ENZIMA ALFA-AMILASA

Humberto Franco y bJuan Camilo Zapata T.

humberto.franco1@correo.icesi.edu.co y bjczapata97@outlook.com

ayb

Universidad Icesi, Facultad de Ciencias Naturales, Programa de aQumica y bQumica

Farmacutica, Laboratorio de Bioqumica
Santiago de Cali, Colombia
Octubre 13 de 2015
actividad de la enzima del extracto E
RESULTADOS
conforme pas el tiempo.
Esta prctica se llev a cabo con el fin de
estudiar la cintica de la enzima alfaamilasa y conocer cmo algunos factores
que alteran la actividad cataltica de la
enzima.
Para esto se tom una muestra de alfa
amilasa y se diluy en 19mL de agua.
(Por razones de simplicidad, llamaremos
de ahora en adelante a esta muestra de
alfa amilasa E).

La Figura 1a muestra los resultados

visuales de la prueba en los instantes de
5,10 y 15 minutos despus de iniciada la
reaccin. La Figura 1b muestra los
resultados obtenidos en la misma prueba
pero en los tiempos de 20,30 y 40
minutos respectivamente. Las muestras
estn numeradas segn el tubo de ensayo
de

Se rotularon cuatro tubos de ensayo con

0.5mL de almidn y se agreg agua y E
segn la siguiente Tabla:
Tabla 1. Reactivos.
Tubos de
1
ensayo
Agua
2.9m
L
E
0.1m
L

2.8m
L
0.2m
L

2.7m
L
0.3m
L

2.6m
L
0.4m
L

Una vez terminado esto, los tubos de

ensayo fueron sometidos a un bao Mara
a 37C.
Se tomaron muestra de cada tubo en una
placa ELISA a intervalos de cinco
minutos hasta llegar a 20 minutos, y de
ah en adelante cada diez minutos hasta
llegar a los 40 minutos. Para cada muestra
en la placa ELISA se agregaron dos gotas
del reactivo de Lugol para cualificar la

izquierda a derecha (1, 2, 3, 4).

Figura 1a. Resultados prueba con yodo en
intervalos de cinco minutos. Figura 1b. Resultados
en intervalos de diez minutos.

adicion 1mL de buffer pH 7.

Posteriormente, se incubaron los tubos de
ensayo en un bao maria a 37C a
temperatura constante y se aadi 0,5 mL
del estracto enzimtico.
En placas para ELISA, se tomaron 3
gotas de la reaccin y se les aadi 1 gota
de lugol, esto para cada reaccin. Se
Repiti este procedimiento en intervalos
de 5 minutos hasta los 10 minutos y
posteriormente cada 10 minutos hasta
haber completado 30 minutos.
Los resultados cualitativos se pueden
observar a continuacin:
Las observaciones de esta prueba fueron
registradas en la Tabla 2.
Tabla 2. Efecto de la concentracin de la
enzima sobre la velocidad de reaccin.
Tiempo
(min)

0
5
10
15
20
30
40

Observaciones (coloracin)
Tubo 1
Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
Solucin violeta
violeta
violeta violeta caf
violeta
violeta violeta amarill
o
violeta
violeta violeta caf
amarillo violeta violeta amarill
muy
o muy
plido
plido
violeta
violeta violeta amarill
o plido
violeta
violeta violeta caf
claro

La Figura 1 no muestra un resultado para

la reaccin en el momento cero debido a
que no se alcanz a tomar. Por lo tanto, se
tom los resultados de otro grupo en el
laboratorio.
Por otra parte, para determinar el efecto
del pH sobre la reaccin de la alfaamilasa, se procedi a aadir 2,5 mL de
almidn en dos tubos de ensayo
(Denominados A y B respectivamente) a
los cuales se les aadi dos soluciones
buffer; al tubo de ensayo A se le adicion
1mL de buffer pH 4 y al tubo B A se le

Tabla 3. Efecto del tiempo y el pH sobre la

actividad enzimtica

Tiempo de
reaccin
0
5
10
20
30

Observacin
pH 4
pH 7
Coloracin Coloracin
violeta
violeta
Coloracin Coloracin
violeta
marrn
Coloracin Coloracin
violeta
violeta
Coloracin Coloracin
violeta
violeta
Coloracin Coloracin
violeta
Crema

Los resultados grficos

observar a continuacin:

se

pueden

Figura 2: Efecto del pH en la alfa amilasa.

