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Universidad de Oriente

Ncleo Bolvar
Escuela de Ciencias de la Salud
Virologa

INMUNOFLUORESCENCIA

Prof:
Alumna:
Angelica Farreras.
Farfn Luimore
C.I: 25.493.050

Ciudad Bolvar, Abril del 2015


La fluorescencia es un fenmeno por el cual algunas sustancias tienen la
capacidad de absorber luz a una determinada longitud de onda, por lo general
en el rango ultravioleta, y luego emiten luz visible en una longitud ms larga.
Dicho de otra manera, absorben fotones con una determinada energa, y
liberan fotones con menor energa. Este proceso es casi inmediato, la luz es
recibida y vuelta a emitir en millonsimas de segundo, por lo tanto podemos
decir que la fluorescencia dura tanto como el estmulo, ya que cuando ste
cesa, tambin cesa el fenmeno de fluorescencia. Esta es la principal diferencia
con el fenmeno de fosforescencia, en el cual la luz absorbida se vuelve a
emitir luego de transcurrido un cierto lapso.
Como se produce la fluorescencia?
La absorcin de luz por parte de la molcula de fluorocromo la eleva a un
estado de excitacin en el cual contiene mayor energa. La molcula
permanece en el estado de excitacin por un perodo de tiempo muy corto. El
retorno a un nivel de energa menor es acompaado por emisin de luz
(fluorescencia)
Inmunofluorescencia;Directa
El procedimiento se realiza en un paso bsico de reaccin. La muestra clnica
que presuntamente contiene antgenos del microorganismo bajo estudio es
puesta en contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contradicho
microorganismo conjugado con fluorescena. Si el antgeno esperado est
presente se formar un complejo antgeno-anticuerpo. La reaccin positiva en
forma de fluorescencia verde manzana puede verse con la ayuda de un
microscopio de fluorescencia.
Inmunofluorescencia;Indirecta
Los detalles tcnicos son idnticos a los del mtodo directo, excepto porque el
suero especifico no esta marcado; en vez de ello, se une el colorante a un
segundo suero preparado contra las globulinas de las especies en que se formo
el suero especifico, por ejemplo con frecuencia los anticuerpos preparados
contra inmunoglobulina humana se preparan en conejos o cabras. A este
mtodo se le conoce como sndwich debido a que se forman tres capas

El
proceso
consta
de
dos
etapas:
Primera etapa: se fijan sobre un portaobjetos los antgenos que constituyen el
substrato conocido especfico (clulas que contiene virus, T. gondii, T. pallidum,
etc.) sobre l se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de

anticuerpos especficos, si la reaccin es positiva se dar formacin de


complejo antgeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba
marcado
Segunda etapa: se agrega una anti-inmunoglobulina humana marcada, que
reaccionar con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa.

FLUOROCROMOS
Sustancias que emiten un fotn cuando son excitados por un fotn incidente.
Formen uniones con las protenas (Ac) pero sin afectar los grupos de
combinacin
especfica
del
anticuerpo.
El pH afecta la fluorescencia y por esta razn se debe trabajar a pH estable y
adecuado dependiendo del colorante: fluorescena (pH 8), rodamina (pH 7),
DANS (pH 1.6-14)
VENTAJAS
Se
pueden
obtener
resultados
rpidos.
-No
es
necesario
realizar
cultivos.
-Se puede identificar microorganismos especficos en un grupo mixto.
-Determina
la
identidad
de
un
organismo
muerto.
-Es sensible.

DESVENTAJAS
-Costos
en
reactivo
y
equipo
-Debe
ser
realizado
por
personal
muy
especializado.
-Los resultados no son 100% especficos (como toda tcnica serolgica).
1.

2.

TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA2.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO. Ac Policlonal Ac


Monoclonal Pool de Ac monoclonalesFuerza de seal Excelente Regular a Buena ExcelenteEspecificidad Buena,
pero a Excelente pero con Excelente veces el posible reaccin cruzada background es altoVentajas Seal fuerte
Especfico Seal fuerteDesventajas No renovable Baja seal Especfico Background Disponibilidad Se necesita
titular2.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE. Es una tcnica CUALITATIVA que
se usa para detectar la presencia de Ac especficos en el suero. En esta tcnica la visualizacin del IC no es
directa, sino que se lleva a cabo por intervencin de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac o anti-Ac, que
recibe el nombre genrico de conjugado fluorescente. Los Ag utilizados son formes o partculas (cortes de tejidos,
bacterias, parsitos o cortes de parsitos, etc).2.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).
11. Se aade la solucin de Ac fluorescente sobre el Ag, previamente fijado en un porta o placa, se incuba, se
lava y seleen los resultados.2.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI).El suero problema (con el Ac
buscado) se aplica sobre el Ag fijado, se lava y luego seaade el anti-Ac fluoresceinado contra la regin Fc del
primero, se lavan y se leen losresultados.Se usa de rutina para detectar auto-Ac en sangre de pacientes con
enfermedadesautoinmunes.2.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA
PORCOMPLEMENTO.Se usa para detectar Ac fijadores del complemento. En el segundo paso, despus
deaadir el Ac, se aade complemento fresco, que se fija alrededor de donde se hanfijado los Ac. Debido a los

pasos de amplificacin de la va clsica del complemento,una molcula de Ac puede fijar muchas molculas de
C3b al Ag, que se revelan con Acanti C3b fluoresceinado. Es una tcnica mucho ms sensible.En los tres casos,
los IC formados se ponen de manifiesto por observacin del porta enun microscopio provisto de luz ultravioleta
(los Ac se ven con fluorescencia verde). Elpatrn de fluorescencia es caracterstico de cada Ag.3. HISTOQUMICA
Y CITOQUMICAHistoqumica es el estudio qumico de los tejidos independientemente del mtodo deanlisis
empleado. En la prctica se emplea la palabra para designar el mtodo juntocon el auxilio de los microscopios
pticos (MO) y electrnico (ME).Esta tcnica permite la identificacin y localizacin de compuestos o radicales
qumicosen las clulas y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productosinsolubles que son
coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME

3. PREPARACIN

DE

LA

MUESTRA

(1)

A. Mtodos de conjugacin : Es posible conjugar las protenas en el suero


completo o en fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos.
Se debe aadir al suero un amortiguador de carbonato-bicarbonato para
mantener condiciones ptimas de pH (9.0), se agita en bao de hielo
aadiendo fluorocromo en un perodo de 15 minutos, se debe permitir una
agitacin toda la noche ya que la conjugacin es del orden del 100% en 24
horas.

4.

B. Purificacin del conjugado : Se logra mediante


eliminacin

por

dilisis

de

las

sales

amortiguadoras y los elementos utilizados como


solventes del fluorocromo (acetona). Se utiliza
extraccin con carbn o filtracin en columna de
sephadex

para

eliminar

las

sustancias

fluorescentes Que. no reaccionaron lo cual puede


ocasionar tincin inespecfica.

5.

C. Concentracin del Anticuerpo : Se logra mediante tratamiento con sales


de amonio saturado. El almacenamiento es el solucin salina amortiguada
con fosfato a pH 7.1.

6.

D. Preparacin de anticuerpos : Se obtienen mediante inmunizacin


en animales, la globulina humana se aplica en 2 o 3 inyecciones a
intervalos de 3-4 semanas, la respuesta de anticuerpos se mide
mediante mtodos serolgicos y el suero se recoge 7-10 das luego
de la ltima inyeccin.

7.

E. Manejo de cortes y tejidos : Los frotis y cortes montados que no


se estudien de inmediato se pueden proteger por sumersin en
carbowax y almacenamiento a -20C. Los cortes liofilizados protegidos con
resina de poliester se pueden conservar varios meses en un desecador a 0C

sin

que
Es

pierda

preferible

trabajar

con

sus
cortes

antgenos.

fijados

ya

que.la

tincin

inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaa de difusin o prdida del


antgeno adems se reduce la autoinmunofluorescencia tisular (vesculas y
partculas).
Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antgenoanticuerpo, el ms empleado es alcohol etlico al 95% entre 4-30C, alcohol
metlico, acetona o formol. Para bacterias es muy til la fijacin mediante
calor. La inclusin en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una
localizacin ms precisa y una tincin ms viva que con cortes en
congelacin.

8. FLUOROCROMOS - Sustancias que emiten un fotn


cuando

9.

son

excitados

por

un

fotn

incidente.

