Practica N 1,2,3 y4 Tincin de Gram y Tcnicas de siembra

Objetivos
Familiarizarse con la siembra de
hongos y bacterias y su observacin
macroscpica y microscpica.
B. Observar
montajes
de
placas,
tanto preparaciones en fresco como
coloreadas.
C. Realizar diferentes coloraciones para
identificar
tipos morfolgicos de hongos y
bacterias
D. Reconocer las diferentes formas
celulares microscpicas bacterianas y
de hongos.

ttradas,
estreptococos.

A.

1.

Introduccin
OBSERVACIN
MICROSCOPIO:

AL

La preparacin en fresco, permite

observar en los microorganismos la
movilidad, el color, el tamao, la forma
y la agrupacin en su forma natural
viva y sin alteraciones. Sin embargo, la
observacin es difcil debido al escaso
contraste, por la poca diferencia entre
el ndice de refraccin del medio y de
los microorganismos.
Una forma de preparacin en fresco es
aquella en la que se utiliza porta y
cubreobjetos.
Otra forma de aumentar el contraste y
observar
estructuras
importantes
es
la
utilizacin de coloraciones.
Morfologa
bacteriana:
Aun cuando existe un nmero enorme
de bacterias que pueden desarrollarse
en una gran diversidad de hbitats, su
morfologa puede agruparse en tres
formas bsicas: Los cocos (redondos),
los bacilos (alargados) y los espirilos
(en forma helicoidal de sacacorchos).
Adems en el caso de
las bacterias
esfricas
se
pueden
distinguir
agrupaciones
como
diplococos,

La

estafilococos

Preparaciones
para
observar
morfologa bacteriana:
morfologa de los microorganismos
se puede examinar
siguiendo
dos
rutas:
observando
las

preparaciones en fresco (sin colorear, por

ejemplo para observar protozoos algas e
incluso bacterias) y preparando extensiones
delgadas llamadas frotis que se
fijan y
colorean. El resultado de la fijacin es la
coagulacin del protoplasma lo que preserva
la morfologa, adems de que permite la
adhesin de la muestra en el portaobjetos.
Los agentes de fijacin ms utilizados son el
calor, el alcohol y varios compuestos
qumicos. El ms empleado para las tinciones
bacterianas es el calor.
Por otro lado, las bacterias son prcticamente
transparentes, por ello no es recomendable
su estudio mediante la observacin de
preparaciones en fresco. El empleo de
colorantes permite aumentar el contraste
entre la clula bacteriana y el medio
ambiente y a travs del empleo de tcnicas
especiales, es posible distinguir algunos de
los constituyentes celulares ms importantes.
Cualquiera sea el procedimiento de tincin,
ste produce la muerte de la clula.
La mayora de los colorantes son compuestos
orgnicos que tienen una afinidad especfica

por los diferentes componentes celulares.

Los colorantes pueden dividirse en tres
grupos: Bsicos o catinicos, cidos o
aninicos, y Liposolubles.
Por otro lado las tinciones pueden ser
simples o diferenciales. Tincin simple en la
que se utiliza un solo colorante y diferencial
aquella que se basa en la aplicacin de ms
de un colorante en etapas sucesivas.
OBSERVACIN MACROSCPICA DE LAS
COLONIAS DE BACTERIAS:
Una colonia est formada por gran nmero
de bacterias que crecen sobre un medio
slido, que se pueden observan a simple
vista. En el proceso de formacin de las
colonias, se supone que cada una de ellas
viene de una clula individual, por lo que, la
colonia representa un clon de un cultivo
puro. Despus de la incubacin, la forma de
la colonia y del borde o margen se puede
determinar observndola sin necesidad de
instrumentos pticos. Otras caractersticas
apreciables se refieren a la elevacin, el
color y la consistencia. Dichas caractersticas
se encuentran resumidas en la siguiente
figura.