En la figura 2 se puede observar el

cambio de coloracin al inicio de la
reaccin y al haber transcurrido 5, 10, 20
y 30 minutos en un bao mara a 37C a
temperatura constante.
Otro aspecto a analizar, fue medir el
efecto de la concentracin del sustrato,
almidn en este caso, en la velocidad de
la enzima se rotularon otros cuatro tubos
de ensayo de la siguiente manera:
Tabla 4. Cantidad de reactivos.
Tubos de
1
2
3
ensayo
Almidn 0.5mL
1mL
1.5mL
Agua
2mL
1.5mL
1mL
E
0.5mL 0.5mL 0.5mL

y se agregaron a cada una dos gotas de

Lugol.
Las Figuras 3a, 3b y 3c muestran los
resultados de esta prueba de 0-20min, 3050min
y
a
los
60
minutos
respectivamente. Las muestras estn
numeradas de izquierda a derecha
iniciando por el 1.

4
2mL
0.5mL
0.5mL

Los tubos fueron llevados a un bao

Mara a 37C. Se tomaron muestras de
cada tubo en una placa ELISA a
intervalos de 10 minutos por 60 minutos

A partir del minuto 30 no hay resultado

para el tubo de ensayo 2 porque ste fue
quebrado en el laboratorio.

Figura 3a. Prueba los primeros 20

minutos. Figura 3b. Resultados de 3050mins. Figura 3c. Resultados a los 60
minutos.

Las observaciones fueron registradas en

la Tabla 5. Los resultados a partir del
minuto 30 para el tubo de ensayo 2 fueron
tomados de otro grupo del laboratorio.
Tabla 5. Efecto de la concentracin del
sustrato sobre la velocidad de reaccin.
Tiempo
(min)

0
10
20
30
40
50
60

Observaciones (coloracin)
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4
Solucin amarilla muy plida violeta
amarillo amarill
amarill
caf
o
o
amarillo amarill
amarill
caf
o
o
amarillo amarill
amarill
caf
plido
o plido o plido claro
amarillo amarill
amarill
caf
plido
o plido o plido claro
naranja
naranja naranja naranja
plido
plido
plido
plido
amarillo amarill
amarill
naranja
oscuro
o
o
plido
oscuro
oscuro

Finalmente, se observ el efecto de la

temperatura sobre la velocidad de la
reaccin enzimtica. Para ello, se
Rotularon
3 tubos de ensayo, para
realizar los experimentos a 4C,
temperatura
ambiente
y
50C
respectivamente.
Posteriormente se le agreg 2 mL de
almidn al 0,5%.
Para lograr la temperatura requerida en
los experimentos, el primer tubo se llev
a un bao de hielo, el segundo se dej a
temperatura ambiente y el ltimo se dej
en un bao mara a 50C a temperatura
constante.
Siguiendo el procedimiento, se le agrego
0,5 mL del extracto enzimtico. Cabe
resaltar que a partir de este momento se
da inicio a la reaccin.
En placas para ELISA, se tomaron 3
gotas de la reaccin y consecutivamente
se les adicion 1 gota de lugol a cada
reaccin (Diferentes temperaturas). Se
repiti el procedimiento en intervalos de
2 minutos durante 10 minutos.

Los resultados cualitativos de las

coloraciones, se pueden observar en la
tabla 6 la cual se encuentra a
continuacin:
Tabla 6: Datos cualitativos de la coloracin obtenida a
diferentes temperaturas.

Tiempo
Reacci
n
0
2
4
6
8
10

Observaciones
4C
Ambient
50C
e
Beige
Beige
Marrn
Beige
Beige
Marrn
Crema
Crema
Marrn
Caf
Crema
Crema
Claro
Amarill
Naranj
Amarillo
o
a
Amarill
Naranj
Amarillo
o
a

Los resultados grficos se pueden

observar a continuacin en la figura 4:

Figura 4: Coloracin obtenida en el efecto de la

temperatura sobre la actividad enzimtica.

ANLISIS DE RESULTADOS
La alfa-amilasa es una enzima que se
encuentra en animales superiores y es la
encargada de degradar las molculas de
almidn al catalizar la ruptura de los
enlaces -1,4 que presenta el almidn
para posteriormente fraccionarlo en sus
monmeros de glucosa y maltosa. (Pea,
2004)

El almidn es un polmero conformado

por dos formas: la amilosa y la
amilopectina las cuales difieren en la
forma en la que estn unidos los
monmeros de glucosa y maltosa.

los enlaces -1,4. Cabe notar que la

enzima slo es capaz de degradar la
amilosa del almidn y no la amilopectina,
puesto que esta presenta enlaces -1,6.
La glucosa y la maltosa son epmeros
debido a que slo difieren en uno de los
diferentes tomos de carbonos asimtrico.
(Lurbert Stryer, 2013).

