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DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCIN POR VIH (VIH-1 y VIH-2)

INDICE
1.

SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR PREDICTIVO DE LAS PRUEBAS


6T

DIAGNSTICAS
2.

MARCADORES INMUNOLGICOS Y VIROLGICOS DURANTE LA INFECCIN


6T

6T17

POR VIH
3.

PRUEBAS DIAGNSTICAS Y PRUEBAS DE CRIBADO

4.

MTODOS DIAGNSTICOS DE LA INFECCIN POR VIH (INDIRECTOS Y


6T

DIRECTOS)
5.

DIAGNSTICO SEROLGICO POR DETECCIN DE ANTICUERPOS FRENTE


6T

EL VIH
5.1. PRUEBAS SEROLGICAS DE CRIBADO O SCREENING
5.1.1. TCNICAS INMUNOENZIMTICAS (EIA o ELISA)
5.1.2. PRUEBAS RPIDAS DE SCREENING: AGLUTINACIN, DOTBLOT E

INMUNOCROMATOGRAFA CAPILAR

5.2. PRUEBAS DE CONFIRMACIN


5.2.1. CONFIRMACIN POR WESTERN BLOT
5.2.1.1. Criterios de positividad del western blot
5.2.1.2. Resultados indeterminados en el western blot
5.2.2. CONFIRMACIN POR INMUNOTRANSFERENCIA INDIRECTA (IFI)
5.2.3. CONFIRMACION POR RADIOINMUNOPRECIPITACION (RIPA)
5.2.4. CONFIRMACIN POR INMUNOENSAYO LINEAL (LIA)
6.

FALSOS POSITIVOS Y NEGATIVOS EN LOS DIAGNSTICOS SEROLGICOS


6T

DEL VIH
7.
8.

ALGORITMO DE DIAGNSTICO DEL VIH-1


6T

IDENTIFICACION SEROLOGICA DEL VIH-2 Y DE COINFECCIONES VIH-1/VIH-2


6T

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9.

MTODOS DIAGNSTICOS DIRECTOS


9.1. DETECCIN MOLECULAR DE CIDOS NUCLICOS
9.1.1. REACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENA (PCR)
9.1.2. CARGA VIRAL DEL VIH
9.1.2.1. Indicaciones actuales de la carga viral
9.1.2.2. Tcnicas disponibles para la cuantificacin de la carga
viral
9.2. ANTIGENEMIA O DETECCIN DEL ANTGENO P24
9.3. AISLAMIENTO DEL VIH Y CULTIVO VIRAL

10. FENOTIPO VRICO


11. INDICADORES DE LAS PRUEBAS DIAGNSTICAS
11.1. EN EL DIAGNSTICO DE LA INFECCIN POR VIH
11.1.1. PRIMOINFECCIN POR VIH
11.1.2. FASE ASINTOMTICA DE LA INFECCIN VIH
11.1.3. FASE SINTOMTICA DE LA INFECCIN VIH
11.2. EN LA DONACIN DE SANGRE/RGANOS
11.3. EN LA MONITORIZACIN DEL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL
11.4. EN EL DIAGNSTICO DE NIOS
11.4.1.

FACTORES

QUE

PUEDEN

AFECTAR

AL

DIAGNSTICO

MOLECULAR EN NIOS
12. BIBLIOGRAFIA RELACIONADA

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TABLAS Y FIGURAS
Figura 1. Tiempo de aparicin y evolucin de los marcadores especficos de infeccin
VIH
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Tabla 1. Mtodos de diagnstico de la infeccin por VIH.


Tabla 2. Pruebas diagnsticas serolgicas para la deteccin de anticuerpos anti-VIH.

Tabla 3. Tipos de inmunoensayos para detectar anticuerpos frente el VIH.


Figura 2. Tcnica de inmunoensayo (EIA o ELISA).
Tabla 4. Pruebas rpidas para la deteccin de anticuerpos frente al VIH.
Tabla 5. Algunas tcnicas de diagnstico rpido comercializadas frente al VIH.
Figura 3. Inmunoelectrotransferencia o western blot (WB).
Tabla 6. Criterios de positividad para VIH por la tcnica de western-blot.
Tabla 7. Posibles causas de un resultado indeterminado con el western blot.
Figura 4. Inmunoflorescencia indirecta (IFI).
Figura 5. Tcnica de radioinmunoprecipitacin (RIPA).
Tabla 8. Comparacin de las principales pruebas de confirmacin serolgica del VIH.
Tabla 9. Causas de falsos positivos en los diagnsticos serolgicos del VIH.
Tabla 10. Causas de falsos negativos en pruebas de deteccin de anticuerpos anti-VIH.
Figura 6. Inmunoensayo lineal o LIA.
Figura 7. Algoritmo diagnstico de la infeccin por VIH.
Tabla 11. Tcnicas diagnsticas para la infeccin por VIH-2.
Tabla 12. Diferencias existentes entre el VIH-1 y el VIH-2.
Tabla 13. Mtodos directos para la deteccin de la infeccin por VIH.
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Figura 8. Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR.


Tabla 14. Indicaciones actuales del PCR como diagnstico del VIH.
Tabla 15. Indicaciones actuales de la carga viral.
Tabla 16. Tcnicas comerciales para la cuantificacin de la carga viral plasmtica.
Tabla 17. Caractersticas de las tcnicas de cuantificacin de carga viral.
Tabla 18. Variables considerar en las tcnicas de cuantificacin del VIH.
Figura 9. Localizacin de la protena p24 en el VIH.
Figura 10. Deteccin del antgeno p24 por EIA o ELISA.
Tabla 19. Aplicaciones de la antigenemia 24.
Tabla 20. Aislamiento del VIH.
Tabla 21. Eficacia del aislamiento del VIH en fluidos corporales.
Figura 11. Aislamiento del VIH a partir de linfocitos de sangre perifrica (PBMCs).
Tabla 22. Tcnicas para la deteccin del VIH en cultivo.
Tabla 23. Variables de las que depende la eficacia de un cocultivo de VIH.
Tabla 24. Aplicaciones del aislamiento del VIH.
Figura 12. Sincitios inducidos por el VIH en un cultivo celular.
Figura 13. Clasificacin de las variantes del VIH-1 en funcin del uso del correceptor.
Figura 14. Evolucin del tropismo viral a lo largo de la historia natural del VIH-1.
Figura 15. Diagnstico del VIH en nios.
Tabla 25. Comparacin de mtodos de diagnstico directo en nios segn su edad.
Figura 16. Sangre seca recogida en papel (DBS).

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El diagnstico de la infeccin por VIH slo se puede establecer de modo definitivo por
mtodos de laboratorio, porque las manifestaciones clnicas, aunque sugestivas, no son
especficas en ningn estadio de la enfermedad. La eficacia de una prueba diagnstica
depende de su capacidad para identificar correctamente la presencia o ausencia de la
enfermedad que se estudia. Se requieren tecnologas que se puedan realizar por la mayora
de laboratorios y aplicable a un nmero importante de muestras.

1. SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR PREDICTIVO DE LAS PRUEBAS


DIAGNSTICAS

Para valorar cualquier tcnica diagnstica, tenemos que conocer dos parmetros
fundamentales: la sensibilidad y la especificidad. Ambas se completan con la expresin
matemtica de los valores predictivos (VP), tanto positivo (VPP) como negativo (VPN).
Conviene conocer las siguientes definiciones:

La sensibilidad es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo,


es decir, la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un
resultado positivo. La sensibilidad es, por lo tanto, la capacidad del test para detectar
la enfermedad. A mayor sensibilidad, menor nmero (n) de falsos negativos.

La especificidad es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es


decir, la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo. En
otras palabras, se puede definir la especificidad como la capacidad para detectar a los
pacientes sanos. A mayor especificidad, menor n de falsos positivos.

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El valor predictivo positivo (VPP) es la probabilidad de padecer la enfermedad si se


obtiene un resultado positivo en el ensayo. El valor predictivo positivo puede
estimarse, por tanto, a partir de la proporcin de pacientes con un resultado positivo
en la prueba que finalmente resultaron estar enfermos. Es el cociente entre el n de
ensayos verdaderamente positivos dividido por el n total de diagnsticos positivos
obtenidos en la prueba.

El valor predictivo negativo (VPN) es la probabilidad de que un sujeto con un


resultado negativo en la prueba est realmente sano. Se estima dividiendo el n de
ensayos verdaderamente negativos entre el n total de diagnsticos negativos
obtenidos en la prueba.

La sensibilidad y especificidad son intrnsecas a cada tcnica, por lo que si el test es


aplicado de la misma manera y es de la misma calidad siempre deberamos encontrar los
mismos valores. Un test muy sensible es mucho ms til cuando es negativo, pues descarta
la enfermedad. Y si es muy especfico es ms til si sale positivo para confirmar una
enfermedad. Estos dos valores nos indican la fiabilidad de la tcnica diagnstica.

Los VPP y VPN se pueden expresar por el cociente obtenido o en forma de porcentaje,
multiplicando por cien las expresiones matemticas anteriores. En general, a medida que la
prevalencia de infeccin VIH es alta en una poblacin dada, el VPP tiende a ser elevado y
por el contrario el VPN disminuye. De forma inversa, cuando la prevalencia de la infeccin es
baja, el VPP tiende a ser menor y el VPN es elevado. En otras palabras, la probabilidad de
que una tcnica de deteccin determine con certeza la infeccin por VIH de un individuo
vara de acuerdo con la prevalencia del virus en la poblacin estudiada. En prevalencias
cercanas a 50% los valores de sensibilidad y VPN y los de especificidad y VPP se igualan.

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2. MARCADORES INMUNOLGICOS Y VIROLGICOS DURANTE LA INFECCIN POR


VIH.
6T

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Durante la infeccin por VIH se pueden utilizar varios marcadores vricos para
identificar la infeccin y monitorizar su tratamiento, cuya cintica y el momento de aparicin
de cada uno es distinto (Fig.1). Por ello, la eleccin del marcador a detectar depender del
objetivo del diagnstico. El primer marcador que aparece tras la infeccin es el ARN del VIH
que se puede detectar por tcnicas de amplificacin aproximadamente a las dos semanas de
la infeccin, generalmente a los 10-12 das. Casi al mismo tiempo se puede detectar el ADN
de VIH integrado en el genoma celular (ADN proviral). El antgeno p24 (protena de la
cpsida viral) aparece en suero a los 11-13 das, y se puede detectar durante 1 mes y medio
aproximadamente, con las tcnicas de mxima sensibilidad. Los anticuerpos se detectan en
el suero a las tres o cuatro semanas de la infeccin, con una media de 22 das, y alcanzan su
concentracin mxima a las 10-12 semanas. Cuando aparecen los anticuerpos, disminuyen
los niveles de viremia (ARN del VIH en plasma) y desaparece el antgeno p24 al formarse
inmunocomplejos. El perodo ventana (tiempo entre la infeccin y la aparicin de
anticuerpos o seroconversin) se caracteriza por presencia de ADN proviral, ARN del VIH,
antgeno p24 y ausencia de anticuerpos especficos.

Figura 1. Tiempo de aparicin y evolucin de marcadores especficos de infeccin VIH.

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3. PRUEBAS DIAGNSTICAS Y PRUEBAS DE CRIBADO

Las pruebas diagnsticas son las que se realizan de forma individualizada en el


suero de una persona. Las pruebas de cribado se aplican a un conjunto de muestras. Su
finalidad no es la diagnstica, sino que detectan la presencia de anticuerpos anti-VIH como
primer paso para el diagnstico de la infeccin. Se aplican en el control de productos
biolgicos (donaciones de sangre, semen, vulos, rganos, tejidos, etc.). Por ello, requieren
una mxima sensibilidad y deber optarse por el tipo de tcnica cuyo valor predictivo se
aproxime ms al 100%.

La prueba diagnstica ideal es aquella en la que los valores de sensibilidad y


especificidad son de 100%, es decir, posee la mxima sensibilidad y nunca es negativa en
los casos de infeccin. Actualmente, ninguna de las tcnicas disponibles cumple esta
condicin y las causas son tanto biolgicas como tcnicas.

4. MTODOS DIAGNSTICOS DE LA INFECCIN POR VIH

Los mtodos de diagnstico del VIH se pueden clasificar en mtodos indirectos y


directos (Tabla 1). Los mtodos indirectos o serolgicos reconocen principalmente los
anticuerpos especficos producidos por el sistema inmune como respuesta a la presencia del
virus o bien detectan la respuesta inmune celular frente al VIH. Los mtodos directos o
virolgicos permiten detectar el propio virus o alguno de sus componentes, como protenas
o cidos nucleicos.

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Tabla 1. Mtodos de diagnstico de la infeccin por VIH.


