Вы находитесь на странице: 1из 38

Facultad de Qumica y Biologa

Ingeniera Civil Qumica


Departamento de Biologa

Gua Laboratorio
Principios de Sistemas Celulares

Profesores
Dr. Alex Elas
Dra. Denise Riquelme
Coordinador
Dr. Mario Tello
Segundo semestre, 2016

Laboratorios de Docencia Louis Pasteur


Facultad de Qumica y Biologa

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

I.- NORMAS GENERALES DEL LABORATORIO


1.

2.

3.
4.
5.
6.
7.

8.

9.

10.
11.
12.
13.
14.

15.

16.
17.

Antes de realizar una prctica, debe leerse la gua detenidamente para adquirir
una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. Los resultados deben ser
siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. Se evaluar a cada
laboratorio el contenido de un cuaderno donde Ud. deber previo a la
experiencia hacer un diagrama con las actividades prcticas a realizar.
El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En
consecuencia, al terminar cada prctico se proceder a limpiar cuidadosamente el
material que se ha utilizado.
Cada grupo se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material.
Antes de utilizar un compuesto hay que verificar la etiqueta para asegurarse de
que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin.
No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos
utilizados sin consultar con el profesor.
No tomar con las manos desnudas y menos con la boca los productos qumicos.
Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y
microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus
mecanismos.
Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados
de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos
productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. Si se manejan
mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al
apagar la llama.
Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse
con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern
bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente
por su pared.
Cuando se quiera diluir un cido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre
al contrario: cido sobre agua.
Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de
forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido
se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco.
Nunca pipetear con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o
artilugio que se disponga en el Centro.
Las pipetas se cogern de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo
superior para regular la cada de lquido.
Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada debe
evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los
ojos para que la visual al enrase sea horizontal.
Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen lquidos debe
evitarse la ebullicin violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El
tubo de ensayo se acercar a la llama inclinado y procurando que sta acte
sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la
ebullicin rpida, se retirar, acercndolo nuevamente a los pocos segundos y
retirndolo otra vez al producirse una nueva ebullicin, realizando as un
calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitar dirigir la boca del tubo
hacia la cara o hacia otra persona.
Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo despus de
haberlos calentado con el fin de evitar roturas.
Los cubreobjetos y portaobjetos deben tomarse por los bordes para evitar que se
engrasen.

ii

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

II.- EVALUACIN
1. El laboratorio de principios de sistemas celulares es una asignatura de tipo
prctica, donde es relevante la experimentacin, por lo tanto, usted deber
tener un cuaderno de laboratorio donde registre de manera grfica y ordenada
sus experimentos. El cuaderno ser evaluado con nota como se explic en la
seccin anterior.
2. Los alumnos deben cumplir con un test de entrada al inicio de cada laboratorio.
Es obligatorio cumplir con el horario de entrada (13:50). Una vez iniciado el test
de entrada, si Ud. llega tarde debe esperar fuera del laboratorio hasta que
esta concluya y ser evaluado con nota 1.0 sin posibilidad de
recuperacin
3. Se deber entregar un informe semanal correspondiente a la actividad
realizada en el laboratorio, este debe ser entregado al comienzo del
laboratorio siguiente a la profesora o el ayudante. No se recibirn informes
atrasados y estos sern evaluados con nota final 1.0. As mismo, el informe
corregido usted lo recibir al comienzo de la siguiente sesin de laboratorio.
4. Se trabajar en grupos de cuatro alumnos, estos grupos quedarn constituidos
en la primera sesin de laboratorio y sern definitivos por el resto del semestre.
Habr un encargado de grupo el que se debe encargar de verificar que quede
todo el material que su grupo utilice durante el laboratorio.
5. La asistencia es 100% obligatoria en todos los trabajos prcticos. La
ausencia a un laboratorio debe ser debidamente justificada, por el contrario Ud.
reprobar de manera inmediata el curso.
6. El uso del delantal es obligatorio por su seguridad, as mismo, se prohbe el
uso de collares, bufandas, o cualquier artculo en su vestimenta que pueda
poner en riesgo su seguridad, es necesario que los alumnas o alumnos que
usen el pelo largo lo lleven recogido durante la prctica del laboratorio.
EVALUACIN
Cuaderno
Test de entrada
Informes

20%
30%
50%

Si usted tiene alguna consulta o inconveniente puede dirigirse directamente al


profesor o al ayudante en horario de clase, fuera de clase puede enviar sus
consultas al e-mail. Esperamos que estos laboratorios sean muy tiles en su
formacin y trataremos de hacer de estos laboratorios una grata experiencia para
ustedes.

iii

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

III. GUA DE MANEJO PARA MICROPIPETAS


La micropipeta es un instrumento volumtrico de laboratorio empleado para
medir y transferir pequeos volmenes de lquidos de manera precisa y segura, lo
que permite su manejo en las distintas tcnicas biolgicas. Segn el modelo se
puede manipular entre 0,1 l a 10.000 l.
El uso de micropipetas permite emplear distintos lquidos sin tener que lavar el
aparato, pues para ello, se emplean puntas desechables de plstico, que
habitualmente son estriles y/o cuentan con un filtro. Existen varios tipos de puntas
para los diferentes volmenes de la micropipeta.

1. Partes de una micropipeta:

iv

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

2. Seleccin del volumen


Para graduar el volumen de la micropipeta identifique la rueda, control y/ o tornillo
de graduacin.
Seleccione la micropipeta y las puntas que utilizar teniendo en cuenta el volumen
de solucin a pipetear:
Tipo de Micropipeta
Volumen
Tipo de punta
P10
0,5 l- 10l
Amarillas o blancas
P20
0,5 l- 20l
Amarillas o blancas
P100
10 l-100l
Amarillas
P200
20 l-200l
Amarillas
P1000
100l-1000l
Azules o blancas
Seleccione el volumen por medio de la rueda y/o tornillo de graduacin, d vuelta
al tornillo mientras observa el cambio de la numeracin en el display, teniendo
cuidado de no exceder los lmites de la micropipeta. El volumen mostrado en el
indicador est compuesto por 3 dgitos. En la parte ms baja del indicador puede
haber un nmero en rojo que permite ajustar el volumen en graduacin decimal.
Los nmeros negros indicarn microlitros y los rojos, dcimas de microlitros.
Ejemplos:
P2
1
2
5
1,25 l

P10
P20
0
7
5
7,5 l

P200
1
8
5
185 l

P1000
0
9
3
930 l

P5000
3
2
5
3,25 ml

Ponga la punta correspondiente y presione la punta firmemente. Evite en todo


momento tocar el orificio de la punta.
3. Operacin de la micropipeta
a. Apriete el botn pulsador suavemente hasta el primer tope. Sostenga la pipeta
verticalmente y sumerja la punta en el lquido. La profundidad a la que la punta se
sumerge en la muestra depende del modelo.
P2
1 mm
P10
1 mm
P20, P50, P100 2- 3 mm
P200, P1000
2- 4 mm
P5000
3- 6 mm
P10ml
5- 7 mm
b. Suelte el botn lenta y suavemente para aspirar la muestra. Espere y retire la
punta del lquido. Si suelta rpido el botn pulsador, entrar aire a la punta y
aspirar mayor volumen del necesario entrando de golpe parte de la muestra al
cuerpo de la micropipeta.
c. Coloque la parte inferior de la punta contra la pared del recipiente en un ngulo
aprox. de 40. Presione el botn hasta e primer tope para expeler la muestra.
d. Contine presionando el botn pulsador ahora hasta el segundo tope, para
vaciar el resto de la muestra. Mantenga el botn presionado hasta retirar la pipeta

del contenedor, deslizando la punta por la pared interior del recipiente. Luego
suelte el botn y expulse la punta apretando el botn expulsor.