Estructura de la amilosa

En esta forma los monmeros estn

unidos por enlaces -1,4.

Se habla de estos dos epmeros, porque

dependiendo del lugar donde la enzima
alfa-amilasa haga el corte en el almidn,
se formar uno de estos dos productos
que luego ser metabolizado para ser
almacenado en forma de glucgeno.
La posicin del OH resaltado en rojo es la
que hace que estos dos compuestos sean
epmeros.

Estructura amilopectina

Por el contrario en la amilopectina, forma

ramificada del almidn, por cada 30
enlaces -1,4 hay un enlace -1,6 entre
los monmeros del polmero. La forma en
la que est estructurada la amilosa le
confiere al almidn una forma helicoidal.
(Lurbert Stryer, 2013)
Ahora bien, al tener esta forma, cuando el
almidn se hace reaccionar con iodo
(componente principal del reactivo de
Lugol), ste es capaz de entrelazarse en la
hlice formada por el almidn dando as
una coloracin violeta. (Sandoval, 2005)
Es por esto que al inicio de la reaccin, en
el primer mtodo, todas las muestras
colorearon violeta. A medida que avanza
la actividad de la enzima se va perdiendo
el color porque la enzima destruye la
forma helicoidal del almidn rompiendo

Es claro que los resultados obtenidos en

esta parte de la prctica no son para nada
coherentes. Comenzando por el hecho
que no tiene sentido la secuencia de
coloracin obtenida para el tubo de
ensayo 1 mostrado en las Figuras 1a y 1b.
La dificultad del procedimiento puede
llevar a estos errores. La toma de las
cantidades debe ser muy exacta para no
crear falsos positivos o alterar los
resultados que se esperara se obtuvieran.

El hecho de tomar las muestras a

intervalos de tiempo implica que todas las
muestras deben ser tomadas en ese
tiempo para poder comparar de manera
idnea los datos. Esto se vuelve muy
difcil porque implica ser muy gil a la
hora de tomar las muestras, y esta
agilidad puede llevar, como pas, al
descuido y dao del material de
laboratorio en el proceso.
De cualquier manera, el mtodo es
bastante tedioso y eso repercuti de
manera
desfavorable
en
nuestros
resultados.
Ahora bien, suponiendo que el
procedimiento se haya realizado de
manera correcta, un aproximado a la
velocidad en la que reaccion la enzima
en cada tubo de ensayo sera el siguiente:
Tabla 7. Aproximado del tiempo de reaccin.
Tubo de ensayo
Tiempo
1
30min
2
20min
3
15min
4
10min

Se puede tomar la velocidad como el

inverso del tiempo debido a que la
velocidad es una razn entre los
diferenciales de concentracin del
producto, o del reactivo, sobre el
diferencial del tiempo que tarda en
aparecer el producto, o desaparecer el
reactivo. Adems, en todas las muestras la
concentracin de sustrato fue la misma
(2mL de almidn al 0.5%). Como nuestro
nico patrn de referencia es el sustrato
porque la tcnica usada no cuantifica la
cantidad de producto, tiene an ms
sentido tomar la velocidad como el
inverso del tiempo de reaccin.
Relacin Concentracin y Velocidad Enzimtica
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
[E]

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0.11

Cabe resaltar que visualmente se puede

concluir que la reaccin termin cuando
la muestra en la placa ELISA haya pasado
de violeta a amarillo, ya que la enzima
habr cortado los enlaces de la amilosa y,
as, liberado los tomos de iodo de la
hlice en la que estaban contenidos.
Con los datos de la Tabla 7 se obtendra la
siguiente grfica para el tiempo de
reaccin de la enzima; donde en el eje y
se encuentra la concentracin de E que se
tom como el volumen agregado en cada
tubo y en el eje x la velocidad de reaccin
calculada como el inverso del tiempo
registrado para cada tubo en la Tabla 7.

1/t

Grfico 1. Relacin concentracin y velocidad

enzimtica.

Lo que el Grfico 1 muestra es que la

concentracin de la enzima es
directamente proporcional a la velocidad
de reaccin cataltica sobre el sustrato.
Por otra parte, analizando el efecto que
produce el pH sobre dicha enzima,
experimentalmente se lleg a la
conclusin de que la enzima se encuentra
inhibida cuando contiene la solucin
buffer que poseen un pH 4.

