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PrcticasdeBioqumicaI
Prctica:ActividaddelaCatalasaSangunea
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ACTIVIDADENZIMTICADELACATALASA
SANGUNEA
Objetivos
Alfinalizareltrabajoprcticolosalumnosestarnencapacidadde:
Conocerlaformaycondicionesparaobtenerunpreparadodecatalasasangunea.
Verificarelefectodelaconcentracindelaenzimasobrelaactividaddelacatalasa
sangunea.
Reconocerelefectodelatemperaturasobrelaactividadenzimtica.
DemostrarlainfluenciadelpHsobrelaactividadenzimtica.
Probarelefectodelaconcentracindesubstratosobrelaactividaddelacatalasa
sangunea.
Verificarlainfluenciadeuninhibidorsobrelaactividadenzimtica.
Introduccin
Elmetabolismocelulardelostejidosanimalesyvegetalesgeneraperxidodehidrgeno
(H2O2)molculaqueresultatxicaparalaclula.Atravsdelaevolucinestosorganismos
handesarrolladosistemasenzimticosquedescomponenesteperxidoyevitandaosala
clula.Unodeestossistemasenzimticoslorepresentalacatalasa.
Lacatalasaesunacromoprotenaporfirnicacuyamasamolecularesde225.000kDa,
contienecuatrogruposhemopormolculaysucontenidodehierroes0.9%.Estaprotena
presentaactividadenzimticadeltipooxidoreductasasobreelperxidodehidrgeno
(H2O2)
elculconstituyeelsustratoparaestaenzimaylodescomponeenoxgenoydosmolculas
de
aguaSunombresistemticodeacuerdoalaUninInternacionaldeBioqumicaesH2O2
oxidoreductasaycatalizalasiguientereaccin:
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2H2O2
Catalasa
O2+2H2O

Peroxidodehidrgeno

Enlosmamferosestaenzimaseencuentraentodotipodeclulas,siendosuactividad
mayorenelhgado,rinyeritrocitos.Unmoldecatalasapuededescomponer5.000.000
de
molculasdeH2O2porminutoa37C,estoseconocecomonmeroderecambioy
representa
unodelosmsaltosdetodalaenzimologa.
Laactividaddelacatalasadeloseritrocitospuededeterminarsemediantealgunos
principiosbioqumicosdeloscualeslosmssencillosestnbasadosenladesaparicindel
H2O2alincubarlosconpreparacionescrudasopurificadasdelaenzima.Asuvezla
desaparicindelH2O2puedeestimarseporvariosmtodos,unodeelloseselmtodo

titrimtricoporpermanganimetra.Enestemtodounapreparacindecatalasaseincuba
conunaconcentracinconocidadeperxidodehidrgenoduranteciertotiempoyen
condicionesadecuadas.Alcabodeestetiempo,lareaccinsedetieneporadicinde
H2SO4
2Nyluegosetitulaconunasolucindepermanganatodepotasio(KMnO4).
Lareaccindeperxidodehidrgenoconelpermanganatodepotasioenmediocido
eslasiguiente:
2KMnO4+3H2SO4+5H2O2
K2SO4+2MnSO4+8H2O+5O2