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

Cuando se pipetean lquidos que tienen una viscosidad y densidad diferentes a la


del agua-como por ejemplo solventes orgnicos-se forma una pelcula de lquido
sobre las paredes internas de la punta. Esta pelcula puede crear error y puede
ser evitado mediante la formacin de la pelcula antes de transferirla primera
muestra; para esto se debe hacer una aspiracin de la muestra y dispensar la en el
mismo vaso, cuando la pelcula est formada y a todas las muestras siguientes
tendrn mejor exactitud y repetitividad. Esta operacin de pre-lavado deber ser
repetida cuando el volumen a ser aspirado cambia o cuando se usa una nueva
punta.
Cuando la muestra tiene una viscosidad alta, como es el caso del glicerol, el
Triton X-100, el aceite, etc. tras introducir la punta en la muestra, se debe aspirar
lentamente y retirar la micropipeta del contenedor, cuidando limpiar la punta en la
orilla de este, pues Ud. observar que la pared externa de la punta arrastrar un
considerable volumen del lquido aspirado. Cambie la punta si debe volver a
pipetear, si no lo hace observar que tras cada pipeteo, acumula muestra en la
punta, haciendo inexacto el volumen expulsado.
Cuando la muestra tiene una baja viscosidad, como es el caso del alcohol, el
cido actico, fenol, cloroformo, etc., debe cuidar no pipetear enrgicamente pues
el volumen puede pasar al interior de la micropipeta. Una vez tomado el volumen,
tenga la precaucin de trasladarlo de inmediato al recipiente que lo contendr,
pues -por su baja capilaridad- comenzar de inmediato a caer a gotas desde la
punta.
4. Recomendaciones
No pipetear volmenes que sobrepasen la capacidad de la micropipeta.
Durante el uso y almacenamiento las micropipetas deben permanecer en forma
vertical. Nunca coloque la micropipeta en posicin horizontal mientras contenga
lquido.
Ubicar las pipetas en soportes adecuados o en el embalaje original sin puntas.
Mantener limpias las micropipetas.
Si sus micropipetas son autoclavables y son sometidas a este proceso, estas
debern ser calibradas antes de su uso.
Evite autoclavar las micropipetas si esta caracterstica no se encuentra dentro
de las especificaciones.
Una vez terminado el uso de la micropipeta debe limpiarse el rea de
acoplamiento para evitar contaminacin y dejarla en el mximo volumen.
5. Gua de actividades
a. Tome y vace los siguientes volmenes de agua: 2 ml, 850 l, 200 l, 140 l,
75,2l, 4l.
b. Tome y vace los siguientes volmenes de alcohol: 2 ml, 850 l, 200 l, 140 l,
75,2 l, 4 l.
c. Tome y vace los siguientes volmenes de aceite: 2 ml, 850 l, 200 l, 140 l,
75,2 l, 4 l.

vi

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

IV. PLANIFICACIN 2do SEMESTRE 2016: CALENDARIO DE LABORATORIOS

Fecha de la
sesin

Control de
entrada

Entrega de
Informe

Laboratorio I:
Microscopa

7 octubre

Si

Si

Laboratorio II:
Microbiologa 1 Sesin

14 octubre

Si

Si

Laboratorio III:
Microbiologa 2 Sesin

21 octubre

Si

Si

Laboratorio IV:
Transformacin bacteriana

28 octubre

Si

Si

Laboratorio V: Extraccin
ADN

4 noviembre

Si

Si

Horario de laboratorio: Viernes 13:50 16:50

vii

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

V.- Informes
Esta pauta para la realizacin de informes slo puede usarse como referencia para
este prctico, debe tener en consideracin que los informes se regirn estrictamente
en esta pauta y que cada error ser penalizado en puntaje.
Pauta de correccin:
Introduccin y objetivos

1,5 pts

Materiales y mtodos

1,0 pts

Resultados

1,5 pts

Discusin y conclusiones

1,5 pts

Referencias

0,5 pts

Pauta de Informes
Los informes debern tener un mximo de pginas de acuerdo a la siguiente pauta:
Introduccin:
Mximo 1 pgina y media
Objetivos:
Mximo pgina
Materiales y mtodos:
Mximo 1 pgina
Resultados:
Mximo 1 y pginas (incluyendo figuras y tablas)
Discusin:
Mximo 1 pgina y media
Conclusin:
Mximo pgina
Referencias:
Mximo 1 pgina
Debern ser escritos en tamao carta (no se aceptarn informes en tamao oficio) con
una pgina portada, cualquier cosa que est ms all de la extensin mxima no ser
corregida. Los informes deben escribirse con letra Arial o Times New Roman de
tamao 11, con espacio 1,5, pginas numeradas y justificadas.
Los informes debern entregarse impresos en el plazo previamente establecido,
generalmente una semana despus de la realizacin del prctico, cualquier atraso
ser considerado en la nota del informe. Un atraso mayor a 3 horas considerar nota 1
(2 puntos menos por hora de atraso).
Los informes debern corresponder a un relato fluido, impersonal y lo ms objetivo
posible. Sern escritos en pretrito indefinido y en tercera persona singular. Debern
escribirse en correcto castellano, es decir, con la adecuada redaccin, sintaxis,
puntuacin y ortografa; obviamente errores en esto tambin restan puntaje.
Las abreviaturas slo se permiten si previamente usted nombra la palabra completa,
por ejemplo ascorbato peroxidasa (APX) y luego utiliza APX para referirse a sta en
el texto, las unidades deben regirse por el sistema cgs o mKs, y no van seguidas de
punto, por ejemplo litro se abrevia L y no Lt., ni Lts..

viii

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

1. La pgina de la portada debe contener:


a. Un membrete que diga: Universidad de Santiago de Chile, la unidad(es)
encargada(s) y el nombre de la asignatura; con el respectivo escudo de la
Universidad (puede obtenerlo de la intranet de la universidad, en la seccin
normas grficas).
b. Ttulo de la experiencia, y no el nmero del informe o trabajo prctico.
c. Autores en orden alfabtico respecto al apellido.
d. Fecha de entrega.
e. Nombre del (los) docente(s) encargado(s).
2. Introduccin
Debe exponer de forma clara los antecedentes tericos acerca de la temtica
abordada en el prctico. Deber comenzar explicando en trminos generales las
tcnicas en caso de ser trascendentales para el entendimiento del informe tambin
deben abordarse, obviamente conectando con lo anterior, es decir, debe ser fluido.
Todo aspecto terico abordado debe estar citado a la literatura, para ello puede
colocar entre parntesis al final de la frase u oracin un nmero, o bien el apellido
del primer autor seguido del ao de la publicacin de sta forma por ejemplo: (Zhu
y col., 2008), en caso de ser slo dos autores debe colocar el apellido de ambos
de sta forma: (Dixon y Sumner, 2004). Al final de esta seccin deber exponer su
hiptesis de trabajo, nunca coloque hiptesis:, sino que colquela fluidamente en
el texto, no es necesario explicitar donde est.
3. Objetivos
En esta seccin deber exponer como un punteo su objetivo general y sus
objetivos especficos, de manera clara y bien definidos.
4. Materiales y mtodos
En esta seccin debe detallar el procedimiento utilizado, paso a paso, con los
tiempos verbales que corresponde, recuerde que no es una receta de cocina.
Deber detallar referencia a materiales, reactivos y equipos utilizados, estos
ltimos con su debida marca de fabricante, modelo y ciudad de origen, por ejemplo
se utiliz un espectrofotmetro UV-Visible (Agilent 7453, Palo Alto, CA, EUA),
materiales de uso comn como micropipetas, matraces y vasos no deben ser
explcitamente nombrados, ni se debe indicar su marca, ni modelo. Cuide de no
ser redundante, no debe decirse se centrifug en una centrifuga, por ejemplo.
Cuide las unidades, por ejemplo si utiliza alcuotas del orden de los microlitros,
deber nombrarlos como L y no como uL, eso es un error y finalmente tenga
cuidado con el tipo de medicin y su unidad, no puede referirse a gramos de
extracto, por ejemplo. En caso de seguirse un protocolo tal cual la gua, esta podr
ser citada; ponga nfasis en los cambios que se realicen.
5. Resultados
En esta seccin debe exponer los resultados y describir sus observaciones. Estas
observaciones deben ser sustentadas mediante el uso de dibujos, fotografas,
tablas y grficos. Cada uno debe llevar un ttulo (el cual puede poner al comienzo
del pie de figura, de forma destacada) y un nmero consecutivo de acuerdo a su
aparicin en el texto, toda figura y tabla debe estar debidamente citada en el texto,
adems deben tener un pie; en el pie de figura no realice ningn tipo de anlisis, ni
descripcin, slo debe indicar lo que representa dicha figura. No debe repetir la
informacin en tablas y grficos, debe incluir errores y anlisis estadsticos en caso

