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COMPARACIN DE LAS RESPUESTAS DE CITOCINAS ENTRE LOS PERROS

CON SEPSIS Y PERROS CON ANEMIA HEMOLTICA INMUNO MEDIADA


(IMHA)

RESUMEN
Anomalas de citocinas se han descrito anteriormente en los perros con inmunidad
mediada variada y condiciones inflamatorias tales como IMHA y sepsis. El
propsito de este estudio fue establecer referencias de rangos para los niveles de
citoquinas en los perros y para comparar los niveles de citoquinas en los perros
normal y los con dos enfermedades inflamatorias comunes (sepsis y IMHA). La
hiptesis es que los perfiles de respuesta de citoquinas en los perros con sepsis
sera significativamente diferentes de los de los perros con IMHA debido a las
diferencias etiologcas de las dos enfermedades.
Las concentraciones de 14 diferentes citocinas en suero fueron medidos y los
valores agrupados de acuerdo a la funcin de las citocinas. El suero de perros
clnicamente normales se utiliz para establecer intervalos de referencia de
concentracin de citoquinas. Los valores de rango para cada uno de los 4 grupos
de citoquinas fueron comparados estadsticamente entre el control sano, sptico y
perros IMHA.
Este anlisis revel diferencias en los grupos de citoquinas entre los perros con
sepsis y con IMHA en comparacin con los perros de control sanos, pero ninguna
diferencia entre los perros con cualquiera de estas condiciones. En conclusin,
perros en la etapa temprana de la sepsis y IMHA tienen citocinas circulantes
similares a pesar de diferente etiologas que sugiere la activacin de las vas
inmunolgicas comunes. Esto puede tener implicaciones para la inmunoterapia de
las enfermedades inmunes mediadas en perros de etiologa variable

INTRODUCCION
La inmunopatognesis de la sepsis, el sndrome de respuesta inflamatoria
sistmica (SIRS), y la anemia hemoltica inmuno mediada (IMHA) en los perros se
cree que se parece a la de las enfermedades anlogas en los seres humanos. Por
ejemplo, la desregulacin de citoquinas es conocido por ser importante para la
disfuncin inmune caracterizado por la sepsis y SIRS en los perros y los seres
humanos.
La desregulacin de las citoquinas se ha documentado en IMHA en los seres
humanos, y las anomalas de citoquinas similares fueron reportados recientemente
en perros con IMHA.

La anemia hemoltica inmuno mediada (IMHA) es una enfermedad devastadora


de los perros que se caracterizan por un proceso de enfermedad auto-inflamatoria
que conduce a la destruccin inmunitaria de los eritrocitos por anticuerpos antieritrocitos. Esta enfermedad registra un pronstico reservado en perros y altas
tasas de mortalidad. Se han propuesto diversas etiologas subyacentes incluyendo
la vacunacin, medicamentos, infeccin viral o bacteriana y procesos neoplsicos,
aunque hay pocas pruebas de que cualquiera de los eventos es causal.
AHIM en perros difiere clnicamente de las enfermedades anlogas en humanos,
la anemia hemoltica autoinmune (AIHA). Por ejemplo, AIHA los seres humanos
es una enfermedad rara y la mayora de los casos son secundarios a otras
enfermedades tales como trastornos linfoproliferativos u otras enfermedades
autoinmunes. Los experimentos en modelos animales sugieren que la inflamacin
secundaria a la infeccin u otras causas, pueden desempear un papel ms
importante en la estimulacin de la AIHA lo que actualmente es reconocido. La
patognesis de la sepsis en los perros parece paralela a la enfermedad en los
seres humanos con tasas similares a la mortalidad en los perros.
La sepsis se define como una infeccin sistmica acompaada de una respuesta
inflamatoria y, como tal, abarca una amplia gama de enfermedades y respuestas
fisiolgicas. La evaluacin de los perfiles de citoquinas en las personas con sepsis
ha demostrado una respuesta pro-inflamatoria exuberante inicial seguida de una
respuesta anti-inflamatoria compensatoria que resulta en la supresin inmune. La
Evaluacin de las citocinas en los perros con sepsis ha demostrado similares
tendencias. Pocos estudios han documentado las anomalas de citoquinas
presente en los perros con IMHA o perros con sepsis. Documentacin de las
anomalas de citoquinas en los perros es an ms complicada por la falta de los
rangos normales indicadas para las concentraciones de citoquinas en animales
sanos. Por lo tanto, se realiz un estudio transversal para establecer un rango
normal para los valores de citocinas en una poblacin de perros normales y
comparar los perfiles de respuesta de citoquinas de los perros con sepsis y perros
con IMHA primaria. El presente estudio se realiz tambin para caracterizar los
perfiles de citoquinas en los perros con sepsis y AHIM y comparar estos dos
procesos patolgicos mediados inmunes.
2. Materiales y Metodos
2.1. Estudio de animales
Perros adultos sanos de control se obtuvieron de perros de propiedad personal
(n=47) y perros de propiedad de los estudiantes de veterinaria se practic una
prueba del parsito del corazn (N = 15) en la Universidad Estatal de Colorado
Veterinaria, hospital de enseanza.
Los criterios para la seleccin de perros sanos incluyeron la ausencia de
problemas mdicos conocidos o enfermedad grave previa en los ltimos 6 meses,

