MICROBIOLOGA GENERAL INGENIERA AMBIENTAL

UNIVERSIDAD DE LA SALLE
MORFOLOGA MICRSCOPICA
Tcnicas de tincin

1. OBJETIVOS
Realizar diferentes tcnicas de tincin utilizadas en microbiologa.
Adquirir destreza en el manejo del microscopio ptico como herramienta esencial para el
estudio de los microorganismos.
Reconocer la morfologa microscpica de los principales grupos bacterianos y micticos.
2. FUNDAMENTACION
La morfologa microbiana se puede examinar microscpicamente de dos maneras.
Primero observando las preparaciones antes de colorear, preparaciones en fresco (hongos,
protozoos) y segundo observando extensiones delgadas (frotis) fijas y coloreadas (bacterias).
El objetivo de la fijacin es coagulas el protoplasma preservando la morfologa, adems de
ayudar a adherir la muestra al portaobjetos. El objetivo de la coloracin es teir el material y
permitir la diferenciacin de la morfologa celular. Como agentes de de fijacin se pueden
utilizar el calor, el alcohol y varios compuestos qumicos, el normalmente utilizado en
microbiologa es el calor.
Tincin simple:
Se lleva a cabo con colorantes bsicos como el azul de metileno, el cristal violeta y colorantes
cidos como la nigrosina.
Tincin Diferencial:
Como la coloracin de Gram y la coloracin de Zielh Neelsen.
* Coloracin de Gram , es la ms empleada en bacteriologa debido a que permite su
clasificacin en Gram positivo o Gram negativo de acuerdo a la composicin de su pared.
Tinciones especiales :
* Coloracin de Schaeffer foulton : especfica para esporas. Las esporas son estructuras de
algunas bacterias, las cuales pueden estar dentro del soma bacteriano (endoesporas) o
permanecer libres ; son formas de resistencia bacteriana, su tamao es variable y se pueden
localizar en posicin central (gnero Bacillus), subterminal (la mayora de los Clostridium) y
terminal (Clostridium tetani).
* Coloracin negativa de tinta china. Permite diferenciar la cpsula que poseen algunas
bacterias g(+) y g(-), localizada por fuera de la pared bacteriana. Dicha cpsula est
constituda por agua en un 90% y diferentes polisacridos simples o complejos o por
polipptidos.
* Coloracin de material de reserva, se utiliza la tincin de Albert o de Stoltemberg la cual es
especfica para grnulos citoplasmticos organizados como material de reserva por algunas
bacterias.
Azul de Lactofenol : Utilizado para resaltar las estructuras micticas en preparaciones en
fresco.

3. PRE-LABORATORIO
a. Cul es el fundamento de la coloracin de Gram?
b. Cul es la composicin qumica de la pared de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas?
c. Qu importancia tiene la presencia de esporas en el rea ambiental?
d. Investigue el fundamento de la coloracin para esporas.
e. Qu parmetros se tienen en cuenta al realizar el estudio microscpico de una bacteria?
f. Cmo se realiza el control de calidad de una coloracin?
4. MATERIALES Y REACTIVOS
- Asa bacteriolgica y micolgica
- Lminas limpias y desengrasadas
- Escobillones estriles
- Colorantes de Gram
- Solucin salina estril (gotero)
- Colorante Azul de Lactofenol
- Mechero
- Microscopio
- Papel Japn o de arroz
- Cepas de diferentes microorganismos
5. PROCEDIMIENTO
a.
b.
c.
d.

Realizar preparaciones en fresco segn instruccin del profesor

Realizar frotis o extensin a partir de cultivos microbiolgicos.
Fijar los frotis y colorear con tincin simple y coloracin de Gram
Realizar montajes en fresco con Azul de Lactofenol, segn las instrucciones del profesor.

a. Frotis:
1) En una lmina portaobjetos limpio y desengrasado coloque una gota de solucin salina.
2) Suspenda en la gota el inculo bacteriano tomndolo con el asa bacteriolgica estril.
3) Extienda la gota de suspensin en un rea no superior a dos centmetros cuadrados (un
buen frotis debe ser uniforme). Siga las instrucciones dadas por el profesor.
4) Deje que la preparacin se seque al aire y luego fjela al calor, pasando tres veces
seguidas a travs de la llama del mechero.
5) Las extensiones a partir de muestras lquidas se realizan de la misma manera, excepto que
no se requiere la suspensin en solucin salina.
b. Tincin Simple:
1) Coloque la preparacin sobre una rejilla encima del vertedero.
2) Cubra la preparacin con cualquiera de las soluciones colorantes que se dan a
continuacin.
Cristal violeta (de genciana) solucin al 5% en agua: 1 min.
Azul de metileno de Loeffler : 5 min.
Fuscina fenicada diluida: 30 segundos.
3) Despus del tiempo indicado, vierta el colorante y lave suavemente con el chorro del agua.
Deje secar.

