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Ratones transgnicos
Animales transgnico, por qu:
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Se peuden transferir genes a clulas germinales (esperma, huevos, embriones) o a clulas somticas. La insercin de
genes en clulas germinales produce un adulto en el que la expresin del gen transferido puede analizarse en todos
los tejidos y adems se transmite a la progenie.
Transgnico : Animales que han sido manipulados de este modo.
Otra manera de producir individuos transgnicos consiste en introducir un gen concreto en unas pocas clulas
embrionarias y estas en el embrin. Los tejido del individuo resultante pueden derivarse de las clulas manipuladas
o de las endgenas (QUIMERA TRANSGNICA). Esta quimera puede producir descendencia totalmente modificada si
las clulas introducidas contribuyen a la formacin de la lnea germinal. Un tercer modo de modificar un organismo
es con la manipulacin ex vivo que consiste en aislar clulas de un individuo, modificarlas genticamente in vitro y
reintroducirlas en el organismo de partida. Las manipulaciones ex vivo se usan como terapia gnica humana.
Microinjeccin de DNA a huevos fecundados . Alta proporcin de transgnicos integrales, es decir, animales
que han introducido el transgen a todas las clulas del organismo y ms baja de quimeras transgnicas o
animales que solo han sido modificados en algunos tejidos. Si uno
de los tejidos afectados son las gonadas al menos la mitad de la
descendencia ser transgnica integral.
Introduccin de DNA a embrioblastos del blastocito.
Microinyeccin
Xenopus laevis, mus musculus.
Consiste esencialmente en la introduccin del DNA lineal que se desee
insertar en proncleos de huevos de raton fecundados.
La ovulacin en el ratn ocurre de manera natural. Despus de la copula,
se extraen los huevos fecundados, que contienen dos proncleos. La
inyeccin se hace en el proncleo masculino.
Resumen:
En la primera fase, se aslan un nmero grande de vulos fertilizados.. En la segunda
fase, los cigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una micropipeta a modo de
aguja, se introduce una solucin que contiene ADN.
En la tercera fase, estos vulos son reimplantados en hembras que actuarn como
nodrizas permitiendo la gestacin hasta trmino. Por ltimo, tras el destete de los
recin nacidos, stos se chequean, para ver si ha ocurrido la incorporacin del
transgn.
La ventaja de esta tcnica respecto a la anterior es que hay la posibilidad de seleccionar in vitro aquellas clulas que
han incorporado el transgn antes de reincorporarlas a un blastocito. La seleccin nos permite obtener animales
transgicos producidos por recombinacin homloga y dianas gnicas.
Resumen:
Una estrategia ms poderosa para la transgnesis implica la
introduccin de ADN extrao en clulas embrionarias
totipotentes(clulas ES) o clulas embrionarias madres (clulas
EM). Estas clulas se toman del interior de la blstula en
desarrollo y se pasan a un medio donde se tratan con distintos
productos con lo que se conseguir que las clulas no se
diferencien, y se mantiene su estado embrionario.
El ADN extrao se introduce en las clulas ES mediante diversas
tcnicas, posteriormente las clulas transfectadas son
reintroducidas en una blstula y sta reimplantada en una
hembra.
Con esta tcnica los neonatos son quimeras( tienen clulas de
origen distinto, parte con el material gentico original y parte
transfectadas ); mediante el cruce de con aquellas quimeras que
hayan incorporado el transgn en su lnea germinal se consiguen
animales transgnicos.
Muchos embriones knock-out mueren y por tanto no se puede estudiar el efecto de este gen silenciado. La solucin
es hacer un knock out CONDICIONAL: ratn trangenico cuando queramos y donde queramos. Para crear un knock
out condicional primero hay que hacer un knock in.
Cre-lox technology
Consiste en utilizar el sistema de recombinacin cre/lox P.
Lox: 34pb que forman dos repeticiones inversas de
13nucleotidos separadas por 8.
Cree: gen que determina una recombinasa cpaz de
eliminar cualquier secuencia localizada entre dos sitios
loxP.
Si el gen esta flanqueado por lox P puede ser eliminado.
Podemos introducir por recombinacin homologa sitios
lox P en los extremos de un gen de inters y facilitar cre
bajo el control de un promotor tejido especfico . Se
producir la eliminacin especfica del gen diana en el
tejido controlado por el promotor.
Para esto se usan dos cepas de ratones:
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Una con el gen flanqueado por LoxP obtenido por diana gnica en embiroblastos.
Cre como transgen controlado por el promotor.
El control del transgen se puede hacer con el sistema de resistencia a tetraciclina y un promotor sintetico formado or
varias subunidades del operador tetraciclina i el promotor CMV que constituye un elemento respuesta a tetraciclina
que se fusiona al gen.