examen fsico normal y ausencia de tratamiento con cualquier medicamento


teraputico. Se obtuvo consentimiento de propietarios antes de alistarse en el
estudio.
Se realiz hemograma completo y anlisis de bioqumica srica en los perros de
propiedad personal (47). Diecisis perros fueron excluidos de este grupo basado
en la historia de la enfermedad, la terapia mdica actual o CBC o anormalidades
bioqumicas en suero.
Los 15 perros sanos que participaron en el estudio del gusano del corazn
recibieron slo un recuento sanguneo completo. Se excluyeron dos perros de este
grupo basndose en las anomalas encontradas en el recuento completo de
glbulos rojos.
Los perros de los dos grupos de perros sanos fueron
aleatoriamente asignado a ser incluidos en el grupo utilizado para establecer la
normalidad rangos de referencia de citoquinas (n = 40) o al grupo de comparacin
utilizado a perros con IMHA y sepsis (n = 22).
Los perros con IMHA primaria evaluados en la CSU-VTH eran inscritos en el
estudio basado en la presencia de anemia (envasados volumen celular PCV
<30%), y, o bien una solucin salina de aglutinacin en portaobjetos positiva
prueba o la presencia de esferocitosis en un frotis de sangre y ambos. Los
pacientes fueron excluidos del estudio si no se identific ningn proceso
subyacente que podra ser una causa potencial de AHIM secundaria, incluida la
neoplasia, infeccin por rickettsias, la medicacin reciente o vacuna. Este grupo
constaba inicialmente de 14 perros, de los cuales 4 fueron considerados no
elegibles debido a otros procesos de enfermedades concurrentes
Los perros seleccionados para su inclusin en el grupo de sepsis bacteriana eran
sobre la base de la evidencia clnica de una respuesta inflamatoria sistmica y
evidencia documentada de infeccin bacteriana. El diagnstico del sndrome de
respuesta inflamatoria sistmica (SIRS) se determin por la presencia de 3 de
cada 4 de los siguientes criterios:

frecuencia cardaca> 120 latidos por minuto


frecuencia respiratoria> 40 respiraciones por minuto
temperatura <100.4 F o> 104 F,
recuento de glbulos blancos> 18.000 clulas /? L, <5000 clulas /? L o>
10% de neutrfilos banda.