4) Observe en el microscopio con el objetivo de menor aumento segn las indicaciones del
profesor.
c. Tincin Diferencial:
Coloracin de Gram;
1) Cubra el frotis con cristal violeta y djelo actuar por 1 min.
2) Lavar con agua de chorro y escurrir.
3) Agregue el lugol y djelo por 1 min.
4) Lavar con agua de chorro y escurrir.
5) Agregue alcohol etlico o alcohol acetona por 30 seg o hasta que decolore completamente
la lmina.
6) Lavar con agua de chorro y escurrir; examine el frotis, si quedan zonas violeta, aplique
nuevamente alcohol etlico por 30 seg.
7) Lavar con agua de chorro y escurrir.
8) Cubra los frotis con fuscina por 1 min.
9) Lavar con agua de chorro y escurrir.
10) Limpiar el exceso de colorante por debajo de la lmina.
11) Dejar secar a temperatura ambiente.
Mediante un buen enfoque observe las lminas, DIBUJE lo que observ y realice el estudio
microscpico.
d. Coloracin especial :
Schaeffer foulton ;
1) Cubrir el frotis fijado con verde de malaquita por cinco minutos calentando con un mechero
de alcohol.
2) Dejar enfriar la placa y lavar con agua destilada.
3) Contra colorear con safranina al 0.5% por un minuto y lavar nuevamente.
4) Dejar secar a temperatura ambiente.
5) Observar y realizar el estudio microscpico.

6. ANLISIS Y RESULTADOS
a. De acuerdo al estudio microscpico realizado dibuje y clasifique los microorganismos segn
su morfologa.
b. Analice brevemente la importancia del control de calidad de los procedimientos realizados.
c. Presente su informe individual al iniciar la siguiente sesin de laboratorio.
7. BIBLIOGRAFIA
Escriba la bibliografa consultada.
8. EVALUACIN
- Preparacin y elaboracin del pre-laboratorio y del informe.
- Actitud en la ejecucin del trabajo prctico.

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UNIVERSIDAD DE LA SALLE
DESARROLLO BACTERIANO
Medios de cultivo. Mtodos de siembra. Morfologa de colonias

1. OBJETIVOS
Conocer y diferenciar las caractersticas de crecimiento bacteriano in vitro.
Conocer y aplicar la utilidad de los diferentes medios de cultivo en el diagnstico
microbiolgico y en la conservacin de cepas para el control de calidad del mismo.
Conocer y realizar los diferentes mtodos de siembra utilizados en el estudio microbiolgico
de muestras.
2. FUNDAMENTACION
Al igual que los dems seres vivos, los microorganismos necesitan nutrientes apropiados junto
con condiciones ambientales favorables para un buen desarrollo.
El medio de cultivo debe contener los nutrientes esenciales para el crecimiento de una
determinada especie bacteriana.
Estn constituidos generalmente por extracto de carne, peptonas, NaCl, hierro, papa, soya,
sustancias que proporcionan a los microorganismos fuentes de carbono, nitrogeno y
nutrientes bsicos para su desarrollo. En general los medios de cultivo se encuentran en las
siguientes formas:
Medio de cultivo slido: Contiene un porcentaje de agar entre el 1 -2 %
Medio de cultivo semislido: Contiene un porcentaje de agar alrededor del 0.5 %
Medio de cultivo lquido: Tambin conocido como caldo, que se caracteriza porque no
contiene agar.
3. PRE-LABORATORIO
a. Consulte cmo se clasifican los medios de cultivo segn su origen, composicin, uso y
utilidad.
b. Cul es el procedimiento ideal para el mantenimiento de cepas bacterianas?
c. Cmo se realiza el control de calidad de los medios de cultivo utilizados en el diagnstico
microbiolgico?
d. En qu consisten las pruebas de efectividad y esterilidad efectuadas a los medios de cultivo
utilizados en el diagnstico microbiolgico?
e. Investigue las diferentes tcnicas de cultivo utilizadas en el estudio del crecimiento
bacteriano?.
f. Como se obtiene un cultivo puro. Cul es su utilidad?.
4. MATERIALES
- Caldo BHI
- Agar sangre
- Agar McConkey
- Asas
5. PROCEDIMIENTO