ix

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

de requerirlo, no puede afirmar que existe una diferencia entre una medicin y otra
sino realiza un anlisis como un ANOVA, por ejemplo. El tipo de grfico tambin es
importante, en caso de cinticas o dosis puede utilizar dispersiones unidas por
lneas, en caso de mediciones independientes las barras son ms adecuadas, si
no ha realizado un curso de estadstica no es excusa para no realizar
adecuadamente los anlisis.
6. Discusin
Esta seccin es quizs la ms importante de su informe, la primera frase debe ser
la verbalizacin de su resultado ms relevante. Luego debe discutir todo sus
resultados y debe darle una interpretacin biolgica a stos, si tiene discrepancias
a lo que esperaba tambin debe exponerlo de forma clara. Debe decir si cumpli o
refut su hiptesis y el porqu, no repita resultados y todas las afirmaciones o
posibles razones deben estar debidamente citadas, tal como en la introduccin.
7. Conclusiones
Exponga si cumpli o no sus objetivos, y el porqu.
8. Referencias
Debe colocar el listado de referencias utilizado, no se aceptar el uso de pginas
web en ningn caso, la aparicin de una pgina web en esta seccin implicar
invalidez de la seccin total; tenga cuidado con los copy-paste que son muy
fciles de descubrir. Utilice la forma estndar para citar (abajo se presentarn
ejemplos), en caso de usar nmeros, debern ir en orden de aparicin en el
informe de forma progresiva (1, 2, 3); si utiliz apellidos para citar, use orden
alfabtico.
Ejemplos
Para el uso de publicaciones:
Verdonk J, Ric de Vos C.H, Verhoeven H.A, Haring M.A, van Tunen A.J, Schuurink
R.C. (2003). Regulation of floral scent production in petunia revealed by targeting
metabolomics. Phytochemistry 62: 997-1008.
Apellidos en orden como aparecen en la publicacin (los autores definen este orden y
quienes usan sus trabajos no deben alterar esto), seguidos del ao entre parntesis, el
ttulo de la publicacin, el nombre de la revista abreviado en cursivas, el nmero en
negrita (si tiene varios tomos el nmero de tomo se debe incluir entre parntesis en
negrita tambin) y dos puntos, seguido de los nmero de pginas.
Para libros
Futuyma D.J. (1986). Evolutionary biology. 2 Ed. Sinauer associates Inc. Publishers
(Sunderland, MA). pp: 325-401.
Apellidos en orden, ao de la publicacin, ttulo del libro, edicin, editorial, ciudad entre
parntesis, pagnas (pp:) y el nmero de las pginas.
*Taxonoma: cada vez que utilice un nombre de alguna especie, se coloca gnero
especie en cursivas y taxnomo en caso de tenerlo (por ejemplo Vaccinium
corymbosum L.) Vaccinium es el gnero (que comienza con mayscula), corymbosum
es la especie (en minsuclas) y la L. es de Linneo, quin clasific la especie, la
primera vez que la nombre debe colocar el gnero completo y entre parntesis la

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

familia, as: Vaccinium corymbosum L. (Ericaceae), en donde Ericaceae es la familia,


no en cursivas. Luego en el texto puede nombrarlo como V. corymbosum, es decir con
la inicial del gnero seguido de la especie, se obvia al taxnomo (quin previamente
ya fue nombrado).
En caso de usar referencias obtenidas de internet procure que la informacin sea de
instituciones confiables.
Colocar autor, ao en fue publicada la informacin, pgina web y da que fue visitada
la pgina.

xi

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

LABORATORIO I.
Microscopa
La observacin directa de los materiales biolgicos, est limitada por la capacidad del ojo
humano para percibir pequeos detalles. El mximo poder de resolucin del ojo humano
est dado por la capacidad de diferenciar dos puntos que se hallan separados por 0,1
mm y colocados a 25 cm de distancia del ojo, que es la distancia ptima de visin distinta
o menor distancia que no produce fatiga visual.
En general las clulas son muy pequeas para ser observadas a simple vista, lo que
obliga disear instrumentos pticos capaces de proporcionar imgenes
considerablemente agrandadas de los objetos.
Considerando el tamao de las estructuras que componen la materia viva y su
dependencia con los instrumentos pticos, aqullas se diferencian en:
a) macroscpicas,
b) microscpicas y
c) submicroscpicas.

Visibles a simple
vista

No visibles a
simple vista

Estructuras
macroscpicas (mm)

Poco aumento: lupa simple (hasta 20


X)
Mayor aumento: lupa binocular (30-50
X)

Estructuras
microscpicas (m)

Gran aumento: microscopio comn:


(hasta 1500-2000 X)

Estructuras submicroscpicas (nm)

Ultra estructura: microscopio


electrnico de transmisin
(hasta 100.000 X)

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

El microscopio ptico
El microscopio ptico tiene un lmite resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m). Este
lmite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 m). Las clulas observadas
bajo el microscopio ptico pueden estar vivas, fijadas y/o teidas.

El Microscopio Electrnico de Transmisin (MET)


El microscopio electrnico de transmisin (MET) tiene un lmite de resolucin de cerca
de 2 nm. Un MET permite la observacin clulas muertas, despus de haber sido
fijadas y teidas con iones de metales pesados. Los electrones son dispersados
cuando pasan a travs de una fina seccin del espcimen, y luego detectados y
proyectados para formar una imagen sobre una pantalla fluorescente.
El Microscopio Electrnico de Barrido (MEB)
El microscopio electrnico de barrido (MEB) tambin tiene un lmite de resolucin de
2nm. El MEB permite la observacin de clulas muertas, despus de haber sido
fijadas y teidas con iones de metales pesados. Con esta tcnica los electrones son
reflectados sobre la superficie del espcimen.
Estructura y manejo del microscopio ptico
Las partes esenciales que componen un microscopio ptico (ver figura adjunta) son:
Parte mecnica
- Pie o soporte: sirve como base al microscopio y en l se encuentra la fuente de
iluminacin.
- Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el centro se
encuentra un orificio que permite el paso de la luz. Sobre la platina hay un sistema de
pinza o similar, para sujetar el portaobjetos con la preparacin, y unas escalas que
ayudan a conocer qu parte de la muestra se est observando. La platina presenta 2
tornillos, generalmente situados en la parte inferior de la misma, que permiten
desplazar la preparacin sobre la platina, en sentido longitudinal y transversal
respectivamente.
- Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el soporte de
oculares y objetivos.
- Revlver portaobjetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos.

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

- Brazo o asa: une el tubo a la platina. Lugar por el que se debe tomar el microscopio
para trasladarlo de lugar.
- Tornillo macromtrico: sirve para obtener un primer enfoque de la muestra al
utilizarse el objetivo de menor aumento. Desplaza la platina verticalmente de forma
perceptible.
- Tornillo micromtrico: sirve para un enfoque preciso de la muestra, una vez que se
ha realizado el enfoque con el macromtrico. Tambin desplaza verticalmente la
platina, pero de forma prcticamente imperceptible. Es el nico tornillo de enfoque que
se utiliza, una vez realizado el primer enfoque, al ir cambiando a objetivos de mayor
aumento.
Parte ptica
- Oculares: son los sistemas de lentes ms cercanos al ojo del observador, situados
en la parte superior del microscopio. Son cilindros huecos provistos de lentes
convergentes cuyo aumento se indica en la parte superior de los mismos
(normalmente 10X en los microscopios que se utilizarn en esta prctica).
Dependiendo de que exista uno o dos oculares, los microscopios pueden ser mono o
binoculares.
- Objetivos: son sistemas de lentes convergentes que se acoplan en la parte inferior
del tubo, mediante el revlver. En esta estructura se pueden acoplar varios objetivos
(ordenados de forma creciente segn sus aumentos, en el sentido de las agujas el
reloj). Un anillo coloreado es distintivo de los aumentos de cada objetivo, que tambin
van indicados en el lateral del mismo. Algunos objetivos no enfocan bien la
preparacin al aire, y se deben de utilizar con un aceite de inmersin (normalmente
van marcados con un anillo rojo).
- Condensador: sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y los
concentra sobre la preparacin, de manera que proporciona mayor o menos contraste.
Se regula en altura mediante un tornillo (letra J de la figura)
- Fuente de iluminacin: en los microscopios a utilizar, el aparato de iluminacin est
constituido por una lmpara halgena de bajo voltaje (12V) situada en el pie del
microscopio. La luz procedente de la bombilla pasa por un reflector que enva los
rayos luminosos hacia la platina
- Diafragma o iris: sobre el reflector de la fuente de iluminacin. Abrindolo o
cerrndolo permite graduar la intensidad de la luz.
- Transformador: ya que el voltaje de la bombilla es menor que el de la red, es
necesario para enchufar el microscopio. Algunos modelos ya lo llevan incorporado en
el pie del microscopio. Adems, el transformador dispone de un potencimetro para
regular la intensidad de la luz.