MTODOS INDIRECTOS o SEROLGICOS:

Reconocen principalmente anticuerpos o respuesta inmune celular especfica frente al VIH


MTODOS DIRECTOS O VIROLGICOS

Detectan el virus o alguno de sus componentes (material gentico/protenas)

5. DIAGNSTICO SEROLGICO POR DETECCIN DE ANTICUERPOS FRENTE EL VIH

La deteccin de anticuerpos frente a VIH en suero es el mtodo ms frecuentemente


empleado para identificar a los pacientes infectados por el VIH. La persona que los presenta
se llama seropositiva. Toda persona seropositiva es portadora del virus y, por tanto, podra
potencialmente transmitirlo por los mecanismos actualmente reconocidos. Cuando no se
evidencia la presencia de anticuerpos frente al VIH, no se podran considerar personas
portadoras del virus. Sin embargo, si en esas personas hay factores de riesgo, se debera de
aconsejar realizar pruebas adicionales.

Una excepcin seran los nios menores de 18 meses nacidos de madres infectadas
por VIH. La razn es que algunos de ellos podran ser seropositivos debido a la presencia en
su sangre de anticuerpos frente al virus procedente de la madre, pero realmente no estar
infectados por el virus, como se explicar ms adelante.

En este mdulo tambin hablaremos de las circunstancias excepcionales en las que


las pruebas serolgicas podran dar falsos negativos en personas realmente infectadas por el
virus y falsos positivos en personas no infectadas. Es importante recordar que los resultados
de las pruebas serolgicas de diagnstico de VIH se deben expresar de forma clara y precisa
para evitar situaciones diagnsticas confusas y ansiedad innecesaria en los individuos a los
que se les realizan.
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En la actualidad, existen diferentes tipos de tcnicas de deteccin de anticuerpos


especficos VIH. La seleccin de la tcnica o combinacin de tcnicas ms apropiada
depender del objetivo de la prueba, de la sensibilidad y especificidad de las tcnicas a
utilizar, as como de la prevalencia de la infeccin VIH en la poblacin estudiada. Sin
embargo, la deteccin de anticuerpos frente el VIH se realiza, no slo para el diagnstico del
VIH-1, sino tambin para el cribado de las donaciones de sangre, rganos, semen y vulos,
as como para estudios de vigilancia seroepidemiolgica de la infeccin VIH. Las pruebas
para la deteccin de anticuerpos frente el VIH se describen en la Tabla 2.

Las pruebas de cribado o screening nos permiten realizar un gran nmero de


anlisis a la vez. La confirmacin de la reactividad en una prueba inicial de screening se
realiza por las pruebas de confirmacin, que presentan mayor especificidad. Un paciente
ser seropositivo frente al VIH cuando se ha demostrado la presencia de anticuerpos frente a
protenas del virus, con reactividad repetida en las pruebas de screening y, adems, en
alguna de las pruebas de confirmacin. Las pruebas estn basadas en distintos principios
tcnicos que han ido evolucionando con el tiempo, la experiencia adquirida y las
recomendaciones nacionales e internacionales.

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Tabla 2. Pruebas diagnsticas serolgicas para la deteccin de anticuerpos anti-VIH.


PRUEBAS SEROLGICAS DE CRIBADO O SCREENING
1. Tcnicas inmunoenzimticas (EIA o ELISA)
Cuatro tipos: indirecto, competitivo, tipo sandwich y de captura.
2. Tcnicas de deteccin rpida:
2.1 Aglutinacin
2.2. Dot-blot
2.3. Inmunocromatografa capilar
PRUEBAS SEROLGICAS DE CONFIRMACIN
1. Western Blot
2. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
3. Radioinmunoprecipitacin (RIPA)
4. Inmunoensayo lineal (LIA)

Los laboratorios que realicen el diagnstico de los anticuerpos anti-VIH en suero


deben observar las normas de seguridad de nivel 2. Todas las muestras debern
considerarse como potencialmente infecciosas. Esto supone trabajar con guantes en todos
los procesos, pipeteado mecnico, utilizacin de contenedores de seguridad biolgica para
los desechos, as como la observacin de aquellas normas y precauciones consideradas
como de buena prctica. Las superficies de trabajo debern ser descontaminadas con
desinfectantes activos contra el VIH, tales como ciertos detergentes, incluido el jabn,
alcohol-acetona al 70% v/v, leja diluida, etc.

Los sueros se deben recoger en la forma habitual y evitar mantenerlos ms de 24


horas a temperatura ambiente. Para minimizar las contaminaciones microbianas que podran
alterar las muestras, se recomienda usar tubos estriles y no conservarlos a +4C ms all
de 72 h. Para perodos de conservacin ms prolongados, hay que utilizar temperaturas de
-20 y 70C, sobre todo si se prev la necesidad de detectar el antgeno p24 u otros
componentes estructurales del VIH, ya que estos ltimos se desnaturalizan paulatinamente a

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temperaturas superiores a 70C. Los sueros no deberan ser inactivados con calor, por las
razones expuestas.

5.1.

PRUEBAS SEROLGICAS DE CRIBADO O SCREENING


5.1.1. TCNICAS INMUNOENZIMTICAS (EIA o ELISA)

La tcnica ms utilizada como prueba de screening es el enzimoinmunoanlisis (EIA,


inmunoensayo o ELISA), que han experimentado un considerable desarrollo y mejoras desde
su desarrollo inicial. Las mejoras han afectado, principalmente, al antgeno o antgenos
utilizados en el ensayo y al principio tcnico en el que se fundamentan dichas reacciones. En
base a eso, se han definido distintos tipos de ELISA o EIA (Tabla 3 y Fig.1).

Tabla 3. Tipos de inmunoensayos para detectar anticuerpos frente el VIH.


Tipos

Antgeno

Producto
detectado

EIA 1 generacin

Lisado viral del VIH-1

IgG

EIA 2 generacin

PR/PS del VIH-1 y VIH-2

IgG

EIA/ELFA 3 generacin

PR/PS del VIH-1 y VIH-2 y del grupo O del VIH-1

IgG, IgM

EIA/ELFA 4 generacin

PR/PS del VIH-1 y VIH-2 y del grupo O del VIH-1


Anticuerpos anti-p24

IgG,
Antgeno p24

EIA, ELISA o inmunoensayo. ELFA, enzyme-linked fluorescent assay; PS, pptido sinttico; PR,
protena recombinante.

La mayora de las primeras tcnicas (EIA de 1 generacin) utilizaron antgenos


U

virales crudos ms o menos purificados procedentes de lisados virales. Estos antgenos


contenan gran cantidad de protenas procedentes del sistema celular en el que se haba
cultivado el virus. La posibilidad de una reaccin inespecfica del suero con algunos de estos
componentes constituy un problema que aceler el diseo de otras pruebas de screening.
As, surgieron los EIA de 2 generacin, donde los antgenos eran protenas recombinantes
U

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o pptidos sintticos que reproducan eptopos del virus VIH-1 y VIH-2. Los EIA de 2
generacin eran ms sensibles y especficos que los de 1 generacin. Los EIA tambin
pueden estar diseados de un modo indirecto o competitivo, segn el mecanismo por el que
se reconozca la presencia de anticuerpos en la muestra problema.
El EIA indirecto emplea viriones desestructurados mediante detergentes que se
adsorben en pocillos. Sobre ellos se aade el suero problema y, ms tarde, una antiglobulina
humana de tipo IgG a la que se le ha ligado una enzima, que proporciona color al aadir un
sustrato en los casos positivos. Sin embargo, el EIA competitivo se basa en la distinta
afinidad entre anticuerpos exgenos marcados frente al VIH-1 y los del suero del paciente, al
enfrentarse ambos con un lisado viral fijado en un pocillo. En general, los EIA indirectos son
ms sensibles. Los EIA competitivos tienen mayor especificidad, aunque cierta falta de
sensibilidad en algunos momentos de la infeccin por el VIH, como al inicio de la
seroconversin y en los pacientes que se encuentran en estadios terminales. Sin embargo,
combinadas con otras pruebas de mayor sensibilidad en forma secuencial, pueden
proporcionar excelentes resultados en la estrategia diagnstica.
En los ltimos aos se han desarrollado EIA ms sensibles y especficos que los dos
primeros, como son los EIA de 3 generacin (EIA de tipo sndwich) y el EIA de captura.
U

Ambos utilizan como antgenos protenas recombinantes o pptidos sintticos de 10 a 40


aminocidos especficos del VIH-1, en ocasiones en asociacin con otros especficos del
VIH-2. Pueden detectar no slo la IgG, sino todas las subclases de anticuerpos. Por ello son
ms sensibles en reconocer la primoinfeccin por VIH-1, cuando la IgM es el primer
marcador de seroconversin y el diagnstico de infeccin peditrica, que cursa con IgM e IgA
si el nio est infectado.
Tambin

se

han

desarrollado

los

EIA
U

de

generacin,
U

que

detectan

simultneamente el antgeno p24 y los anticuerpos anti-VIH, reduciendo as el tiempo de

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diagnstico en el periodo ventana una media de 8 das respecto a los EIA de 3 generacin
(ver Fig. 1). El perodo ventana es el tiempo desde la seroconversin hasta que aparecen los
anticuerpos frente el VIH, que puede oscilar entre 2 y 4 semanas y, a veces, hasta varios
meses. Los EIA de 4 generacin permiten el diagnstico en el 80-90% de casos de infeccin
aguda. No se debe de confundir la infeccin aguda con la infeccin reciente, que hace
referencia a pacientes diagnosticados en los primeros seis meses (180 das) de la infeccin.
Los EIA han sufrido tambin variaciones tecnolgicas, siendo una de las ms
empleadas la utilizacin de substratos fluorescentes que han dado lugar a las pruebas
denominadas ELFA (enzyme-linked fluorescent assay).
La evolucin de los antgenos incluidos en las pruebas de deteccin ha permitido
incrementar la sensibilidad sin perder especificidad, mejorando la deteccin de anticuerpos
frente a tipos y subtipos del VIH-1 que escapaban a los equipos de diagnstico habituales.
Sin embargo, a pesar de los avances logrados en el desarrollo de estas pruebas, se siguen
produciendo casos de falsos positivos y, con menor frecuencia, falsos negativos, de los que
hablaremos ms adelante. Actualmente existen en el mercado ms de 130 pruebas
comerciales para la deteccin de anticuerpos frente al VIH-1 y VIH-2 en suero (Fig.2). La
sensibilidad y la especificidad son los parmetros ms importantes para valorar una prueba.
En general, las pruebas aprobadas para los bancos de sangre presentan una sensibilidad
superior al 99.5% y una especificidad cercana al 99%.

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Figura 2. Tcnica de inmunoensayo (EIA o ELISA).

5.1.2. PRUEBAS RPIDAS DE SCREENING: AGLUTINACIN, DOT-BLOT E


INMUNOCROMATOGRAFA CAPILAR
Adems de los inmunoensayos EIA, existen otros mtodos de screening que permiten
detectar anticuerpos anti-VIH-1 con gran rapidez y simplicidad de ejecucin. Estas son las
pruebas de aglutinacin, las de inmunoadherencia (dot-blot) y las de inmunocromatografa
capilar (Tabla 2). Emplean antgenos similares a los EIA y ELFA, es decir, protenas
recombinantes o pptidos sintticos del VIH-1 (Tabla 4). Son rpidas porque el tiempo en el
que se puede obtener un resultado oscila entre 5 y 20 minutos. Tienen lectura visual y no
requieren instrumentacin. Su sensibilidad y especificidad an no estn suficientemente
evaluadas, aunque en general es menor que la de los EIA y ELFA. Estas pruebas rpidas
han experimentado un desarrollo importante. Su ventaja y principal indicacin es la
posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus (VIH-1 y VIH-2) y su mayor
inconveniente es un elevado coste. Sin embargo, deben considerarse para situaciones de
urgencia. Combinadas con otras pruebas de deteccin de anticuerpos constituyen una
estrategia que mejora la especificidad de los resultados de forma asequible en trminos de
costes laborales y de tiempo. La disponibilidad de estas pruebas, ms fciles de realizar que

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los EIA, tambin ofrecen ventajas para detectar el VIH en pases en vas de desarrollo y para
estudios amplios de vigilancia epidemiolgica.

Tabla 4. Pruebas rpidas para la deteccin de anticuerpos frente al VIH.


Tcnica

Antgeno

Aglutinacin pasiva

PR/PS del VIH-1, VIH-2 y del grupo O del VIH-1

Dot-EIA 1 generacin

PR/PS del VIH-1 y VIH-2 en un nico spot


PR/PS del VIH-1, VIH-2 y del grupo O del VIH-1 en "spots" diferenciados

Dot-EIA 2 generacin

para VIH-1 y VIH-2


Inmunocromatografa capilar

PR/PS del VIH-1, VIH-2 y del grupo O del VIH-1

PR; protena recombinante; PS, pptido sinttico.

