Optical microscopy Not just for

making pictures
July 23, 2015 Leave a comment
The study of natural materials at varying scales from molecular to millimetric- is an
increasingly necessary field of research. By observation of the interaction of light with
natural materials at different scales through an optical microscope, we can further understand
their organization and properties. This understanding leads to the development of new
technologies for practical applications from medicine to the processing of natural resources.
Although optical microscopes are often thought of only as instruments for making pictures
they are actually multi-functional instruments which can also use light to probe structures
across many length scales.
Imaging requires contrast: some way of distinguishing where something is located in space
and where it is not. Modern developments in microscopy have provided us with new tools for
gaining contrast of natural materials as small as 0.1 to 1 nanometer based on chemical or
other atomic-scale structural properties. This is still too small for an optical microscope to let
us actually see anything but it does enable us to infer something about their structures
based on other measurements done on the same instrument.
Moreover, careful measurement in an optical microscope of the motion of small particles in
biological and other soft materials gives us important understanding of their integration at
the nanometric level. Therefore, modern optical microscopy-based instruments are not just
about taking pictures of small things; they are an ideal experimental platform to make
measurements across many time and space scales up to a few millimeters size and help us
better understand the organization of natural materials.

A view of the oil sands after processing, through an optical microscope. The blue and
magenta areas in the image show quartz sand grains. Adhering to these grains, the fluorescent
(green) areas are a residual oily material. Additionally some nanometer size carbon particles
are found on the surfaces in some places and show up as bright yellow colored dots some
are indicated by the white arrows. Credit: National Research Council of Canada.
A bit of history
We understand well that most things in nature animal, vegetable and mineral are
composed of molecules formed through tight, chemical bonding of atoms. Deriving
macroscopic properties of materials is more difficult. A process which is most successful in
cases where there is little interaction between particles, or highly ordered lattice or crystal
structures. Very few natural materials, however, conform nicely to these states of matter. In
most materials there is aggregation and granularity occurring at many different spatial and
time scales. But by using optical microscopy we can make difficult multi-scale measurements
and have been doing so over the course of history.
Around 1830 the Scottish botanist Robert Brown observed the ceaseless agitated motion of
small particles of about 1 micron in preparations of pollen grain specimens suspended in
water using a simple optical microscope. This type of movement of microscopic particles in a
liquid or gas is now called Brownian motion. Early in the 20th century, in work derived from
his doctoral thesis, Albert Einstein showed that it was possible to estimate the size of the

molecules of water, which we cannot observe with an optical microscope, from the careful
measurements of Brownian motion of particles about 10,000 times bigger.
At that time the idea that there was a discontinuous/granular nature in the structure of matter
was controversial. It wasnt until a few years after Einsteins work not much more than
100 years ago that the careful measurements of Brownian motion by the French physicist
Jean Perrin, again using an optical microscope, provided experimental confirmation that lead
to the wide acceptance of the atomic theory of the organization of matter.
This story from the history of science reveals the important role of optical microscopy in the
experimental confirmation of theories of the organization of matter; something that is
continuing today.
Enabling technology: how different types of light have let us see new things
Many important insights can be made into the organization of matter, especially at the atomic
and molecular scale by carefully managing the light we use to illuminate a sample.
One method is to use nonlinear optical signals. Normally, light interaction with matter will
generate a response which is linearly proportional to the intensity of the light, where an
increase in one will lead to an increase of one in the other. However, many revealing
responses in materials are made through nonlinear illumination. To give a better picture,
mathematically y = x, is a linear relationship while y=x2 or y=x3 etc. are nonlinear.
Continuous illumination levels required for observable nonlinear optical responses would
rapidly destroy samples. These light intensity levels can be obtained, however, by using a
laser that produces a stream of very short light pulses. In this case, while the transient
intensity is sufficient for nonlinear optics, the average power can remain within a tolerable
level. The squeezing of light in time and space confines the non-linear optical response to a
very small volume by tightly focusing it through the microscope. This volume is about one
billion times smaller than a 1 millimeter grain of sand but still contains around a billion
atoms.
Using a variety of these nonlinear optical techniques, we are able to discern specific
properties about the organization of matter. The optical signals provide the contrast needed
for imaging and multi-scale measurements.
The most basic organization of atoms into matter is the chemical bonding of two atoms
together to form molecules. This primary level of organization creates a new property that
we can probe with light. As a mechanical analogy, atoms can be thought of as little weights
and the bond holding them together as a stiff spring. This simple mechanical system will
vibrate at a well-defined frequency as a characteristic of the two atoms and how they are
bonded together. The frequency will be shifted slightly when more atoms join together or
when the molecule is close to others. Very generally measuring the frequency responses of
something is called spectroscopy.
Saving lives and resources one microscope at a time
At the National Research Council of Canada (NRC) some of the techniques we use to make
these kinds of measurements are called coherent-anti Stokes Raman scattering (CARS) and

