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DEDICATORIA
El alumno.
Microbiologa de Alimentos I
AGRADECIMIENTO
A la docente de la asignatura
Microbiologa de Alimentos I, Dra. Graciela
Olga Albino Cornejo, quien nos brinda e
imparte sus conocimientos da a da.
A mis padres y hermanos, como
agradecimiento a su comprensin y apoyo
incondicional, durante mi formacin tanto
personal como profesional.
Microbiologa de Alimentos I
INTRODUCCIN
Microbiologa de Alimentos I
OBJETIVOS
BOTULISMO
Es una enfermedad humana y animal producida por la toxina del Clostridium botulinum que
afecta al sistema nervioso produciendo parlisis flcida en msculo. Se puede originar por
una intoxicacin por ingestin de la toxina preformada, una toxiinfeccin por ingestin de
las esporas que germinan en el tubo digestivo produciendo la correspondiente toxina o la
toxina del microorganismo entra por una herida. La complicacin mas frecuente es que la
debilidad muscular afecte los msculos respiratorios y por tanto hay que acudir a la
respiracin artificial.
Historia:
La palabra botulismo procede del latn botulus = salsa, pues se sospechaba que en la salsa
de carne se encontraba la explicacin de esta enfermedad. Durante las guerras
napolenicas, entre los aos 1795 y 1813, el botulismo se present como epidemia en el
reino de Wrttemberg y el Ducado de Baden, lo que permiti su estudio ms detallado.
Si bien el botulismo era conocido, la primera descripcin clnica detallada fue realizada en
Alemania por el Dr. Justinus Kerner, entre los aos 1817 y 1822. Kerner adems realiz
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BOTULISMO INFANTIL.- Es una toxiinfeccin que se relaciona con la ingesta de la miel, los
sntomas tardan en aparecer como en adultos. Los sntomas son: estreimiento, dificultad
para mover las extremidades, mamar, respirar y mantener la cabeza erguida.
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Clostridium botulinum
Bacilo grueso Gram + que presenta forma de varilla,
anaerobio estricto, formador de esporas ovales de
localizacin
subterminal
deformantes,
presenta
A. Clasificacin:
De acuerdo con la especificidad serolgica de sus toxinas
Se distinguen 7 tipos; la toxina predominante (o nica) se designa con la misma letra
mayscula que el tipo de bacilo que la elabora.
TIPO A: Es el nico tipo que suele producir el botulismo humano en E.E.U.U. Es ms
txico que el tipo B.
TIPO B: Se encuentra con mayor frecuencia que el tipo A en la mayora de los suelos
de todo el mundo y es menos txico para el hombre.
TIPO C: Produce botulismo de las aves, del ganado vacuno, del visn, y de otras
especies animales, pero hasta ahora no se conocen casos en la especie humana.
TIPO D: Se relaciona con la intoxicacin por forraje del ganado vacuno.
TIPO E: Es txico para el hombre, se ha aislado principalmente en el pescado y en los
productos derivados del mismo.
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TIPO F: Que excepto por lo que se refiere a tu toxina es parecido a los tipos A y B,
produce el botulismo humano.
TIPO G: A sido aislado del suelo de Argentina, pero no se ha relacionado con el
botulismo humano.
Las cepas del tipo A y la mayora de los cultivos del tipo B son lo suficientemente
proteolticas y putrefactivas para comunicar un olor repugnante a los alimentos
proteicos, aunque algunas cepas del tipo B y las del tipo E carecen de las citadas
propiedades. Incluso los dos primeros tipos, a pesar de que producen toxina, no dan
signos evidentes de originar putrefaccin en alimentos de bajo contenido proteico,
como son las judas verdes y el maz, a pesar de que producen toxina. Este
microorganismo fermenta los hidratos de carbono con produccin de gas, aunque a
veces ni siquiera es observable.
Segn Karen L. Dodds y Jhon W. Austin:
Los agrupa de acuerdo a los caracteres de sus cultivos y sus propiedades fisiolgicas,
en 3 grandes grupos:
GRUPO I.- Incluye a todas las cepas de tipo A (proteolticas) y las cepas proteolticas
de los tipos B y F.
GRUPO II.- Incluye a todas las cepas de tipo E (no proteolticas) y las cepas no
proteolticas B y F.
GRUPO III.- Incluye los tipos C y D; son cepas no proteolticas y comparten un patrn
metablico comn.
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Las caracteristicas generales de los grupos y las toxinas que estan producen se resume
en el siguiente cuadro:
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C. ESPORA
Comparadas con las esporas de la mayora de las dems especies de Clostridium, las de
los anaerobios de la putrefaccin, entre los que se incluye C. botulinum, estn dotadas
de una termorresistencia relativamente elevada. La intensidad del tratamiento trmico
necesaria para destruir todas las esporas en un determinado alimento depende de la
clase de alimento, del tipo y de la cepa de C. botulinum, del medio en el cual se originaron
las esporas, de la temperatura a la cual se originaron, de la edad de las mismas, y del
nmero de esporas existentes.