La infeccin bacteriana fue confirmada con un cultivo bacteriano positivo de una


cavidad corporal, una herida abierta o deteccin de la presencia de bacterias
intracelulares durante la evaluacin citolgica de un derrame. Los 11 perros
inicialmente evaluados para posible inscripcin, fueron determinadas para ser
elegibles para su inclusin.
2.2. Anlisis de laboratorio

Las muestras de sangre se obtuvieron y se centrifugaron dentro de 1 h de


coleccin. El suero se congel a -80 C y los anlisis de citoquinas realizaron en
mltiples muestras simultneamente.
El anlisis de citoquinas Multiplex se realiz usando un canino ensayo mltiple de
cuentas Este ensayo ha sido utilizado anteriormente para cuantificar las
concentraciones de citoquinas en los perros
Las 13 citoquinas medidos por este ensayo incluyen IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL10, IL-15, IL-18, la protena inducible de interfern (IP) -10, factor de necrosis
tumoral alfa (TNF) , factor estimulante de macrfago.. (GM-CSF), factor
quimiotctico de los queratinocitos (KC),y la protena quimiotctica de monocitos
(MCP) -1. Los ensayos fueron segn las instrucciones del fabricante.
Las concentraciones de IFN no se incluyeron en los resultados como el Luminex
ensayo multiplex fue incapaz de detectar IFN canina en el suero (datos no
mostrados). Las concentraciones sricas de TGF fueron determinados el uso de
un TGF-humano comercial, el kit ELISA, de acuerdo a las instrucciones del
fabricante. TGF canina y humana ha informado anteriormente ser idnticas en el
nivel de aminocidos..
Anlisis mltiplex de citoquina se realizaron segn el fabricante instrucciones para
generar una curva estndar de reactivos de concentraciones conocidas para cada
una de las 13 citoquinas siempre en el kit. Se generaron curvas estndar usando
la citocina normal con matriz de suero aadida a los pocillos estndar. Una curva
estndar de adicional se gener utilizando los estndares del citoquina con la
adicin de suero de perro normal en lugar de la matriz de suero suministrada con
el kit. Estas curvas fueron comparadas para todas las citocinas y fueron
encontradas para ser aproximadamente equivalentes para todas las citoquinas 13
medidas.
2.3. Anlisis estadistico
2.3.1. Determinacin de rangos normales
Los perros sanos (n = 62) se seleccionaron como se describe anteriormente para
uso en este estudio. Para derivar valores de referencia para cada citoquina de
inters, 40 de estos perros normales fueron seleccionados al azar utilizando un
nmero aleatorio generador, reservando los 22 perros restantes para la
comparacin con la poblacin de estudio de los perros con IMHA y sepsis.
Como los datos no eran normalmente distribuidas, valores normales fueron
basadas en porcentajes con todos los valores de menor o igual al 90 % que
considerado normal para los propsitos de este estudio. (Tabla 1) El 90%
representa el punto de corte que minimice la clasificacin de perros normales y
mnimamente afectadas por la clasificacin de anormales.

2.3.2. citoquinas anlisis


Citoquinas medidas de tres grupos de pacientes (22 sanos, 10 con IMHA y 11
sptico) fueron utilizados en este anlisis. Los datos fueron introducidos en una
hoja de clculo, validado y explorado utilizando estadstica descriptiva. Citocinas
se categorizaron en cuatro paneles basados en importancia biolgica:

Panel 1 incluye la quimioquinas MCP-1, KC, IP-10 y el interleuquinas (IL) -8;


Panel 2 incluy pro-inflamatorias citoquinas IL-6 e IL-18.
Panel 3 incluye las citoquinas antiinflamatorias IL-10 y TGF-.
Panel 4 incluyen las producidas por las clulas T, citocinas IL-2, IL-4, IL-7 y IL15.