El principal efecto del pH sobre la

amilasa es la desnaturalizacin, que
significa que la enzima cambia su forma y
bsicamente deja de funcionar o al menos
deja de funcionar eficientemente. La alfa
amilasa funciona ptimamente en un
rango de pH entre 6.7 y 7.0 unidades.
Como ya se ha dicho, el trabajo principal
de la enzima amilasa es convertir el
almidn en glucosa que pueden ser ms
fcilmente digeridas y absorbidas para ser
llevadas al torrente sanguneo. (Salud,
2015)

Cambios en el pH pueden llegar a

desnaturalizar la enzima modificando la
carga inica de la protena. Los enlaces
inicos son los encargados de crear la
forma funcional de la enzima. Cuando se
generan cambios en las cargas netas de
las protenas, la forma de la enzima
cambia y a su vez su funcin. La enzima
puede seguir funcionando pero de manera
regular. (Lurbert Stryer, 2013)
Es por lo anterior, que en la figura 2, a
pesar de haber pasado 30 minutos desde
la adicin del extracto enzimtico, la
solucin se sigue tornando de la misma
coloracin violeta con la que se inici;
esto me indica que en estas condiciones la
amilasa no posee la capacidad para
degradar el almidn en contraste con el
experimento realizado a pH 7, en el cual
se puede observar en la misma figura 2 el
cambio en la coloracin a medida que
pasa el tiempo, lo que me indica que si
est presente la accin de la enzima en el
experimento realizado.
Cabe resaltar que la prueba se realiz en
un bao mara a una temperatura
constante de 37C puesto que por lo
general, las enzimas de los humanos
poseen un desarrollo ptimo a esta

temperatura debido a que es la que posee

por lo general el cuerpo de las personas.
Adems, se puede apreciar que no hay
una diferencia de reaccin dependiendo
de la acidez del entorno en el que se
realice la catlisis debido a que a pH 4, la
amilasa se encontraba totalmente
inhibida.
Ahora, analizando otros aspectos, con los
datos registrados en la Tabla 5, podemos
hacer tambin hacer un aproximado a la
velocidad de reaccin en comparacin a
la concentracin de sustrato.
Ntese que en este caso la concentracin
de sustrato vara dependiendo de la
muestra, esto implica que no podemos
hacer la generalizacin de la velocidad
hecha para el primer mtodo. Para este
caso tomaremos la velocidad como la
razn entre el volumen del sustrato y el
tiempo de reaccin; hacemos esto porque
de esta manera podemos fijar un patrn
justo de comparacin entre las muestras.
La siguiente tabla muestra la velocidad
relativa de cada tubo de ensayo:
Tabla 8. Velocidades relativas de reaccin.
Volumen sustrato
Velocidad relativa
en el tubo de
de reaccin
ensayo
0.5
0.0166
1.0
0.0333
1.5
0.0375
2.0
0.04

Con base en esta informacin obtenemos

el siguiente grfico:

Velocidad de Reaccin y Concentracin del Sustrato

0.05
0.04
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
0

Si la concentracin de sustrato es muy

elevada (su valor es mucho mayor que el
de KM) La ecuacin (1) se reorganizara
as:
V 0=V mx (3)
Entonces la reaccin sera de orden cero y
la velocidad no depender de la
concentracin de sustrato. (Lurbert Stryer,
2013)

0.4 0.6 0.8

1.2 1.4 1.6 1.8

2.2

[S]
Grfico 2. Relacin entre la velocidad de reaccin y la
concentracin del sustrato.

Donde en el eje y se encuentra la

velocidad de reaccin y en el eje x la
concentracin del sustrato.
Este grfico se ajusta en cierta medida al
grfico obtenido por una enzima que siga
la ecuacin de Michaelis-Menten:
V 0=V mx

[S ]
[ S ]+ K M

(1)

Donde Vo representa la velocidad de

reaccin, Vmx la velocidad mxima de
reaccin, [S] la concentracin del sustrato
y KM la constante de Michaelis.
Esto implica que a concentraciones muy
bajas de sustrato, el denominador de la
expresin puede quedar con slo el valor
de KM y la ecuacin (1) quedara de la
siguiente manera:
V 0=

V mx
[S ]
KM

(2)

De esta manera la reaccin sera de

primer orden y la velocidad dependera de
la concentracin de sustrato.