Esty y Meyer (1922) han recomendado los siguientes
tratamientos trmicos para destruir la totalidad de las
esporas de C. botulinum en un alimento:
En general, las esporas de los microorganismos de los
tipos C, D, y E son menos termorresistentes que las
esporas de los tipos A, B, y E que son inactivadas en 15 minutos a 80C.
Las esporas de los tipos A y B tienen valores D121C de 0,21 minutos, mientras que para el
tipo E se ha sealado que el valor D110C es de 0,003 a 0,017 minutos.
La comprobacin de la termorresistencia de las espora de tipo C ha puesto de manifiesto
que las cepas de origen marino son ms termorresistentes (D104C es de 0,4 a 0,9 min.)
que las de origen terrestre (D104C de 0,002 a 0,008 min.).
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D. TOXINA BOTULINICA
Es una metaloproteinasa compuesta por 2 cadenas de aminocidos, una liviana de 50
KDa y una pesada de 100 KDa (vase Figura 1), las que se encuentran unidas por un
puente disulfuro.
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Es liberada al medio, cuando muere la bacteria, junto con protenas no txicas y ARN;
formando un complejo por medio de uniones no covalentes. Por la accin de proteasas
del Clostridium o del husped, se transforma en una doble cadena unida por puente
disulfuro. Figura 2.
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SNAP-25:
Protena
asocada a sinaptosoma de
25KDa
VAMP:
Protena
de
membrana asociada a
vescula sinptica
Cuadro 2: Compromiso especfico de protenas
citoslicas por los serotipos de toxina botulnica.
medios que contienen leche o casena, glucosa o maltosa, y el agua de maceracin del
maz producen una toxina de tipo A ms potente que la que se produce en los dems
medios. La potencia de las toxinas de los siguientes alimentos enlatados, en orden de
ms a menos, es: maz>guisantes>judas verdes>espinaca.
Las concentraciones de cloruro sdico necesarias para inhibir la multiplicacin del
microorganismo y la produccin de toxina en los alimentos dependen de la composicin
de cada uno de ellos y de la temperatura a que se encuentren. La presencia de nitrato
sdico en los embutidos o de fosfato disdico en el queso en porciones reducen la
concentracin de cloruro sdico necesaria para que se produzca la toxina. A
temperaturas ms elevadas, por ejemplo a 37C, se necesita ms sal que a una
temperatura ms baja, por ejemplo a una temperatura de 15C. Para inhibir la
multiplicacin de C. botulinum en un medio que rena condiciones apropiadas para ello,
es necesaria una concentracin de sal del 8 por cien o ms.
Un pH prximo a la neutralidad estimula la multiplicacin de C. botulinum. Un pH de 4,5
o de valores ms bajos impedir la produccin de la toxina en la mayora de los
alimentos. Los valores de pH mnimos sealados son 4,87 para las clulas vegetativas y
5,01 para la germinacin de las esporas en el caldo infusin de ternera, 4,8 y 5,0 en el
pan, y 4,8 en el budn de arroz y pia. El valor mximo de pH al cual se encontr
crecimiento vegetativo fue de 8,89.
La temperatura es un factor importante para determinar si tendr lugar la produccin de
toxina y cul ser la velocidad con que se producir. El crecimiento vegetativo tendr
lugar a una temperatura ms baja que la temperatura mnima de germinacin de las
esporas. Las distintas cepas de C. botulinum de los tipos A y B difieren en cuanto a la
exigencia de temperatura. Se ha sealado que unas pocas cepas son capaces de
multiplicarse a temperaturas comprendidas entre los 10 y los 11C, si bien se ha
pretendido que la temperatura mnima a la cual germinan las esporas es de
aproximadamente 15C. Para los citados tipos, la temperatura mxima de crecimiento
es de unos 48C, mientras que para el tipo E es de unos 45C. Los microorganismos de
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tipo E producen gas y toxina entre los 31 y los 45 das a temperaturas tan bajas como la
de 3,3C.
La temperatura ptima para la produccin de toxina y para la multiplicacin de las cepas
proteolticas es de unos 35C, mientras que para las cepas no proteolticas se suelen dar
valores correspondientes a las temperaturas ptimas comprendidos entre 26 y 28C.
Naturalmente que cuanto ms lenta sea la produccin de la toxina, tanto ms se tardar
en obtener cantidades estimables.
Toxicidad
Es generalmente expresada en unidades ratn (U), donde una unidad (U) de la toxina
botulnica es la mediana de la dosis letal intraperitoneal (DL 50) en ratones y es de
aproximadamente 20 unidades / nanogramos (1U = aproximadamente 0,05 ng). La dosis
letal en humanos no se conoce, pero extrapolada a partir de datos de experimentos en
mono, para un humano de 70 kg de peso, sera de 0.09-0.15 picogramos de toxina por
va intravenosa o intramuscular, 0.70-0.90 picogramos por inhalacin y 70 g por va oral.