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

A
B
C
D
E

OCULARES
REVLVER
OBJETIVOS
PLATINA
TORNILLOS para desplazar la
preparacin sobre la platina en
sentido longitudinal y transversal
F
CONDENSADOR
G
Tornillo MACROMTRICO
H
Tornillo MICROMTRICO
I
DIAFRAGMA IRIS
J
TORNILLO para regular la altura
del condensador
K
INTERRUPTOR
L
REGULADOR
DE
LA
INTENSIDAD DE LUZ
M
PINZAS
para
ajustar
la
preparacin sobre la platina
N
PIE O SOPORTE
MONTAJE Y ENFOQUE DE UNA
PREPARACIN MICROSCPICA
Antes de observar la preparacin al microscopio, esta debe de ser montada sobre
vidrio. Para ello existen dos piezas de vidrio denominadas portaobjetos (porta), que,
como su nombre indica, es el soporte sobre el que va la muestra, y cubreobjetos
(cubre) que siempre ha de colocarse sobre la muestra. Una vez colocada la muestra
en el porta, se debe aadir una gota de agua, o de la solucin acuosa pertinente,
antes de colocar el cubre, para evitar interfases agua-aire, que provocan zonas ciegas.
ENFOQUE DEL MICROSCOPIO
Los pasos a seguir para la perfecta utilizacin del microscopio son las siguientes:
1. Enchufar el microscopio al transformador y ste a la red
2. Colocar la preparacin sobre la platina de forma que la estructura a observar
quede en el orificio central de la platina.
3. Poner el objetivo de menor aumento cuyo amplio campo visual facilita el
hallazgo de estructuras importantes.
4. Subir la platina accionando el tornillo macromtrico y mirando la preparacin
desde fuera hasta alcanzar el tope superior. En ningn caso tocar la
preparacin con los objetivos.
5. Mirando por los oculares, bajar lentamente la platina con el tornillo
macromtrico hasta conseguir ver el objeto lo ms ntido posible.
6. Ajustar el enfoque con el tornillo micromtrico hasta verlo claramente.
7. Para observar la preparacin a mayores aumentos cambiar de objetivo con un
simple giro del revlver (SIN MOVER EN NINGN CASO EL TORNILLO
MACRO). Las pequeas variaciones que se observen en el enfoque se
producen al cambiar de objetivo y se corrigen con el micro.
8. Para observar otros campos, desplazar la preparacin moviendo los tornillos de
la platina.

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

OSMOSIS EN CLULAS ANIMALES


Cuando los eritrocitos (clulas rojas) se encuentran en un ambiente hipotnico el agua
les entra por difusin y sucede hemlisis (el rompimiento de una clula roja). Cuando
la clula roja est en un ambiente hipertnico pierde agua, se encoge y sucede
crenacin. En este experimento se observar el comportamiento de las clulas rojas
de la sangre en soluciones hipotnicas e hipertnicas.
Para que la clula funcione eficientemente, debe mantenerse en la misma un ambiente
estable conocido como homeostasis. Para mantener este equilibrio existen
mecanismos para el transporte selectivo de materiales hacia el interior o exterior de la
clula. Las membranas de la clula son selectivamente permeables, permitiendo el
paso de algunas sustancias o partculas (molculas, tomos, o iones), e impidiendo el
paso de otras. Esta selectividad se debe a la capa doble de fosfolpidos de la
membrana. La manera en que las molculas pasan por la membrana depende en
parte de la polaridad de las mismas. Las molculas hidrofbicas, o no polares, pasan
con relativa libertad a travs de la capa de lpidos, mientras que molculas hidroflicas,
o polares, incluyendo el agua, y las molculas de mayor tamao, pasan a travs de
canales formados por protenas transportadoras. La regulacin del transporte de las
molculas, o la direccin en que se mueven depende de su gradiente de
concentracin (diferencia en concentracin entre dos lugares). Las molculas se
mueven constantemente debido a su energa cintica y se esparcen uniformemente en
el espacio disponible. Este movimiento, llamado movimiento browniano, es la fuerza
motriz de la difusin. Difusin se define como el movimiento natural de las partculas
de un rea de mayor concentracin a un rea de menor concentracin hasta alcanzar
un equilibrio dinmico, en el cual el movimiento neto de partculas es cero. La difusin
no requiere gasto de energa por parte de la clula y por lo tanto es un movimiento
pasivo. Cuando la clula transporta sustancias en contra de un gradiente de
concentracin (de un rea de menor concentracin a un rea de mayor concentracin)
se requiere energa (ATP) y sucede movimiento activo.
El componente principal de la clula es el agua, que acta como solvente (el agente
que disuelve) de solutos orgnicos e inorgnicos. El movimiento de agua a travs de
una membrana selectivamente permeable se llama osmosis (difusin de agua) y
sucede siempre del rea de mayor concentracin de agua (con menor concentracin
de soluto) al rea de menor concentracin de agua (con mayor concentracin de
soluto). El agua se mover entonces, a favor de un gradiente de concentracin hacia
el rea de mayor concentracin de soluto (donde hay una menor concentracin de
molculas de agua libres). Cuando la clula contiene una concentracin de solutos
mayor que su ambiente externo, se dice que la clula est en una solucin hipotnica,
y como consecuencia, el agua entra a la clula causando que se expanda. Si la
concentracin de solutos es mayor fuera de la clula, se dice que la clula est en una
solucin hipertnica; la clula pierde agua y se encoge. Si las concentraciones de
soluto son iguales en ambos lados de la membrana, se dice que la clula est en una
solucin isotnica, donde el movimiento neto es cero. Las clulas animales funcionan
ptimamente en ambientes isotnicos. En las clulas vegetales, sin embargo, cuando
la vacuola se llena de agua, sta ejerce presin contra la pared celular hasta llegar a
un punto donde se impida que entre ms agua (presin de turgencia) y la clula se
encuentra trgida (firme), lo cual es el estado ideal de estas clulas. Por otra parte, si
la clula vegetal pierde agua, la clula sufre plasmlisis al separarse la membrana
celular de la pared celular, lo cual suele ser letal para la clula.

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

ACTIVIDAD PRCTICA
1. Observacin de catfilo de Allium cepa. Separe un catfilo de un bulbo de cebolla y
mantngalo en una placa con agua destilada, corte en dos el catfilo. El primer
catfilo transfiralo directamente a un portaobjetos, observe la organizacin celular
a 10x y 40x; dibuje lo observado a escala, reconociendo el mayor nmero de
estructuras posibles. El segundo trozo somtalo a tincin con hematoxilina/eosina,
para ello cubra el catafilo con hematoxilina durante 10 minutos, lave repetidamente
con agua hasta eliminar el exceso de tincin, luego trate 30 segundos con HCl 0.2%
y lave con agua abundante, finalmente cubra con eosina durante 5 minutos y
elimine el exceso de tincin, observe al microscopio a 10x y 40x, reconozca
estructuras y dibuje a escala.
2. Observacin de cloroplastos en Elodea. Exponga una hoja de Elodea sumergida en
agua a oscuridad durante 15 minutos, transfiera la muestra rpidamente a un
portaobjetos, observe y compare entre la muestra en oscuridad (realice rpido el
procedimiento ya que la luz del microscopio podra influir en sus resultados.
Identifique cloroplastos (forma, color y movimiento). Realice un diagrama a escala.
3. Observacin de muestras preparadas. En este caso el profesor le proveer de
muestras de diversos tejidos cartlago, neuronas, pared estomacal, algas, tallo de
plantas mono y dicotiledneas, races, etc., las que deber dibujar a escala,
identificando las principales estructuras (cada dibujo debe estar debidamente
rotulado).
4. Observacin muestra de sangre. Se realizar un frotis de a acuerdo a las siguientes
indicaciones:
1. Rotule tres tubos de ensayo: 0.1, 0.3 y 0.6 M.
2. Aada soluciones de sacarosa de diferentes osmolaridades:
Tubo 1: 3 ml de solucin de sacarosa 0.1 M
Tubo 2: 3 ml de solucin de sacarosa 0.3 M
Tubo 3: 3 ml de solucin de sacarosa 0.6 M
3. Aada 3 ml de sangre a cada tubo, y observe la apariencia de la mezcla.
4. Rotule y prepare cuatro frotis:
Muestra 1: Gota de sangre, coloque el cubreobjeto y observe los eritrocitos bajo
el microscopio.
Muestra 2: Gota de la mezcla del tubo 1 (0.1 M), coloque el cubreobjeto,
observe bajo el microscopio y compare con muestra 1.
Muestra 3: Gota de la mezcla del tubo 2 (0.3 M), coloque el cubreobjeto,
observe bajo el microscopio y compare con muestra 1.
Muestra 4: Gota de la mezcla del tubo 3 (0.6 M), coloque el cubreobjeto,
observe bajo el microscopio y compare con muestra 1.

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

LABORATORIO II.
Microbiologa 1 Sesin
OBJETIVOS
Al trmino del curso, el alumno deber ser capaz de:
Identificar el material habitual utilizado en la prctica de Microbiologa.
Manipular con alguna destreza y en condiciones de esterilidad materiales de
laboratorio y cultivo de microorganismos.

REGLAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA


Antes de comenzar y despus de terminar, limpie la superficie del mesn con una
solucin de etanol 70%.
Mantenga su mesn libre de materiales no esenciales en el momento y djelo
ordenado al terminar.
Ponga el material slido sucio en recipientes de vidrio, especialmente el material
contaminado con microorganismos.
Debido a que muchos de los microorganismos con los cuales Ud. trabajar son
potencialmente patgenos, Ud. debe trabajar usando tcnicas aspticas en el manejo
y transferencia del material.
Si se derrama algn lquido contaminado, limpie con cloro o etanol la superficie.
Evite llevarse las manos a los ojos, boca o mojar con la lengua. Avise inmediatamente
cualquier accidente, tales como cortaduras, quemaduras o derrames al ayudante o
profesor.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
En la naturaleza los microorganismos existen como complejas poblaciones de muchos
tipos diferentes. Nuestro conocimiento de la microbiologa se desarroll gracias al
estudio de especies aisladas, creciendo en ambientes libres de contaminacin de otras
formas de vida.
Como todas las formas de vida, los microorganismos requieren de los nutrientes
adecuados para crecer como tambin de un ambiente favorable. El medio de cultivo
debe contener aquellos nutrientes esenciales para el crecimiento y este medio debe
estar adems en las condiciones adecuadas para el crecimiento, esto es, factores
como pH, presin osmtica, oxgeno, etc. Los medios de cultivo pueden ser de una o
dos formas: lquido o slido.
Ya que la mayora de los estudios en el laboratorio se realizan con cultivos puros, esto
es, con un nico microorganismo, se deber estar capacitado para esterilizar un medio
de cultivo y mantenerlo en condiciones estriles, libre de otras formas vivas. Al mismo
tiempo, cuando se inocule el medio con el microorganismo en estudio, esto se deber
hacer en condiciones libres de contaminacin. Esto ltimo se conoce como tcnica
asptica.

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

Debido a que los medios cuando son preparados contienen microorganismos


provenientes de los ingredientes y de los utensilios, tiene que ser esterilizado, esto es,
tratado con temperatura a presin u otros mtodos para destruir las clulas presentes.
Los recipientes en donde se encuentra el medio de cultivo (tubo, matraz, frasco)
debern ser tapados con tapones de gasa o tapas roscas sueltas, de manera de
impedir la entrada de los microorganismos a los medios de cultivo, pero permite el
intercambio gaseoso.
INOCULACIN
Para crecer un cultivo bacteriano en un medio estril, un nmero de clulas el
inculo- debe ser transferido (inoculado) desde otro medio con las precauciones
necesarias para mantener la pureza del cultivo. Este procedimiento se realiza con un
asa microbiolgica (asa de nicrn), la que debe ser calentada a la llama hasta
enrojecimiento y luego enfriarla antes de ponerla en contacto con el cultivo bacteriano.
Con esta asa es posible realizar inoculaciones desde un cultivo bacteriano en medio
lquido o desde colonias en un medio slido al medio estril. La cantidad de bacterias
que es transferida es lo suficientemente grande en el asa que no es necesario agitarla
en el medio lquido estril.
En el procedimiento de inoculacin es muy importante calentar el asa hasta
enrojecimiento, tanto antes como despus de la transferencia, lo que destruye
cualquier forma de vida en la superficie del asa. Para ello debe sostener el asa hacia
abajo en la llama, calentando todo el alambre y parte del porta asa (ver figura).

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

Durante la transferencia, sostenga el tubo con la mano izquierda y tome el tapn con
el dedo meique de la mano derecha o entre los dedos (no es fcil al comienzo, pero
se logra con la prctica). Mantenga el tubo lo ms horizontal posible durante la
inoculacin, pero por el mnimo tiempo posible. Las bocas de los tubos tanto del que
se toma el inculo como del que se inocula, debern ser flameadas a la llama antes y
despus. La llama crea una corriente de conveccin disminuyendo la probabilidad de
contaminacin (ver figura).

Como es de gran importancia el trabajo con cultivos puros, es necesario que estas
tcnicas aspticas sean dominadas.
Despus de la inoculacin, el cultivo bacteriano deber ser incubado en un ambiente
adecuado para el crecimiento. Crecimiento significa el desarrollo de una poblacin de
clulas a partir de una o pocas clulas. Esta masa de clulas hijas se hace visible al
ojo desnudo por la turbidez en un medio lquido, o por una poblacin aislada una
colonia- en un medio slido. La apariencia del crecimiento bacteriano es una forma de
diferenciacin entre las especies microbianas.
Una forma de preparar un medio slido de cultivo es agregando un agente solidificante
a un medio de cultivo, el que en fro se solidifica. El ms comn es el agar, sustancia
obtenida de un alga marina y que se comercializa en forma de polvo seco.
Qumicamente, el agar es un galactano, un carbohidrato complejo compuesto por
molculas de galactosa y no es metabolizado (degradado) por la mayora de las
bacterias. Se usa generalmente a una concentracin de 1,5%, cuando se siembra
sobre su superficie. Otros agentes utilizados para solidificar los medios de cultivo son:
la gelatina a una concentracin de 12 15%, que es lquida a temperatura sobre 25 C
y que es hidrolizada por algunas bacterias; la slica gel, una sustancia usada para el
cultivo de auttrofos, para los cuales la materia orgnica debe estar ausente.
Las siguientes actividades tienen como objetivo familiarizarse con el material usado en
microbiologa, con los diferentes tipos de medios de cultivo y con las tcnicas
aspticas en el aislamiento y transferencia de cultivos puros.

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

TCNICAS DE CULTIVO PURO


Al agregar una sustancia solidificante a un medio lquido las clulas bacterianas
quedan atrapadas en forma individual en un lugar. Producirn una colonia fija que
crece como una masa visible. Si las clulas originales quedan atrapadas lo
suficientemente separadas, cada clula viable se desarrollar en una colonia separada
y distinta. Este hecho es de gran importancia, porque permite trabajar con cultivos
puros obtenidos a partir de una colonia, ventaja que no ofrece el cultivo lquido.
Imagnese separar una mezcla de bacterias usando un cultivo lquido. Sin embargo, si
las clulas son separadas por dilucin y luego fijadas en un medio slido para formar
colonias, se pueden despus aislar en tubos con medio de cultivo en forma separada.
Si las diluciones se miden cuidadosamente y se deposita en el medio slido una
cantidad tambin conocida, es posible cuantificar el nmero de bacterias viables
presentes en la muestra inicial.
Las colonias varan en tamao, forma, textura y color entre los diferentes
microorganismos; por lo tanto, la apariencia de la colonia es una pista valiosa en la
identificacin de un cultivo y la confirmacin de su pureza.
SEPARACIN DE COLONIAS EN PLACA
Se describe dos mtodos para separar colonias mediante siembra en placa (ver
figuras). Se aplica el cultivo de bacterias sobre la superficie del agar y se distribuye
sobre todo el agar con el asa en una lnea.

El objetivo inmediato es producir colonias de bacterias lo suficientemente separadas


desde una suspensin muy concentrada de bacterias. Al comienzo de la inoculacin
habr una gran concentracin de bacterias que estarn muy juntas, pero a medida que

10

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

la lnea de siembra contina, cada vez menos bacterias quedarn en el asa. Estas
ltimas formarn colonias lo suficientemente separadas.
En ambas tcnicas se comienza con una gota de cultivo en un borde de la placa.
En la primera tcnica, se flamea el asa y se enfra apoyndola en la tapa de la placa o
en una zona del agar del borde. Con el asa as esterilizada, se toma el cultivo
bacteriano y se inicia la siembra en lnea desde un borde de la placa y realizando
lneas de un extremo a otro con lneas paralelas hacia Ud. y cuidando de no pasar por
la estra anterior. Una vez que llegue a la mitad de la placa, grela en 180 y contine
con las lneas alejndose de Ud.
La segunda tcnica, se inicia con una gota y se realizan 2 3 estras paralelas en un
borde de la placa. Se flamea el asa, se enfra y se realizan 2 3 estras en un ngulo
recto con las primeras lneas y pasando una vez por las estras anteriores. Repita 1
2 veces ms, y en la ltima cubra completamente la placa. Es importante flamear entre
cada ngulo el asa para eliminar el exceso de bacterias.

11

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

ACTIVIDAD PRCTICA

Antes de comenzar el trabajo no olvide:

Rotular correctamente sus tubos y placas.


Trabajar en un radio de 15 cm del mechero para mantener la esterilidad.

1. Aislamiento
a.

Control microbiolgico del ambiente.

Para determinar la carga microbiana del aire en el rea de trabajo, existen equipos
especiales. Sin embargo, una tcnica simple y bastante efectiva consiste en dejar
abierta en el ambiente una placa Petri con el medio selectivo para el microorganismo
que se desea investigar. En este caso utilizaremos placas de LB agar para el
crecimiento de bacterias.
Para este objetivo se dejar durante 15 minutos una placa Petri que contenga LB agar;
finalmente cerrar la placa e incubar durante 24 horas a 37C. Realizar el recuento de
microorganismos (UFCs) presentes.
b.

Control microbiolgico de superficies.

