Determinao estrutural de Protenas por RMN

- RMN Bidimensional

Princpios de deteo de protenas por RMN

O tomo 1H est presente em protenas.
13C

e 15N podem ser incorporados atravs de sntese.

Figura 1. Ligao peptdica.

Desvios qumicos dos 1H de protenas

Idealmente cada ncleo distinto tem um desvio qumico
diferente decorrente de um ambiente qumico distinto;

Em protenas grandes o nmero de ressonncias pode ser

na ordem dos milhares.

Desvios qumicos dos 1H de protenas

Figura 2. Desvios qumicos de 1H de protenas na conformao random coil.

Princpios de deteo de protenas por RMN

Todos os 1H das protenas podem ser observados, excepto os
protes lbeis dos grupos -NH2, -NH, -OH, -COOH e SH
de aminocidos, pois estes trocam com os hidrognios do
solvente e no so detetados.
O acoplamento entre os 1H dos anis aromticos de
aminocidos e os 1H dos C muito fraco para ser
observado.

Glicina

Leucina

Lisina

Alanina

Valina

Arginina

Isoleucina

Prolina

Treonina

Aminocidos que geram padres COSY bem distinguveis , devido

diferente conetividade dos hidrognios da cadeia lateral.

cido asprtico

Tirosina

Triptofano

Serina

Asparagina

Cistena

Histidina

Fenilalanina

Aminocidos AMX geram padres COSY indistinguveis , devido aos

protes lbeis dos grupos da cadeia lateral e aos anis aromticos.

Princpios de deteo de protenas por RMN

A informao acerca da conformao das protenas que est

presente nos espetros RMN surge de interaes entre os 1H
que ocorrem:

-Ao longo das ligaes covalentes: acoplamento J

- Ou atravs do espao (Nuclear Overhauser Effect, NOE)

Equao de Karplus
Os aminocidos tm entidades isoladas, uma vez que no ocorre
acoplamento J ao longo da ligao peptdica - o valor de acoplamento
vicinal 3J, depende do valor do ngulo de torso .

Karplus obteve uma equao geral que relaciona o valor de 3J com o

ngulo :

3J

= Acos2 + Bcos + C

Nuclear Overhauser Effect, NOE

uma consequncia das interaes dipolo-dipolo entre
diferentes spins nucleares h polarizao de spin que
transferida para outro spin prximo
Os tomos no tm de estar no mesmo resduo, tm de estar
prximos no espao.
NOEs so observados em protenas cujos hidrogniosno
esto distanciados mais de 5:
NOE 1/r6

RMN bidimensional
As experincias Bidimensionais que existem so:
Mtodos de correlao Homonuclear atravs de ligaes qumicas:

o Correlation spectroscopy (COSY), Exclusive correlation spectroscopy (ECOSY), Total

correlation spectroscopy (TOCSY), Incredible natural-abundance double-quantum
transfer experiment (INADEQUATE);
Mtodos de correlao Heteronuclear atravs de ligaes qumicas:

o Heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy (HSQC); Heteronuclear

multiple-bond correlation spectroscopy (HMBC);
Mtodos de correlao atravs do espao:

o Nuclear Overhauser effect spectroscopy (NOESY); Rotating frame nuclear Overhauser

effect spectroscopy (ROESY);

Objectivo central destas experincias

atribuio dos desvios qumicos aos respectivos ncleos

Sequncia de impulsos
Sequncia tpica de experincias de RMN por tcnicas de impulso

RMN Bidimensional

Variao do tempo de evoluo (t1);

Duas variveis (t1, t2) e suas transformada de Fourier obtendo duas

variveis de frequncia (v1 e v2);

Espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear, Antnio M. D'A. Rocha Gonsalves, Teresa M- V. D. Pinho e
Melo, Imprensa da Universidade de Coimbra, 2007

Mtodos de correlao Homonuclear

atravs de ligaes qumicas
Transferncia de magnetizao atravs das ligaes entre tomos

vizinhos do mesmo tipo, que corresponde a acoplamentos spinspin (J) de ncleos conectados;

Desvantagem: Quanto maior for a proteina maior a

sobreposio de picos. Sendo uma experincia restrita para

pequenas proteinas ou pptidos.

Correlation spectroscopy (COSY)

Na experincia do tipo COSY s h transferncia de magnetizao entre

protes em tomos adjacentes

Picos diagonais correspondentes aos desvios qumicos dos protes

correspondente a um espectro RMN 1D e picos cruzados entre protes

acoplados

COSY de aminocidos isolados

Exemplo: Aspargina (Asp)

Aspargina (Asp)

Alanina (Ala)

C-H

1
2
3

C-H

4
5

6
7

Ala
Asp

N-H

8
9
10
10

Total correlation spectroscopy (TOCSY)

Na experincia do tipo TOCSY os protes so capazes de

retransmitir a magnetizao, podendo ser transferido para todos

os protes conectados entre tomos adjacentes

Aspargina (Asp)

Alanina (Ala)

C-H

1
2
3

C-H

5
6
7

Ala
Asp

N-H

8
9

10
10

Mtodos de correlao Heteronuclear

atravs de ligaes qumicas
Sinais baseados no acoplamento entre dois ncleos de

diferentes;
Normalmente entre o proto e outro ncleo (denominado

heteroncleo);
Exemplos de heteroncleos usados: 13C e 15N;

Heteronuclear single-quantum
correlation spectroscopy (HSQC)

Correlao entre dois ncleos diferentes que esto separados

por apenas uma ligao, dando origem a um pico por par;

exemplo: 13C-H; 15N-H

Heteronuclear multiple-bond correlation

spectroscopy (HMBC)

Deteco de correlaes heteronucleares a maiores

distncias, cerca de 2-4 ligaes

Mtodos de correlao atravs do espao

Transferncia de magnetizao atravs do espao

indepedentemente de haver uma ligao entre eles;

Estas experincias fazem uso do efeito overhauser nuclear

pelo qual tomos prximos (at 5) sofrem relaxao

cruzada spin-rede (T1);

Nuclear Overhauser effect

spectroscopy (NOESY)

Picos diagonais correspondentes aos desvios qumicos dos

protes correspondente a um espectro RMN 1D e picos

cruzados entre protes prximos no espao

http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/projects/schirra/html/assign.htm (10/11/2013)

Determinao estrutural de Protenas por RMN

- RMN Bidimensional