stimulated Raman scattering (SRS). CARS and SRS provide contrast in imaging based on
the density of vibrating chemical bonds in the sample. These occur at the same time and can
often be collected simultaneously.
Using the CARS/ SRS techniques NRC is studying microorganisms which can accumulate
high quality oil. With these methods we are able to take many microscopic pictures, each one
depicting a different part of the vibrational frequency spectrum (see below) to help us better
understand how the micro-organisms generate the oil drops

Some microorganisms can accumulate a lot of high quality oil. Pictured above is molecular
scale information (spectrum on right) from 1 micron scale oil drops (circled in picture) that
are accumulated in a single-cell organism, using CARS/SRS microscopy. Credit: National
Research Council of Canada.
Another nonlinear optical signal we can readily see in the microscope is second harmonic
generation (SHG). This is a signal which occurs in materials where there is some periodic
ordering (crystal-like) but where there is a particular asymmetric arrangement. SHG arises
from the atomic level structure of materials. Nature seems to have contrived to provide us
with SHG as a means of microscopic study as it is very common in natural materials. For
example, collagenwhich is the major structural component of most tissues of animals as
well as being the most abundant protein in their bodiesprovides a very strong SHG. By
understanding the origin of the SHG signal from collagen from microscopy, we may be able
to relate it to the diagnosis of disease in collagen containing tissues.
SHG is also very strong from the mineral quartz which, again, is one of the most abundant
terrestrial minerals and so is a major component of many soils and rocks.

Another example of a project taking place at NRCs CARS laboratory is the observation of
oil sands using optical microscopy to let us understand how the different components of the
raw material interact during processing. Here we use SHG as well as the natural fluorescence
of the oil component. We also use strong signals originating from nanometer sized particles
which are much smaller than can be resolved by the optical microscope but still interact
strongly with the laser light.
Sand ore consists of grains that are usually less than 200 microns or so in size as well as a lot
of much smaller mineral material. Process developers are working to reduce the amount of
wet waste produced by oil extraction from the sands. They would like to know how the
different components migrate during oil extraction. This information is an important step
towards developing new natural resource processing technologies. The Figure at the
beginning of the post depicts a view of an oil sand after processing.
Optical microscopy at the heart of innovation
We now can see how structure at the atomic scale can be inferred by examining the
interaction of a material with light. Lets return to Robert Brown and what he saw when he
examined plant material with his microscope. The agitated random motion of small particles
when pollen grains were put into water was only one of many forms of motion he saw. The
motion inside the cells of living plants was quite different. Particles embedded in living cells
and tissues demonstrate movement which deviates from that which is characterized by
Einsteins theory.
Careful characterization of this type of motion is one of a number of new hardware and
analytical tools, again based on optical microscopy, that are leading to a significant
deepening of our understanding of the mechanical integration of cells and tissues. These
insights should, in turn, provide advances in diagnosis and treatment of disease.
New optical microscopy techniques based on the intimate understanding of the interaction of
light with matter are finding other important applications across science and technology. For
many measurement types there are overlapping methods that may be superior to optical
microscopy. However, I believe that some of our best hope for breakthrough understanding in
science that leads to life-enhancing technology will involve the careful multi-scale
measurement of intact living things and other complex materials. Optical microscopy will
continue to be at the heart of discovery and innovation.

