ISCED-LUBANGO

ENSINO DE BIOLOGIA
GENTICA CLSSICA E MOLECULAR

1.

TEMA:

EXTRACO

DE

DNA

GENMICO

DE

DIFERENTES

MATERIAIS

BIOLGICOS

2.

OBJECTIVO: Conhecer princpios bsicos da extraco do material gentico de

diferentes fontes biolgicas

3.

INTRODUO: O DNA contm a informao gentica bsica de todas as clulas.

Nos procariotas, a actividade gentica ocorre no citoplasma, enquanto que nos
eucariotas a maioria do DNA se encontra condensado num compartimento
individualizado (com membrana), o ncleo, associado a protenas (histonas). A forma
compacta de ADN do ncleo denominada cromatina. O isolamento de ADN de um
organismo envolve essencialmente trs etapas. A primeira consiste na rotura das
membranas celulares para facilitar a extraco do ADN. Para tal usam-se detergentes
que iro solubilizar os lpidos das membranas. A segunda etapa est relacionada com
o facto do DNA formar um complexo com as protenas e com a presena de enzimas
em soluo. assim necessrio adicionar uma fonte de enzimas que iro digerir ou
inibir (proteases, nucleases) as protenas libertando o DNA. Finalmente, necessrio
recorrer a um mtodo de extraco que permita separar o DNA dos outros
componentes celulares. Neste caso usa-se o etanol como agente precipitante.
A actividade de hoje consiste na extraco de DNA de clulas eucariotas: vegetais
(banana [Musa spp.] e cebola [Allium cepa L.]), animais (fgado de porco [Sus scrofa
domesticus] ou de boi [Bos taurus] ), fungos (levedura do po [Saccharomyces
cerevisae]) e do epitlio bucal. Para a realizar com sucesso ter que ter em conta
alguns cuidados: 1) A liquefaco da matria prima ter que ser suave e breve
(mximo 15 segundos), para que o DNA no seja partido pela fora mecnica; 2)
Depois da adio de detergente deve-se esperar pelo menos 5 minutos, para garantir
a solubilizao dos lpidos das membranas e, consequentemente, a libertao do
contedo celular. Se mesmo assim no conseguir ver DNA, deve verificar-se se a
mistura inicial, depois da liquefaco, no est muito diluda. O problema tambm
poder ser uma questo de quantidade. Por isso pode ter que se utilizar outro
detergente, pois a composio dos detergentes varia de marca para marca e sabe-se
que alguns no funcionam.

4. MATERIAIS NECESSRIOS

Copos descartveis

gua

Esptulas de madeira e palitos

lcool etlico (96)

Cloreto de sdio (sal de cozinha)

Parafilm ou pelcula aderente

Tubos

Varinha mgica

1 coador de rede

Filtros de caf

2 bananas, 2 cebolas mdias, 50 g

de

ensaio,

bquers

de

plstico

Banho

termoestatizado

(banho

maria)

Provetas

Conta gotas ou pipeta descartvel

Detergente da loua

de fermento de po, 2 fatias de

fgado, sumo de anans fresco

5. PROCEDIMENTOS
A. EXTRACA DO DNA GENMICO DE CLULAS DO EPITLIO BUCAL
1. Lavar a boca fazendo bochechos com gua ou se possvel escovando os dentes;
2. Medir para um copo descartvel 30 ml de gua e adicionar 1 colher de ch de
cloreto de sdio. Misturar bem;
3. Colocar a soluo salina na boca e bochechar vigorosamente durante 1 minuto;
4. Recolher o volume obtido para o copo descartvel;
5. Recolher clulas do epitlio bucal, utilizando uma esptula ou um palito de ambos
os lados da bochecha;
6. Suspender as clulas na soluo salina;
7. Marcar duas linhas num tubo de ensaio, uma a meio e outra perto da extremidade
do tubo;
8. Transferir o contedo do copo descartvel para
o tubo de ensaio at primeira linha;
9. Adicionar 2 colheres de ch de detergente da
loua. Tapar o tubo com parafilm ou pelcula
aderente de cozinha;
10. Inverter com cuidado o tubo duas vezes;
11. Aquecer o tubo a 55c durante 10 minutos;
12. Arrefecer em gelo durante 5 minutos.
13. Adicionar suavemente isopropanol ou lcool
gelado,

