, sin hacer la destilación.

TOXICOLOGIA
5-324
Determinación de paraquat y diquat en orina
Tomar 5 mL de orina en un tubo de ensayo de 10 mL

Agregar 4 lentejas de Hidróxido de sodio.
Mezclar bien.
Dejar en reposo por 2 minutos.
Adicionar 1-2 mg de Ditionito de sodio a la muestra alcalinizada y mezclar bien.
Observar si ocurre la formación inmediata de un coloreado que con la presencia de
Paraquat en la muestra es de color azul, y en presencia de Diquat es verde.
De otro lado, realizar a la orina sin tratar un barrido espectrofotométrico en el ultravioleta
entre 200 y 350 nm, mezclándola con ácido sulfúrico 0.5 N. Si hay presencia de cierta
cantidad de Paraquat en la muestra, esta exhibe un máximo de absorbancia a 257 nm, y
en presencia de Diquat, un máximo a 310 nm.
Para ambas pruebas, desarrollar un blanco y un control positivo con una solución acuosa
de Paraquat y de Diquat al 0.2%,respectivamente.

TOXICOLOGIA
5-324
BIBLIOGRAFÍA
Medina MM, Torres AH, Rodríguez AG. Notas del curso. Laboratorio de Toxicología.
Universidad de Antioquia: Medellín, Colombia.
CLARKE´S ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS In Pharmaceuticals, Body Fluids and
post-mortem material. Second Edition. Senior Consulting Editor. A.C. Moffat. London. The
Pharmaceutical Press. 1986. The Pharmaceutical Society of Great Britain. Páginas 70 - 86.
MANUAL DE TOXICOLOGÍA. Fanny Cuesta y otros. Universidad de Antioquia. Medellín.
Páginas 14 a 24.
TOXICOLOGÍA ANALÍTICA. Luz Amparo Arenas de Arenas y Esperanza Vesga Torres.
Universidad Industrial de Santander. Departamento de ciencias Fisiologicas. Páginas 82-
107.
MEDICINA LEGAL Y TOXICOLOGÍA. Juan Antonio Gisbert Calabuig. Cuarta Edición. Salvat
Editores S.A. Barcelona (España). 1991. Páginas 696 - 707.

TOXICOLOGIA
5-324
Practica # 11: Perfil cromatográfico de plaguicidas en

muestras biológicas y no biológicas
Objeto
Realizar un perfil cromatográfico con el objeto de evaluar la presencia de plaguicidas en
muestras biológicas y no biológicas.
Introducción
Cromatografía de capa delgada
Es una técnica de separación cromatográfica donde la fase estacionaria corresponde a una capa
uniforme de un material absorbente, el cual se soporta sobre una placa, que puede ser de diversos
materiales como vidrio, aluminio u otro material y la fase móvil es líquida.
En cromatografía fase normal, la fase estacionaria es polar y el eluente será apolar o de

polaridad intermedia, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán
los menos polares.
Existen algunos aspectos importantes a considerar para el desarrollo de la cromatografía:
Las muestras se deben procesar de acuerdo a su procedencia (biológica ó no biológica), de

acuerdo a las directrices de la práctica 11. Posteriormente, se debe redisolver la muestra en
solventes orgánicos, con bajo punto de ebullición, facilitando así su evaporación luego de la
aplicación.
Elegir el tipo de eluente a utilizar, por ende es necesario considerar la polaridad de los
solventes. A continuación, se describe el orden creciente de polaridad de los solventes más
utilizados a nivel de laboratorio.

TOXICOLOGIA
5-324
Éter de petróleo < Hexano <Diclorometano< Cloroformo<Acetato de etilo < Etanol

<Metanol<Agua
Así mismo, en el caso del eluente se deben considerar los siguientes factores:
Precio
Pureza (Evitar trazas de metales, catalizadores)
Laboratorio fabricante
La elección del eluente se realiza de forma empírica. Es necesario estudiar la polaridad del
componente.
Al aplicar en primer lugar eluentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para
aplicar otros eluentes más polares, hasta encontrar el más apropiado.
En el caso de la muestra procesada de acuerdo a las indicaciones establecidas en la practica 11.

