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Enlafotosntesisribulosa1,5bisfosfatocarboxilasa/oxigenasa(Rubisco)catalizala
frecuenciaquelimitalavelocidaddeCO2fixationpasoenelciclodeCalvin.Estohaceque
laRubiscotantoelguardindelaentradadecarbonoenlabiosferayunobjetivoparala
mejorafuncionalparamejorarlafotosntesisyelcrecimientodelasplantas.Gravarel
rendimientocatalticodeRubiscoessumuyconservadasqumicacataltica,compleja.En
consecuencia,losesfuerzostradicionalesparamejorarlacatlisisRubiscoelusode"ensayo
yerror"prolongadaenfoquesdeingenieradeprotenashantenidounxitolimitado.Aqu
sedemuestralaversatilidaddealtorendimientodirigido(laboratorio)laevolucinde
protenasparamejorarlaspropiedadesdecarboxilacindeunRubisconofotosintticade
lasarqueasMethanococcoidesBurtonii.Elusodelatransformacindecloroplastosenla
plantamodelodeNicotianatabacum(tabaco)confirmamoslasformasmejoradas
deM.BurtoniiRubiscoaumentlafotosntesisyelcrecimientoenrelacinconlos
controlesdeproduccindetabacodetiposilvestreM.BurtoniiRubisco.Nuestroshallazgos
indicancontinuaronevolucindirigidadearqueasRubiscoofrecenuevasposibilidadespara
mejorarlafotosntesisdelahojaycrecimientodelasplantas.
Introduccin
MejorarelrendimientodelasemisionesdeCO2delaenzimaRubiscoFijacintieneel
potencialdemejorarsignificativamentelaeficienciafotosintticayproducir1.Las
estrategiasparalograresteobjetivosuponenilamodificacindelabioqumicayla
ultraestructuradeloscloroplastosdelashojasdeconcentrarCO2alrededordeRubisco,o
mejorardirectamentelacatlisisensRubiscomediantecruzamientogenticoo
modificacintransgnica2.Aunqueambosenfoquesseenfrentanadesafostcnicos
significativos,lassugerenciasdequeRubiscoenplantasyaestoperandoaocercade
ptimafisiolgicaplanteaincertidumbreencuantoalniveldemejoraposible3,4.Algopasa
poraltoenestospequeosconjuntodedatosdeanlisisesquelaplantaRubisconoesel
pinculodelaevolucincomoelRubiscosuperioresdealgunasalgasrojastienenel
potencialparabeneficiaraC3productividadPlantahastaenun30%2.Pordesgracia,en
sustitucindelaplantaRubiscoconalgasrojasRubiscopareceinsostenibledebidoala
chaperonaincompatibilidadesqueimpidenelmontajedealgasRubiscogrande(L)y
pequea(S)subunidadesfuncionalesenL8S8complejoshexadecamerenloscloroplastos
delashojas5.Enlosltimosaossehanproducidoavancessignificativosenla
comprensindelaschaperonasauxiliarescomplejasyespecializadasparalabiognesisde
lascianobacteriasylaplantaL8S8Rubisco6,7,8,9,sinembargohomlogosparamuchas
deestaschaperonasenalgasrojasnosonfcilmenteidentificables.
Apesardecincodcadasdeinvestigacin,unaamplificacindramticaenlapotenciade
clculoymsde25estructurasderayosXparadiferentesisoformasRubisco10seguimos
siendoincapacesdemejorarlaRubiscocatlisispordiseoracional11,12,13.Esta
limitacinhaconducidoaldesarrollodelasindicaciones(invitrodelaprotenaevolucino
laboratorio)EnfoquesadaptadosparaseleccionarmutantesRubiscoconmejoradela
funcin12.Engeneral,laevolucindeprotenasdirigidaimplicalaidentificacinde
protenasconpropiedadesdeseadasapartirdeunabibliotecademutantesquecomprende
unadiversidadgenticasuficiente14.Losavancesenlastecnologasdelaevolucinde
protenasdirigidashanestimuladosuxitoenlaidentificacindemutacionesquemejorano
alteran,lacatlisisy/olasolubilidaddeunagranvariedaddeenzimas14,15,16.Un
beneficioclavedelaevolucindirigidaesquepuederevelarnuevassolucionesde
acondicionamientofsicoqueseraprobablequedeotramanerapasaransinexplorar
durantelaevolucinnaturalde14,17.