Una puntuacin de Panel fue derivado para cada perro normal (n = 22), para cada
perro con sepsis (n = 11) y para cada perros con IMHA (n = 10). Se desarroll un
Panel de puntaje asignando un "1" a cada perro con una elevacin en la
concentracin de citoquinas y un "0" a cada perro con una concentracin normal,
basada en el derivado previamente rangos normales descritos arriba. Para cada
perro, estos puntajes fueron agregados para cada panel, determinando un Panel
de puntaje para cada uno de los 4 paneles de citoquina, para cada perro en el
estudio. En general las diferencias en las puntuaciones de Panel entre los grupos
(normal, sepsis y IMHA) se determinaron utilizando una prueba de Kruskal-Wallis.
Si hubo una diferencia estadstica significativa, entonces pares comparaciones se
realizaron mediante una prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney Rank Sum. Un-valor
de P 0.05 fue considerado como estadsticamente significativo. El anlisis
estadstico fue realizado utilizando el software de la v9.3 SAS.

RESULTADOS/ DISCUSION
81 perros fueron incluidos en este estudio; 62 perros sanos, 10 con IMHA y 11 con
sepsis. Un amplio rango de razas y edades fueron representados, sin edades
estadsticas diferentes entre grupos. 71% de los perros que presentaban sepsis
(8-11) murieron o se les aplico la eutanasia debido a mostraban sntomas graves.
Los perros restantes (3) sobrevivieron hasta que fueron dados de alta. 2 de los 10
perros (20%) del grupo con IMHA murieron o se les aplico la eutanasia antes de
ser dados de alta. 8 perros en el grupo IMHA sobrevivieron. Sin embargo dos de
los perros que presentaban IMHA murieron o se les aplico la eutanasia despus
de dos semanas de haber sido dados de alta debido a complicaciones asociadas a
IMHA. Todos los perros que presentaban IMHA en este estudio, presentaron SIRS
segn el criterio estndar mencionado en los materiales y mtodos. Los valores de
referencia normales para citoquinas se basaron en el 10-90% de los valores de
cada citoquina. Estos valores fueron usados para comparar los resultados
obtenidos con los perros que presentaban IMHA y sepsis (Tabla 1).

Los paneles individuales de citoquinas se compararon entre perros sanos, perros


con IMHA y perros con sepsis (Fig. 1a-d). Cada citoquina fue descrita en cada
grupo (perros sanos, perros con IMHA y peros con sepsis, Tabla 2), sin embargo
estas no se compararon debido a que existe una insuficiencia en la comparacin
mltiple correcta. En este estudio las concentraciones de cerumen de 14
citoquinas diferentes fueron medidas en perros saludables, perros con IMHA y
perros con sepsis. Estas citoquinas fueron evaluadas y agrupadas de acuerdo a
su funcin. El panel o tabla de citoquina 1 estaba constituido por quemoquinas,
MCP-1, IL8, KC y IP-10. El panel o tabla de citoquinas 2 inclua las citoquinas proinflamatorias tales como IL6 y IL-18. Las citoquinas del panel 3 incluan las
citoquinas anti-inflamatorias tales como TGF y IL-10. El panel de citoquina 4
inclua clulas T derivadas de las citoquinas: IL-2, IL-4, IL-7 y IL-15. Interferones
gama no fueron incluidos en el anlisis ya que estos no podan ser ledos en
caninos. Cuando los patrones de INF gama fueron suministrados mediante un kit
al cerumen normal canino las citoquinas se volvieron indetectables. Los patrones
de TNF fueron detectados en el cerumen canino, sin embargo no fueron
detectados en ninguna muestra analizada. GM-CSF no fue incluido en los paneles
ya que no se ajustaba a ninguna de las categoras y adems no haba suficientes
muestras para analizar.
Como era de esperarse, los perros que padecan IMHA o sepsis, presentaban
concentraciones en el panel 1 (quemoquinas, p < 0.0001), panel 2 (citoquinas proinflamatorias, p=0.001), panel 4 (clulas T derivada citoquinas, p= 0.0004)
mayores comparadas con las concentraciones de citoquinas en perros sanos.
Sorprendentemente los valores de las citoquinas del panel 3 (citoquinas antiinflamatorias) no mostraron diferencias significativas entre perros sanos y perros
con IMHA o sepsis (p=0.069). Incluso ms inesperado, se encontr que los perfiles
de las citoquinas en el panel 4 fueron estadsticamente indistinguibles entre los
perros con IMHA y perros con sepsis (p 0.003) (Tabla 3).
Existen varias explicaciones posibles para que existan respuestas tempranas de
citoquinas similares entre los perros que presentaban alguna de las dos
enfermedades inflamatorias (IMHA y sepsis) con diferente etiologa. Por un lado,
las respuestas tempranas en ambos procesos, puede desencadenar respuestas
similares. Por ejemplo, la liberacin temprana de citoquinas como el TFN- es la
causante o la que inicia una respuesta en ambos casos (IMHA y sepsis), sin
importar la causa inicial, por ende la respuesta de las citoquinas ser similar.
Alterativamente, una vez el proceso de enfermedad est en marcha, las
respuestas inmunes convergen en similares respuestas inflamatorias. No
estuvimos en la capacidad de identificar TNF en ninguna de nuestras muestras.
Esto puede ser debido a que esta citoquina es liberada en el perido inicial del
proceso inflamatorio causando que est presente su mayor pico de accin por
ende en el momento que estos estaban en tratamiento no mostraron presencia de
estos.