Estareaccinconstituyeunatpicatitulacindeoxidacinreduccin,lacualsehaceen
proporcionesestequiomtricasentreelpermanganatoyelperxidodehidrgeno.
Losexperimentosqueserealizarnenestetrabajoprctico,sebasarnenelmtodo
titrimtricoporpermanganimetrayencadaunodeellosserealizarlatitulacindeun
tubo
control,elculconstituyeunamedidadeperxidopresentealcomienzodelexperimento.
Latitulacindelostubosexperimentalesrepresentalamedidadelperxidoremanente
despusquelaenzimahaactuadosobreelsustrato.
Ladiferenciaentrelasdostitulaciones(controlexperimental)representalacantidad
deperxidodescompuestoenunaunidaddetiempo,esdecir,lavelocidaddelareaccin.
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MATERIALESYREACTIVOS
Matraceserlenmeyer
Tubosdeensayo
Embudo
Buretaysoporteuniversal
Gradilla
Baosdecalentamiento
Pipetasgraduadasde1,5y10mL.
H2SO42N
Bufferfosfato0,01M,pH3,7y8.DebecontenerH 2O2paragastaraproximadamente
15mLdeKMnO40,012N.
KMnO40,012N
SolucionesdeKCN102M.,103M.,104MapH7lascualesdebenserpreparadasel
dadesuuso.
Obtencindeunpreparadodecatalasasangunea:(serpreparadaconanticipacinpor
el
docente).
Paraobtenerunapreparacincrudayaltamenteactivadelaenzimasesigueelsiguiente
procedimiento:
1.Pipetear25mLdeaguadestiladaenuntubodeensayograndeyenfriarlasobrehielo
picado.
2.Conayudadeunalancetaestril,extraersangrecapilar(deldedopulgar),descartarla
primeragotadesangreyluegopipetear0,02mLdesangreconunapipetadeShalli.
3.Agregarlos0.02mLdesangreenlos25mLdeaguadestiladafra.Lavarvariasvecesla
pipetaenelagua.

4.Mantenerlapreparacindeenzimaenbaodeaguaheladaconsuficientehielopara
prevenireldeteriorodelaenzima.
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Experimentos.
Seestudiarnlossiguientesfactoresquemodificanlaactividadenzimtica:
a.Concentracindeenzima.
b.Concentracindesubstrato.
c.Temperatura.
d.pH.
e.Efectosdeinhibidor:concentracinprogresivadeinhibidoryconcentracinprogresiva
de
substratoconconcentracinfijadelinhibidor.
PRIMERAPARTE(Semana1)
Experimento1
Efectodelaconcentracindeenzima
Lavelocidaddereaccinesafectadaporlaconcentracindeenzimapresenteenel
mediodeincubacin.Amedidaqueseincrementalaconcentracindeenzima,lavelocidad
de
lareaccinesmayor.
Enesteexperimentosevariarlaconcentracindeenzimaysemantienenconstantes
todoslosdemsfactores.
a.Tomar5frascoserlenmeyerde125mLc/u;rotularlosdel1al5yprocederaagregar
lascantidadesqueindicalasiguientetabla:
Frasco
N
H2O2
pH7
Enzima
Tiempo
enmin
H2SO42N
mL
gastados
KmnO4
1
5mL
0,1mL
5'
5mL
2
5mL
0,2mL
5'

5mL
3
5mL
0,4mL
5'
5mL
4
5mL
0,8mL
5'
5mL
5*
5mL

5'
5mL
*Tubocontrol.
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b.Unavezagregadalaenzimadeberntranscurrirexactamente5minutosencadafrasco
paraluegodetenerlareaccinconcidosulfrico(entodoslosfrascos).
c.TitulelosfrascosconKMnO4hastaqueaparezcauncolorrosadoplidopermanente.
Anoteelvolumendepermanganatogastadoparacadafrasco.
d.Tabulelosresultadosycalculelavelocidaddereaccinparalostubosexperimentales
Volumende
enzima
Concentracin
de
Enzima(UI)
Velocidaddereaccin
(Calculada)
0,1mL
2x103
0,2mL
4x103
0,4mL
8x103
0,8mL
1,6x102
e.Construyaungrficoquemuestrelarelacinentrelavelocidaddereaccinyla
concentracindelaenzima.Nota:usarpapelmilimetrado.
Experimento2
Efectodelatemperatura.
Todareaccinenzimticapresentaunatemperaturaptimalaculesdefinidacomola
temperaturaalacuallavelocidaddelareaccinesmayor,manteniendoconstantelosotros

factores.Enesteexperimentoseutilizarantrestemperaturasdiferentesparaobservarel
efecto
delamismasobrelaactividaddelacatalasa.
a.Preparartresseriesdetubosdeensayo(cadaserieconstadedostubos).
b.Procederarotularlostubosdelasiguientemanera:
1eraserie:tubos1Ay1B.
2daserie:tubos2Ay2B.
3eraserie:tubos3Ay3B.
Lostubos"A"serncontrolesylos"B"experimentales.
c.Agregaracadaunodelostuboslosreactivosyvolmenesindicadosenlasiguiente
tabla:
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Tubo
N
H2O2
pH7
TemperaturaEnzima
Tiempo
H2SO42N
mL
gastados
KmnO4
1A
5mL
10C