Se debe sembrar en 3 placas cromatográficas diferentes para aplicar diferentes reveladores
direccionados a verificar la presencia de organofosforados, carbonatos y organoclorados.
A los extractos que resulten positivos en la Cromatografía en capa fina se les debe realizar un
espectro en el Ultravioleta entre 200 y 300 nm, comparando con los patrones o con datos de la
literatura.
ESTRUCTURAS DE LOS PLAGUICIDAS

PLAGUICIDAS ESTRUCTURA
Insecticidas
Organofosforados 1
Carbamatos 2-3
Organoclorados 4
Piretrinas y piretroides 5-6
Ureas sustituidas 7
Organoestaño 8
Compuestos Heterocíclicos 9
Herbicidas
Ac. Fenoxiclorados 10
Ureas sustituidas 11
Triazinas 12
Uracilos 13
Comp. Amonio cuaternario 14
Carbamatos 15
Fungicidas
Otros Compuestos 16

TOXICOLOGIA
5-324
Técnicas de análisis
Preparación de la muestra
Disolver la muestra procesada de acuerdo a las directrices de la práctica No. 11 con

suficiente Cloroformo (500 uL) y aplicar por iguales cantidades sobre 3 placas de sílica gel
HF-254, para la detección de:
o Organofosforados.
o Carbamatos y piretrinas.
o Organoclorados (debido a que no están aprobados en Colombia, en este caso no
se realiza)
Detección por cromatografía en capa delgada
Detección de compuestos Organofosforados

o Aplicar en esta placa patrones disueltos de organofosforados como: Parathion
(FOLIDOL), Metil Parathion ( FOLIDOL - M), clorpyrifos (LORSBAN; DURSBAN),
metilclorpyrifos, dimetoato (ROXION, SYSTEMIN), ethion (GARAFOS),
methamidofos (TAMARON), fenthion (Tiguvon), diazinon (BASUDIN,
TERMINATOR), fenitrothion (SUMITHION).
o Sumergir la placa en una cámara dispuesta con el eluente, Hexano:Acetato de etilo
(80:20), cerrar bien la cámara.
o Dejar eludir la placa hasta una altura del eluente mayor de 10 cm.
o Retirar la placa de la cámara y dejarle secar el eluente bajo cabina de extracción o
estufa de secado.
o Observar la placa bajo lámpara de luz ultravioleta (corta/larga).
o Revelar la placa con solución alcohólica de Rodamina al 0.5%
o Observar las manchas obtenidas en cuanto a su Rf, color y forma, comparando con
los patrones.
Detección de compuestos de tipo Carbamato y piretrinas

o Aplicar esta placa patrones disueltos de carbamatos como: propoxur (BAYGON),
carbofuran (FURADAN) carbaryl (SEVIN), metomyl (LANNATE); piretrinas como
cipermetrina y deltametrina, entre otras.
o Sumergir la placa en una cámara dispuesta con el eluente Hexano:Acetato de etilo
(80:20), cerrar bien la cámara.
o Dejar eluir la placa hasta una altura de la fase móvil mayor de 10 cm.

TOXICOLOGIA
5-324
o Retirar la placa de la cámara y dejarle secar el eluente bajo la cámara de extracción

o estufa de secado.
o Revelar la placa con una solución de vainillina/H2SO4
los patrones.
Detección de compuestos organoclorados.

o Aplicar en esta placa patrones disueltos de pesticidas organoclorados como: aldrin,
dieldrin, endrin (HEXADRIN), chlordano, heptaclor, endosulfan (THIODAN),
lindano, DDT:
o Sumergir la placa en una cámara dispuesta con el eluente éter de petróleo.
o Dejar eluir la placa hasta una altura de la fase móvil mayor de 10 cm.
o Retirar la placa de la cámara y dejarle secar el eluente bajo la cámara de extracción
o estufa de secado.
o Revelar la placa con solución alcohólica de Rodamina al 0.5%
o Asperjar luego la placa con solución de Hidróxido de sodio al 4%.
los patrones.
Visualización de plaguicidas para CCD

Organofosforados Carbamatos-piretroides
Fase móvil Hexano:Acetato de etilo (80:20) Hexano:Acetato de etilo (80:20)
Ext. Destilado Ext. Destilado
Ext directa Ext directa
revelador 1. UV-Vis 1. UV-vis
2. Rodamina(rosados) 2. Vainillina/H2SO4 (rosa-violeta-azul)
RF RF
Formas Formas
Muestras vs patrón Muestras vs patrón
Patrones Parathion, Malathion,cloro,rifos- Baygon-carbaryl, furaden-lipermetrina,
curacron lorsban deltametrina
Análisis al ultravioleta
A los extractos que resulten positivos, hacer un barrido espectrofotométrico ultravioleta
entre 200 y 300 nm, utilizando como solvente éter de petróleo o el indicado en la

TOXICOLOGIA
5-324
literatura, de acuerdo al patrón con el cual coincidan las manchas obtenidas en la placa
Cromatografía.
Otros sistemas de detección