Tal vez la mayor sorpresa fue que la respuesta de las clulas T derivadas de las
citoquinas fueron muy similares tanto en lo perros con IMHA y sepsis,
particularmente porque IMHA es considerada como una enfermedad conducida
principalmente por clulas T auto- reactivas, mientras que la sepsis es
considerada una enfermedad que es conducida por las respuestas del sistema
inmune. Actualmente podemos proveer una explicacin no convincente del porque
las respuestas de las clulas T citoquinas eran tan parecidas. Es tentador
especular que tal vez IMHA en perros no es impulsado o conducido por clulas T
auto reactivas pero puede en vez representar una manifestacin inusual de una
enfermedad infecciosa. Por ejemplo, hay una caracterstica nica en los perros
con IMHA (fuerte estacionalidad, rpida aparicin de la enfermedad, fuerte
asociacin con alteraciones de la coagulacin, alta tasa de mortalidad) que
sugiere un proceso infeccioso en vez de un proceso de anti-inmunidad, como es
descrito por otros autores (Balch and Mackin, 2007a; Karagianni et al., 2012; Kidd
et al., 2014). En contraste, el proceso hemoltico anti-inmune en humanos es
generalmente considerado ms como una enfermedad crnica con fuertes
anormalidades sistmicas. En perros, si tanto la sepsis como IMHA fueran
desencadenadas por un patgeno infeccioso, esto podra explicar las similitudes
existentes entre las respuestas de las citoquinas de ambas enfermedades.
Tambin existen numerosas similitudes clnicas entre perros con IMHA primario y
perros con sepsis. Estos incluyen una irregularidad significativa inmunolgica,
presencia de coagulacin anormal, rpida presencia de enfermedades clnicas,
fiebre, cantidad de neutrfilos y monocitos anormales y alta tasa de mortalidad.
Este anlisis de los signos clnicos puede sugerir la posible presencia o muestra
de una patognesis similar entre las dos enfermedades. As que no puede dejar
de mencionarse que IMHA representa una manifestacin de inflamacin aguda
sistmica desencadenada por un patgeno desconocido. La concentracin de
citoquina ha sido examinada exhaustivamente en pacientes humanos con sepsis y
en modelos de animales, ambos como indicadores de pronstico y blancos
potenciales de inmunoterapia. El desarrollo reciente de anlisis multiples de
citoquinas permite la determinacin rpida y simultanea de varias citoquinas a
partir de una pequea muestra de sangre. Se ha demostrado en humanos, que
existen diferentes perfiles de citoquinas en pacientes con shock sptico que lo
presentes en pacientes con sepsis severa. La habilidad de monitorear perfiles de
citoquinas seriales en perros con un cuadro clnico crtico puede proporcionar
oportunidades para inmunoterapia individualizada al igual que proveer informacin
de diagnstico.
Se ha demostrado que las citoquinas anti-inflamatorias juegan un papel en la
patognesis tanto de la anemia mediadora inmune como de la sepsis en humanos,
incrementando la concentracin de IL-9 en ambas enfermedades observadas. Sin
embargo, esperbamos detectar un incremento en la concentracin de IL-10 y de
TGF en perros con IMHA y en perros con sepsis. A pesar de esto no se