Un solo gramo de toxina botulnica es suficiente para matar a un milln de cobayas, y
para matar a un ratn de laboratorio es necesario un picogramo de botulina (1
picogramo = 1x10-12 gramos).
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Homogenizador
Jeringas de 1 ml
Centrifuga
Estufa de 25 31C
Tubos de ensayo
Pipetas (2 y 5ml)
Procedimiento:
1. Homogenizar de 4 10g de muestra del alimento mas la misma parte del diluyente
(si es viscosa o compacta la relacin es de o mas).
2. Centrifugar el homogenizado a 1300rpm por 30 minutos.
3. Someter al extracto de sobrenadante o inoculacin intraperitoneal en los ratones
de 20g de peso.
Medios de carne cocida o tripticasa soya glucosa, en tubos de 150 x 15 mm con 4 5 cm de profundidad de medio. O tambin se puede utilizar caldo tripticasa peptona
glucosa extracto de levadura. Incluso se obtuvieron mejores resultados
(particularmente con las cepas tipo E) por la adiccin de tripsina a este medio.
Procedimiento
1. Aadir unos 5g. (5ml) del homogenizado del alimento en tres tubos con medio
(medio carne cocida, medio tripticasa glucosa o caldo tripticasa peptona glucosa
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Preparacin de la muestra
Se esteriliza la lata por donde se va abrir con alcohol y se flamea con cuidado porque las
toxinas son sensibles al calor, se debe observar las caractersticas del envase: si est
hinchado, color. Se mezclan a partes iguales muestra y tampn fosfato,
homogeneizamos y se centrifuga a 3500 rpm durante 30 minutos a 4C, desde esta forma
precipitan todos los slidos y queda sobrenadante claro, en el sobrenadante se detecta
la toxina y en el sedimento se detectan las clulas o esporas.
Sedimento
Se debe trabajar con muestras no calentadas para ver la presencia de toxina E, hacen
falta 3 bateras de tubos con 15 ml de caldo de carne cocida, en tres tubos caliento a
bao a 60C, otros 3 tubos caliento a 80C y otros tres tubos sin calentar. Siembro cada
tubo con 1 ml. de muestra y luego se someten a la misma temperatura durante 30
minutos. En los tubos de 60C y 80C mueren las formas vegetativas y esporas del grupo
E, en los tubos a temperatura ambiente no muere nada. Luego incubamos a 30C durante
5 das, si al cabo de 5 das no hay crecimiento se dejan otros 15 das por si tarda en
germinar, se hace la tincin de Gram y ver si son positivos.
El cultivo se centrifuga refrigerado y obtengo un sobrenadante y un sedimento. A partir
del sedimento se siembra en agar yema de huevo para anaerobios y se incuba a 30C
durante 72 horas. Las colonias de Clostridium son con borde regular rodeadas de
precipitado amarillento debido a la actividad lipoltica que da lugar a cidos grasos que
precipitan son de aspecto nacarado. Se seleccionan las colonias tpicas y se vuelven a
sembrar en caldo de carne cocida o en caldo tripticasa peptona glucosa extracto de
levadura con tripsina. Si se sospecha de esporas E, para activarla incubamos a 25-26C.
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2. Durante el ahumado o despus del mismo, el pescado debe alcanzar una temperatura
de por lo menos 82C durante 30 minutos en la parte ms fra.
3. El pescado debe ser congelado inmediatamente despus de su envasado y se debe
mantener congelado.
4. Todos los envases que contienen pescado congelado deben ser rotulados con la
siguiente advertencia: Perecedero- Mantngase congelado.
IMPORTANTE
Para dar resultados de una muestra de la cual se presume la existencia o no de clostridium
botulinum los parametros a seguir son: La presencia o ausencia de la misma, de haber
presencia el alimento esta contaminado y por lo tanto no debe salir al mercado.
CONCLUSIONES
La toxina botulnica al ser ingerida es mortal por lo que los alimentos deben ser
tratados correctamente.
La intoxicacin comienza con la ingesta del vehculo alimentario, luego las clulas
llegan al estmago, si la contaminacin es grave cierto nmero de microorganismos
atraviesan la barrera fsica y se dirigen a las clulas de los extremos de las vellosidades
del intestino.
El caso de los vehculos alimentarios los ms frecuentes son las carnes, aves y sus
derivados, as como tambin pescado, hortalizas, etc.
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BIBLIOGRAFIA
Centers for Disease Control and Prevention: Botulism in the United States, 1899-1996.
Handbook for epidemiologists, clinicians, and laboratory workers, Atlanta, GA.
Centers for Disease Control and Prevention, 1998.
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