LaevolucindirigidadeRubiscohautilizadoprincipalmentesistemasdebajorendimiento
fotosintticodeseleccin(porejemplocapsulatusRhodobacter)odealtorendimiento
dependeRubiscoE.colisistemasdeseleccin(RDE)quevarandramticamenteen
eficiencia12,18,19.ComnalossistemasdeseleccinRDEeslaexpresinectpicade
fosforribuloquinasa(PRK)cuyoproducto,elsustrato5carbonodeRubiscoribulosa1,5
bisphospahte(RuBP),esfortuitamentetxicosparalasbacterias.UnMM1
refinadaPRKseleccinRDEsehaadaptadogenticamenteparautilizarun'PRKRubisco
shunt'paracerrarunabrechaArupturaintroducidaenlagluclisis(figura1a.
20,21).La
bajafrecuenciadefalsospositivosobtenidosutilizandoelMM1PRKsistemaRDE
contrastaconlaineficienciasorprendentedeotrossistemasRDE22,23.Comoresultado,la
MM1PRKsistemaRDEhaidentificadomutacionesqueinfluyennegativamenteenel
CO2/O2especificidad(SC/O)deLbacteriana2RubiscodeRhodospirillumrubrum,as
comomutacionesquemejoransignificativamenteelconjunto(solubilidad)deL
cianobacterias8S8Rubiscoy,enuncaso,marginalmentemejoradatodoslosparmetros
catalticos12,24.Msrecientemente,elMM1PRKRDEidentific
unSynechocystisPCC6803L8S8Rubiscomutanteconmejorasde3vecesenlaeficiencia
decarboxilacinquemejoraronlastasasdefotosntesisde>50%cuandosevuelvea
integrarseenlaaltaconcentracindeCO2compartimentocarboxisomadentrodela
cianobacteria11.Porelcontrario,espocoprobablequeestasmejoraspodranserde
beneficioenhojasdeplantascomolaaltaconcentracindeCO2nivelesnecesariospara
explicarlabajadeCO2deafinidadylamalaSC/SdelascianobacteriasRubisconose
cumplenporloscloroplastos25.
Figura1:SeleccindemejorasenlacatlisisMBRusandoRubisco
dependienteE.coli(RDE).
resultados
LaevolucindirigidadeM.BurtoniiRubisco(MBR)
enE.coli
ElnativoMBIILgenquecodificaM.BurtoniiRubiscosetraduceeficientemente
enE.coliyseensamblaenabundantementeexpresado(>6%(w/w)delaprotenasoluble
declulas)comofuncionalL2Rubisco(MBR)26.EnpresenciadeRuBPsustrato(oligando
fosfatodeazcarestructuralmentecomparable)elL2unidadesseensamblanenunL
estable10complejoMBR.LasmutacionesalazarseintrodujeronenMBIILusandoPCR
propensaerror(conunpromediode2mutacionesporkb)ylosgenesmutantesseligen
unlacdelvectorinduciblepTrcHisB20.
TresMBIILbibliotecas(comprendiendocadauno~180kvariantes)setransformaronen
MM1PRKclulas(Fig.1a)ysecultivarona23Ccomosehadescrito20.Laseleccin
inicialsellevacabobajoaltaRubiscoinducir(0,5mMdeIPTG)ybajocondicionesde
induccindePRK(0.05%(w/v)dearabinosa)enelairesuplementadasconCO2,5%(v/
v)2.Despusde916das80coloniasquemuestranelcrecimientomejoradoenrelacin
conMM1PRKseidentificaronproduccindetiposalvajeMBR(quecomplementael
cuadro1).ElplsmidoquecontienelaRubiscodecadacoloniasesecuencisustituciones
reveladorasen78delos474aminocidos(Tabla1complementario).CadaMBIILmutante
seclondenuevoenpTrcHisByvolveratransformarseenMM1PRKclulasRDEypor
separadocultivabajomayorseleccinactividadRubisco(esdecir,enmediosquecontienen
0,1%(w/v)dearabinosaparaelevarlaexpresindePRK;laFig.1b).Elcrecimientode
coloniassepuntuenrelacinconMM1PRKclulasqueexpresandetiposalvajeMBR
quenopodancrecerenunmedioquecontiene0,1%(w/v)dearabinosa(Fig.
1b).SieteMBIIseencontrarongenesmutantesLparatransmitirunaventajaselectiva
distintaaMM1PRKE.colicrecimiento(Fig.1c).