presentaron diferencias significativas entre los paneles 3 de citoquina entre los 3


grupos de perros (sanos, IMHA y sepsis). Este hallazgo podra ser explicado si las
muestras de cerumen hubieran sido tomadas para el anlisis de citoquina durante
el inicio del proceso de la enfermedad, antes de que se desarrollara la respuesta
inmune. Alternativamente, los perros pueden mostrar una respuesta inmune autoreguladora ms dbil que otras especies, o respuestas dominadas por otras
citoquinas (IL-12, IL-1RA) que no estn registradas en nuestros anlisis multiplex.
Un reciente estudio desarrollado por Kjelgaard-Hansen et al. Describe la
concentracin de citoquinas en perros con IMHA encontrando una asociacin
entre las concentraciones de MCP-1 y IL-18 y el incremento en la tasa de
mortalidad. Este estudio tambin reporta elevaciones en IL-2, IL-10, KC y MCP-1
en perros con IMHA al ser comparados con perros normales. Nuestro estudio
tambin documenta el incremento en las concentraciones en los paneles que
incluyen IL-2, KC y MCP-1 en perros con IMHA. Sin embargo, el incremento en las
concentraciones de IL-10 no fue medido o identificado en nuestro estudio. Estas
diferencias insignificantes encontradas en el estudio pueden reflejar nuestra
decisin de comparar grupos de citoquinas con funciones similares, en vez de
comparar cada citoquina como tal. Algunas de las limitaciones que presenta este
artculo incluyen pequeas muestras, lo que no permite el anlisis de pares de
citoquinas especficas. Las posibilidades de tener un error al realizar multiples
comparaciones ente pequeas muestras son enorme, lo que incrementa el riesgo
de reportar diferencias que tal vez no existan. Por lo tanto, decidimos agrupar las
citoquinas de acuerdo a su funcin. En adicin, la clasificacin de las citoquinas
en grupos puede variar los resultados estadsticos. La mayoria de las citoquinas
cumple multiples funciones. Por ejemplo la IL-8 tiene como funcin atraer
neutrfilos por ende es considerada como una citoquina inflamatoria, en adicin a
esto es considerada tambin una quemoquina (Andaluz-Ojeda et al., 2012). Por lo
tanto la IL-8 se ha tomado como parte del panel 1 y del panel 2. Esto podra
confundir la interpretacin de los paneles de citoquinas respecto a la patognesis
de la enfermedad. El tiempo de recoleccin de muestra desde el comienzo del
proceso de la enfermedad IMHA y sepsis tambin puede influir en la concentracin
de citoquinas. Sin embargo, a ambos grupos de perros, tanto los que presentaban
IMHA como sepsis, se les realizo la toma de muestra lo ms rpido que fue
posible, una vez la enfermedad fue diagnosticada, aproximadamente 24 hr
despus del diagnstico.
Para discusiones posteriores respecto a la inmunopatogenesis de IMHA, estudios
adicionales son necesarios. Por ejemplo, sera interesante comparar los perfiles
de citoquinas de perros con IMHA con otros perros que presenten otras
condiciones inmunolgicas tales como la trombocitopenia o Poliartritis. Tambin
sera de gran ayuda comprara perros con IMHA con un grupo ms estandarizado
de perros con sepsis, por ejemplo perros con piometra o perros con neumona
bacteriana. Finalmente, comparacin de perros con IMHA con perros que

presenten otras condiciones pro-inflamatorias causantes de anomalas en la


produccion de citoquinas.