Optical microscopy Not just for

making pictures

https://light2015blog.org/2015/07/23/optical-microscopy-not-just-for-making-pictures/
Studi tentang bahan-bahan alami di berbagai skala - dari molekul ke millimetric- adalah bidang
semakin diperlukan penelitian. Dengan pengamatan interaksi cahaya dengan bahan-bahan alami pada
skala yang berbeda melalui mikroskop optik, kita dapat lebih memahami organisasi dan sifat mereka.
Pemahaman ini mengarah pada pengembangan teknologi baru untuk aplikasi praktis dari obat untuk
pengolahan sumber daya alam.
Meskipun mikroskop optik sering dianggap hanya sebagai instrumen untuk membuat gambar mereka
sebenarnya instrumen multi-fungsional yang juga dapat menggunakan cahaya untuk menyelidiki
struktur di banyak skala panjang.
Pencitraan memerlukan kontras: beberapa cara untuk membedakan mana sesuatu terletak dalam ruang
dan di mana tidak. Perkembangan modern dalam mikroskop telah memberikan kita dengan alat-alat
baru untuk mendapatkan kontras bahan alami sekecil 0,1 hingga 1 nanometer berdasarkan skala atom
sifat struktural bahan kimia atau lainnya. Ini masih terlalu kecil untuk mikroskop optik untuk
memberitahu kami benar-benar "melihat" apa-apa tapi itu memungkinkan kita untuk menyimpulkan
sesuatu tentang struktur mereka berdasarkan pengukuran lain dilakukan pada instrumen yang sama.
Selain itu, pengukuran-hati dalam mikroskop optik dari gerakan partikel kecil dalam "lunak" bahan
biologis dan lainnya memberikan kita pemahaman penting dari integrasi mereka di tingkat
nanometric. Oleh karena itu, modern optik instrumen berbasis mikroskop tidak hanya tentang
mengambil gambar dari hal-hal kecil; mereka adalah platform eksperimental yang ideal untuk
melakukan pengukuran di banyak waktu dan ruang skala sampai dengan ukuran beberapa milimeter
dan membantu kita lebih memahami organisasi bahan-bahan alami.
Pandangan dari pasir minyak setelah pengolahan, melalui mikroskop optik. Biru dan magenta daerah
di gambar acara butiran pasir kuarsa. Mengikuti butir ini, fluorescent (hijau) daerah adalah bahan
berminyak residual. Selain itu beberapa partikel karbon ukuran nanometer yang ditemukan pada
permukaan di beberapa tempat dan muncul titik-titik berwarna kuning terang - beberapa ditunjukkan
dengan tanda panah putih. Kredit: National Research Council of Canada.
Pandangan dari pasir minyak setelah pengolahan, melalui mikroskop optik. Biru dan magenta daerah
di gambar acara butiran pasir kuarsa. Mengikuti butir ini, fluorescent (hijau) daerah adalah bahan
berminyak residual. Selain itu beberapa partikel karbon ukuran nanometer yang ditemukan pada
permukaan di beberapa tempat dan muncul titik-titik berwarna kuning terang - beberapa ditunjukkan
dengan tanda panah putih. Kredit: National Research Council of Canada.
Sedikit sejarah
Kami memahami dengan baik bahwa kebanyakan hal di alam - hewan, tumbuhan dan mineral - terdiri
dari molekul yang terbentuk melalui ketat, ikatan kimia dari atom. Berasal sifat makroskopik bahan
lebih sulit. Sebuah proses yang paling sukses dalam kasus di mana ada sedikit interaksi antara
partikel, atau sangat memerintahkan kisi atau kristal struktur. Sangat sedikit bahan-bahan alami,
namun, sesuai dengan baik untuk negara-negara ini materi. Pada sebagian besar bahan ada agregasi
dan granularity terjadi di banyak skala spasial dan waktu yang berbeda. Tapi dengan menggunakan
mikroskop optik kita dapat membuat pengukuran multi-skala sulit dan telah melakukannya selama
sejarah.
Sekitar 1.830 ahli botani Skotlandia Robert Brown mengamati gerak gelisah tanpa henti dari partikelpartikel kecil dari sekitar 1 mikron dalam persiapan spesimen butir serbuk sari tersuspensi dalam air
menggunakan mikroskop optik sederhana. Jenis gerakan partikel mikroskopis dalam cairan atau gas
yang sekarang disebut gerak Brown. Pada awal abad ke-20, dalam pekerjaan berasal dari tesis