LossietedetiposalvajeymutantepTrcMBIILgenesseexpresanenXL1Blue
deE.coliysincoexpresindePRK.EstodiocomoresultadosloenL2seforman
oligmerosMBRcomolasclulasnohicieronningnRuBPqueserequiereparala
formacindeL10MBRcomplejos26.Elcontenidocelularylaspropiedadescatalticasde
cadaL2semidienzimaMBR(Fig.2a).LastasasmximasdeCO2fixation(kgatoC)a25
Csedeterminaronenambientes,O2niveles(~252MO2)yconunpHde7,2,debidoal
bajopHfavorecidoporcatlisisMBR26.EnestascondicionesMBRmutanteasla#1
(MBRK332E),#10A(MBRE138V)y#63(MBRT421A)mostraronsignificativas40%a
90%mejorasenlakcatCy10%a25%deincrementoenloscorrespondientesSOC/(Fig.
2a).LacuantificacindelaexpresindeMBRenE.colipor14CCABPdeuninyla
confirmacinmedianteSDSPAGE(Fig.2b)mostrquelamayoradelasmutaciones
tuvieronpocoefectosobreelniveldeexpresinMBR.ElmutanteMBRT421A(#63)
mostrunmodesto,perosignificativo,aumentoenlaexpresin,mientrasquelas
mutacionesenelMBRmutantes#14,#23y#45laproduccindeMBRobstaculizadade
formasignificativa(Fig.2b).
Figura2:AnlisisdemutantesdeMBRconlamejoradelacatlisis.
C/S
C/S
gato
LaexpresindelamejoradeMBRenloscloroplastosde
tabaco
ElgenotipodeltabacocmtrLsehaadaptadogenticamenteparalaingenieradeRubisco
mediantelatransformacindecloroplastos31.EnelplastomadecmcloroplastosTRLeltipo
salvajerbcLgenhasidoreemplazadoconunsinttico,codnversinmodificadade
laR.rubrumbacterianarbcgenH(cmrbcM)quecodificaparalaFormaIIL2Rubiscoen
lugardetabacoL8S8Rubisco(Fig.3a).ElaumentodeO2sensibilidad
deR.rubrumL2RubiscoreducetantoSC/Oylaeficienciadecarboxilacinenambientes,
O2(kgatoC/KC21%O2)por~7vecesenrelacinconeltabacoL8S8Rubisco(Tabla1).Estas
propiedadescatalticasmspobrescomoresultadolacmgenotipotrLquerequierealta
concentracindeCO2paraelcrecimientoenelsuelo31.ComosemuestraporAlonsoet
al.,(2009)laspropiedadescatalticasdeMBR(tantoenL2yL10complejos)sonanms
impedidoqueR.rubrumL2Rubisco,especialmenteconelaumentodepHalcalino.Apesar
deestaalteracin,sustitucintransplastmicasdelcmrbcgenMencmtrLconladetipo
salvajeMBIIgenLgenerlaL10genotipotabacoMBRproducirTobMBIILquepodran
sobrevivirbajoniveleselevadosdeCO2(2,5%v/v)enelsuelo26.LosTobMBIILlneas
tomaronmsde300dasparaalcanzarlamadurezfrtilencomparacincon~30daspara
eltabacodetiposalvajey~32dasparacmtrLenlasmismascondicionesdecrecimiento.
Figura3:TransformacinyexpresindelaMBRmutadoenzimasenlashojasde
tabaco.
Las variables mb R genes que codifican tipo salvaje y mutante MBR se integraron
en elRBC regin L del plastoma del tabaco mediante transformacin del
cloroplasto. ( Un ) Comparacin de la secuencia de plastoma y tipos de Rubisco
hecho en los genotipos de tabaco diferentes examinados. El mb R y marcador
seleccionable aad un gen en los plsmidos transformantes pLEVMbR, pLEVMbRE138V y pLEVMbR-K332E se transformaron en el plastoma del genotipo trL
tabaco para reemplazar el rbc M (que codifica R. rubrum L Rubisco 31 ) por
recombinacin homloga de la secuencia de plastoma de flanqueo (situado entre
las lneas de trazos, la numeracin correspondiente a la secuencia de Genbank
Z00044). P, 292-bp rbc L promotor / 5 'UTR; T, de 288 pb RBC L 3'UTR; T , 112 pb
del PSB Un 3'UTR; t, 147 pb rps 16 3'UTR. Posicin de alineacin de cebadores
LSD y LSE 32 y la sonda 5UTR 221 pb 8 se muestran. ( B ) anlisis de PAGE nativa
de la L S , L y L isoformas Rubisco producido, respectivamente, en las hojas
de tabaco, trL y los tres Tob genotipos. * protena no Rubisco. ( C ) C-CABP
cuantificacin de Rubisco contenido del sitio activo en las hojas jvenes dosel
superior comparables de cada genotipo durante la primera (~ 20 cm de altura,
barras de colores) y tarda (~ 60 cm de altura, barras negras) de crecimiento
exponencial.