5'
5mL
1B
5mL
10C
0,5mL
5'
5mL
2A
5mL
37C

5'
5mlL
2B
5mL
37C
0,5mL

5'
5mL
3A
5mL
60C

5'
5mL
3B
5mL
60C
0,5mL
5'
5mL
d.Unavezagregadalaenzimadeberntranscurrirexactamente5minutosencadafrasco
paraluegodetenerlareaccinconcidosulfrico.
e.TransfieraelcontenidodelostubosafrascoserlenmeyerytituleconKMnO4hastaque
aparezcauncolorrosadoplidopermanente.Anoteelvolumendepermanganato
gastadoparacadafrasco.
f.Tabulelosresultadosycalculelavelocidaddereaccinparalostubosexperimentales
Temperatura
C
Velocidadde
reaccin
(calculada)
10
37
60
g.Construyaungrficoquemuestrelarelacinentrelavelocidaddereaccinyla
temperatura.Nota:usarpapelmilimetrado.
Experimento3
EfectodelpH
Lamayoradelasenzimasmuestransumximodeactividadenunrangolimitadode
pH.Esconocidoquelaconformacindelsitioactivoysurelacinconelsustratoson
afectadasporestefactor.Estoeselresultadodelasumadeunaseriedefactorestalescomo:
ionizacindelaenzima,ionizacindelsubstrato,difusindeproductos,etc.
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EnesteexperimentosedeterminarlaactividaddelacatalasaadiferentesvaloresdepH,
paraobservarelefectodeesteimportantefactorsobrelavelocidaddelareaccin.
a.Rotulartresseriesdeerlenmeyeraligualqueenelexperimentoanterior.
b.Adicionelosreactivosysuscantidadessegnlasiguientetabla:
Frasco
N
H2O2

pH3
H2O2
pH7
H2O2
pH8
Enzima
TiempoH2SO42N
mLgastados
KmnO4
1A
5mL

5'
5mL
1B
5mL

0,5mL
5'
5mL
2A

5mL

5'
5mlL
2B

5mL

0,5mL
5
5mL
3A

5mL

5
5mL
3B

5mL
0,5mL

5
5mL
c.Unavezagregadalaenzimadeberntranscurrirexactamente5minutosencadafrasco
paraluegodetenerlareaccinconcidosulfrico.
d.TituleconKMnO4hastaqueaparezcauncolorrosadoplidopermanente.Anoteel
volumendepermanganatogastadoparacadafrasco.
e.Tabulelosresultadosycalculelavelocidaddereaccinparalostubosexperimentales
pH
Velocidaddereaccin
(calculada)
3
7
8
f.ConstruyaungrficoquemuestrelarelacinentrelavelocidaddereaccinyelpH.
Nota:usarpapelmilimetrado.
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SEGUNDAPARTE(Semana2)
Experimento4
Efectodelaconcentracindelsubstrato
Amedidaqueaumentalaconcentracindelsustrato,lavelocidaddereaccinaumenta.
Elaumentoenlaconcentracindesustratopuedellegarasobrepasarlacapacidaddela
enzima
deconvertirloenproducto,llegandoestaalavelocidadconocidacomomxima.(Vmax)
Enesteexperimentoseaumentarprogresivamentelaconcentracindeperxidode
hidrgenoconelobjetivodedeterminarlavelocidadmxima(Vmax)
Procedimiento:
a.Rotulartresseriesdeerlenmeyeraligualqueenelexperimentoanterior.
b.Adicionelosreactivosysuscantidadessegnlasiguientetabla:
Frasco
No.
H2O2
pH7
H2O
destilada
Enzima
Tiempo
H2SO4
2N
mLgastados
KmnO4
1A
1,25mL
3,75mL