doktornya, Albert Einstein menunjukkan bahwa adalah mungkin untuk memperkirakan ukuran
molekul air, yang kita tidak dapat mengamati dengan mikroskop optik, dari pengukuran-hati gerak
Brown dari partikel sekitar 10.000 kali lebih besar.
Pada saat itu ide yang ada / granular alam terputus dalam struktur materi kontroversial. Tidak sampai
beberapa tahun setelah bekerja Einstein -tidak lebih dari 100 tahun yang lalu-bahwa pengukuran yang
cermat dari gerak Brown oleh fisikawan Perancis Jean Perrin, lagi menggunakan mikroskop optik,
memberikan konfirmasi eksperimental yang mengarah pada penerimaan luas teori atom dari
organisasi materi.
cerita ini dari sejarah ilmu pengetahuan mengungkapkan peran penting dari mikroskop optik di
konfirmasi eksperimental teori organisasi materi; sesuatu yang terus hari ini.
Mengaktifkan teknologi: bagaimana jenis cahaya yang berbeda telah mari kita lihat hal-hal baru
Banyak wawasan penting dapat dibuat menjadi organisasi materi, terutama pada skala atom dan
molekul dengan hati-hati mengelola cahaya yang kita gunakan untuk menerangi sampel.
Salah satu metode adalah dengan menggunakan sinyal optik nonlinier. Biasanya, interaksi cahaya
dengan materi akan menghasilkan respon yang berbanding lurus dengan intensitas cahaya, di mana
peningkatan satu akan menyebabkan peningkatan dari satu di lain. Namun, banyak tanggapan
mengungkapkan dalam bahan dilakukan melalui iluminasi nonlinear. Untuk memberikan gambaran
yang lebih baik, secara matematis y = x, adalah hubungan linear sementara y = x2 atau y = x3 dll
nonlinear.
tingkat pencahayaan terus menerus diperlukan untuk respon optik nonlinear diamati akan cepat
menghancurkan sampel. tingkat intensitas cahaya ini dapat diperoleh, namun, dengan menggunakan
laser yang menghasilkan aliran pulsa cahaya yang sangat singkat. Dalam hal ini, sedangkan intensitas
transien cukup untuk optik nonlinier, daya rata-rata dapat tetap dalam tingkat ditoleransi. The
meremas cahaya dalam ruang dan waktu membatasi respon optik non-linear dengan volume yang
sangat kecil dengan erat fokus melalui mikroskop. Volume ini adalah sekitar satu miliar kali lebih
kecil dari sebutir 1 milimeter pasir tapi masih mengandung sekitar satu miliar atom.
Menggunakan berbagai teknik optik nonlinier ini, kita dapat membedakan sifat spesifik tentang
organisasi materi. Sinyal optik memberikan kontras yang diperlukan untuk pencitraan dan multi-skala
pengukuran.
Organisasi yang paling dasar dari atom menjadi materi adalah ikatan kimia dari dua atom bersamasama untuk membentuk molekul. tingkat dasar organisasi ini menciptakan sebuah properti baru yang
kita dapat menyelidiki dengan cahaya. Sebagai analogi mekanik, atom dapat dianggap bobot sedikit
dan obligasi menahan mereka bersama-sama sebagai semi kaku. sistem mekanis sederhana ini akan
bergetar pada frekuensi yang terdefinisi sebagai karakteristik dari dua atom dan bagaimana mereka
terikat bersama. frekuensi akan bergeser sedikit ketika lebih atom bergabung bersama atau ketika
molekul dekat dengan orang lain. Sangat umumnya mengukur respon frekuensi sesuatu yang disebut
spektroskopi.
Menyelamatkan nyawa dan sumber daya satu mikroskop pada suatu waktu
Pada Dewan Riset Nasional Kanada (NRC) beberapa teknik yang kita gunakan untuk membuat jenisjenis pengukuran disebut koheren-anti Stokes Raman hamburan (CARS) dan dirangsang hamburan
Raman (SRS). CARS dan SRS memberikan kontras dalam pencitraan berdasarkan kepadatan bergetar