- Agar TSI
- Medio SIM
- Cepas puras de cocos Gram (+) y bacilos Gram (-)

 Preparacin de medios de cultivo:

El tipo y modo de preparacin de los medios de cultivo es decisivo para obtener una
solucin ptima y de alto rendimiento. Para la preparacin de cualquier medio es
recomendable seguir los siguientes pasos :
a. Emplear agua destilada o desmineralizada fresca, de reaccin neutra y dentro de lo
posible pobre en grmenes.
b. A una cantidad de agua aproximadamente igual a la mitad de la necesaria a la que se vaya
a preparar adicionar la cantidad prescrita en la etiqueta del frasco del medio de cultivo
deshidratado. Hacer una suspensin homognea y luego agregar el agua restante.
c. Utilizar recipientes poco alcalinos como el vidrio u ollas esmaltadas.
d. Los medios que contienen agar se dejan en reposo durante 10 min. Para que pueda
embeberse el agar por el agua, y se colocan en una estufa o en el mechero hasta que
hierva y el lquido est brillante. Para caldo o medios que no contienen agar no es
necesario hervir. DEBE EVITARSE TODO CALENTAMIENTO INNECESARIAMENTE
PROLONGADO.
e. A continuacin se sirve en tubos tapa rosca y se lleva a esterilizar en el autoclave. Si el
medio a preparar es para servir en cajas, se coloca en el autoclave en un erlenmeyer cuya
capacidad sea el doble del volumen deseado. Una vez esterilizado sacar del autoclave,
dejar reposar de 15 a 20 minutos y luego en condiciones aspticas verter entre 15 y 20 ml
del medio en cajas de pretri estril, tapar y dejar solidificar.
Si se siguen las normas de preparacin de cada medio, no ser necesario ni filtracin, ni
corregir el pH despus de la esterilizacin. Pero es recomendable efectuar a cada lote del
medio preparado una prueba de esterilidad y una prueba de efectividad.
Siembra en medio lquido:
a. Caliente el asa al rojo y djela enfriar.
b. Sostenga el tubo que contiene el cultivo o la muestra biolgica a sembrar, con la mano
izquierda, y el asa con la mano derecha, remueva con esta misma mano la tapa del tubo.
c. Tome una asada de la muestra, tapone de nuevo el tubo y djelo en la gradilla.
d. Coja el tubo a sembrar y con la mano izquierda destpelo sosteniendo la tapa en la mano
derecha.
e. Deposite en el medio de cultivo lquido la asada de la muestra rotndola suavemente.
f. Flamee la boca del tubo y tpelo de nuevo.
g. El asa debe calentarse al rojo antes de volverla a colocar en la gradilla.
h. Lleve a incubar a 37C durante 24 -48 horas.
Siembra en medio slido:
a. Realice la siembra en medio slido procediendo de manera similar a la descrita para medio
lquido.
b. La siembra en medio slido debe hacerse estriando sobre la superficie del agar.
Realice diferentes mtodos de siembra en placa de agar segn las indicaciones del profesor.
c. Las cajas de los cultivos deben colocarse en la incubadora en posicin invertida.
6. RESULTADOS
a. Despus del periodo de incubacin observe los cultivos y diferencie las caractersticas del
crecimiento bacteriano (Morfologa de colonias).
b. Realice coloracin de Gram y observe al microscopio.
c. Realice dibujos de los resultados.
d. Presente su informe individual al iniciar la siguiente sesin de laboratorio.

7. BIBLIOGRAFIA
Escriba la bibliografa consultada.

8. EVALUACIN
- Preparacin y elaboracin de pre-laboratorio e informe
- Inters y compromiso en la ejecucin de los procedimientos diseados para el desarrollo de
habilidades y destrezas. (inters, creatividad, observacin, interpretacin) .