Form
a
Puntiforme Circular
Irregular
Rizoide

Filamentosa
Huso o Eje

Elevaci
n
Plana

Elevada

Convexa

Pulvinada Acuminada/ Umbonada

Borde
Entero
Ondulado Lobulado
Filamentoso Enrollada

Crenada

Caractersticas
pticas: Opaco, no permite el paso de la luz. Translcido, permite el paso de la luz sin
dar una visibilidad completa de objetos vistos a travs de la colonia. Opalescentes, se
asemeja el color de un palo.
Iridiscente, exhibiendo los colores de arco iris. Mate, no satinado o brillante. Brillante,
brillante o no mate.
Consistencia: Cremosa, como mantequilla. Viscosa, se estira la colonia formando un
filamento mucoso una vez se
retira el asa de punta. Membranoso, crecimiento tipo membrana, delgada. Quebradizo,
crecimiento seco.
Textura: Homognea, granular o en suspensin membranosa
Pigmentacin o color: Blanco, ocre, amarillo claro, amarillo paja, amarillo profundo,
rosado, rojo, etc. El color depende mucho del medio de cultivo en el que se haya sembrado
el microorganismo ya que este responde a los
elementos del medio.

Figura 1: Caractersticas macroscpicas de las colonias bacterianas al crecer sobre

medio slido. Fuente: Modificado
de HarleyPrescott. 2002.

OBSERVACIN MACROSCPICA DE
LAS COLONIAS DE HONGOS:
Los
hongos
son
seres
vivos,
hetertrofos, carentes de clorofila,
descomponedores de materia orgnica
y formadores de esporas. Algunos se
reproducen sexual y asexualmente. Se
dividen en hongos macroscpicos y
microscpicos, los cuales se pueden
ver a simple vista como mohos y
levaduras.
La
mayora
de
los
hongos
estn
constituidos por finas fibras llamadas hifas,
que contienen un protoplasma, a menudo
divididas por tabiques llamados septos. En
cada hifa hay uno o dos ncleos y el
protoplasma se mueve a travs de un
diminuto poro que ostenta en el

centro de cada septo. Existe sin embargo,

un grupo de hongos, que se asemejan a
algas, cuyas hifas generalmente no tienen
septos y los numerosos ncleos estn
esparcidos por todo el protoplasma. Las
hifas crecen por alargamiento de las puntas
y tambin por ramificacin. La proliferacin
de hifas, resultante de este crecimiento, se
llama micelio. Cuando el micelio se
desarrolla puede llegar a formar grandes
cuerpos fructferos. Otros tipos de enormes
estructuras de hifas permiten a algunos
hongos sobrevivir en condiciones difciles o
ampliar sus fuentes nutricionales, de un
ambiente a otro. Ciertos hongos forman
masas de micelio resistentes, con forma
ms
o
menos
esfrica,
llamadas
esclerocios. stos pueden ser pequeos
como granos de arena, o grandes como
melones (Arcos et al., 2009).

2.
Materiales
Llevar siempre al laboratorio:
Bata blanca de laboratorio. Manga larga.
Gorro.
Guantes de nitrilo
Tapabocas
Marcador sharpie
Toallas de papel
Cinta de enmascarar
Material de laboratorio para esta
prctica:
Cajas de Petri con medios de cultivo (Agar
nutritivo y
PDA)
Asas de Inoculacin: recta y redonda
Solucin salina
Kit para tincin de gram
Lminas o portaobjetos
Laminillas o cubreobjetos
Pipetas pasteur
Papel de arroz
Microscopio
Mechero
Cultivos de hongos y bacterias
3. Procedimiento
El profesor proporcionar cultivos puros de
bacterias, levaduras y hongos.
Se practicar la tcnica de aislamiento por
estra o
agotamiento a partir de muestras de
bacterias y levaduras aisladas en
cultivo puro.
Tambin se har siembra por puncin de
hongos.
A parte se harn lminas para observar al
microscopio:
- De hongos y bacterias con azul de
lactofenol
- De bacterias para hacer tincin de gram
A. PARA BACTERIAS
1. Hacer la observacin macroscpica de
cada una de las cepas bacterianas segn el
cuadro: caractersticas macroscpicas de
las colonias bacterianas.
2. Hacer la observacin microscpica de
cada una de las
bacterias
as:

5. Extender la gota de suspensin en

un
rea no de las lminas por Frotis
Preparacin
fijo:
1.
En una lmina portaobjetos limpia y
marcada, colocar una gota de agua
destilada pequea.
2. Destapar la caja de Petri cerca
al mechero
3. utilizando el asa bacteriolgica estril:
quemar al mechero y enfriar en un borde
del medio de cultivo y coger el inculo.
4. Suspender en la gota el inoculo
bacteriano,

2.
superior a dos centmetros cuadrados,
Materiales
usando el asa o con la ayuda de otra
lmina.
6. Dejar que la preparacin se seque al aire
o Fijar con calor, fameando rpidamente
por tres veces seguidas a travs de la
llama del mechero: Tenga Cuidado de
No quemarse porque LA LMINA SE
CALIENTA.
7. Colorear segn protocolo para la tincin
de gram.
Tincin de Gram (slo para bacterias)
1. Preparar un frotis segn se indic en la
seccin anterior. Cubrir totalmente el frotis
con unas pocas gotas del colorante cristal
violeta, dejar un minuto.
2. Descartar en la rejilla con bandeja el
exceso de
colorante. Enjuagar con
agua.
3. Agregar algunas gotas del reactivo lugol
para cubrir la preparacin totalmente,
dejar por un minuto.
4. Descartar el exceso de lugol. Enjuagar con
agua.
5. Realizar la decoloracin con la mezcla
alcohol- acetona al 3%, por
30
segundos. Lavar inmediatamente con agua
suavemente.

5. Extender la gota de suspensin en

un
rea noel colorante fucsina o safranina
6. Agregar
dejar un minuto. Lavar con agua como se
ha indicado y dejar secar.
7. Observar con objetivo de 40X y despus
con el de
100X COLOCAR aceite de inmersin
sobre la laminilla. Despus De esto,
no puede volver a verla en los otros
objetivos, a no ser que se limpie muy
bien con papel.
Esquematice lo observado para cada una de
las cepas bacterianas que se le dio, as:
Nombre de
bacteria
Medio en la que
est sembrada:

Descripcin
macroscpica
Colonia borde,
forma, elevacin

Objetivo
empleado:
Tcnica de siembra por estra o
agotamiento
(para bacterias y levaduras)

a) En la parte posterior y exterior

de
la caja,
dividirla
en cuatro cuadrantes. Tomar
una muestra con el asa previamente
fameada y fra. Inocular la muestra
haciendo 45 estras simples muy
juntas de lado a lado sobre el primer
cuadrante de la caja, cerrar la caja.
b) Flamear el asa de inoculacin y
hacer girar la caja de petri un cuarto de
vuelta. Abrir nuevamente la caja y
enfriar el asa de siembra tocando la
superficie del medio lejos de la zona de
estras recin hechas.
c) Rozar con el asa una vez la
superficie del conjunto original de
estras y hacer un segundo (grupo de
estras en el segundo cuadrante como
en el caso anterior.
d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el
tercer cuadrante y al efectuar la
siembra en el ltimo cuadrante. No se
deber famear el asa de siembra y se
har una estra ms abierta (simple).

Figura 2. Cuatro pasos para la

inoculacin por estra en caja de petri
con asa redonda (Elaborado por: Laura
Afanador).
Condiciones de Incubacin
1. Incubar las cajas
Invertida a 35C37C durante 24
horas.

en

forma

B. PARA HONGOS MICELIALES Y

LEVADURAS
1. Tome una caja de petri con cada uno
de los hongos cultivados y observe
detenidamente
su
forma
de
crecimiento, su morfologa en placa.

b. Coloque sobre el portaobjetos una

gota de
Descrbalos de acuerdo con: el color, la
textura y la forma.
2.