La tcnica de aglutinacin pasiva permite realizar titulaciones de forma sencilla. Se


han comercializado varias pruebas de aglutinacin que utilizan protenas recombinantes o
pptidos sintticos del VIH-1 que muestran gran sensibilidad y especificidad. La aglutinacin
se realiza con partculas de ltex, gelatina o hemates sensibilizados con protenas del VIH-1.
La dificultad de automatizacin las hace poco adecuadas para procesar gran nmero de
sueros, estando menos extendidas. Estas tcnicas permiten detectar tanto anticuerpos de la
clase IgG como IgM.
En la tcnica de inmunoadherencia o dot-blot (tambin llamado EIA de
membrana o dot-EIA), los anticuerpos frente al VIH se detectan por un mtodo
inmunoenzimtico. El antgeno viral (protenas recombinantes o pptidos sintticos del VIH-1
o VIH-1/VIH-2) est fijado a tiras de nitrocelulosa. La mayora de las pruebas rpidas de
deteccin de anticuerpos emplean este principio. Su ventaja y principal indicacin es la
posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus y su mayor inconveniente es un
elevado coste. Esta prueba ha sido aprobada para situaciones urgentes y para la prctica de
transplantes.
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En los ltimos aos, han aparecido pruebas rpidas basadas en el principio de la


inmunocromatografa capilar que han mejorado de forma importante la sensibilidad y la
especificidad de stas respecto a las de dot-blot. Se deben elegir aqullas que tengan
controles internos que verifiquen el correcto funcionamiento de la reaccin. Suelen utilizar de
50l (0.05ml) a 150l (0.150ml) de plasma, suero o sangre, aunque algunos emplean un
volmen mucho menor. Tambin se estn desarrollando pruebas rpidas no invasivas de
deteccin de anticuerpos del VIH-1, que detectan anticuerpos empleando distintos fluidos
biolgicos diferentes a la sangre, suero, o plasma. Existe ya una tcnica rpida de
diagnstico del VIH-1 en saliva aprobadas por la FDA (Food and Drug Administration) y con
marcado de la Comunidad Europea (CE): el OraQuick (Tabla 5).

La posibilidad de detectar anticuerpos frente al VIH-1 en fluido oral u orina ofrece


indudables ventajas con respecto al suero. La recogida de la muestra es cmoda para el
paciente, se evitan pinchazos y manipulacin de sangre, no precisa material especial, es ms
barata y entraa menos riesgo de infeccin para el personal sanitario. Sin embargo, los
inconvenientes son la menor concentracin de anticuerpos que suele existir en fluido oral y
orina respecto a la sangre, as como el predominio de anticuerpos tipo IgA.

Actualmente las tcnicas rpidas comercializadas gozan de buena especificidad y


sensibilidad y son rpidas y simples. Ofrecen ventajas en lugares donde las tcnicas
diagnsticas habituales son de difcil incorporacin y con falta de infraestructuras adecuadas
para un diagnstico serolgico convencional. La gran mayora de estas pruebas detectan las
distintas variantes del VIH-1 y VIH-2, por lo que cada vez ms su uso est ms extendido en
frica, especialmente para situaciones de diagnstico urgente.

La mayora detecta un gran nmero de subtipos y recombinantes del VIH-1. Sin


embargo, sera conveniente investigar en cada una de esas tcnicas paneles grandes de
variantes VIH-1 diferentes, sobre todo las que se estn generando por el fenmeno de la
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recombinacin y aquellos subtipos y recombinantes menos prevalentes que circulan en la


pandemia. Nunca se debe olvidar que cualquier diagnstico positivo por estas tcnicas
serolgicas de diagnstico rpido debe ser confirmado en centros especializados por
tcnicas convencionales antes de emitirlo como positivo.

Se puede encontrar ms informacin relacionada con los ensayos rpidos para el


diagnstico serolgico del VIH en un documento de la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS)

publicado

en

2013

con

acceso

en

la

siguiente

web:

http://www.who.int/diagnostics_laboratory/evaluations/hiv/131107_hiv_assays17_final.pdf.Los
9T

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ensayos de screening y confirmacin serolgicos, as como los de diagnstico gentico


aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) americana se resumen en:
http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/Licensed
ProductsBLAs/BloodDonorScreening/InfectiousDisease/UCM080466#anti_HIV1_Assays.

La estrategia de la OMS para el diagnstico de VIH dice que en lugares con alta
(>5%) prevalencia de infeccin en la poblacin a estudiar, los pacientes que han dado
negativos por un test se consideran negativos. Pero cualquier muestra que de positiva con un
primer ensayo rpido, slo se darn como positiva si otra segunda muestra es reactiva con
otro test distinto al primero. Si el segundo ensayo fuera negativo y, por tanto, discrepante con
el primero, la OMS dice que se repitan ambos ensayos con las mismas muestras (suero,
plasma). Slo si se usara sangre tomada del dedo y recogida en papel, habra que tomar una
nueva muestra. En caso de repetirse la discrepancia, se deber de hacer un tercer ensayo
antes de informar a la muestra como positiva o negativa. En lugares con baja (<5%)
prevalencia de infeccin se debe confirmar la positividad con un tercer ensayo, en caso de
que los dos primeros hayan sido reactivos para VIH.

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Tabla 5. Algunas tcnicas de diagnstico rpido comercializadas frente al VIH.

Ms informacin en: http://www.who.int/diagnostics_laboratory/evaluations/hiv/131107_hiv_assays17_final.pdf


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5.2. PRUEBAS DE CONFIRMACIN


La trascendencia de la infeccin por el VIH hace siempre necesaria la confirmacin de
los resultados positivos obtenidos en las pruebas de screening o de deteccin primaria de
anticuerpos para el diagnstico de la infeccin por VIH. Existen diferentes pruebas de
confirmacin: la inmunoelectrotrasferencia o western blot (WB), la inmunofluorescencia
indirecta (IFI), la radioinmunoprecipitacin (RIPA) y los inmunoensayos lineales con
antgenos recombinantes (LIA), como se expuso en la Tabla 2. Estas tcnicas se basan en
fundamentos distintos y ms especficos que las tcnicas de screening. Por lo general, se
utilizan para la confirmacin de sueros positivos, pero en determinados casos pueden
emplearse para confirmar sueros negativos, dada su mayor sensibilidad en muchos casos.
La tcnica ms ampliamente utilizada es el WB. Las tcnicas de IFI y RIPA, por razones
distintas (mayor subjetividad de la lectura, requerimientos de laboratorio, y complejidad), se
emplean cada vez menos. Por tanto, los resultados del WB son considerados el estndar de
confirmacin de la presencia de los anticuerpos anti-VIH.

5.2.1. CONFIRMACIN POR WESTERN BLOT


La tcnica de inmunoelectrotransferencia, ms comnmente denominada western blot
o WB, es una de las ms ampliamente utilizadas para confirmar resultados positivos en las
pruebas de deteccin de anticuerpos frente el VIH. Permite una discriminacin puntual de las
especificidades de reactividad de anticuerpos frente a las distintas protenas del virus (Fig.
3). Se basa en tiras de nitrocelulosa en las que se han transferido las protenas del virus.
Incluyen algunas protenas estructurales (gag, env) y de pol del VIH, algunas protenas
precursoras virales y otros antgenos celulares contaminantes que proceden de las clulas
infectadas empleadas para la obtencin del antgeno viral. Adems, algunas tiras de WB
comercializadas para VIH-1 incluyen en un extremo diferenciado de la tira un pptido
sinttico especfico, correspondiente a glicoprotenas especficas de la envuelta del VIH-2

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(gp36), lo que permite identificar la infeccin VIH-1 y VIH-2 con una sola tira de reactivo.
Existen diferentes comercializaciones de la tcnica que pueden variar en la cantidad y
calidad del antgeno presente en las tiras, tipo y mtodo de revelado y tiempo de incubacin
con el suero.

La tcnica de WB consiste, bsicamente, en la incubacin de una de esas tiras con el


suero problema durante un tiempo que oscila entre 2-4 horas hasta 18 horas. Despus se
revela la presencia de anticuerpos frente a las diferentes protenas del virus mediante
reacciones inmunoenzimticas de distinta configuracin dependiendo del fabricante. El
resultado es la aparicin de bandas coloreadas de mayor o menor intensidad en el lugar de la
tira de nitrocelulosa en el que estn situadas las protenas del VIH contra las cuales existen
anticuerpos en el suero problema. Dada la finalidad de esta prueba, los WB de tiempo de
incubacin largo (16-18 horas) deberan utilizarse en los casos de muestras especialmente
conflictivas.

Figura 3. Inmunoelectrotransferencia o western blot (WB).

p24 y p17 (Protenas Gag); gp160, gp120, gp41 (precursor y protenas Env); p32, protena Pol.

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La tcnica de WB es una prueba de confirmacin que en el momento actual es


fcilmente adaptable a laboratorios de equipamiento medio, que no tengan un excesivo
nmero de muestras para confirmar. Debido a que las tiras de nitrocelulosa en las que se
depositan los antgenos del VIH contienen, en mayor o menor cantidad, protenas de la clula
husped en la que se ha cultivado el virus, a menudo se observan bandas de reactividad
contra dichas protenas. Por ello es muy conveniente adoptar una disciplina metodolgica en
la lectura e interpretacin de las bandas de origen viral, que deber ser uniforme y
sistematizada para cada laboratorio.

5.2.1.1. Criterios de positividad del western blot


Existen distintos criterios de positividad del WB propuestos por organismos o
sociedades involucrados en el diagnstico del VIH (Tabla 6). De ellos, el de la Organizacin
OMS es el ms especfico cuando se manejan sueros de diversa procedencia poblacional. Es
el criterio que se adapta mejor a nuestra realidad hospitalaria. Un WB positivo requiere la
presencia de, al menos, dos bandas de la envoltura. La negatividad sera una ausencia de
bandas y los restantes patrones seran WB indeterminados. Las bandas del core (protenas
gag virales) pueden ser fruto de reactividades inespecficas, detectndose en el 15-20% de
los donantes de sangre no infectados.

Tabla 6. Criterios de positividad para VIH por la tcnica de western-blot .


Criterio

Reactividad frente a:

OMS

Dos glicoprotenas de la envuelta: precursor gp160, gp120, gp41

Cruz Roja Americana

Una protena de cada gen estructural (env, pol y gag)

Food and Drug Administration (FDA)

p24 + p32 + (gp41 o gp120 o gp160)

Consortium for Retrovirus Serology and


Standardization (CRSS)

p24 + (gp41 o gp120 o gp160) o p32 + (gp41 o gp120 o gp160)

Centers for Disease Control/Association


of State and Territorial Public Health

p24 + (gp41 o gp120 o gp160) o gp41 + (gp120 o gp160)

Laboratory Directors (CDC/ASTPHLD)

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Los sueros se consideran positivos cuando cumplen el criterio de positividad adoptado


por el laboratorio, negativos cuando no se observa ninguna banda de reactividad e
indeterminados cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de positividad.

5.2.1.2. Resultados indeterminados en el western blot


Los resultados indeterminados de la prueba WB son la mayor fuente de ansiedad en
pacientes y los que pueden llegar a generar desconcierto en los responsables del
diagnstico. En los WB indeterminados se observan frecuentemente reactividades clnicas
frente a una slo banda de la envuelta viral (gp160, gp120, gp41) o del core viral (p24, p55 y
p40) (Tabla 7). En otras ocasiones la reactividad se produce frente a componentes celulares
contaminantes de las tiras de nitrocelulosa o eptopos no vricos que aparecen en el
procedimiento de manufacturacin del WB, permitiendo la exposicin de zonas parcialmente
desnaturalizadas de aquellas protenas.

Las causas de estas reactividades anormales en la prueba WB son muy variadas y no


estn totalmente explicadas. Se han descrito resultados indeterminados en personas con
factor reumatoide en el suero, con lupus eritematoso, con bilirrubinemias elevadas, con
anticuerpos contra el sistema HLA, con parasitosis y por otras causas, incluidos en pacientes
hemodializados. Si tenemos en cuenta que en la cubierta del VIH estn presentes antgenos
HLA, podemos entender que hasta el 30% de los individuos multitransfundidos presenten
reactividades en el WB y que se hayan descrito en ellos falsos positivos con dicha tcnica.
En otros casos la indeterminacin en el WB de VIH-1 puede ser causada por infeccin por
VIH-2 u otros retrovirus (HTLV-I, HTLV-II).

Asimismo, los Individuos africanos pueden presentar un perfil atpico de bandas


debido a la hipergammaglobulinemia secundaria a la hiperestimulacin antignica. Tambin
puede ocurrir reactividad inespecfica o cruzada con otros anticuerpos, como se ha descrito
en donantes de sangre sanos y en embarazadas. Un estadio avanzado de la enfermedad,
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con deterioro inmunolgico grave y presencia de inmunocomplejos, puede tambin reducir el


ttulo de anticuerpos anti-VIH-1 circulantes y originar un WB indeterminado.

Cuando aparece un WB indeterminado, deben repetirse anlisis peridicos por EIA y


WB al menos durante 6 meses para verificar si existe un cambio en el patrn de anticuerpos
hacia la positividad o si, por el contrario, desaparecen las bandas detectadas inicialmente.
Las personas con resultados persistentemente indeterminados al cabo de 6 meses, en
ausencia de factores de riego, sntomas o hallazgos clnicos compatibles con la infeccin
VIH, deben considerarse seronegativas. Sin embargo, no deberan donar sangre, plasma,
semen u rganos.