Pasar un trula estril por una superficie (zapato, suelo y mesn, etc) y sembrar sobre
la mitad de una placa de LB agar. A continuacin, humedezca la trula en una solucin
de cloro y psela por la otra mitad de la placa. Incubar las placas en las condiciones
correspondientes.
c.

Control microbiolgico del manipulador.

Pasar un trula por la superficie interior de la boca y/o garganta; sembrar sobre la
mitad de una placa de LB agar. A continuacin en la otra mitad repita el procedimiento
anterior pasando la trula sobre su mano. Incubar las placas en las condiciones
correspondientes.

12

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

2. Siembra de muestras
a.
De medios Slidos a medios Slidos (Siembra en Placa por Estras)
Con ayuda de un asa estril traspasar una asada del cultivo en csped a un extremo
de la placa Petri que contiene LB Agar y extender formando estras sobre la superficie
del agar.
Algunas clulas individuales se desprenden del asa al frotarla sobre la superficie y
desarrollarn colonias aisladas. Incubar durante 24 horas a 37C con el fondo hacia
arriba.

b.
De medios Slidos a medios Lquidos (Siembra en tubo con medio de
cultivo lquido)
Con ayuda de un asa traspasar una colonia del cultivo a un tubo con caldo LB.
Tapar el tubo, rotule como corresponde e incube durante 24 horas a 37C.

13

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

c.

De medios Lquidos a medios Slidos

c.1. Siembra en Placa por Extensin (csped bacteriano)


Tomar 0,1 mL del tubo de ensayo que contiene microorganismos suspendidos en
medio de cultivo lquido (LB).
Depositar el volumen al centro de una placa de Petri con LB Agar.
Extender uniformemente sobre la superficie con un rastrillo de vidrio.
Incubar durante 24 horas a 37C con el fondo hacia arriba.

c.2. Siembra en Profundidad


Fundir tubos con LB Agar y a continuacin enfriar alrededor de los 45C.
Mezclar ~20 mL de LB Agar con una alcuota de 1 mL cultivo que contiene
microorganismos suspendidos en medio de cultivo lquido (LB).
Rpidamente verter al centro de una placa Petri vaca y esterilizada, tapar.
Mezclar con suaves movimientos circulares, evitando que el agar lquido se derrame.
Dejar solidificar el agar a temperatura ambiente.
Incubar durante 24 horas a 37C con el fondo hacia arriba.

14

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

c.3. Agar profundo


Con la ayuda de un asa, tome una alcuota de bacterias desde su cultivo lquido.
Inserte en un solo movimiento el asa por el centro del agar, sin llegar al fondo de este.
Incubar durante 24 horas a 37C.
c.4. Agar tendido.
Utilizando los tubos de agar tendido entregados, realice una siembra sobre la
superficie tendida del agar: utilizando el asa, tome un alcuota de cultiva bacteriano y
de manera similar a lo realizado anteriormente, siembre en estras con un movimiento
ondulante del asa, cuidando de no presionar en exceso el agar.
Incubar durante 24 horas a 37C.

NOTA: Siempre marque las placas con su nombre o iniciales, la fecha y una
identificacin del contenido.
Despus de la incubacin, estudie el crecimiento en sus placas. Observe las
diferencias del tamao de las colonias, la forma y su apariencia. Hubo separacin de
colonias? Si no la hubo, por qu cree que no result?
Dibuje el resultado de su separacin de colonias. Anote la apariencia de las diferentes
colonias.
En las placas con demasiadas colonias, stas crecen como colonias pequeas,
juntndose de modo que el crecimiento aparece como turbidez. En las placas en que
hay una buena separacin de colonias, stas crecen grandes, con una forma, color y
textura caractersticos y distintivos.

15

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

16

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

LABORATORIO III.
Microbiologa 2 Sesin
Agentes Qumicos de Control: Desinfectantes y Antispticos.
(Traer agentes antispticos y/o desinfectantes acuosos).
Antispticos y desinfectantes son sustancias qumicas usadas para prevenir la
contaminacin e infeccin. La mayora se encuentran disponibles comercialmente para
la desinfeccin y asepsia. Los agentes qumicos simplemente inhiben actividades y/o
el crecimiento microbiano, o bien son letales y matan los microorganismos.
Generalmente los que son usados para limpiar la piel son los antispticos, los cuales
son normalmente bacteriostticos, inhibiendo el crecimiento. En cambio, los
desinfectantes son bactericidas. Entre estas sustancias qumicas podemos encontrar
los alcoholes, halgenos, aldehdos, fenoles, complejos con metales pesados y
compuestos de amonio cuaternario. Su mecanismo de accin se especifica en la
siguiente tabla:
Agente
Compuestos fenlicos.
Fenol
Cresol
Alcoholes
Etanol
Isopropanol
Halgenos
Compuestos clorados

Compuestos Iodados
Metales pesados
Compuestos de Mercurio
Nitrato de Plata
Agentes Catinicos
Comp. Amonio
cuaternario
Formaldehdo

Mecanismo de Accin
Usos
Efecto Germicida causado
Solucin 5%
por
alteracin
de
la
estructura de protenas;
Desinfeccin.
Solucin 0,5 1%
precipita
las protenas
celulares y altera la
Efecto antisptico.
membrana celular.
Solvente lpidico.
Antisptico de piel
Denaturacin y
til: 50 70%
coagulacin de protenas.
Isopropil: 75%
Cloruro reaccin con el
agua para formar c. Industria lechera, equipos
Hipocloroso, el cual es de la industria alimentaria,
bactericida.
Agente
suministros de aguas.
oxidante.
Ioda los residuos de
Piel,
jabones,
tirosina de las protenas.
desodorantes y lociones
Agente oxidante.
corporales.
Principalmente
usados
Reacciona con los grupos
como desinfectantes de
SH de las protenas.
material de laboratorio.
Ojos del recin nacido,
Precipita las protenas.
para evitar la ceguera.
Interacciona con
Piel, Desinfectante de
fosfolpidos de la
piscinas,
Sanitizacin
membrana.
diaria y en restaurantes.
Desinfeccin de piezas,
Agente alquilizante, causa
Solucin alcohlica para
reduccin de enxzimas
instrumentos.

17

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

La eficiencia de todos los desinfectantes y antispticos est influenciada por una


variedad de factores, incluyendo los siguientes:
I.
Concentracin: la concentracin de una sustancia qumica influye en el efecto
sobre el microorganismo, con una mayor concentracin se produce mayor muerte. La
concentracin no puede ser arbitrariamente determinada, hay que considerar la
toxicidad sobre tejidos y el dao en el material no vivo.
II.
Tiempo de exposicin: todos los microbios no son destruidos dentro el mismo
tiempo de exposicin. Entre ms larga la exposicin del agente, la actividad
antimicrobiana es mayor.
III.
Tipo de poblacin microbiana que ser destruida: los microorganismos
varan e su susceptibilidad a la destruccin por qumicos. Las esporas bacterianas son
las ms resistentes. Bacterias encapsuladas son ms resistentes que las no
encapsuladas, bacterias con cidos grasos son ms resistentes que las que no tienen;
las clulas ms viejas, metablicamente menos activas son ms resistentes que las
clulas jvenes.
IV.

Condiciones ambientales:

i.
Temperatura: las clulas mueren como resultados de una reaccin qumica
entre los agentes y los componentes celulares. Un incremento en la temperatura
incrementa la tasa de reacciones qumicas.
ii.
pH: pH extremos son perjudicial para la mayora de los microorganismos y
puede potenciar la accin antimicrobiana del agente. Tambin podra disminuir su
accin, porque cambios en el pH neutro puede ionizar el compuesto.
iii.
Tipo de material en el cual vive el microorganismo: Si el material en el cual
microorganismos habitan son principalmente orgnicos, como sangre, pus, o fluidos, el
agente reaccionar con estas molecular orgnicas extracelulares, y su actividad
antimicrobiana ser reducida.
Antibiticos y antibiograma.
El empleo de sustancias antibacterianas constituye en la actualidad una parte
importante en el tratamiento de diversas enfermedades que afectan al hombre,
animales y vegetales. Debido al enorme consumo mundial de estas sustancias, en los
ltimos aos se ha dado un gran valor a los fenmenos bacterianos de tipo ecolgico.
De esta manera, la gran actividad antibacteriana de los antibiticos se ha visto
opacada por consecuencias desfavorables, entre ellas la aparicin de cepas que
presentan una elevada resistencia a varios antibiticos en forma simultnea, la
variacin paulatina de la etiologa de algunas enfermedades infecciosas por el
desplazamiento de las especies o cepas ms sensibles, etc.
Una manera de disminuir la intensidad de los fenmenos indeseables que acarrea el
uso indiscriminado e inadecuado de los antibiticos, es su empleo correcto.