ikatan kimia dalam sampel. Ini terjadi pada waktu yang sama dan sering dapat dikumpulkan secara
bersamaan.
Menggunakan mikroorganisme CARS / teknik SRS NRC belajar yang dapat mengakumulasi minyak
berkualitas tinggi. Dengan metode ini kita dapat mengambil banyak gambar mikroskopis, masingmasing menggambarkan bagian yang berbeda dari spektrum frekuensi getaran (lihat di bawah) untuk
membantu kita lebih memahami bagaimana mikro-organisme menghasilkan tetes minyak
Beberapa mikroorganisme dapat mengumpulkan banyak minyak berkualitas tinggi. Gambar diatas
adalah informasi skala molekuler (spektrum di kanan) dari 1 mikron tetes minyak skala (dilingkari
dalam gambar) yang terakumulasi dalam organisme sel tunggal, menggunakan CARS / SRS
mikroskop. Kredit: National Research Council of Canada.
Beberapa mikroorganisme dapat mengumpulkan banyak minyak berkualitas tinggi. Gambar diatas
adalah informasi skala molekuler (spektrum di kanan) dari 1 mikron tetes minyak skala (dilingkari
dalam gambar) yang terakumulasi dalam organisme sel tunggal, menggunakan CARS / SRS
mikroskop. Kredit: National Research Council of Canada.
Lain sinyal optik nonlinier kita dapat dengan mudah melihat di mikroskop adalah generasi harmonik
kedua (SHG). Ini adalah sinyal yang terjadi pada bahan di mana ada beberapa memesan periodik
(kristal-seperti) tapi mana ada pengaturan asimetris tertentu. SHG muncul dari struktur tingkat atom
bahan. Alam tampaknya telah dibikin untuk menyediakan kami dengan SHG sebagai sarana studi
mikroskopis seperti itu sangat umum di bahan-bahan alami. Misalnya, kolagen-yang merupakan
komponen struktural utama dari sebagian besar jaringan hewan serta menjadi protein yang paling
melimpah di mereka tubuh-menyediakan SHG sangat kuat. Dengan memahami asal sinyal SHG dari
kolagen dari mikroskop, kita mungkin dapat menghubungkannya dengan diagnosis penyakit pada
jaringan kolagen yang mengandung.
SHG juga sangat kuat dari kuarsa mineral yang, sekali lagi, adalah salah satu mineral terestrial paling
berlimpah dan merupakan komponen utama dari banyak tanah dan batu.
Contoh lain dari proyek berlangsung di CARS laboratorium NRC adalah pengamatan pasir minyak
menggunakan mikroskop optik untuk memberitahu kami memahami bagaimana berbagai komponen
bahan baku berinteraksi selama pemrosesan. Di sini kita menggunakan SHG serta fluoresensi alami
dari komponen minyak. Kami juga menggunakan sinyal kuat yang berasal dari nanometer berukuran
partikel yang jauh lebih kecil daripada yang dapat diselesaikan dengan mikroskop optik tapi masih
berinteraksi kuat dengan sinar laser.
bijih pasir terdiri dari biji-bijian yang biasanya kurang dari 200 mikron atau lebih dalam ukuran serta
banyak bahan mineral jauh lebih kecil. pengembang proses sedang bekerja untuk mengurangi jumlah
sampah basah yang dihasilkan oleh ekstraksi minyak dari pasir. Mereka ingin tahu bagaimana
berbagai komponen bermigrasi selama ekstraksi minyak. Informasi ini merupakan langkah penting
menuju pengembangan teknologi pengolahan sumber daya alam baru. Gambar pada awal posting
menggambarkan pandangan dari pasir minyak setelah pengolahan.
mikroskop optik di jantung inovasi
Kita sekarang dapat melihat bagaimana struktur pada skala atom dapat disimpulkan dengan
memeriksa interaksi bahan dengan cahaya. Mari kita kembali ke Robert Brown dan apa yang dia lihat
saat dia diperiksa bahan tanaman dengan mikroskop. gerakan acak yang gelisah partikel kecil ketika
serbuk sari dimasukkan ke dalam air hanya satu dari banyak bentuk gerak yang dilihatnya. Gerak di
dalam sel-sel tanaman yang hidup sangat berbeda. Partikel tertanam dalam sel dan jaringan hidup

menunjukkan gerakan yang menyimpang dari apa yang ditandai dengan teori Einstein.
karakterisasi yang cermat dari jenis gerak adalah salah satu dari sejumlah hardware dan analitis alatalat baru, lagi berdasarkan mikroskop optik, yang mengarah ke pendalaman signifikan dari
pemahaman kita tentang integrasi mekanik sel dan jaringan. wawasan ini harus, pada gilirannya,
memberikan kemajuan dalam diagnosis dan pengobatan penyakit.
Baru teknik mikroskop optik didasarkan pada pemahaman intim interaksi cahaya dengan materi yang
menemukan aplikasi penting lainnya di seluruh ilmu pengetahuan dan teknologi. Bagi banyak jenis
pengukuran ada metode tumpang tindih yang mungkin unggul mikroskop optik. Namun, saya percaya
bahwa beberapa harapan terbaik kita untuk memahami terobosan dalam ilmu pengetahuan yang
mengarah ke teknologi-meningkatkan kehidupan akan melibatkan pengukuran multi-skala-hati
makhluk hidup utuh dan bahan kompleks lainnya. mikroskop optik akan terus berada di jantung
penemuan dan inovasi.