Si los ensayos se hubiesen realizado con

ms
muestras
a
diferentes
concentraciones de sustrato, con base en
la ecuacin (3) y el grfico 2, se esperara
que despus de la concentracin de 2mL
de sustrato, la velocidad de reaccin se
volviera constate (~0.04) de ah en
adelante, ya que la velocidad de reaccin
tendera a alcanzar la velocidad mxima
de catlisis de la enzima.
Finalmente, se realiz el respectivo
estudio del efecto de la temperatura sobre
la velocidad de la reaccin enzimtica.
En la figura 4, se puede observar la
prdida del color principalmente en la
muestra de la izquierda que corresponde a
la prueba realizada a 4C y en la muestra
de la mitad que corresponde a la prueba
realizada a temperatura ambiente.
Los cambios en la coloracin, como ya se
ha dicho, corresponden a una hidrlisis en
los enlaces 1,4 y 1,6 en los cuales
justamente el lugol se adhiere para formar
una solucin que se torna de color violeta;
es decir que si la muestra no se torna del
color mencionado anteriormente, la
amilasa no se encuentra inhibida bajo
estas condiciones.

En contraste, se puede observar en la

muestra del lado izquierdo que la
coloracin tiende a parecerse un poco a la
del almidn teido con lugol, es decir en
su forma no hidrolizada; teniendo en
cuenta lo dicho anteriormente, se puede
decir que en estas condiciones de
temperatura impiden la accin de la alfa
amilasa.
Gran parte de las enzimas que se
encuentran en el cuerpo humano, trabajan
por lo regular a una temperatura de 37C
a la cual se encuentra nuestro cuerpo; la
alfa amilasa no es una excepcin a estas
condiciones y es por esto que en la prueba
realizada a temperatura ambiente, muestra
una catlisis natural. (Pascual, 2000)
Segn los resultados visualizados en la
prctica, la enzima presenta una aparente
inhibicin a altas temperaturas y una
inhibicin moderada a bajas temperaturas,
debido a que presenta una mayor
decoloracin con respecto a la prueba que
se realiz a 50C.
Todo este anlisis nos da una
aproximacin a lo que es la cintica de la
enzima alfa-amilasa, pero queda una
pregunta por responder, Por qu la alfaamilasa no degrada celulosa?

paso evolutivo en la historia del Homo

Sapiens debido a que la cantidad
energtica que se le puede ganar a el
almidn es mucho mayor que la de la
celulosa, y esto implica un aumento en las
capacidades cognitivas y motoras de la
especie. (Nature Genetics, 2007).

CONCLUSIONES

La enzima alfa-amilasa, segn los

datos obtenidos en esta prctica,
sigue la cintica de MichaelisMenten.
La ecuacin de Michaelis-Menten
describe el comportamiento de la
enzima, por lo que antes de
realizar cualquier prueba se puede
hacer uso de la ecuacin para
modelar la actividad de la enzima
bajo condiciones especiales.
El mtodo de trabajo es bastante
tediosos, por lo que por lo que el
cuidado y la precaucin deben ser
de vital importancia a la hora de
realizar la prctica si se quieren
obtener resultados confiables.
Aunque degradar almidn implica
una alta ganancia energtica, el no
degradar celulosa tambin es de
vital importancia, puesto que al no
ser degrada, esta sirve como fibra
y ayuda en la digestin de los
alimentos.

Esto se debe a que en la celulosa, aunque

presenta los mismos monmeros del
almidn, los monmeros estn unidos por
enlaces -1,4, los cuales pasan
desapercibidos al ataque cataltico de la
enzima. (Karp, 2009)

BIBLIOGRAFA

Qu importancia tiene que la enzima no

degrade celulosa? Estudios afirman que el
hecho de que la alfa-amilasa no degrade
celulosa, pero s almidn, fue un gran

Lurbert Stryer, J. M. (2013). Bioqumica

con Aplicaciones Clnicas.

Karp, G. (2009). Biologa Celular y

Molecuar . Mxico D.F.: McGraw
Hill. pgina 46.

Barcelona: Revert.pginas
27,232,327,321.
Nature Genetics. (9 de Septiembre de
2007). Recuperado el 11 de
Octubre de 2015, de US National
Library of Medicine:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/
articles/PMC2377015/
Pea, A. (2004). Bioqumica. Mxico
D.F.: Limusa. pgina 256

Sandoval, E. (2005). Tcnicas Aplicadas

al Estudio de la Anatoma
Vegetal. Mxico D.F.: Universidad
Nacional Autnoma de Mxico.
Salud. (2015 de Marzo de 2015). Recuperado
el 11 de Octubre de 2015, de Si
Salud: http://si-salud.com/cuales-sonlos-efectos-del-ph-sobre-la-amilasa/
Pascual, M. D. (2000). Microbiologa
Alimentaria. Madrid: Diaz De
Santos.