En algunos casos pueden estar indicadas nuevas entrevistas clnicas y un seguimiento


mas prolongado en el que se incluyan otros anlisis de confirmacin (RIPA), evolucin de la
funcin inmune e incluso descartar una infeccin VIH en su pareja sexual, solicitando la
cooperacin y consentimiento de sta. Tambin se recomienda realizar otras pruebas para el
diagnstico gentico del VIH, preferentemente mediante amplificacin del material gentico
viral por la reaccin de la polimerasa en cadena o PCR, que describiremos en otro apartado.

En los ltimos aos, para minimizar los problemas debidos a resultados


indeterminados observados en el WB, se han desarrollado otras pruebas accesorias para
discriminar y confirmar las muestras positivas en la prueba de screening o cribado de
anticuerpos.

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Tabla 7. Posibles causas de un resultado indeterminado con el western blot.


Una glicoprotena de la envuelta aislada (gp160, gp120 o gp41)
Posible causa
Inicio de la seroconversin
Infeccin por otros tipos de VIH u otros retrovirus
Hijos de madres infectadas
Seguimiento
En adultos: repetir WB en otro suero 7 das ms tarde
En nios: PCR y seguimiento
Descartar VIH-2 y otras variantes del VIH segn procedencia
geogrfica
p24 aislada (protena Gag de la cpsida viral)
Posible causa
Frecuente en indeterminados de embarazadas
Multitrasfundidos
Pacientes africanos
Seguimiento
Descartar VIH-2 y otras variantes de VIH-1
Descartar otros retrovirus (HTLV-I/II)
p17 aislada (protena Gag de la matriz viral)
Causa desconocida
No es necesario el seguimiento
Otras bandas del core aisladas
Posible causa
Inespecificidades muy variadas
Seguimiento
Anamnesis para posibles factores de WB indeterminado
Anamnesis para posibles factores de riesgo. Seguimiento a los 7-15
das
Ms de una banda del core o bandas no vricas
Posible causa
Multitrasfundidos
Enfermedades autoinmunes
Seguimiento
Anamnesis para posibles factores de riesgo
Seguimiento hasta 3-6 meses para ver evolucin

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5.2.2. CONFIRMACIN POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)


La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una tcnica rpida, sencilla y de bajo coste.
Puede ser empleada como primera tcnica de confirmacin en sueros con pruebas
diagnsticas de screening claramente positivas y en poblaciones con factores de riesgo. Es
una tcnica muy til para laboratorios que necesiten confirmar gran nmero de sueros.

Esta tcnica se basa en la identificacin de anticuerpos frente a clulas infectadas por


VIH, que pueden ser linfocitos humanos infectados y fijados sobre portaobjetos (Fig. 4). Los
resultados slo pueden expresarse como positivos o negativos, sin especificar de forma
concreta otras reactividades. Para descartar las posibles reacciones entre anticuerpos no
especficos presentes en la muestra y el substrato celular utilizado, la tcnica incorpora como
sistema de control clulas no infectadas. Slo sern positivas las muestras donde el suero
provoque reactividad positiva en las clulas infectadas por el virus y no en las clulas control
sin infectar. Si existe reactividad tanto frente a las clulas que expresen antgeno como en las
clulas control, el resultado es ilegible. Eso significa que no puede atribuirse la positividad a
los anticuerpos especficos pero tampoco descartar su presencia.

La lectura se efecta con microscopio de luz ultravioleta. Por ello, los resultados
dependen mucho de la calidad del microscopio y de la experiencia del observador para
identificar los patrones de fluorescencia citoplsmica y de membrana que corresponden a la
presencia de anticuerpos especficos. El grado de subjetividad en la lectura y la dificultad en
la normalizacin y control del antgeno utilizado (distintas lneas celulares, fijacin en
portaobjetos en diferentes momentos de la infeccin celular, estado de conservacin, etc.)
afectan a la reproducibilidad de la tcnica. Por ello, los resultados IFI con patrones atpicos,
reactividades inespecficas o negativos con pruebas de screening positivas, debern
procesarse con una segunda prueba confirmatoria, generalmente con WB.

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Figura. 4. Inmunofluorescencia indirecta (IFI).

Conjugado
(anticuerpo anti-humano unido
a un compuesto fluorescente)

Anticuerpos del paciente


Clulas infectadas en el portaobjetos (Soporte slido)

Esta tcnica detecta todo tipo de anticuerpos frente al VIH, pero necesita que existan
niveles superiores de anticuerpos que los detectados por el WB. Por ello, es una tcnica muy
aconsejable para la confirmacin de la infeccin en muestras EIA positivas pertenecientes a
personas con prcticas de riesgo. Sin embargo, su utilidad sera menor en muestras de
donantes de sangre con resultado EIA positivo dbil y en muestras de personas que estn en
un contexto epidemiolgico con baja prevalencia del VIH, aunque las pruebas de cribado o
screening hayan sido claramente positivas.

Esta tcnica no es vlida para discriminar VIH-1 y VIH-2, por problemas de reactividad
cruzada. Es una prueba de gran utilidad cuando se desea comparar niveles de anticuerpos
frente el VIH en distintos fluidos biolgicos, como es el caso de suero/lquido cefalorraqudeo
del mismo paciente si se sospecha infeccin VIH del sistema nervioso central. Para ello, las
diluciones seriadas del suero problema nos permiten expresar los resultados indicando el
ttulo obtenido de anticuerpos anti-VIH.

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5.2.3. CONFIRMACIN POR RADIOINMUNOPRECIPITACIN (RIPA)

Esta tcnica de confirmacin de anticuerpos frente al VIH emplea protenas virales


marcadas radiactivamente y evala la formacin de inmunocomplejos. Es la tcnica necesita
condiciones de alta seguridad, tanto para la obtencin de las protenas virales a partir de un
cultivo del virus en lneas celulares de linfocitos humanos, como para el posterior marcaje
radioactivo. El virus complejo marcado se obtiene del sedimento celular (antgeno con alta
expresin de glicoprotenas y sus precursores) y del sobrenadante del cultivo, ms rico en
protenas enzimticas y aquellas codificadas por el gen gag.

La reaccin antgeno-anticuerpo es previa a cualquier a cualquier manipulacin del


antgeno y ello confiere al RIPA una elevada sensibilidad y gran especificidad. Los complejos
protena viral-anticuerpo especfico son separados por tcnicas electroforticas segn su
peso molecular. Se visualizan mediante la impresin del marcaje radioactivo en placa
fotogrfica, obteniendo un patrn de bandas similar al del WB (Fig. 5).

Dada la complejidad de la tcnica, las condiciones obligatorias de seguridad biolgica


y de manejo de sustancias radioactivas, esta tcnica est reservada concretamente en varias
circunstancias:

1) En la investigacin de muestras problemticas en las que no se pueda establecer


diagnstico de infeccin mediante las tcnicas convencionales de confirmacin.

2) En la elaboracin de paneles de suero destinados a sistemas de control de calidad,


tanto de reactivos como de sueros patrn".

3) En la diferenciacin serolgica, de la infeccin VIH-1 y VIH-2 cuando las


reactividades cruzadas den patrones mixtos en las tcnicas de WB y dot-blot con fines de
investigacin.

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Figura. 5. Tcnica de radioinmunoprecipitacin (RIPA)

La comparacin de las caractersticas principales del WB, IFI, RIPA y LIA para la
confirmacin de la infeccin por VIH se muestra en la siguiente tabla.

Tabla 8. Comparacin de las pruebas de confirmacin serolgica del VIH.

CARACTERSTICA

WB

IFI

RIPA

LIA

Indicaciones

Confirmacin de
todo tipo de sueros
VIH 1 y VIH 2

Confirmacin en
grupos de alta
prevalencia VIH 1

Confirmacin de referencia
en nuestras problemticas.
Investigacin.

Confirmacin de
todo tipo de
sueros VIH 1 y
VIH 2

Lectura

Subjetiva

Subjetiva

Paneles de suero patrn


Subjetiva

Subjetiva

Automatizacin

Parcial

Parcial

Parcial

Parcial

Dificultad

Media

Baja

Alta

Media

Sensibilidad

+++

++

++++

+++

Especificidad

+++

++

++++

+++

Rapidez

++

+++

++

WB, western blot; IFI, inmunofluerescencia indirecta; RIPA, radioinmunoprecipitacin; LIA, inmunoensayo lineal.

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5.2.4. CONFIRMACIN POR INMUNOENSAYO LINEAL (LIA)

Hay otra tcnica para confirmar las muestras positivas en la prueba de screening
que se basa en el inmunoanlisis de tipo lineal (LIA). ste incorpora una o varias protenas
recombinantes o pptidos sintticos del VIH-1 (en ocasiones junto con antgenos del VIH2) en un soporte plano (Fig. 6). Son muy sensibles y especficas. Sin embargo, la
utilizacin de pptidos sintticos en la infeccin aguda por VIH-1 o en la infeccin perinatal
puede ser causa de falsos negativos. Existen varios tipos: PeptiLav (BioRad), RIBA
(Ortho), Innolia (Boehringer), etc.

Figura 6. Inmunoensayo lineal o LIA.

6. FALSOS POSITIVOS Y NEGATIVOS EN LOS DIAGNSTICOS SEROLGICOS DEL VIH

Las causas de los falsos positivos son variadas (Tabla 9) y dependen


bsicamente de la tcnica (antgenos y principio tcnico empleado) y de las condiciones
derivadas del paciente. La presencia de autoanticuerpos es una de las causas importantes
de falsos diagnsticos serolgicos positivos. stos se producen porque en la cubierta del
VIH existen antgenos del sistema HLA procedentes de la clula husped. Ello explica, en
parte, las falsas reacciones observadas en sueros de individuos transplantados,
multitransfundidos u otros con enfermedades autoinmunes. Los resultados falsos positivos,
tanto en las pruebas de screening como en las de confirmacin (menos frecuente), son
muy preocupantes. Sobre todo cuando stos se producen en personas sin ningn factor de
riesgo, como ocurre generalmente.

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La evolucin de las tcnicas serolgicas y antgenos utilizados ha reducido la


aparicin de falsos positivos que en la actualidad es inferior al 1%. Es posible minimizar los
falsos positivos si se evitan los fallos indicados en la Tabla 9 en cuanto la extraccin,
conservacin y procesamiento del suero.

Tabla 9. Causas de falsos positivos en los diagnsticos serolgicos del VIH


Relativas al suero
Congelaciones y descongelaciones repetidas
Almacenamiento a temperatura subptima
Aspecto lipdico o turbio del suero
Contaminacin microbiana
Sueros tratados con calor ( 60C)
Errores de extraccin o identificacin
Relativas a la presencia de autoanticuerpos
Personas con anticuerpos anti-HLA-DR4, DQw3
Enfermedades reumatoideas
Polimiositis
Lupus eritematoso
Multitrasfundidos
Trasplantados renales
Multparas
Debido a otras condiciones
Hemodializados, fracaso renal crnico
Sndrome de Stevens-Johnson
Administracin previa de inmunoglobulinas
Sueros postvacunales (gripe, hepatitis B)
Infecciones agudas por virus ADN
Enfermedad heptica alcohlica grave
Cirrosis primaria biliar
Colangitis esclerosante
Pacientes con parasitosis

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Tambin es posible la aparicin de falsos negativos en el diagnstico y


determinacin de los anticuerpos frente al VIH. Aparecen menos frecuentemente, sobre
todo porque los resultados negativos no suelen ser reconfirmados si no existe una
indicacin clnica precisa al respecto. Las causas de falsa negatividad son tambin
variadas (Tabla 10). Se han descrito pacientes infectados por el VIH pero seronegativos,
debido a causas orgnicas derivadas de una respuesta aberrante o anormal a la infeccin
por el VIH. Desde el punto de vista serolgico, en la infeccin por el VIH ocurren cambios
en la dinmica de produccin de anticuerpos desde el momento de la seroconversin,
como se vio en la Fig.1. El perodo ventana, de dos a cuatro semanas de duracin, se
caracteriza por la ausencia de anticuerpos y la presencia del antgeno p24, como dijimos
en el apartado 2. Por ello, las tcnicas de EIA/ELFA de 4 generacin (Fig.1) se utilizan ya
en algunos pases con el fin reducir al mnimo el perodo ventana. En ciertas personas se
ha observado la ausencia de criterios diagnsticos de positividad por WB en los meses
finales de la enfermedad, como consecuencia del intenso deterioro inmunitario. As, en
estadios finales de la infeccin desaparecen los anticuerpos contra algunas de las
protenas estructurales internas del virus (p24, p17, p55, etc.).