cm
cm
cm
cm
cm
10
MBR
14
L2yL8S8contenidoenelRubiscocmtrLyloscontrolesdetabacodetiposalvajequecrece
junto.
LaslimitacionesenelestadoestacionariombnivelesdeARNmRencadagenotipo
contribuyeronaladeficienciaenelMBR(Fig.1complementario).Comoseindicaenla
figura.3a,tantounmonocistronicmbRyA(5070%menosabundantes)discistronicmbR
aadUnatranscripcinserealizaronencadaT0TobMBRgenotipo.Enlashojasjvenes
superioresdeT0plantasen~21cmdealturatotalmbabundanciadeARNmdeIera3070%
msbajaenlaabundanciadelosRBCnivelesdemRNAenLdetiposalvaje
(complementarioFig.1).Comosehavistoanteriormenteenlosgenotiposdetabaco
modificadasRubiscoconpotencialreducidafotosinttica8,26,30,32,estosnivelesde
mRNAreducidossecorrelacionanconlaviabilidaddelaalteracindelamsdelgada,de
tamaomspequeo,plidohojasverdesdecadagenotipotransplastmica(verabajo).
ElMBRevolucionadohanmejoradolaactividad
carboxilasa
LaspropiedadescatalticasdeladetiposalvajeymutantesL10isoformasMBRproducido
enlosT0progeniesemidieronapH8(elpHaproximadodelaestromadel
cloroplasto,Tabla1).MientrasqueelSc/ovalorescoincidanconlosmedidosparael
L2enzimasproducidasenE.coli(Fig.2b),loskgatoCtasasfueroninferioresalosmedidosa
pH7,2,debidoalamayoractividaddeMBRabajopH26.Sinembargo,inclusoapH8
tantokgatoCylaseficienciasdecarboxilacin(kgatoC/KC21%O2)delasenzimasMBRE138Vy
MBRK332Eeranentre2y3,4vecesmayorqueMBR,conunacompaante~aumentodel
15%enelSC/SparalaenzimaMBRE138V(Tabla1).Esimportantedestacarqueestas
mejorasenCO2deafinidad,especificidadyfijacinvelocidadllegaronsingastosalaalta
afinidadnaturaldeMBRparaRuBP(esdecir.UnabajaKmRuBP,Tabla1).
LamejoradelacatlisisMBRmejoralafotosntesisyel
crecimientodeltabaco
LamejoradelcrecimientoyfenotipomssaludabledelaTobMbRK332EyTobMbRE138Vgenotipos
enrelacinconlostobMBRlneasfueevidenteenelT1progenie.Enlosensayosde
germinacindecultivodetejidosdetodoelT1progeniesurgicomocotiledonesverdesen
losmediosdecomunicacinespectinomicinadespusde1semanaconfirmandotodoseran
transplastmicas(Fig.4).Despusde5semanas,eraevidentequeserequierelaadicinde
sacarosaalmediodecultivodetejidosparaelgerminadoTobMBRyTobMbRE138Vlneaspara
sobrevivirbajoelevada(v2,5%v/)CO2(Fig.4).Encontraste,lostobMbRK332Eplantas
sobrevivieronaaltaCO2sinsuplementacinsacarosaycrecieronmsrpidamenteentodas
lascondicionesdecultivodetejidosensayados.
Figura4:ElT1TobMBRE138VyTobMBRK332Eprogeniemostrunamejoraenelcrecimiento
encultivodetejidos.
-2
-1
(Fig.5A).ParacompensarlosnivelesinferioresdelahojaMBRylaspropiedades
catalticasmspobresdelaL10MBRenrelacinconeltabacoL8S8Rubisco(Fig.