Hacer la observacin
microscpica as:
a. Esterilice el estilete o asa de
punta especial para hongos, y
luego djelo enfriar

a) En la parte posterior y exterior

de la caja,
lactofen
ol
c. Destapar la caja de Petri cerca al mechero
d. Con el estilete tome una parte del cultivo
del hongo a observar, (procure no tomar
mucho medio del cultivo) y colquelo
sobre la gota del colorante.
e.
Aydese a despegar el micelio del asa
con la laminilla o con otra asa estril
f. Cubra el preparado con el cubreobjetos
g. Presione suavemente el cubreobjetos con
el mango del estilete o un borrador de
lpiz, haciendo ligera presin, sin daar la
muestra.
h. Observe al microscopio, enfocando
primero en 10X,
luego utilice el objetivo
de 40X.
Observacin de levaduras con azul
de lactofenol
a.
Agregue una gota de azul de lactofenol
en el centro de una lmina o portaobjetos
b. Destapar la caja de Petri cerca al mechero
c. Tome con un estilete o un asa redonda
una muestra del cultivo de levaduras y
colquelo sobre la gota del colorante.

b. Coloque sobre el portaobjetos

gotaCubra
de la muestra con una
d.
laminilla e. Observe en 10X y
luego en 40X

una

Dibuje las estructuras microscpicas

observadas (hifas, micelio, esporas) en
cada uno de los montajes realizados para
tal fin e indique a que hongo pertenecen
en el siguiente cuadro:
Nombre de hongo Descripcin
Medio en la que
macroscpi
est sembrado:
ca
Colonia
color,
textura, forma

Objetivo
empleado:10x o
40X la levadura observada con azul de
Dibuje
lactofenol y dibuje:

D. La coloracin de Gram es una tincin de

qu
y por
B. tipo
Para
qu se usa una tincin simple y una

Nombre de levadura
Medio en la que est
sembrado Descripcin
macroscpica: Colonia
color, forma, textura

diferencial?,
cul de stas es ms apropiada para la
observacin de bacterias?
C. Qu otro tipo de tinciones existen?

Objetivo 10X o
40X
Tcnicas de siembra por puncin
(para hongos miceliales):
Con el asa recta esterilizada al mechero,
coger un
poco del hongo crecido en la caja de Petri
dada por el profesor (si es necesario
coger un pedazo pequeo de agar o
medio de cultivo con hongo); y pinchar
en el centro del medio de cultivo en la
caja de Petri que se va a inocular o en
donde
se
pondr
a
crecer
este
microorganismo.

Figura
3.
Siembra
por
de mohos
(Elaborado
por:
Laura
Afanador).

puncin

Condiciones de Incubacin
1. Incubar las cajas en forma Invertida a
25C- 28C
durante 5-7 das.
2. Recuerde Marcar Adecuadamente las
Cajas:
Grupo,
Fecha,
Cultivo,
Organismo Sembrado y Nombres de
ustedes.

Cuestionario:
A.

Defina cada uno de los 3 grupos en los

que se dividen los colorantes.

qu?
La fucsina es el ltimo colorante que se
adiciona en la coloracin de gram, por qu?
F.
Cul es el fundamento en la que se basa
la coloracin
de Gram?
G.
Indique la importancia ecolgica o una
caracterstica especfica de cada una de las
cepas con las que se trabaj: tanto de
bacterias como de hongos y levaduras.
E.

I.- Como se pesan las bacterias?

J.- Medios de cultivos y para que bacterias se
utilizan?
6. Bibliografa

D. La coloracin de Gram es una tincin de

qu
tipo y por
Annimo.
Manual de bioseguridad laboratorio
de biotecnologa. 2004. Universidad Nacional,
Medelln.
Arcos, Y., Garca, Y., Polanco, D., Vsquez, C.
2009. Manual de Prcticas Microbiologa
general
y
laboratorio.
Universidad
de
Antioquia, Medelln.
Brock. Madigan Michael T., Martinko John M.,
Parker
Jack.
2006.
Biologa
de
los
Microorganismos. 10 edicin. Pearson
HarleyPrescott.
2002.
Laboratory
Exercises in Microbiology, Fifth Edition.
III.
The McGrawHill Companies. Exercises 1, 6,
7, 8, 9 ,10 y 11.