Tabla 10. Causas de falsos negativos en pruebas de deteccin de anticuerpos antiVIH


1

Periodo ventana que precede a la aparicin de anticuerpos

Infeccin por tipos o variantes de VIH no detectables por los antgenos incluidos en la prueba

Tratamiento inmunosupresor prolongado

Trasplante de mdula sea

Disfunciones de los linfocitos B

Plasmafresis, trasfusin sangunea

Neoplasias

Errores de extraccin o identificacin

Fallos en la tcnica o en el proceso de fabricacin del equipo diagnstico

10

Respuestas anmalas ante la infeccin VIH

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La posibilidad de falsos negativos es extremadamente alarmante en los bancos de


sangre, hemoderivados, y donaciones. En el pasado hemos podido tambin observar
falsos negativos causados por fallos de los equipos de deteccin de anticuerpos VIH. Se
debe descartar el diagnstico de infeccin por el VIH mediante pruebas complementarias
cuando existan factores de riesgo, sntomas u otros datos de laboratorio o indicaciones
clnicas sugestivas de la infeccin por el VIH. A pesar del alto n de variantes del VIH-1,
parece que los ELISAs comerciales pueden detectar la mayora de grupos, subtipos y
recombinantes del VIH-1.

7. ALGORITMO DE DIAGNSTICO DEL VIH-1


El algoritmo de decisiones propuesto para la serologa del VIH debe tener en cuenta
las diferentes situaciones y contexto clnico en los que se produce la demanda de una
prueba de deteccin de anticuerpos anti-VIH. Cuando el objetivo de las pruebas de
deteccin de anticuerpos frente al VIH es el diagnstico de infeccin y la prevalencia de la
misma es inferior al 10%, se recomienda el uso de tres tcnicas con distinto principio o
base antignica, siendo obligado que una de ellas sea el Western Blot. Para diagnosticar a
una persona como positiva las tres pruebas deben ser positivas. Es aconsejable disponer
al menos de dos tcnicas de screening de anticuerpos anti-VIH y utilizar un mtodo de
confirmacin con muestras del mismo paciente tomadas en momentos diferentes.

En la Figura 7 se refleja el algoritmo diagnstico de la infeccin VIH seguido en


Espaa. Es de destacar, que el algoritmo diagnstico puede variar segn el pas y
dependiendo muchas veces de los recursos econmicos de los sistemas sanitarios.Los
informes clnicos de los resultados de estas pruebas deben expresar de forma clara si la
persona es positiva o negativa para los anticuerpos anti-VIH, o si se aconseja un
seguimiento o la realizacin de pruebas adicionales. Cualquier cambio que haga el

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laboratorio respecto a los criterios de positividad adoptados deber comunicarse a los


clnicos que atienden a los pacientes infectados por el VIH.

Figura 7. Algoritmo diagnstico de la infeccin por VIH.

8. IDENTIFICACIN SEROLGICA DEL VIH-2 Y DE COINFECCIONES VIH-1/VIH-2


En Espaa, la casi totalidad de individuos diagnosticados serolgicamente y
confirmados estn infectados por VIH-1. Por ello, cualquiera de las pruebas de
confirmacin basadas en reactividad diferenciada frente a las protenas del virus (WB,
RIPA, IFI) puede servir para identificar el tipo de infeccin VIH. Todas las tcnicas para la
infeccin por VIH-2 se resumen en la Tabla 11.

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Tabla 11: Tcnicas diagnsticas para la infeccin por VIH-2

MTODOS INDIRECTOS
(Deteccin de anticuerpos especficos)
Pruebas de screening: EIA VIH-1+2

MTODOS DIRECTOS
(deteccin del virus o sus cidos nucleicos)
Cocultivo

Pruebas de confirmacin y complementarias: PCR del VIH-2 a partir de ADN proviral o ARN de
viriones circulantes
Western blot de VIH-1 + Gp36 de VIH-2
Western blot de VIH-2
LIA de VIH1+2

Para diagnosticar la infeccin por el VIH-2, se puede emplear un EIA indirecto de 3


generacin (VIH -1/2) y un EIA competitivo (VIH-1). Una positividad elevada en el primer
test y negativo o dbilmente positivo en el segundo test, es muy sugerente de infeccin por
VIH-2. Las tcnicas de EIA que se utilizan habitualmente en el diagnstico de la infeccin
por el VIH-2, desde su aprobacin en 1991 por la Federal Drug Administration
norteamericana, son pruebas mixtas que utilizan pptidos de 10 a 40 aminocidos como
antgenos, tanto del VIH-1 como del VIH-2, obtenidos por ingeniera qumica o
recombinacin gentica. En su diseo, y para evitar falsos positivos por reacciones
cruzadas de ciertos anticuerpos con la gp36, hay que elegir un eptopo inmunorreactivo
especifico de la gp36. Existe tambin una prueba de ELISA que detecta exclusivamente
anticuerpos frente a un pptido sinttico de 11 aminocidos del eptopo inmunodominante
de la glucoprotena de transmembrana (gp36) de la envoltura del VIH-2 y que posee una
buena sensibilidad y especificidad.

Para confirmar la infeccin por el VIH-2, se puede utilizar dos tipos de WB. Uno de
ellos detecta anticuerpos especficos frente a todas las protenas del VIH-1 obtenidas por
cultivo viral y frente a la gp36 o protena transmembrana del VIH-2, que se incorporan en
un extremo diferenciado de la tira como pptido sinttico del VIH-2. La otra alternativa es
utilizar un WB que detecte exclusivamente anticuerpos frente al VIH-2, partiendo por tanto

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de un cultivo infectado por dicho virus. Segn el criterio de la OMS, un WB ser positivo si
existen, al menos, dos bandas de envoltura con o sin otras bandas de gag. Las diferencias
entre protenas del VIH-1 y VIH-2 se resumen en la Tabla 12.

Tabla 12. Diferencias existentes entre el VIH-1 y el VIH-2.

Diferencia en genes

Protenas de env

Protenas de gag

Protenas de pol

VIH-1

VIH-2

vpr

vpx

gp160

gp 140

gp120

gp 105

gp 41

gp 36

p55

p55

p24

p26

p17

p15

p68

p64

p34

p34

p12

p11

Para distinguir adecuadamente los anticuerpos frente a ambos tipos de virus, en los
ltimos aos se ha sugerido que podran utilizarse otro tipo de pruebas complementarias
para la confirmacin y diferenciacin de las infecciones por cada uno de ellos. Estas
pruebas son LIA o inmunoensayos lineales diseados con pptidos sintticos y protenas
recombinantes. Son menos costosas, ms fciles de interpretar y tienen una gran
sensibilidad y especificidad, lo cual permite considerar su uso como prueba de
confirmacin. Sin embargo su mayor inconveniente es que pueden dar falsos negativos,
sobre todo en las infecciones agudas y en las peditricas. Pueden ser usadas como
pruebas confirmatorias en sujetos con prcticas de riesgo. Son un mtodo bueno para
resolver resultados indeterminados

y para

reconocer infecciones

que pasaran

desapercibidas con otras tcnicas.

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En Espaa circula el VIH-2 en muy baja prevalencia, principalmente en inmigrantes


africanos y espordicamente en sujetos espaoles. En algunos de los sueros de dichos
casos se ha observado que puede haber una cierta reactividad en las pruebas de VIH-1 y
una lectura superficial del WB podra confundir a personas poco habituales a esta prueba
de confirmacin. La identificacin de infeccin por VIH-2 se aconseja slo en los casos de
reactividad repetida en pruebas de screening serolgico y con resultados indeterminados
frente a VIH-1 en pruebas de confirmacin. Tambin en individuos con antecedentes de
contactos sexuales con personas de antiguas colonias portuguesas donde circula el virus,
de pases africanos o con prostitutas de esos pases. Las pruebas de pptidos sintticos
(LIA) pueden ayudar a la identificacin serolgica de la infeccin VIH en dichos sueros.Las
coinfecciones por VIH-1 y VIH-2 de difcil confirmacin con pruebas serolgicas
necesitaran ser confirmadas mediante pruebas de diagnstico directo, de las que se
hablar en el siguiente apartado.

9. MTODOS DIAGNSTICOS DIRECTOS


Siguiendo los algoritmos diagnsticos presentados previamente, el diagnstico de la
infeccin por VIH se debe realizar mediante la deteccin de anticuerpos anti-VIH utilizando
mtodos serolgicos. Sin embargo, existen una serie de situaciones en las que no es
posible o no es suficiente. Como ya hemos explicado, las metodologas serolgicas
dependen principalmente de la capacidad de respuesta de anticuerpos del husped (que
en ciertas ocasiones est limitada) y tambin de la variabilidad antignica del virus.
Adems, el periodo ventana o tiempo entre la exposicin al VIH-1 y la produccin de
anticuerpos es variable. Por ello, existen pacientes infectados donde no se han podido
detectar anticuerpos por pruebas serolgicas, cuyas causas posibles se resumieron en la
Tabla 10. Todos estos casos son candidatos a pruebas para el diagnstico directo, as

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como el diagnstico del VIH en nios menores de 18 meses hijos de madres infectadas
por VIH, de lo que se hablar en el apartado 11.4.

Las pruebas para el diagnstico directo del VIH o pruebas virolgicas son las
tcnicas que detectan directamente al virus o a algunos de sus componentes (material
gentico o protenas virales).

Incluyen las tcnicas de deteccin de cidos nucleicos

virales (en ingls NAT, nucleic acid-based technologies), el cultivo vrico, la deteccin de la
presencia de la protena viral p24 y la deteccin de la actividad retrotranscriptasa del VIH
(Tabla 13).
Tabla 13. Mtodos directos para la deteccin de la infeccin por VIH
MTODOS DIAGNSTICOS DIRECTO o PRUEBAS VIROLGICAS

1. Deteccin molecular del material gentico del virus (ARN viral o ADN proviral) (NATs)
1.1. Tcnicas cualitativas (detecta presencia o ausencia de virus):
Amplificacin por la reaccin de la polimerasa en cadena o PCR (convencional o
a tiempo real)
U

Amplicor HIV-1 DNA Test v1.5 (RUO) (Roche Diagnostics)


COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Qualitative Test (Roche Diagnostics)
Real Time RUO Qualitative HIV-1 (Abbott)
P

1.2. Tcnicas cuantitativas (cuantifica virus: carga viral)


1.2.1. Basadas en amplificacin de cidos nucleicos empleando PCR a tiempo
real
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Quantitative Test version 2.0 (Roche
U

Diagnostics)
RealTime HIV-1 m2000 (Abbott), Versant HIV RNA 1.0 (kPCR) (Siemens)
ArtusTM HIV-1 QS-RGD (Qiagen)
P

1.2.2. Basadas en amplificacin de cidos nucleicos


NASBA:

empleando tecnologa

NucliSens EasyQ HIV-1 v2.0 (bioMrieux),

1.2.3. Basados en la amplificacin de una seal unida a molculas de ARN viral o


bDNA:
Versant HIV-1 RNA v3.0 (Siemens)
P

2. Cultivo del virus


3. Deteccin de antigenemia (antgeno p24 viral) ExaVir Load versin 3.0 (Cavidi)
4. Deteccin de la actividad retrotranscriptasa (RT) viral HIV-1 p24 Ultra ELISA (Perkin
Elmer)
Ver ms detalles de cada tcnica en: http://www.unitaid.org/images/marketdynamics/publications/UNITAIDHIV_Diagnostic_Landscape-3rd_edition.pdf. Con asterisco, los ensayos que detectan 2 regiones virales. El
resto slo detecta una regin.
9TU

U9T

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Las pruebas que analizan la presencia del genoma vrico (ARN viral o ADN proviral)
constituyen el mejor recurso diagnstico de la infeccin por VIH-1 y actualmente las
tcnicas comercializadas por Abbott, bioMrieux, Roche y Siemens dominan el mercado.
La mayora se basa en la amplificacin de cidos nucleicos. Sin embargo, existe un alto
nmero de tcnicas moleculares cualitativas y cuantitativas no comerciales y en desarrollo.
El aislamiento por cultivo es una metodologa compleja y, como la deteccin del Ag p24,
no goza de gran sensibilidad, aunque tienen una aplicabilidad demostrada en ciertos
casos. La medida in vitro de la actividad retrotranscriptasa de la protena RT viral en una
muestra puede determinar la presencia del virus e incluso cuantificarlo. Inicialmente
empleaba istopos radiactivos, pero se ha desarrollado un ensayo comercial que evita el
uso de radiactividad.

9.1. DETECCIN MOLECULAR DE CIDOS NUCLICOS

9.1.1. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La tcnica del PCR (reaccin en cadena de la polimerasa o polymerase chain


reaction) es una tcnica rpida, reproducible y muy sensible que puede amplificar in vitro
regiones genticas de inters a partir de mnimas cantidades de material de partida para
llegar a producir millones de copias de las mismas (Fig. 8). As, la PCR permite amplificar
el ARN del VIH circulante en el organismo infectado (siempre que se pase a ADN
complementario en una reaccin previa catalizada por una retrotranscriptasa comercial), o
el ADN proviral del VIH integrado en el ADN celular. El PCR diagnstico puede demostrar
la presencia del VIH a partir de muestras de sangre perifrica principalmente, aunque se
podra realizar a partir de cualquier fluido, tejido o clulas infectadas. Se considera una
tcnica de deteccin molecular del material gentico viral, y puede ser usada con fines
cualitativos o cuantitativos.