3cyTabla1),lasmedicionesdeCOfotosintticos2assimilationbajasentodoelMBR
transformaronhojasserealizaronen1%(v/v)O2.Inclusoenestasbajasconcentraciones
deO2presiones,lafotosntesissemantuvolimitadoporMBRactividadentodoelrangode
lahojaintercelulardeCO2presiones(Ci)aprueba(Fig.5a)conlamsaltatasade
asimilacinde2,4moldeCO2fixed.m2.s1medidoenTobMbRK332Edejabajoelintercambio
degasesdelahojaCmsaltaide2000barCO2(Fig.4b).Comoestatasaesmsde10
vecesmslentoqueel2630moldeCO2fixed.m2.s1tasasmedidasenaltaconcentracin
deCO2crecidotiposalvajedeja33TOBMbRK332Ecrecieron~5vecesmslentaqueladetipo
salvajebajoaltoCO2(Fig.5b,c).
Figura5:ElMBRmutadoamejorarlafotosntesisdelahojadetabacoycrecimiento
delasplantasenrelacinconlaproduccindetabacodetiposalvajeMBR.
-2
-1
10
14
MBR-E138V
MBR-K332E
MBR
LasdiferenciasrelativasenlahojadeCO2tasasassimilationdecadagenotipo
transplastmica(Fig.5a)secorrelacionconsutasadecrecimiento(Fig.5b).Los
TobMbRK332Eplantascrecanmsrpidamenteyalcanzaronlamadurezfrtilantesdequelos
TobMbRE138Vlneas,mientrasqueelcrecimientodelostobMBRcontrolessedeterioraron
considerablemente(Fig.5b).ElcrecimientomsrpidodelosTobMbRK332Eplantascontrasta
conlasmejorespropiedadesdecarboxilacindelMBRE138VconrespectoalMBR
K332E(Tabla1).Estadiscrepanciapuedeseratribuidaalosnivelesde~50%msbajosde
MBRE138VproducidosenTobMbRE138VdejarelacinalosnivelesproducidosenMBRhojas
comparablestantodelaTobMBRyTobMbRK332Egenotipos(Fig.5A).Laidentificacindesila
mutacinE138Vimpidelatraduccin,labiognesisy/oestabilidaddeMBRpermanecea
ensayar.
LaubicacinestructuraldelaE138Vymutaciones
K332EenelMBR
ElanlisisfilogenticodeMBRrevelaquecompartehomologadesecuenciamsestrecha
conR.rubrumFormaIIRubiscoqueotrosRubiscoarqueas(SupplementalFig.
2)26.EstosalineamientosmostraronqueelE138yK332enelMBRsealineanconA134y
E331enR.rubrumRubiscoyR134yE324enelT.kodakorensisarqueasL10Rubisco(Fig.
6a).ComosemuestraenlaFig.
6b,A134enelR.rubrumL2estructuracristalinaes
solventeexpuestaysituadadistilalsitioactivo.EncontrasteR134enelT.kodakarensisL10
deestructuraesunodelosdiezaminocidosqueformanunaredaltamenteinicaentre
dmerosadyacentes(esdecir,encadaL2L2interfaz)27.
Figura6:AnlisisestructuraldelacatlisismejorademutacionesenelMBR.
10
Discusin
lnosdemuestrandeformanicaelpotencialdeevolucindirigidausandolaseleccin
RDEparaentregarconxitolasformasmseficientesdelano
fotosintticaM.BurtoniiarqueasRubisco(MBR).LasmejorasderivadasdeCO2fixation
velocidad,CO2affinityyespecificidadparaelCO2delasenzimasmutantesMBRE138V
yMBRK332EevolucionadotraducidosaapoyaratasasmsrpidasdeCO2asimilaciny
elcrecimientoeneltabacoenrelacinconlosTobdecontrolMBRproduccindetiposalvaje
genotipoMBR.Estehallazgoproporcionalaprimerapruebadeconceptoquedirigela
evolucindelanofotosintticaRubiscoenE.colipuedeentregarmutantesconmejorasen
todoslosparmetroscatalticosnecesariosparaestimularlafotosntesisenloscloroplastos
delashojas.Estocontrastaconelxitoanteriorenlaevolucindemutantesmejorados
catalticasdecianobacteriasRubiscoque,obienmostrarslomarginal(<5%)mejora
generaldelacatlisis24ounamejorasignificativa(>50%)enlaeficienciadecarboxilacin
quevinieronaexpensasdeunaumentoparalelonodeseadoseninhibidoradelaeficiencia
deoxigenacin11.UnretoadicionalconcianobacteriasL8S8Rubiscoessupotencial
biognesislimitadaenloscloroplastosdetabaco(~10%detiposalvaje34)encomparacin
conelMBRL10queseproduceen~2550%deltabacodetiposalvajeRubisco(Fig.