Se deben utilizar colorantes que formen uniones con las protenas pero
sin afectar los grupos de combinacin especfica del anticuerpo. La reaccin
de unin ocurre entre los grupos amino y carboxilo de la protena y los
grupos tiocianato o cloruro de sulfonilo de los colorantes. El fenmeno de
fijacin disminuye la fluorescencia de los fluorocromos de tal manera que los
conjugados solo muestran de 15-30% de la fluorescencia del colorante libre.
El pH afecta la fluorescencia y por esta razn se debe trabajar a pH
estable y adecuado dependiendo del colorante : fluorescena (pH 8), rodamina
(pH

7),

DANS

(pH

1.6-14)

(1).

El colorante fluorescente es una molcula que absorbe luz en una longitud


de onda, lo que excita los electrones y los lleva a un nivel energtico mayor y
al volver a su nivel energtico inicial emite luz en una segunda longitud de
onda.

El

isocianato

fluorescencia verde

de

fluorescena

manzana bajo

la

rodamina anarajando

el
luz

DANS

muestran

ultravioleta

una
la

brillante (1).

Cuando el lapso de tiempo entre la absorcion de la luz activamente y la


emision de la nueva luz es mayor de 1/10000 segundos el fenomeno se
define como fosforescencia, pero cuando el fenomeno es menor de 1/10000
segundos

se

define

como fluorescencia.

10.VENTAJAS Y DESVENTAJAS
11. VENTAJAS
-

Se

-No

pueden

obtener

es

resultados

necesario

rpidos.

realizar

cultivos.

-Se puede identificar microorganismos especficos en un grupo mixto.


-Determina
-Es

la

identidad

sensible.Nota:

La

figura

de

un

muestra

un

organismo
ejemplo

de

muerto.
fagocitosis.

12. DESVENTAJAS
-Costos
-Debe

en
ser

reactivo

realizado

por

personal

muy

equipo
especializado.

-Los resultados no son 100% especficos


(como toda tcnica serolgica).

13.APLICACIONES
Esta tcnica tiene mltiples
aplicaciones en diagnstico e
investigacin. Se ha utilizado
en

estudios

bacteriolgicos,

virales, parasitolgicos. Se ha utilizado en el


estudio de la distribucin intracelular de las
molculas.

14. Microscopio de luz polarizada


15. Es un microscopio de campo claro al cual se le adicionan filtros que
modifican la luz. Tambin se denomina microscopio petrogrfico o
metalrgico por su uso inicial en el estudio de minerales, sin embargo su
aplicacin se ha extendido al campo de la biologa, medicina, qumica y

muchas otras disciplinas. Esta tcnica microscpica puede emplear tanto la


luz transmitida como la luz incidente (trans-iluminacin y epi-iluminacin
respectivamente).
16. Comparada con las otras tcnicas de incremento de contraste, el uso de la
luz polarizada es la ms efectiva en el estudio de muestras ricas en
materiales birrefringentes, puesto que mejora de manera incomparable la
calidad

de

la

imagen.

La luz proveniente de una fuente estndar de iluminacin vibra y se


propaga en todas las direcciones, pero al pasar por un filtro polarizador las
ondas y su campo elctrico oscilan todos en un mismo plano. El polarizador
es un dispositivo que solo deja pasar la luz que vibra en un plano
determinado denominado eje de polarizacin.

17.

18. Esquema que muestra el efecto de filtros polarizadores en un rayo de luz. A


la izquierda la luz no polarizada se distribuye en todos los planos, pero al
pasar por el primer filtro (horizontal) ste slo deja pasar las ondas que se
propagan en un plano horizontal. Si se interpone un filtro polarizador
orientado de manera vertical (rotado 90 en relacin al horizontal) la luz
polarizada no pasa y se detiene. Tomada de Multimedia Encarta Luz
Polarizada (28).
19.
20. Muchos materiales tienen sus tomos uniformemente distribuidos en las
tres direcciones principales del espacio y presentan una mxima simetra
(cbica o regular) o por el contrario, en algunos materiales sus tomos

carecen de organizacin. Los primeros tienen las mismas propiedades


pticas, independientemente de la direccin en que se midan. Cuando la
luz atraviesa sustancias con estas caractersticas, la velocidad es la misma
en todas las direcciones y gracias a ello se denominan istropos. Por el
contrario,