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La reaccin de PCR est catalizada por una ADN polimerasa termoestable. La


amplificacin es el resultado de la repeticin de una serie de ciclos compuestos por tres
etapas:

desnaturalizacin

del

ADN,

hibridacin

elongacin

(Fig.

8).

La

desnaturalizacin del ADN se requiere para separar las dos cadenas de ADN y permitir
as que la ADN polimerasa pueda empezar a elongar o iniciar la reaccin de sntesis de
ADN. Se realiza aplicando temperaturas altas (94-95C) durante 3-5 minutos para asegurar
que todo el ADN (molde y oligonucletidos iniciadores) quede en forma monocatenaria y
sin estructuras secundarias. El calor disocia los puentes de hidrgeno que mantienen
unidas las dos cadenas de ADN molde y adems destruye la actividad enzimtica de la
mayora de las enzimas. Por ello las ADN polimerasas empleadas en el PCR deben ser
termoestables y no desnaturalizarse ni perder su funcin a esas altas temperaturas.
Existen varias ADN polimerasas termoestables, siendo las ms utilizadas variantes
recombinantes de la Taq polimerasa obtenida de la bacteria termfila Thermus aquaticus.
Si partiramos de ARN viral en vez de ADN, requeriramos un paso previo de
retrotranscripcin del ARN viral a ADN complementario catalizado por una RT comercial
que se amplificara por PCR

La amplificacin se realiza diseando dos cebadores u oligonucletidos iniciadores


(o primers) sintticos adecuados que hibridan con los extremos de la secuencia diana a
amplificar elegida en el genoma viral. Deben ser complementarios a dichos extremos y en
sentido antiparalelo uno respecto al otro. En la fase de hibridacin de los
oligonucletidos iniciadores, con diseo especfico segn la regin a amplificar, se hace
disminuir la temperatura para que puedan unirse a las secuencias complementarias en el
ADN molde. La temperatura de hibridacin depende de la longitud del oligonucletido y de
su composicin de nucletidos. La longitud es variable, pero lo normal es que tengan de
17 a 30 nucletidos.

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Figura 8. Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR.

La elongacin es el ltimo paso de un ciclo de PCR. En ella, la Taq polimerasa


utiliza los dNTPs presentes en el medio o buffer de reaccin para sintetizar la cadena
complementaria a partir

del oligonucletido hibridado con su secuencia diana.

Generalmente se emplea una temperatura de 72C en este paso. Las nuevas cadenas de
ADN formado sirven, a su vez, de molde en el ciclo siguiente. Por ello, se produce una
amplificacin exponencial del material de partida igual a 2n, siendo n el n de ciclos
P

realizados en el PCR. Normalmente durante la amplificacin del VIH por PCR se requieren
entre 35-40 ciclos de amplificacin. Despus del ltimo ciclo del PCR se suele realizar una
elongacin final prolongada, de 5-10 minutos, a 72C para que terminen todas las
elongaciones parciales en curso y confirmar que todas las cadenas de ADN se han
elongado correctamente. En la PCR convencional los oligonucletidos no llevan
fluorescencia y la deteccin del producto se realiza tras finalizar la amplificacin y realizar

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una electroforesis en gel de agarosa, que separa molculas por su tamao. El amplificado
se visualiza despus empleando agentes intercalantes del ADN.

Una modalidad de la PCR es la PCR a tiempo real (real time PCR), que emplean
primers y/o sondas especficas marcados con fluorescencia, empleando distintos mtodos
de deteccin segn la tcnica. En ella se puede detectar la amplificacin viral desde el
primer ciclo de amplificacin. La mayor parte de tcnicas cuali y cuantitativas (tcnicas de
carga viral) de deteccin de ARN viral y ADN proviral se basan en PCR a tiempo real,
como indicaremos ms adelante. Otra modalidad es el nested PCR, que amplifica un
producto de PCR ya amplificado previamente, pero empleando primers internos a los
usado en el primer PCR. Muchos laboratorios usan el nested PCR para amplificar una o
varias regiones del virus por PCR convencional cuando las muestras tienen baja carga
viral o cuando se parte de volmenes de muestra pequeos, tanto con fines diagnsticos
como para identificar resistencias a antirretrovirales.

Existen varias situaciones en las que la PCR resulta imprescindible para el


diagnstico de la infeccin por VIH (Tabla 14). En esos casos el PCR logra un diagnstico
ms rpido y precoz de la infeccin VIH en situaciones en las que el diagnstico clsico
serolgico puede tardar en confirmarse. El grado de estandarizacin de estas pruebas, as
como la disponibilidad de reactivos no siempre es igual en los distintos pases. Hasta el
momento, existen reactivos comercializados para PCR diagnstica de VIH-1 pero no para
el VIH-2.

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Tabla 14. Indicaciones actuales del PCR como diagnstico del VIH

1. En recin nacido de madres infectadas por VIH o con antecedentes de riesgo de infeccin VIH

durante el embarazo.
2. Para confirmar la infeccin en nios seropositivos menores de 18 meses.
3. En sujetos con patrn serolgico indeterminado
4. Para demostrar infecciones por VIH-2 con serologa no concluyente o coinfecciones VIH-1+VIH-2.
5. En sujetos con infeccin aguda que todava no han desarrollado anticuerpos frente el VIH.

La PCR es imprescindible para el diagnstico del VIH en nios menores de 18


meses con riesgo de haber contrado la infeccin durante el embarazo, parto o lactancia
materna al nacer de una mujer seropositiva. Es importante recordar que los nios no
producen sus propios anticuerpos hasta que su sistema inmune madura. Ya que los
anticuerpos de la madre pueden persistir en ellos hasta los 15-18 meses (y en algunos
casos incluso ms tiempo), sus hijos podran tener anticuerpos maternos hasta el primer
ao y medio de vida pero no estar infectados con el VIH. Por eso, en nios de madre
infectada por VIH el diagnstico serolgico no es til porque presentan el mismo patrn de
anticuerpos frente al VIH que su madre seropositiva. Por tanto, el uso de mtodos directos
es el ms adecuado para el diagnstico precoz.

La presencia de VIH-2 se puede confirmar por tcnicas de diagnstico directas, bien


realizando un cocultivo del virus o por amplificacin de su genoma por PCR,
principalmente del ADN proviral. El aislamiento en cocultivo es muy difcil. Adems, la
carga proviral del VIH-2 es sensiblemente inferior a la del VIH-1, quizs porque existe
menor nmero de linfocitos CD4 infectados. Esto explica que, incluso mediante una PCR
nested no se detecte el cido nucleico en algunos pacientes que realmente estn
infectados. En la actualidad, mediante tcnicas ultrasensibles, se detecta entre el 95 y el
98% de los pacientes infectados por VIH-2. La confirmacin por tcnicas de biologa
molecular no se puede asegurar en el 100% de las infecciones por el VIH-2, ya que

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depender de un diseo acertado de los oligonucletidos empleados en el PCR que cubra


la mayor variabilidad posible del VIH-2 y de la cantidad de virus (carga viral) en el paciente.

La deteccin cualitativa del virus por PCR presenta una alta especificidad en la
deteccin de secuencias de ADN proviral, con una sensibilidad del 30-50% en la primera
semana de vida y entre un 95-100% en nios mayores de un mes. Adems, a diferencia
del cultivo del virus, en 1 o 2 das se puede tener los resultados.

Un inconveniente de las tcnicas de deteccin de cidos nucleicos es que estn


diseadas para detectar VIH-1 de grupo M subtipo B, y no siempre detectan con la misma
fiabilidad variantes del VIH de otro tipo, grupo o subtipo, pudiendo dar falsos negativos.
Por ejemplo, la infeccin por ciertos subtipos no-B y recombinantes del VIH-1 tambin
puede ser responsable de falsos negativos por PCR (tanto en nios como en adultos), ya
que usan oligonucletidos diseados bsicamente para amplificar principalmente cepas B.
Dado que la mayora de los nios que se infectan por VIH-1 lo hacen en pases de
recursos limitados donde los subtipos no-B y recombinantes son prevalentes, es
importante conocer la variabilidad gentica en las regiones del virus que hibridan con
primers o sondas que se empleen en las tcnicas de diagnstico molecular, ya que su
eficacia diagnstica podra verse afectada y dar lugar a falsos negativos. Tambin se ha
estimado que la prevalencia de transmisin vertical del VIH de madre a hijo afectara a la
tasa de falsos positivos en diagnstico de nios menores de 18 meses por tcnicas de
deteccin molecular de ADN proviral, que alcanza valores mayores a menor prevalencia
de transmisin vertical. En el apartado 11.4 se enumerarn los factores que pueden
afectar al diagnstico molecular perinatal.

9.1.2. CARGA VIRAL DEL VIH


La carga viral (CV) o viremia es la cantidad de virus que existe en una determinada
muestra, habitualmente es plasma o suero. Se expresa como n de copias de ARN viral/ml
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o el logaritmos decimales. Debe tenerse en cuenta que el VIH-1 circulante en sangre est
por debajo del 2% del total existente en todo el cuerpo, estando el resto en los tejidos
linfticos y otros tejidos. Por tanto, tambin podemos determinar la carga viral en tejidos
infectados y en otros fluidos biolgicos. Aunque se estima que la CV del plasma es un
buen reflejo de lo que ocurre en el sistema linftico, no existe tanta informacin sobre lo
que ocurre en los otros fluidos (saliva, orina, semen, fluido vaginal, lquido cefalorraqudeo
o LCR, etc) y tejidos.

9.1.2.1. Indicaciones actuales de la carga viral

La CV es un marcador de la actividad replicativa del VIH-1, que ayuda a monitorizar


el tratamiento antirretroviral, a estimar el riesgo de transmisin, a predecir la progresin en
el curso de la infeccin por VIH, e incluso ayuda al diagnstico en ocasiones muy
puntuales (Tabla 15). Se considera una tcnica de deteccin molecular cuantitativa del
ARN del VIH.

Tabla 15. Indicaciones actuales de la carga viral

1. Monitorizar el tratamiento con antirretrovirales para ayudar a determinar:


- Cundo se debe iniciar el tratamiento.
- Cundo estn siendo eficaces los antirretrovirales.
- Cundo estn fracasando (resistencias) y se deben cambiar
2. Estimar el riesgo de transmisin, especialmente la materno-fetal
3. Predecir la progresin clnica de la infeccin VIH/SIDA.
4. Ayuda al diagnstico en situaciones especiales (infeccin aguda y
perinatal)

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El uso ms habitual que se le da a la determinacin de la CV plasmtica es la


monitorizacin del tratamiento antirretroviral (TAR). La CV debe tenerse en cuenta
cuando se inician los tratamientos y su uso resulta esencial para valorar la respuesta al
tratamiento, al demostrarse una asociacin significativa entre la reduccin de la CV y la
mejora en el seguimiento clnico. Una meta del tratamiento anti-VIH es mantener los
niveles de carga viral lo ms bajos posibles y durante el mayor tiempo posible. La mayora
de los pacientes infectados que no reciben tratamiento tienen una carga viral detectable en
rango muy amplio que puede llegar a ms de 10 millones de copias/ml. Con regmenes de
TAR

eficaces, la carga viral se puede reducir a niveles que no se pueden detectar

mediante pruebas de laboratorio (normalmente entre 10-50 copias/ml). En general se


espera una reduccin de 1 log 10 en la primera semana, y 2 log 10 en la semana 4.
R

Dependiendo del nivel basal, la CV debera ser indetectable entre las 16-24 semanas del
inicio de tratamiento en pacientes naive, si el paciente tiene buena adherencia al
tratamiento y siempre que no hayan aparecido mutaciones de resistencias a los frmacos
ARV. En pacientes que han fracasado a mltiples tratamientos este objetivo en ocasiones
no es posible y se considera respuesta al tratamiento una reduccin de CV de, al menos, 1
log 10 . En el apartado 11.3 se complementar esta informacin.
R

Adems la CV sirve para valorar el riesgo de transmisin, porque cuanto mayor


es la viremia, mayor es el riesgo de transmisin del virus por cualquiera de las vas por las
que se transmite. Aunque no puede excluirse completamente, la transmisin del VIH tanto
por contacto sexual como por punciones accidentales con agujas, es muy poco probable si
la CV es indetectable.