5'
5mL
1B
1,25mL
3,75mL
0,5mL
5'
5mL
2A
2,50mL
2,50mL

5'
5mL
2B
2,50mL
2,50mL
0,5mL
5'
5mL
3A
5mL

5'
5mL
3B
5mL

0,5mL
5'
5mL
c.Unavezagregadalaenzimadeberntranscurrirexactamente5minutosencadafrasco
paraluegodetenerlareaccinconcidosulfrico.
d.TitularconKMnO4hastaqueaparezcauncolorrosadoplidopermanente.Anoteel
volumendepermanganatogastadoparacadafrasco.
e.Tabulelosresultadosycalculelavelocidaddereaccinparalostubosexperimentales
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Volumende
sustrato
Concentracinde
Sustrato
Velocidaddereaccin

(calculada)
1,25mL
1,25x102M
2,5mL
2,5x102M
5mL
5x102M
f.Construyaungrficoquemuestrelarelacinentrelavelocidaddereaccinyla
concentracindesustrato.Nota:usarpapelmilimetrado.
Efectosdelinhibidor.
Laactividaddelacatalasaesfuertementeinhibidaporagentescapacesdecombinarse
conelhierrodesugrupoprostticoporfirnico,talescomoelKCN.Indudablementela
mayor
partedelosefectosletalesdelcianurosedebenalainhibicindeenzimasferroporfirnicas
comolacatalasa,citrocromooxidasa,etc.
Enesteexperimentosedemostrarelefectoinhibitoriodeconcentracionesprogresivas
decianurosobrelavelocidaddereaccinenzimtica.Sehartambinlareaccinconuna
sola
concentracindecianuroydosisprogresivasdesubstrato,paradeterminareltipode
inhibicin
producidaporelcianurosobrelaenzima.
Experimento5
Efectodelaconcentracinprogresivadelsubstratosobreunasolaconcentracindel
inhibidor
a.Rotulartresseriesdeerlenmeyeraligualqueenelexperimentoanterior.
b.ProcederdeigualformaalexperimentoN4.Lanicadiferenciaentreambos
experimentoseslapresenciaentodoslostubosdeKCN.Contrastandolosdatoscon
losdelexperimento4,podremosdeterminarquetipodeinhibicinllevaacaboel
cianurodepotasiosobrelacatalasasangunea.
c.Coloqueenlosfrascosloqueseindicaenlatablasiguiente:
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Frasco
N
H2O2
pH7
H2O
KNC
10
3M
Enzima
Tiempo
H2SO42N
mL

gastados
KmnO4
1A
1,25mL
3,75mL
0,5mL

5
5mL
1B
1,25mL
3,75mL
0,5mL
0,5mL
5
5mL
2A
2,50mL
2,50mL
0,5mL

5
5mL
2B
2,50mL
2,50mL
0,5mL
0,5mL
5
5mL
3A
5mL

0,5mL

5
5mL
3B
5mL

0,5mL
0,5mL
5
5mL
d.Unavezagregadalaenzimadeberntranscurrirexactamente5minutosencadafrasco
paraluegodetenerlareaccinconcidosulfrico.
e.TituleconKMnO4hastaqueaparezcauncolorrosadoplidopermanente.Anoteel
volumendepermanganatogastadoparacadafrasco.
f.Tabulelosresultadosycalculelavelocidaddereaccinparalostubosexperimentales,
ascomolosinversosdelasvelocidades1/[V]ydelasconcentracionesdesustrato