3c).LaaltasolubilidadyelxitoglobalconlaevolucindelacatlisisMBRinspira
esfuerzocontinuadoevolucionandoalolargodelastrayectoriasevolutivaspropiedadesque
mejorananmssupotencialfotosinttico.
ExploracindelespaciodesecuenciasRubiscohaciamutacionesquemejoransueficiencia
enlasplantasdecultivoesundesafopermanente13.Nuestracontinuaincapacidaddespus
de50aosdepredecirracionalmentequcambiosdesecuenciapuedenmejorarlafuncin
Rubiscodiriginuestraatencinhaciaelpotencialdeevolucindirigidaparaexplorar
Rubiscosecuenciaespacioparalamejoradelacatlisis.Unrequisitocomndelosestudios
deevolucindirigidadexitoeslaidentificacindeunpuntodepartidaadecuadoparael
sistemademutagnesisyseleccinapropiada14,17,35.Lafacilidadconlaquelas
actividadescarboxilasadeMBRsepodranmejorarporcambiosdeaminocidos
individuales(Tabla1)probablementesederivadelmismoquetienelaespecializacin
sometidoaunpapelmetablicoalternativadurantesuevolucinnofotosinttica29.Esto
implicaquearqueasRubiscopuedeocuparunaposicinalternativaparafotosinttica
Rubiscodentrodelpanoramadelaevolucindeladiversidaddelespaciodesecuenciasen
relacinconlacatlisis.Enconsonanciaconesto,arqueascatlisisRubiscoesnormalmente
distintaconrespectoalocontemporneo(fotosntesis)Rubisco26.ArqueasRubiscopuede
sostenerfuncionalidadatemperaturasextremas,enlasquetermotolerantescrecerarqueas,y
muestranlaafinidadaumentadaparaRuBPnecesariaparametabolizarlosnivelesfinitos
realizadasduranteelmetabolismodenucletidos29.Lacompensacindeestas
caractersticasbeneficiosas,arqueasRubiscomuestranunabajakgatoCySC/S26.Mejorar
nuestracomprensinfundamentaldelascaractersticasestructuralesquedeterminanesta
cinticanoconvencionalesrequiereunestudiomsexhaustivodelaestructuradearqueas
Rubisco,cataltica,yladiversidaddesecuencias.
Losmritosdelaprotenaevolucindirigidaseilustranporlosmuchosejemplosdexito
alterarlasolubilidaddeprotenas,mejoradelacatlisis,inclusopermitiendopromiscua
funcincataltica12,14,15,17.Estosresultadossuelenrequerirmltiplesrondasde
mutagnesisygraduales.ParaMBR,sehizounintentoparaseleccionarmutantesde
segundageneracinconactividadmejoradautilizandounabibliotecacombinadadeepPCR
mutadombgenesquecodificanRMBR,MBRE138VyMBRK332E.Nohaymutantes
MBRsedetectaronquepermitilasupervivenciaRDEMM1PRKbajoaltainduccinPRK
(esdecir,0,2%w/varabinosa).Losobjetivosfuturossonexaminarlaviabilidaddela
capturadelaepistasisdelespectrodelaprimerageneracinMBIIgenesmutantesL(Tabla
Suplementaria1)utilizandounenfoquebarajadoparaidentificartrayectoriasadaptativas
quemejorananmsMBRcatlisis.Elxitosinembargodependedelpotencialepistatic
positivoparalaevolucindelaactividaddelacarboxilasadeMBRylacapacidaddeevitar
oeludirmutacionesbeneficiosasquepuedanproducirefectosdesestabilizadoressobrela
estructurayfuncin.Talesincertidumbressoncomunesalosestudiosdelaevolucinde
protenasdirigidas.Pronsticodelamedidaenquelasmutaciones(atravsdeinteracciones
decidoaminodistanciadirectaolarga)influyenenlastrayectoriasevolutivasartificiales
siguesiendoimpredecible36.