18

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

Modo de accin

Inhibicin de sntesis de la
pared

Accin sobre la membrana


Polipptidicos bsicos
Replicacin del DNA
Transcripcin del DNA

Traduccin del mRNA


(sntesis de protenas)
Anomalas en la lectura del
cdigo

Antibiticos
Penicilina
Bacitracina
Novobiocina
Cicloserina
Vancomicina
Ristocetina
Grriseofulvina
Polimixinas
Bacitracina
Tirotricina
Mitomicina
cido
nalidixico
Actinomicina
Novobiocina
Macrolidos
Sinergistina
Lincomicina
Tetraciclina
Cloranfenicol
Aminosidas

La lectura de los resultados es bastante simple y su expresin representa en buena


forma la actividad in vitro del antibitico a emplear; segn Leclerc (1981) los resultados
se pueden interpretar cualitativamente de la siguiente manera:

Sensible: zona de inhibicin superior a 15 mm


Lmite: zona de inhibicin inferior a 15 mm
Resistente: zona de inhibicin inexistente.

Es necesario sealar que el tamao del halo de inhibicin es influenciado por varios
factores, entre ellos tenemos: medio de cultivo en que se realiza la prueba, estabilidad
del antibitico, capacidad de difusin del antibitico, cantidad de inculo, rapidez de
desarrollo del microorganismo, sensible al antibitico, perodo de incubacin.
Cualquier variacin de estos factores puede afectar el resultado de la prueba, sin
embargo, al emplear un procedimiento estndar es posible obtener resultados
confiables.
Objetivo: Evaluar y Comparar la efectividad de desinfectantes, antispticos,
antibiticos y otras sustancias contra microorganismos.

19

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

ACTIVIDAD PRCTICA
Actividad 1: Accin de desinfectantes y antispticos sobre el crecimiento bacteriano en
placa (Mtodo de Kirby- Bauer).
i.

Realice un csped bacteriano con cultivo de Escherichia coli sobre una placa
de LB-agar, asegurndose que no quede ninguna superficie sin cultivo. Realice
lo mismo con un cultivo de Bacillus subtilis. Espere que se seque bien.

ii. Con pinzas flameadas con alcohol, distribuya 6 discos de papel repartidos por
la placa.
iii. Con una pipeta Pasteur agregue 1 gota pequea de los diferentes agentes a
cada uno de los discos de papel. Identifquelos en la placa de Petri.
iv. Incube las placas sin invertirlas 37C.
v. Mida los dimetros de los halos de inhibicin del crecimiento. Registre los
resultados y clasifique a la bacteria como sensible, lmite o resistente.

20

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

Actividad 2: Accin de antispticos en la piel de manos.


i.

Aplique antispticos en una de las manos o lave una con jabn.

ii. Para cada mano, pase una trula humedecida en suero fisiolgico e inocule la
mitad de una placa (una mitad de la placa para el control y la otra para el
tratamiento).
iii.

Incube las placas sin invertirlas a 37C.

iv. Determine el grado de crecimiento en las placas correspondientes a cada


seccin.
Actividad 3. Efecto de antibiticos sobre el crecimiento bacteriano (antibiograma).
i. Agregar 200 l del respectivo cultivo bacteriano a una placa de agar MullerHinton.
ii.

Esparcir con rastrillo estril, a fin de obtener un csped bacteriano.

iii.

Agregar los discos con antibiticos que se le indicara.

iv.

Rotular la placa.

v.

Incubar a 37C

vi.

Medir rea de inhibicin luego de 24 horas.

Actividad 4: Efecto de metales pesados sobre el crecimiento bacteriano (toxicidad).

Repita el procedimiento de la Actividad 1, agregando sobre los sensidiscos 10


ml de cada una de las soluciones de metales pesados.

21

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

LABORATORIO IV.
Transformacin Bacteriana
La transformacin es el proceso por el cual se introduce el cido desoxirribonucleico
(ADN) forneo en una clula. La transformacin de las bacterias con plsmidos
(unidades de ADN que contiene informacin gentica) es importante no slo para los
estudios en bacterias, sino tambin porque las bacterias se utilizan como medio para
almacenamiento y replicacin de plsmidos.
El propsito de esta tcnica de biologa molecular es la introduccin de un plsmido
forneo en una bacteria compatible y utilizar estas las bacterias transformadas para
amplificar el plsmido con el fin de hacer grandes cantidades de la misma. Esto se
basa en la funcin natural de un plsmido: para transferir informacin gentica vital
para la supervivencia de las bacterias.
Debido a esto, casi todos los plsmidos, incluso los diseados para su uso en clulas
de mamfero, llevan tanto un origen de replicacin bacteriano y un gen de resistencia a
los antibiticos para el uso como un marcador seleccionable en bacterias.
Los cientficos han hecho muchas modificaciones genticas para crear cepas
bacterianas que pueden ser ms fcilmente transformado y que ayudar a mantener el
plsmido sin reordenamiento del ADN plsmido. Adems, los tratamientos especficos
se han descubierto que aumentar la eficiencia de transformacin de las bacterias y los
hace ms susceptibles a ya sea qumica o de transformacin en base elctrica,
generando lo que se conoce comnmente como "clulas competentes".
Una tcnica que permite obtener clulas competentes es tratar un cultivo de bacterias
recogido en fase logartmica con una solucin a 4C de CaCl2, tras lo cual la mezcla de
clulas y ADN se someten unos 2 min a 42C (choque trmico). Este tratamiento altera
las envolturas (sobre todo la membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN.
Los transformantes se suelen seleccionar en base a la resistencia a algn o algunos
antibiticos conferidos por los plsmidos. Es posible realizar transformaciones con
secuencias de ADN, sin embargo, el uso de plsmidos ofrece la ventaja de aumentar
considerablemente la eficiencia de la transformacin.

22

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

En este sentido, se ha logrado transformar bacterias de E. coli con genes que


aumentan su resistencia a antibiticos como por ejemplo la estreptomicina.

En la figura se muestra que existe un aumento en la resistencia a estreptomicina a


medida que aumenta el nmero de bacterias de E. coli transformadas., es decir, que la
transferencia de genes de resistencia a estreptomicina (strr) en cepas sensibles a
este antibitico, produce una recuperacin en las clulas transformantes de E. coli, lo
cual depende de la concentracin de ADN strr.
ACTIVIDAD PRCTICA
Protocolo de transformacin bacteriana usando bacterias quimio-competentes
1.- Descongelar en hielo viales de clulas novablue (200 l aprox.) y el plsmido.
2.- Agregar 1-2 l del plsmido purificado a las clulas y dejar incubando 30 min en
hielo.
3.- Incubar 90 segundos a 42 C y luego incubar 5 min en hielo.
4.- Agregar 800 l de medio LB y crecer 1-2 horas a 37C con agitacin suave.
5.- Sembrar 100- 150 l de las bacterias en placas LB-antibitico.
6.- Dejar las placas creciendo a 37C toda la noche.

23

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

LABORATORIO V.
Extraccin de ADN
En las clulas se encuentran dos variedades de cidos nucleicos: el cido ribonucleico
(ARN) y el cido desoxirribonucleico (ADN). En el ADN estn codificados los genes, el
material hereditario de las clulas, y contiene instrucciones para la produccin de
todas las protenas que el organismo necesita.
El ADN se puede extraer a partir de clulas de cualquier organismo vivo, desde
bacterias a clulas humanas y tambin a partir de virus.
Uno de los principales factores a considerar cuando se extrae ADN genmico, es el
tipo de organismo con el cual se va a trabajar y la cantidad de tejido del que se
dispone.
Todas las clulas vivientes, tanto procariotes como eucariotes, contienen DNA como
material gentico. La nica excepcin son los virus, que no son clulas, y que pueden
tener DNA o RNA, de simple o doble hebra, lineal o circular, como genoma. El
material gentico de procariotes y eucariotes es replicado cuando la clula se divide y
permite que la clula hija herede el mismo material gentico que la clula madre. Para
que se formen las clulas se deben sintetizar las protenas y los RNA estructurales
(rRNAs, tRNAs y snRNAs) que forman una clula, entre otras biomolculas
estructurales importantes. Para ello, los genes codificados en el genoma deben ser
expresados; esto significa que los genes que codifican para protenas tienen que ser
transcritos en RNA informacionales (mRNA) y luego ser traducidos por los ribosomas
hasta polipptidos, y que los RNA estructucturales (rRNA, tRNAs y snRNAs) deben ser
transcritos.
Mediante electroforesis en un gel de agarosa es posible separar ADN o una mezcla de
molculas de ADN. Para ello las molculas de ADN que estn inmersas en un gel se
someten a la accin de un campo elctrico. Dado que los fragmentos de ADN estn
cargados negativamente todos se mueven en la misma direccin hacia el nodo,
migrando ms rpido los fragmentos ms pequeos. Las molculas as separadas se
pueden visualizar mediante tincin con bromuro de etidio (cuidado; el bromuro de
etidio es altamente cancergeno), un colorante que se intercala entre las bases
nitrogenadas y emite fluorescencia cuando se irradia con luz ultravioleta.
El genoma de la bacteria Escherichia coli (E. coli) est compuesto por 4.7 x 106 pares
de bases y codifica para 4.300 genes. En contraste, el genoma de una levadura
contiene 20 x 106 pares de bases y codifica para 6.000 genes, el genoma de la mosca
Drosophila melanogaster posee 125 x 106 pares de bases y codifica para 20.000
genes, Arabidopsis thaliana posee 125 x 106 pares de bases que codifican 25.500
genes, y el genoma humano est compuesto por 3000 x 106 pares de bases y codifica
para 30.000 a 40.000 genes. Por lo tanto, el genoma de E. coli es 5 veces ms
pequeo que el de levadura, 25 veces ms pequeo que el de Drosophila y 600 veces
ms pequeo que el de clulas humanas.
El genoma de E. coli ha sido
completamente secuenciado, al igual que el de clulas humanas.
Para extraer DNA bacteriano se deben realizar cuatro etapas principales: a) el
tratamiento con lisozima de las bacterias que permite degradar la pared bacteriana y
generar esferoplastos, b) la ruptura de las clulas, que en este caso se realizar con la
solucin comercial DNAzol (Gibco) que contiene isotiocianato de guanidinio como
agente desnaturante, c) la desnaturacin de las protenas con fenol a pH=8.0 y la
extraccin del fenol residual en la fase acuosa que se realiza con cloroformo o ter, d)
la precipitacin del DNA con etanol para purificarlo an ms y concentrarlo. El DNA
cromosomal extrado tanto de procariotes como eucariotes migra en un gel de agarosa