1/[S]delosexperimentosN4y6(grficodelosinversosrecprocos)
Volumende
sustrato
Concentracin
desustrato
Velocidadde
reaccin
1/[S]
Exp4
1/[S]
Exp5
1/[V]
Exp4
1/[V]
Exp5
1,25mL
2,5mL
5mL
g.Construyaungrficoquemuestrelarelacinentreelinversodelavelocidadde
reaccinyelinversodelaconcentracindesustratoenpresenciaonodelinhibidor.
Nota:usarpapelmilimetrado.
Experimento6
Efectodelaconcentracinprogresivadecianuro
a.Tomar5erlenmeyerde125mLyroturarlosdel1al5.
b.Agregaracadaunodeloserlenmeyerloqueseindicaenlasiguientetabla:
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Frasco
N
H2O2
pH7
KNC
104M
KNC
103M
KNC
102M
Enzima
TiempoH2SO42N
mL
gastados
KmnO4
1

5mL
0,5mL

0,5mL
5
5mL
2
5mL

0,5mL

0,5mL
5
5mL
3
5mL

0,5mL
0,5mL
5
5mL
4
5mL

0,5mL
5
5mL
5
5mL

5
5mL
c.Unavezagregadalaenzimadeberntranscurrirexactamente5minutosencadafrasco
paraluegodetenerlareaccinconcidosulfrico.
d.TitularconKMnO4hastaqueaparezcauncolorrosadoplidopermanente.Anoteel
volumendepermanganatogastadoparacadafrasco.
e.Tabulelosresultadosycalculelavelocidaddereaccinparalostubosexperimentales
Concentracinde
Inhibidor(M)
Velocidaddereaccin
(calculada)
0
104

103
102
f.Construyaungrficoquemuestrelarelacinentrelavelocidaddereaccinyla
concentracindelaenzima.Nota:usarpapelmilimetrado.
Clculosdelavelocidaddereaccin
Lavelocidaddereaccinparacualquiertuboexperimentalseexpresaenlasiguiente
unidad:
=mmolesdeH2O2destruidos/minuto
Paraobtenerelresultadodevelocidadexpresadoenesaunidaddebenrealizarselos
siguientes
clculossiguiendoestasecuencia:
a.mEqdeKmnO4=NKMnO4xVolumengastado(mL)
b.mEqdeH2O2=mEqdeKmnO4
c.mmolesdeH2O2=mEqdeH2O2/Ndehidrgenos(2)
d.mmolesdestruidosdeH2O2
=mmolestotales(control)mmolesremanentes
(experimental)
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e. (velocidaddereaccin)=mmolesdestruidosdeH2O2/tiempodereaccin(5
minutos)
Losclculosdebernrealizarseparacadatuboexperimentalentodoslosexperimentos.
Construyalassiguientesgrficas:
a.Concentracinenzimticacontravelocidaddereaccin(Experimento1)
b.Temperaturacontravelocidaddereaccin(Experimento2)
c.pHcontravelocidaddereaccin(Experimento3)
d.Concentracindesustratocontravelocidaddereaccin(Experimento4)
e.Inversodelaconcentracindesustratocontrainversodelavelocidaddereaccincony
sininhibidor(Experimentos4y5)
f.Concentracinprogresivadeinhibidorcontravelocidaddereaccin(Experimento6)
Autoevaluacin
1.Comocreeustedqueserelefectodelastemperaturas15C,37Cy60Csobrela
actividadenzimticadelacatalasasangunea?
2.Expliquequediferenciaexisteentrelostuboscontrolesyexperimentalesdeestaprctica.
3.Enquesebasaelmtodotitrimtricoporpermanganimetra?
4.QuefuncincumpleelH2SO4Nenlosexperimentosdeestaprctica.
Bibliografa
Plummer,David.Bioqumicaprctica.McGrawHill.1981.
Robyt,John;WhiteBernard.BioquemicalTechniques.WavelandPress.1987.
UniversidadSimnBolvar.PrcticasdeBioqumicaI:BC3181.Departamentode
Biologa
Celular.1999.