com

um

conta-gotas

ou

lcool
DNA
Fig. 1 - O DNA forma um anel na
zona de contacto entre a fase
orgnica e a fase aquosa

pipeta

descartvel, ao tubo de ensaio, deixando-o

escorrer pelas paredes do tubo;
14. O DNA surge com o aspecto de pequenos fios na interface com a camada de
lcool (Fig 1); suavemente, rodar um palito ou uma pipeta no interior do tubo

para obter o DNA. Se pretender armazenar o seu DNA basta coloc-lo num
microtubo (eppendorf), com uma soluo de lcool.
B. EXTRACO DO DNA GENMICO DE TECIDOS DE CEBOLA, BANANA E FGADO DE
CLULAS DE SACCHAROMYCES CEREVISAE
No quadro seguinte encontram-se as quantidades de reagentes necessrias para os
diferentes materiais.

Fonte de DNA

gua

Sal

Detergente
lquido

1 Cebola

1 chvena de caf

2 colheres de ch

4 colheres de ch

Banana

1 chvena de caf

2 colheres de ch

4 colheres de ch

1 Fatia de Fgado

1 chvena de caf

2 colheres de ch

4 colheres de ch

Levedura (20 g)

1/2 chvena de
caf

1 colher de ch

2 colheres de ch

1. Dissolver o sal na gua fria;

2. Colocar o material escolhido no misturador ou no copo da varinha mgica. Deitar a
soluo salina suficiente para cobrir o tecido;
3. Misturar at obter a consistncia de um pur (no liquefazer totalmente a cebola,
podero ficar pequenos fragmentos);
4. Transferir a mistura para um copo;
5. Adicionar o detergente e misturar. Esperar cerca de 5 minutos;
6. Colocar o filtro de caf sobre um outro copo e coar a mistura. Adicionar umas
gotas de sumo de anans fresco. Se usar fgado como fonte de DNA, a mistura
ser demasiado viscosa para atravessar o filtro. Neste caso utilizar apenas o
passador de rede;
7. Agitar suavemente durante cerca de 1 minuto;
8. Marcar duas linhas num tubo de ensaio, uma a meio e outra perto da extremidade
do tubo;
9. Colocar o filtrado em cada um dos tubos de ensaio at primeira linha;
10. Adicionar cuidadosamente o lcool gelado, fazendo-o escorrer pelas paredes do
tubo de ensaio, at segunda linha;

11. Como o DNA no se pode dissolver no lcool,

na concentrao aqui utilizada, comear a
separar-se da soluo aquosa elevando-se na
camada de lcool (Fig.2).
12. Poder pescar o ADN enrolando-o num palito
ou com uma pipeta de Pasteur.

5. RESPONDA S SEGUINTES QUESTES:

Fig. 2 O DNA n se dissolve no

cool

5.1. Considera que o DNA que isolou nestas experincias est livre de protenas e de
RNA?
Justifique.
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5.2. Qual a funo dos reagentes usados na experincia?
5.2.1. Sal _______________________________________________________________________
5.2.2. Detergente? ________________________________________________________________
5.2.3. Sumo de anans? ___________________________________________________________
5.2.4. lcool? ____________________________________________________________________
5.3. Na actividade de extraco do DNA das clulas do epitlio bucal, qual o efeito do
aquecimento
do
filtrado?
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5.4. Haver diferenas entre o DNA dos diferentes tipos de clulas usados?
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5.5. Usando como referncia a figura do DNA apresentada no cabealho deste protocolo,
descreva com pormenor a estrutura qumica do DNA.
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5.6. Qual o papel do DNA nos seres vivos?
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5.7. Nos organismos eucariontes, o DNA existe somente nos cromossomas? Explique.
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