Carbamatos y piretroides
Solventes Extractores
o Cloroformo: Acetona (1:1)
o Éter dietilico
o Hexano: Acetona (3:1)
Reveladores
o Vainillina al 5% en ácido sulfúrico concentrado: Agua (1:1) calentando luego en
estufa a 110ºC por 10 minutos.
o 2,6-Dibromoquinona clorimida al 0.5% en ciclohexano, calentando luego en estufa
a 110ºC por 10 minutos.
Organofosforados
o N-Hexano
o Hexano: Cloroformo (1:1)
o Diclorometano:Acetato de etilo (40:10)
Reveladores
o KOH al 5% en metanol o NaOH al 5% en metanol, calentando luego la placa por 10
minutos a 110ºC, observando manchas amarillas.
o Cloruro de Paladio al 0.5% en HCl al 10% solo o seguido de aspersión de solución
de KOH al 20% y calentar en estufa por 15 minutos a 100º C.
Organoclorados
o Eter de Petroleo
o Hexano
Reveladores
o KOH 1 N en metanol, calentando a 100ºC por 10 minutos y observándose manchas
de color pardo
o Etanolamina calentando a 100ºC por 10 minutos
o KMnO4 0.1 N, observándose manchas amarillas en fondo rosado

TOXICOLOGIA
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ESPECTROS DE PLAGUICIDAS
Carbaryl (Etanol) 279nm
Paraquat (acuosa/medio ácido) 257 nm

TOXICOLOGIA
5-324
Parathion (Etanol) 274 nm
Aldicarb (Acetonitrilo) 249 nm


Manual de Laboratorio Toxicologia REIMPRESOS

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MANUAL DE LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA

Practica # 1: BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

En este documento se registran una serie de directrices básicas sobre seguridad y

Los objetivos específicos en materia de bioseguridad involucran una serie de

Antimicrobiano: Agente que mata los microorganismos o suprime su

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 1 de 8

Buenas prácticas de laboratorio

Conjunto de lineamientos, procedimientos operativos y prácticas previamente

Bioseguridad: Conjunto de directrices que tienen como objetivo principal

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 2 de 8

Este documento debe ser de consulta, conocimiento y aplicación de todo el

Durante el trabajo en el laboratorio el estudiante deberá acoger las siguientes

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Utilizar siempre los pipeteadores para dispensar los reactivos y muestras

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Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 4 de 8

Practica # 2: ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LOS

Características de funcionamiento de los métodos analíticos

Comprenden todos los datos y resultados experimentales generados en el proceso

Etapas de la Aplicación de un método analítico

Etapa 1: Preparación: Etapa en la cual se acondiciona la muestra par el análisis.

Para la obtención de datos confiables y para el éxito de la aplicación del método

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 5 de 8

Además de todo lo expuesto anteriormente, para la elección de un método

Dichos parámetros están enmarcados en la capacidad del método analítico para

Parámetros fundamentales del método analítico

Fiabilidad (confiabilidad): Capacidad de un método analítico para mantener los

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 6 de 8

Especificidad: Propiedad del método de producir una respuesta debido a la sola

Para el análisis de analitos y metabolitos en fluidos biológicos, se deben considerar

Para la valoración de la linealidad de los datos obtenidos, se pueden utilizar diferentes

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 7 de 8

Y= bx + a Ecuación de la línea recta

% Desviación Estándar Relativa (DER) (s) x 100

Exactitud: Expresa cual es el grado de acercamiento entre el valor medido o

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 8 de 8

Una de las herramientas estadísticas que se aplica para establecer la precisión y

x1: valor tomado como referencia ( verdadero )

La sensibilidad y la especificidad de una prueba solamente indican la proporción de

Valor predictivo positivo: de una prueba es la probabilidad de que una persona

Se evalúa con un grupo de muestras que contengan el analito buscado (positivas) y

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 9 de 8

Sensibilidad = a/(a+c) es decir, S= (VP) / (VP +FN)

Valor Predictivo Positivo VPP = a/(a+b) es decir, VPP=(VP) / (VP+FP)

Valor Predictivo Negativo VPN= d/(d+c) es decir, VPN=(VN) / (VN+FN)

Limite de detección (ld): Es la mínima cantidad de analito o sustancia de interés

Limite de cuantificación (lc): Es la menor concentración o cantidad de analito

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 10 de 8

Medina MM, Torres AH, Rodríguez AG. Normas de Trabajo en el laboratorio de

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 11 de 8

Practica # 3: VALIDACIÓN DE MÉTODOS

Identificar las características y principios de los métodos de análisis cuya respuesta

Aplicar una estrategia metodológica para validar un método analítico no

Adecuabilidad: Proceso que consiste en corroborar que los componentes,

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 12 de 8

interés, debido a que ocurrió una adecuada reacción o interacción de los

Obtención de pruebas convenientemente documentadas

Las pruebas convenientemente documentadas son evidencia de que un método de

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 13 de 8

*USP: Farmacopea de Estados Unidos

Parámetros de calidad para métodos analíticos cualitativos

Soluciones de 2 muestras de fenotiazinas en diferentes rangos de

Fecha Elab: 26/01/2012 Fecha Rev: 26/01/2013 Versión 1 Página 14 de 8

o Se mezclan en una relación de 1 : 9 : 10