Unobstculoimportanteeslarelativamentebajafidelidaddelaseleccinylaproduccin
delMM1PRKsistemadeseleccin20.Lafrecuenciadexitoenaplicacionesdeevolucin
dirigidadependedelaseleccindelabibliotecarendimientoylasensibilidaddelsistemade
seleccinparadetectarunrasgodeseado14,15.Ladependenciayelrendimientodelas
cepasdeRDEexistentessufrendealtasfrecuenciasdefalsospositivosquesurgen
tpicamenteatravsdemutacionesdeescapePRKtransposnasociada11,12.Aunquees
relativamenteinmunealosfalsospositivos,laMM1PRKrendimientoseleccinRDEseve
impedidaporelrequisitodebajatemperaturadecrecimiento(25C),faltadeeficaciadela
transformacin,yredujolaviabilidadcelularcomoresultadode
ladiferenciaAmutacin20.LamejoradelafidelidaddelaseleccindelossistemasRDE
tanto,esfundamentalparalaevolucinulteriorMBR,yotrasisoformasRubisco,con
mejorespropiedadesfotosintticas.UnasolucinpodraserladeatarPRKconunaprotena
deresistenciaalosantibiticosenunacepadeRDEevitandoaslaseleccinde"PRK
silenciado"falsospositivosyaquetalesmutacionestambinrenuncienresistenciaalos
antibiticos.
LaevolucindeadaptacindearqueasRubiscoinvitrohaciaunoqueesmseficienteque
laplantadecultivoL8S8enzimasessindudaunretoalargoplazosignificativa,mucho
tiempo.AdiferenciadeL8S8Rubiscodelasplantasylasalgas,losrequisitosde
plegamientoyensamblajedearqueasRubisco,comoMBR,secumplenenE.coli(Fig.
1c)26,27,29.EstapropiedadrefuerzalaidoneidaddearchaealRubiscoparaidentificar
mutantesquemejoranlacatlisisutilizandocepasRDE,yaquerestringelaseleccinde
mutacionesquepotencianlasolubilidad,unresultadoquehadominadolosestudiosde
evolucindirigidaconcianobacteriasL8S8Rubisco11,12,22.Lasusceptibilidaddearqueas
RubiscoparalaspruebasdemutacinenE.coliyahademostradosertilparademostrar
cmolaincorporacindesecuenciadeRubiscoespinacasenT.kodakarensisL10Rubisco
puedemejorarkgatoC27.LamejoradelacatlisisdearqueasRubiscopordiseoracionalo
evolucindirigidaounacombinacindeambos,portanto,planteavasfuturoviablellevara
cabo,especialmenteteniendoencuentanuestraconclusindequeestosbeneficiosse
puedentraducirdirectamentealamejoradelafotosntesisdelashojas.
Comoseindicaenlafigura.
6,lassecuenciasprimariasdearqueasRubiscosonmuy
diversosysusestructurasdeoligmeroscomoL2oL10aparecevariable.Sibienelanlisis
deespectrometrademasasinfiereunamaduraL10estructuracuaternariadeMBR26nose
sabesiformaunaestructuratoroidalcomparableaT.kodakarensisarqueasRubisco(PDB:
1GEH),enparticular,yaqueslocompartenel36%dehomologadeaminocidosyMBR
contieneunanoveladeinsercinde11aminocidosensudominioC26.Losesfuerzosen
cursosecentranenlaresolucindelasestructurascristalinastantoparaL2yL10MBRpara
entendermejorladiversidadestructuralentrearqueasRubisco,ascomoayudarainterpretar
cmolasmutaciones,comoE138VyK332E,funcionalmenteimpartencambiosenla
catlisis.
Materialesymtodos
Laevolucin,expresinypurificacindeMBRenE.coli
ElMBIILgendePhuembiiL26seclonenpTrcHisBusandoNcoI/HindIIIyelplsmido
resultantepTrcMbRutilizcomomoldeparamutaraleatoriamenteelMBIILporPCR
propensaaerrores(epPCR)comosedescribe20.LosproductosdePCRseclonaronen
pTrcHisByladiversidaddelaMBIIbibliotecaLmutantecalculadoutilizandopedel
AA37.LabibliotecasetransformenlaRubiscodependienteE.coli(RDE)cepa
MM1PRKycrecidobajodiferentescondicionesselectivasdeacuerdoconla20.Los
mutantesMBIILgenesdelascoloniasdecrecimientomsrpidoseclonaronenel
plsmidodeexpresindelaubiquitinamarcadacon6xhistidinePhueycadaMBRafinidad
isoformapurificadaporcromatografadeafinidaddemetalinmovilizado(IMAC)comose
describe26.