Tambin las determinaciones de la CV se usan en la prediccin de progresin


clnica en pacientes infectados. Durante el periodo de infeccin primaria en adultos, la CV
plasmtica inicial se eleva para despus descender, coincidiendo con la respuesta inmune

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humoral y celular (Fig.1). Los valores de CV descienden 2-3 log 10 hasta alcanzar un valor
R

bajo y estable, aproximadamente a los 6-12 meses tras la infeccin aguda. Esto refleja el
continuo equilibrio entre produccin viral y eliminacin inmune. Una CV baja en el
momento de la estabilizacin se asocia con una progresin ms lenta y una mejor
supervivencia, frente a aquellos individuos con CV elevadas. La carga viral tambin puede
aumentar rpidamente en situaciones en las que se produce un estmulo inmunolgico que
aumenta la produccin de partculas vricas por los linfocitos infectados. Estos episodios se
han descrito en infecciones activas (tales como tuberculosis, neumona por Pneumocystis
jiroveci, etc.) y tras la administracin de vacunas.

Los datos de los nios con ms de 30 meses de edad son similares a los datos de
estudios realizados en adultos infectados, en los que el riesgo de progresin de la
enfermedad aumenta sustancialmente cuando la CV es superior a 10.000-20.000
copias/ml (4-4,3 log 10 ). En nios menores de 12 meses de edad, una CV >100.000
R

copias/ml (5 log 10 ) se correlaciona con progresin de la enfermedad y mortalidad,


R

incrementndose esta probabilidad si el porcentaje de linfocitos T CD4+ es <15%. A pesar


de que estos datos indican que una CV alta se asocia con progresin de la enfermedad,
durante el primer ao de vida la interpretacin de su valor es difcil. Ello se debe a que los
valores de CV son altos y existe un marcado solapamiento entre los valores de la CV de
los nios que van a progresar rpidamente a sida y aquellos que no. Los datos indican que
los valores basales del porcentaje de linfocitos T CD4+ y CV y los cambios en estos
parmetros, ayudan a determinar el riesgo de mortalidad en los nios infectados. Por ello
se recomienda el empleo de ambos marcadores conjuntamente para predecir con mayor
precisin el pronstico de la infeccin.

Aunque la CV no est indicada para el diagnstico en infeccin aguda, en ciertas


ocasiones es til porque permite detectar partculas virales pocos das despus de la

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exposicin, reduciendo considerablemente el periodo ventana. Del mismo modo puede


utilizarse para el diagnstico perinatal precoz del VIH en nios nacidos de madres
infectadas por VIH, porque las pruebas de diagnstico serolgico no seran adecuadas.
Durante las primeras semanas de infeccin los anticuerpos especficos anti-VIH no son
detectables por las tcnicas diagnsticas rutinarias. Sin embargo la replicacin del virus es
muy activa en ese momento y alcanza su mximo alrededor de los 10 das post-infeccin,
lo que a menudo coincide con la fase sintomtica.

Aunque formalmente las tcnicas para la determinacin de CV del VIH no tienen un


diseo cualitativo (positivo-negativo), dada su sensibilidad se utilizan frecuentemente para
cubrir el diagnstico de una posible infeccin aguda por el VIH. Si bien la sensibilidad de la
tcnica para este propsito es excelente, conviene tener en cuenta la eventualidad de
resultados falsos positivos. Como se dijo anteriormente, generalmente la viremia durante
las primeras semanas de la infeccin es muy elevada, en general >100.000 copias de ARN
viral/ml, por lo que deben interpretarse con muchas reservas los resultados con valores
bajos (<10.000 c/ml). En cualquiera de los casos, para poder informar un diagnstico
positivo por CV se debe obtener una cuantificacin elevada. Sin embargo es
recomendable confirmar el diagnstico con otros mtodos directos especficos (PCR o
cultivo), ya que es posible obtener falsos positivos por la tcnica de CV.

9.1.2.2. Tcnicas disponibles para la cuantificacin de la carga viral plasmtica

En la actualidad hay varias tcnicas pruebas comercializadas pueden utilizarse para


medir la carga viral de VIH y que emplean varios mtodos de biologa molecular (Tabla
16). stas estiman de forma cuantitativa la concentracin de viriones en la circulacin, con
una sensibilidad de 20-50 copias de ARN de VIH por ml de plasma utilizando entre 100 l y
2 ml de plasma. Cada una de ellas utiliza tcnicas de deteccin diferentes. Tambin
existen tcnicas comerciales ultrasensibles que llegan a detectar hasta 1 copia de ARNDIAGNSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCION POR VIH
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VIH-1/ml de plasma. Es importante que la muestra se recoja sin aadir ningn compuesto
que pueda interferir posteriormente en el funcionamiento de los mtodos de cuantificacin.
Por ello, se recomienda el uso del EDTA como anticoagulante, ya que otros como la
heparina podran interferir con algunos de los reactivos empleados en la amplificacin por
PCR del VIH circulante.

Tabla 16. Tcnicas comerciales para la cuantificacin de la carga viral


plasmtica.

TCNICAS DE CARGA VIRAL


Mtodos basados en la amplificacin de cidos nucleicos
1. Amplificacin por PCR a tiempo real
- COBAS TaqMan v2.0 (Roche Diagnostics)
P

- Abbott RealTime HIV-1 m2000


- VersantTM HIV RNA 1.0 (kPCR) (Siemens)
- ArtusTM HIV-1 QS-RGD (Qiagen)
P

2. Amplificacin por tecnologa NASBA


- NucliSens EasyQ HIV-1 v2.0 (bioMrieux),
Mtodos basados en la amplificacin de una seal unida a molculas de ARN del
virus
Branched chain DNA (bDNA)
-

Versant HIV-1 RNA v3.0 (Siemens)


P

En la Tabla 17 se recogen todas las particularidades tcnicas y operativas de las


tcnicas de CV mostradas en la Tabla 16. Todas las tcnicas para la determinacin de CV
del VIH-1 comerciales deben de estar aprobadas para su uso por instituciones acreditadas,
como por la Unin Europea (marcado CE), por la FDA en Estados Unidos o por la
OMS.Los ensayos de carga viral se diferencian en la tcnica empleada, en el diseo de
primers y sondas, en la regin o regiones virales detectadas, en el tipo de muestras
validadas, en los volmenes de muestras requeridos y en sus lmites de deteccin. Las

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diferencias tcnicas fundamentales radican en los mtodos de deteccin, en los formatos,


tiempos, instrumentacin requerida y capacidad de procesamiento. Algunas ya se han
validado para su uso empleando tan slo unas gotas de sangre seca recogidas en papel
de filtro especial (DBS, dried blood spots). Sin embargo, las viremias obtenidas empleando
DBS han de corregirse para dar copias de ARN-VIH-1/ml de plasma, teniendo en cuenta el
volumen de plasma que hay en la sangre seca empleada en la determinacin (correccin
por volumen), lo que requiere idealmente requiere conocer el porcentaje de hematocrito en
cada muestra o emplear un valor promedio estimado.

La reciente introduccin de la extraccin automtica de cidos nucleicos supone un


considerable ahorro de trabajo manual y reduce las posibilidades de variabilidad
relacionadas con una de las fases ms crticas del procedimiento. Las tcnicas de CV en
plasma son ensayos reproducibles en general y ms sensibles que el cultivo viral y la
deteccin de antgeno p24. Sin embargo, valores de CV proporcionados por distintas
tcnicas no son siempre estrictamente comparables cuando se cuantifican ciertos subtipos
y recombinantes del VIH-1, como comentamos al final del apartado 9.1.1. As las sondas o
primers empleados por los ensayos de CV estn diseados para hibridar o amplificar
bsicamente secuencias de subtipos B del VIH-1. Ello podra originar un resultado falso
negativo, o un valor positivo de carga viral pero errneo en muestras de otros subtipos.
Esto ltimo resulta crtico tanto para la eleccin inicial del TAR como en las pautas
sucesivas de tratamiento durante el seguimiento clnico del paciente infectado por
variantes no-B del VIH-1.

Cada vez hay ms publicaciones comunicando diferencias en la cuantificacin de la


carga viral del VIH-1 entre tcnicas e incluso entre versiones diferentes de la misma
tcnica para algunas muestras de subtipos no-B y recombinantes entre subtipos,
encontrndose diferencias mayores de 0.5 log 10 e incluso de >1 log 10 de CV en
R

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porcentajes muy importantes de muestras de variantes no-B del VIH-1 cuando se


cuantifican con tcnicas diferentes en paralelo. Con respecto a otros grupos del VIH-1, no
todas cuantifican los grupos O y N del VIH-1. Ninguna de las tcnicas licenciadas detecta
el VIH-2, aunque previamente el Nuclisens EasyQ cuantificaba el subtipo A, ahora no est
entre sus especificaciones (Tabla 17).

Aunque la determinacin de la CV del VIH en muestras que no son plasma no est


estandarizada, en ocasiones es necesaria su realizacin en el contexto de estudios de
investigacin o bajo peticin expresa y puntual del clnico responsable. La sangre seca se
puede emplear para cuantificar la CV si no se dispone de gran cantidad de sangre, si no es
posible la toma de plasma por causas tcnicas o para facilitar el transporte de la muestra a
laboratorios de referencia. El Lquido cefalorraqudeo (LCR) se puede procesar por la
mayora de los procedimientos de manera similar al plasma y conviene centrifugarlo en las
mismas condiciones que la sangre total para separar clulas inflamatorias y hemates
antes de emplearlo para la CV. Respecto al semen y otros fluidos es posible adaptar las
tcnicas para la determinacin de la viremia, tanto en el propio semen, como en muestras
cervico-vaginales e incluso en tejidos. En estos casos es necesario realizar la extraccin
previa de cidos nucleicos, ya que la viscosidad de las muestras impide el procesamiento
automtico por algunos de los sistemas. Se trata igualmente de procedimientos
experimentales que se realizan en estudios de investigacin y la interpretacin de los
resultados adquiere significado nicamente para el contexto en el que se realiza.

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Tabla 17. Caractersticas de las tcnicas de cuantificacin de carga vral.

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Las variables a tener en cuenta en estas tcnicas de cuantificacin de la viremia se


resumen en la tabla siguiente.

Tabla 18. Variables considerar en las tcnicas de cuantificacin del VIH.

Sensibilidad o lmite de
deteccin

Es la concentracin mnima de ARN detectada con una


probabilidad del 95% o superior.

Especificidad

Es la probabilidad de dar falsos positivos

Reproducibilidad
Linealidad

9.2.

Trata de definir que los resultados no presenten


diferencias significativas tras repetir el ensayo varias veces
Establece los valores de carga viral entre los cuales la
determinacin es precisa

ANTIGENEMIA O DETECCIN DEL ANTGENO P24

La p24, protena de la cpsida del VIH (Fig. 9), se puede detectar en la sangre, en
tejidos y fluidos biolgicos infectados. La antigenemia p24 detecta la cantidad de esa
protena, siendo proporcional a la cantidad de virus producido en la muestra a estudiar,
incluyendo virus infecciosos y defectivos. Se expresa como picogramos/ml. La protena
p24 se puede reconocer desde la primoinfeccin por VIH-1 y por VIH-2, en ausencia de
otros marcadores serolgicos, aunque este periodo ventana suele ser leve. Tambin se
emplea para el reconocimiento de la replicacin del VIH en cultivos. La antigenemia p24
muestra una buena correlacin con la carga viral, siendo el coste mucho ms reducido y
constituyendo una tcnica alternativa para la monitorizacin de pacientes infectados por el
VIH en pases de recursos limitados.

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Figura 9. Localizacin de la protena p24 en el VIH.

La aparicin de la protena viral p24 libre en el curso de la infeccin sera el


resultado de una mayor replicacin vrica y su persistencia es marcador de mal pronstico
y de progresin de la infeccin. La presencia de p24 puede demostrarse en lquido
cefalorraqudeo en diferentes estadios de la infeccin, como expresin de la multiplicacin
neurolgica del virus.

La deteccin del antgeno p24 se realiza por un inmunoensayo enzimtico (EIA o


ELISA) comercial que detecta las protenas de la cpside viral (p24 en VIH-1 y p27 en VIH2) en el suero, plasma y LCR (Fig. 10). La mayora de esos ELISA utilizan pptidos
recombinantes o sintticos de p24. Las muestras pueden almacenarse a 4C durante una
semana y ms tiempo a -20C. Para almacenamiento prolongado es recomendable
guardarlas a -70C, para evitar la desnaturalizacin del antgeno. Para este tipo de
ensayos deben rechazarse muestras turbias, hemolizadas, o repetidamente congeladas y
descongeladas.

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Figura 10. Deteccin del antgeno p24 por EIA o ELISA.

Como se mostr en la Fig. 1 del apartado 2, el antgeno p24 aparece en suero a los
11-13 das de la infeccin por VIH, y se puede detectar durante 1 mes y medio
aproximadamente. El aclaramiento posterior del p24 es debido, entre otros factores, a la
formacin de inmunocomplejos por la aparicin de anticuerpos circulantes anti-P24. El
tratamiento por calor del suero/plasma puede disociar inmunocomplejos antes de medir el
p24, permitiendo aumentar la sensibilidad de la antigenemia y evaluar la cantidad libre y
combinada de esta protena. Las aplicaciones de la antigenemia p24 se resumen en la
Tabla 19.