los

materiales

cuya

organizacin

cristalina

es

diferente

(hexagonal, trigonal, tetragonal, rmbico, entre otras) poseen sus


constituyentes dispuestos de manera asimtrica y varan segn la direccin;
en consecuencia el comportamiento de las ondas luminosas tambin en
diferente, denominndose anistropos (101). La estructura interna del
espcimen determina su comportamiento istropo o anistropo.
21.
Cuando se estudia el comportamiento de la luz al atravesar un espcimen,
los materiales anistropos presentan distintos ndices de refraccin en
relacin a la direccin del haz de luz; por el contrario, los materiales
istropos presentan un ndice de refraccin constante. Cuando un rayo de
luz incide sobre la superficie de un material anistropo transparente se
presenta el fenmeno de la doble refraccin o birrefringencia; esto quiere
decir que se producen dos rayos refractados distintos que vibran en planos
diferentes que se propagan con diferentes velocidades en el interior del
material.
22.
Este microscopio facilita la investigacin de las propiedades pticas de los
especmenes y es ideal para observar y fotografiar aquellos elementos que
son visibles gracias a la anisotropa, de all su uso en cristalografa; sin
embargo, tambin se emplea para estudiar el carcter birrefringente de
muchas estructuras celulares anistropas.
23.
El contraste de la imagen se observa gracias a la interaccin de la luz
polarizada con los elementos birrefringentes del espcimen que producen

las dos ondas refractadas, cada una de ellas polarizada en planos


perpendiculares. Una vez que las ondas de luz salen del espcimen lo
hacen de manera desfasada (ver fig. 6-9) pero son recombinadas al pasar
por otro filtro o filtro analizador. De esta manera, el microscopio de luz
polarizada permite el estudio comparativo entre minerales tomando en
cuenta la absorcin del color e ndices de refraccin. Sin embargo, en
biologa su principal utilidad consiste en distinguir las sustancias isotrpicas
de las anisotrpicas, revelando informacin detallada sobre la estructura y
composicin de los materiales con la finalidad de caracterizarlos para fines
diagnsticos (102). El ojo humano no capta las direcciones en las que vibra
la luz y la luz polarizada puede ser detectada como un incremento en la
intensidad luminosa o como un efecto de color. O en lo cotidiano, por
ejemplo, con el uso de lentes de sol polarizados se logra reducir el
resplandor de la luz ambiental.
24. El 90% de las sustancias slidas son anisotrpicas y como materiales
isotrpicos se pueden enumerar una variedad de gases, lquidos y cristales.
25. Este microscopio est equipado con:
26.
Polarizadores: Un primer filtro polarizador colocado entre la fuente de luz y
el condensador que se puede rotar 360 y un analizador o segundo
polarizador, colocado por encima del objetivo, entre su lente posterior y el
tubo de observacin o cmara fotogrfica. Tambin puede rotarse 90 o
360. Los polarizadores antiguos conocido

como

nicoles estaban

conformados por un sistema de prismas de calcita descrito por W. Nicol y.


En los microscopios actuales el polarizador est constituido por una lmina
polaroid, que consiste en una pelcula de un polmero transparente
(revestida de cristales minsculos de sulfato de iodoquinina orientados en la
misma direccin) interpuesta entre dos placas de vidrio (102).

27. Condensador polarizador: Debe estar libre de desperfectos en sus


componentes pticos.
28. Platina circular: Con capacidad de rotar 360 para facilitar la orientacin
del eje ptico con el campo de visin. Puede contener un vernier para medir
los ngulos de rotacin. El espcimen debe rotarse y colocarse en una
posicin diagonal en la cual los elementos anisotrpicos se observarn ms
brillantes (birrefringentes).
29. Objetivos polarizadores: Diferentes a los objetivos comunes, estos deben
estar libres de desperfectos y tener capacidad polarizadora. Son
ensamblados de manera que se evita en lo posible el dao de las lentes ya
que cualesquier dao por mnimo que sea compromete el rendimiento del
objetivo. Poseen la inscripcin P, PO, o Pol.
30. Ocular con una cruz visible en el campo visual: Para marcar el centro del
campo visual.
31. Lente de Bertrand: Situada inmediatamente debajo del ocular, es
removible y sirve para ver la interferencia con la finalidad de ajustar la
iluminacin de una manera precisa.

La

figura

muestra

un

ejemplo

de

fagocitosis.

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