transformacindeplastomadeltabacoyelcrecimiento
Ungensinttico,mbR,quecodificalaM.BurtoniiRubiscoconysinmutacionesde
codificacinE138VosustitucionesK332EfuesintetizadoporGenScript.Elusode
codonesdembRsecorrespondaconeltabacorbcgenLysesustituyelasecuencianativa
Nterminaldecodificacin(MSLIYEDLV)conladelRubiscogrande(L)subunidadtabaco
nativo(MSPQTETKASVGF).Los1.418pbmbfragmentosdegenesRseclonaronenNheI
/SalcortpLEV432paraproducirlatransformacindeplsmidosplastomapLEVmbR,
pLEVmbRK332EypLEVmbRE138VytransformadosendiezcmTRLhojaspor
bombardeobiolstico31.Independentlneastransformadaspositivamentelaproduccinde
L10MBRseidentificaronporPAGEnodesnaturalizante(PAGEnativa)26ydoslneas
independientesparacadagenotipoMBRsehicieroncrecerhastalamadurezenelsueloen
unacmaradecrecimientoconelairesuplementadocon2,5%(v/v)CO230.Lasfloresde
lasfrtilesT0plantasfueronfertilizadasconpolendetiposalvajeylasemillagerminadaen
cultivodetejidosenmediosdemedidarelativadepredictibilidadsuplementadascon0%a
3%(w/v)desacarosa30.ElgerminadoT1progeniesetransfiricuidadosamentealsueloy
elintercambiodegasdelahojaylabioqumicacelulardecercadehojastotalmente
expandidasenposicionescomparableseneldoselsuperioranalizadacuandolasplantaseran
de2025cmdealtura.
LosanlisisdeADN,protenasyPAGE
ADNgenmicodelahojatotalfueaisladoutilizandoelDNeasyKitycebadoresPlant
MiniLSHyLSE(Fig.3a)utilizadosparaamplificarporPCRylasecuenciadelaregin
deplastomatransformadoencadagenotipodetabacocomosedescribe32.Serealizla
preparacin,lacuantificacin(contraBSA)deprotenadehojasolubleyanlisisporSDS
PAGE,PAGEnativayanlisisdeinmunotransferenciacomosehadescrito38.
contenidodeRubiscoycatlisis
LastasasdeRubisco14CO2defijacinserealizaronutilizandoextractosdeprotenas
solublesaisladosdebacteriasodeprotenadelahojaen50mMHEPESNaOH(pH7,2o
8,0)quecontienetampndeextraccincomosehadescrito30.Seutilizextractode
protena(20l)parainiciarlaactividaden0,5mldeensayosrealizadosen7mlvialesde
centelleodeseptotope38.Cadamuestrasemidiporduplicadoendiversas
concentracionesdeNaH14CO3(067mM)yO2(0,2,y5%(v/v))paracalcularlatasa
mximadecarboxilacin(VC)ylaconstantesdeMichaelis(Km)paraelCO2(KC)y
O2(KS)38.Latasaderotacincarboxilacin(kgatoC)secalculdividiendoVCporlos
sitiosactivosdecontenidoRubiscocuantificadospor[14C]2CABPunin30.Rubisco
CO2/O2especificidad(SC/S)ylaKmparaRuBPsecuantificaroncomoseha
descrito38utilizandoMBRpurificapartirdeE.coliporcromatografadeafinidadcon
metalinmovilizado26olashojasdetabacomedianteintercambioinico30.
Anlisisdelcrecimientoylafotosntesis
Todaslasplantassecultivarona25Cenunacmaradecrecimientotalcomose
describe30envirtudde20050molquanta.m2.s1enairequecontiene2,5%(v/v)
CO2.Unavezaproximadamente21cmdealturalastasasdefotosntesisdelahoja(A)en
la5hojadecubiertasuperiorsemidieronusandoun6400LIsistemadeintercambiode
gasesXT(LICOR)adiferentesatmosfricasdeCO2presionesparciales(Cuna;502000
ppm)aunahojatempladaconstantede25Cy1,000molquanta.m2.s1.El"ACi"
mediciones(Ci,dehojaintercelulardeCO2niveles)serealizaronaconcentracionesbajas
deO2presionesparciales(1%(v/v)deO2enN2)paraobtenermedidasadecuadasdeA.