24

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

como una banda de un tamao "artefactual" de 21 a 23 kpb (fragmento ms grande


del estndar de tamao molecular).
ELECTROFORESIS
La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de macromolculas. La
separacin tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las
macromolculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo elctrico
como consecuencia de su relacin carga/masa. Los cidos nucleicos son
macromolculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en
su estructura. La naturaleza del enlace fosfodister de las cadenas polinucleotdicas
condiciona la carga de un cido nucleico, que es aproximadamente igual al nmero de
grupos fosfato.
La electroforesis en geles de agarosa se realiza en cubetas apropiadas, generalmente
horizontales, y requiere dos elementos indispensables: la fase mvil y la fase
estacionaria. La fase mvil es el medio amortiguador o tampn que permite la
movilidad de las molculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se
genera un campo elctrico. La fase estacionaria o soporte, es un polmero de
naturaleza gelatinosa con un tamao de poro homogneo que se haya sumergido y
embebido en la fase mvil. El polmero utilizado para el anlisis electrofortico de
cidos nucleicos de gran tamao (100pb-10kb) es la agarosa.
La migracin de los fragmentos de cidos nucleicos (ADN o ARN) en un gel de
agarosa sometido a un campo elctrico depende tanto del voltaje del campo, como del
tamao de poro del gel de agarosa. La separacin efectiva de los fragmentos de ADN
o ARN (resolucin) depende tanto de la masa como de la carga de los distintos
fragmentos, en realidad de la relacin carga/masa. Transcurrida la electroforesis, la
localizacin relativa de los fragmentos se determina mediante distintos mtodos de
deteccin. La tincin con bromuro de etidio, una sonda fluorescente tras iluminacin
con luz UV, es un mtodo generalizado de deteccin de fragmentos de ADN, ya que la
sonda se intercala entre la doble hlice de ADN y emite luz.

25

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

ACTIVIDAD PRCTICA
Para comenzar con el trabajo de cada grupo, se cultivar la cepa de E. coli JM109
(DE3) en 100 mL de medio Luria-Bertani (medio LB) (bactotriptona 10 g/L, extracto de
levadura 5 g/L, NaCl 5 g/L) durante toda la noche hasta obtener un cultivo en fase
estacionaria.
El cultivo de E. coli lo realizarn los ayudantes y se le entregar un tubo Eppendorf
con 100 L de bacterias controles (crecidas sin cobre) congeladas y un tubo
Eppendorf con 100 L de bacterias tratadas con cobre congeladas. A continuacin el
trabajo que sigue lo realizar cada grupo de laboratorio:
1.

Tomar un tubo Eppendorf con 100 L de pellet bacteriano control y descongelar a


temperatura ambiente.

2.

Resuspender las clulas en 100 L de buffer Tris-HCl 50 mM pH 8.0, agregar 10


L de solucin recin preparada de lisozima 10 mg/mL e incubar 20 minutos a
temperatura ambiente.

3.

Agregar 1 mL de solucin DNAzol (Gibco BRL) para obtener la lisis de los


esferoplastos pipeteando suavemente repetidas veces la mezcla con ayuda de
una micropipeta Gilson P1000.

4.

Centrifugar el homogenizado 10 minutos a 14.000 rpm (velocidad mxima) en una


microcentrfuga Eppendorf a temperatura ambiente y recuperar el sobrenadante
(viscoso por la presencia de DNA genmico) en otro tubo Eppendorf.

5.

Agregar un volumen de solucin fenol-cloroformo, agitar suavemente (para no


romper el DNA cromosomal) en un vortex para mezclar las fases y centrifugar 5
minutos a temperatura ambiente en una microcentrfuga Eppendorf.

6.

Retirar la fase superior (fase acuosa), ponerla en otro tubo Eppendorf y repetir la
extraccin con fenol-cloroformo (para eliminar bien las protenas).

7.

Retirar la fase superior (fase acuosa), ponerla en otro tubo Eppendorf, agregar un
volumen de ter o cloroformo, agitar suavemente en un vortex y centrifugar 1
minuto.

8.

Retirar la fase inferior si se us ter o la superior si se us cloroformo (fase


acuosa) y repetir la extraccin con ter o cloroformo una segunda vez (para
eliminar bien el fenol residual).

26

Facultad de Qumica y Biologa


Ingeniera Civil Qumica
Departamento de Biologa

9.

Retirar la fase acuosa, ponerla en otro tubo Eppendorf, agregar 500 L de etanol
absoluto fro, mezclar suavemente por inversin varias veces y dejar 3 minutos a
temperatura ambiente. Observar la precipitacin del DNA cromosomal.

10. Centrifugar 2 minutos a temperatura ambiente para obtener un pellet de DNA


cromosomal y descartar el sobrenadante.
11. Agregar 1 mL de etanol al 75% para lavar superficialmente el pellet de DNA y
descartar el sobrenadante.
12. Secar el pellet de DNA a 50 grados Celsius (poner el tubo abierto en una estufa)
ambiente durante algunos minutos (10-15 minutos aprox., o el tiempo que sea
necesario hasta que el pellet est completamento seco). Agregar 100 L de agua
destilada para hidratar el DNA dejndolo sin agitacin a temperatura ambiente por
al menos 5 minutos. Posteriormente, con la punta de una pipeta mezclar el pellet
con el buffer y luego succionar y expulsar el lquido suavemente hasta completa
homogenizacin. De esta manera, obtendrn una solucin acuosa de DNA
cromosomal de aproximadamente 1 g/L.
13. Preparar un gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X y al agregar buffer de corrida
bromuro de etidio (EtBr) 50 g/mL (los ayudantes les mostrarn esta primera vez).
Si se prepara 1 litro de buffer de corrida y la solucin stock de bromuro de etidio
tiene una concentracin de 10 mg/mL, se deben agregar 5 L. Despus de haber
puesto el gel en la cmara y haber adicionado el buffer de corrida, agregar 2,5 L
en el compartimiento del ctodo y 2,5 L en el compartimiento del nodo y agitar
suavemente el buffer de ambos compartimientos para que se el EtBr se distribuya
homogneamente. Obviamente, todo esto se hace antes de cargar las muestras
en el gel.
NOTA: No es necesario ni conveniente agregar EtBr a la agarosa, ni tampoco a las
muestras que se van a cargar en el gel.
14. Tomar una alcuota de 3 L de la solucin de DNA bacteriano, agregar 2 L de
agua destilada y 1 L de buffer de carga 6X y cargar todo el volumen en un pocillo
del gel de agarosa con ayuda de una micropipeta. En un pocillo contiguo, cargar
2 L de estndar de tamao molecular correspondiente a DNA de fago lambda
digerido con las enzimas EcoRI y HindIII 1 g/L (Promega) mezclado con 3 L de
agua destilada y 1 L de buffer de carga 6X.
15. Realizar la electroforesis en gel de agarosa a 90 Volts durante 45 minutos (o hasta
que le indique el ayudante, dependiendo de la migracin del azul de bromofenol),
visualizar el DNA sobre un transiluminador de luz ultravioleta y tomar una registro
fotogrfico para poder estimar la concentracin.

27