Tabla 19. Aplicaciones de la antigenemia p24.

1. Diagnstico precoz de la infeccin aguda por VIH


2. Diagnstico de la infeccin por va vertical
3. Valor predictivo de la evolucin clnica
4. Monitorizacin de respuesta a antirretrovirales
5. Correlacin con alta carga viral
6. Reconocimiento de la replicacin del VIH en cultivos

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La tcnica para detectar p24 es muy especfica, al emplear anticuerpos especficos


contra la protena viral de inters, llegando al 100% en nios. Sin embargo, su sensibilidad
es variable y menor que el WB, el cultivo o la PCR. Su sensibilidad en nios recin nacidos
infectados puede ser de slo un 20%. Tienen la ventaja de permitir una semi-cuantificacin
del ttulo de dichos anticuerpos anti-p24. En algunos casos pueden presentarse falsos
positivos en la deteccin de anticuerpos anti-p24 debido a reacciones heterogneas con
diversos antgenos. Por ello no es aconsejable hacer este tipo de determinacin sin la
confirmacin previa de la infeccin VIH en un individuo por pruebas diagnsticas
serolgicas.

La deteccin de p24 para diagnstico en el perodo ventana es de menor utilidad y


debera reservarse slo ante signos clnicos compatibles con la primoinfeccin en caso de
exposicin conocida o sospechada. En los casos peditricos, la deteccin de antgeno p24
confirmada es indicativo de infeccin y puede agilizar el diagnstico, sobre todo cuando no
hay infraestructura para realizar otras pruebas para detectar la presencia de virus como la
amplificacin gentica viral por PCR o el cultivo viral. En estos casos la deteccin de p24
libre o en inmunocomplejos ofrece una alternativa diagnstica ms asequible.

9.3. AISLAMIENTO DEL VIH Y CULTIVO VIRAL

El VIH se puede aislar de clulas infectadas de diversos tejidos humanos


susceptibles a la infeccin, de fluidos biolgicos y de tejidos a los que ha llegado el virus
por la circulacin sangunea (Tabla 20). El aislamiento del VIH sigue siendo hoy en da
una tcnica de referencia, aunque su empleo quede restringido a laboratorios bien
equipados y con personal entrenado y cualificado.

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Tabla 20. Aislamiento del VIH.


Clulas infectadas

- Clulas del tejido linfoide (linfocitos T CD4 , linfocitos T CD8, monolitos,


macrfagos, linfocitos B, clulas Natural Killer, etc)
U

- Clulas del tejido nervioso (microgla)


U

- Clulas del tejido epitelial (clulas mucosas del intestino, clulas de


Langerhans, clulas dendrticas, etc)
U

- Otras
Fluidos biolgicos

Plasma, lgrimas, semen, secreciones vaginales, orina, leche materna,


secreciones del odo, saliva, lquido cefalorraqudeo, sudor, heces

Tejidos

Ganglios linfticos, bazo, tejido linfoide asociado al intestino (GALT)


13T

13T

La eficacia del aislamiento del VIH depender del fluido orgnico y del tipo de clula
que se extraiga del paciente, as como de su estadio clnico y de la cantidad de virus que
lo infecte. Se sabe que el n de clulas infectadas en el individuo est directamente
relacionado con su CV en plasma, aunque el porcentaje de clulas infectadas por VIH no
es muy elevado. En pacientes asintomticos con ms de 500 CD4+, tan slo un linfocito T
CD4+ de cada diez mil o cien mil est infectado por el VIH. Sin embargo, cuando existen
entre 200 y 500 CD4, se estima 10 veces ms el nmero de clulas infectadas, pasando a
1 clula infectada por cada 10-100 en estadios avanzados de la enfermedad en pacientes
con linfocitos CD4<200. Esto indica que una elevada proporcin de los linfocitos T CD4+
del paciente permanecera sin infectar.
Si analizamos qu clulas estn replicando activamente el virus, las cifras
disminuyen todava ms, ya que slo el 10 % de las clulas que contienen el genoma del
VIH integrado estn produciendo nuevos viriones. En otras palabras, slo el 10 % de las
clulas infectadas presentan replicacin activa del VIH. En el resto de las clulas, el VIH
permanece inactivo y produce viriones a bajo nivel. No est claro si esas cifras pueden
reflejar lo que ocurre en otros rganos y tejidos del cuerpo, ya que los linfocitos de sangre
perifrica slo representan un bajo porcentaje del total.

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El conocimiento de los niveles de VIH en los diferentes fluidos corporales, a lo largo


de la historia natural de la enfermedad, es de gran utilidad para establecer la relacin entre
los niveles detectados y la transmisin del virus. La eficacia de aislamiento del VIH en
fluidos biolgicos donde est presente el VIH se muestra en la Tabla 21.

Tabla 21. Eficacia del aislamiento del VIH en fluidos corporales.


Fluidos

n aislamientos/ n total (%)

Plasma
33/33 (100 %)
Lgrimas
2/5
(40 %)
Semen
5/15 (33 %)
Secrecin vaginal
5/16 (31 %)
Orina
1/5
(20 %)
Leche
1/5
(20 %)
Secreciones del odo
1/8
(12.5 %)
Saliva
3/55 (5.4 %)
LCR
2/86 (0.02 %)
Sudor
0/2
(0 %)
Heces
0/2
(0 %)
LCR, lquido cefalorraqudeo. ND: no detectado.

cantidad estimada
(partculas infecciosas/ml)
1-5.000
<1
10-50
<1
<1
<1
5-10
<1
<200
ND
ND

En el plasma existe un porcentaje muy elevado de viriones. Sin embargo tambin


hay virus en las lgrimas, orina y saliva, siendo su concentracin es tan baja que la
frecuencia de aislamiento o de infeccin por contacto directo es prcticamente inexistente.
Se han publicado casos de nios que se han infectado con VIH a travs de la lactancia
materna cuando sus madres seropositivas presentaban altas cargas virales. La facilidad
para extraer la sangre en los pacientes y la obtencin de un volumen de muestra
adecuado, le permite ser la fuente de aislamiento de virus para diagnstico, prcticas
clnicas e investigacin.
El cultivo del virus se puede realizar a partir de muestras clnicas que contengan
virus libres o clulas infectadas. La carga viral en el individuo con VIH-1 o VIH-2 es un
factor crtico a la hora de poder cultivar el virus que lo infecta, ya que a mayor carga viral,
mayor eficiencia en el aislamiento. Existe un protocolo totalmente extendido por todos los
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laboratorios que trabajan con el VIH para recuperar virus de pacientes infectados a partir
de linfocitos de sangre perifrica (tambin llamados PBMC por sus siglas en ingls), que
incluyen linfocitos y monocitos. Consiste en cultivar los linfocitos extrados del paciente con
linfocitos procedentes de donantes sanos. Mediante esta tcnica llamada cocultivo se
consigue aislar el virus de pacientes (Fig. 11).

Para realizar el cocultivo se extrae la sangre del paciente en presencia de un agente


anticoagulante (heparina, citrato sdico, EDTA) y los PBMC del paciente VIH+ se separan
del plasma y del resto de los componentes celulares por medio de una centrifugacin en
gradiente de ficol. La sangre debe de ser procesada lo ms pronto posible. Los PBMCs
pueden ser crioconservados en nitrgeno lquido en medio RPMI en presencia de 20-50 %
de suero bovino fetal (SBF) y un 10 % de dimetilsulfxido (DMSO), en condiciones de
esterilidad para poderlos cultivar cuando se requiera. El medio RPMI lleva aminocidos,
sales, vitaminas, e indicador de pH, entre otros componentes. Los PBMCs del paciente se
U

cultivan a 37C en atmsfera de 5% de CO en medios ordinarios (RPMI complementado


R

con 5-10% de suero de ternera fetal, antibiticos y el aminocido glutamina). A stos se


aade la interleuquina 2 (IL-2), un factor de crecimiento de linfocitos, junto con PBMCs de
U

donante sano previamente estimulados con un mitgeno (fitohemaglutinina o PHA). ste


U

estimular su proliferacin celular y la expresin de receptores de IL-2 en la superficie


celular, lo cual facilitar su infeccin posterior por los virus producidos por los PBMCs del
paciente infectado.

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Figura 11. Aislamiento del VIH a partir de linfocitos de sangre perifrica (PBMCs).

Plasma
(ficol)

Nube de
Linfocitos
(PBMCs)

En el cocultivo generalmente se usan clulas del paciente y del donante


estimuladas en una proporcin 1:1 o 1:3, tratando de no exceder de 107-108 clulas en el
P

volumen final de cultivo. Normalmente las clulas se cultivan a una concentracin de 1-2 x
106 clulas/ ml. Una o dos veces por semana se aade clulas frescas de donante que
P

previamente han sido estimuladas con PHA durante 2-3 das, lavadas y resuspendidas en
medio RPMI complementado y con IL-2. As se aportan nuevas clulas diana para ser
infectadas por el virus producido en el cultivo, y se logra un mayor rendimiento en el
aislamiento del VIH. Hay que tener en cuenta que, debido a las rondas de replicacin que
sufre el VIH durante el cocultivo, se pueden introducir mutaciones en su genoma que no
aparecan antes.

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La presencia del VIH en el cocultivo se puede detectar por diversas tcnicas (Tabla
22). La ms empleada es la deteccin del antgeno viral p24 por ELISA, que explicamos
previamente. A lo largo de la duracin del cultivo se produce un pico de p24, en torno al
da 10 del cocultivo. El umbral de deteccin es 7-125 pg/ml en ciertos ensayos
comerciales, considerndose una muestra como positiva cuando se detectan al menos 30
pg/ml. Ese valor se incrementa en muestras consecutivas del cultivo.

Tambin se puede detectar la presencia de virus por PCR o por la visualizacin del
efecto citoptico en forma de sincitios, que son el resultado de la fusin de dos o ms
clulas (ver Fig.12 en apartado 10). Originan grandes formaciones translcidas, similares
a burbujas, que poseen varios ncleos rodeados de una nica membrana nuclear. En
general, la presencia de sincitios dura dos o tres das, y precede al pico mximo de
produccin viral, y fuera de ese periodo ya han desaparecido. Adems las cepas no
formadoras de sincitios no induciran los mismos y la produccin viral de su cultivo no se
podra visualizar de esa forma. La microscopa electrnica es de una complejidad que se
enmarca slo dentro de investigaciones ms especficas y la CV, aunque posible, tiene un
alto coste para emplearlas en cultivos virales de manera rutinaria.

La eficacia de un cocultivo de VIH depende de varios factores (Tabla 23). En


algunas ocasiones, el eliminar los linfocitos T CD8+ de los PBMCs del donante por
citometra de flujo o marcaje inmunomagntico puede facilitar el aislamiento. Tambin se
puede cocultivar el virus con lneas celulares inmortalizadas susceptibles a la infeccin, en
cuyo caso no se requiere adicionar la IL-2 al medio de cultivo, pero se disminuye la
sensibilidad. Algunas de las lneas celulares T ms empleadas son las clulas MT-2, MT-4,
Jurkat, Sup-T1, y MOLT-4, entre otras. Entre las lneas celulares monocticas se
encuentran las clulas U937, HL-60 y THP-1.

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Tabla 22. Tcnicas para la deteccin del VIH en cultivo.


1. Deteccin de p24 en sobrenadante

2. Deteccin ARN viral o ADN proviral (PCR)

3. Observacin efecto citoptico


(microscopio ptico invertido)

4. Microscopa electrnica

5. Determinacin de la actividad enzimtica de la


retrotranscriptasa inversa (RT)

Actualmente, con las terapias antirretrovirales combinadas, se pueden alcanzan


niveles muy bajos de viremia, por lo que se hace difcil obtener cultivos virales positivos de
esos pacientes donde la terapia es eficaz. La eficacia del cocultivo del VIH a partir de
PBMC de nio tiene una sensibilidad del 50% en los 15 primeros das y entre el 70-80% al
final del primer mes, y del 80-90% en los 6 primeros meses de vida.

Tabla 23. Factores de los que depende la eficacia de un cocultivo de VIH.


1. De la carga viral del paciente
2. De las caractersticas fenotpicas de las clulas del donante sano
3. De la calidad del almacenamiento de las clulas
4. De la variante del VIH a crecer

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El aislamiento del VIH por cultivo tiene diversas aplicaciones (Tabla 24). El mtodo
del cocultivo tiene la gran ventaja de que el virus aislado puede confirmar un diagnstico
peditrico, puede emplearse en ensayo de susceptibilidad a agentes antirretrovirales, para
conocer el fenotipo de la cepa aislada, su cintica de replicacin, su tropismo celular y su
composicin gentica, entre otros. La infeccin de ciertas lneas celulares, como MT4,
permite la identificacin inequvoca de las cepas SI.

Tabla 24. Aplicaciones del aislamiento del VIH.

1. Diagnstico de infeccin peditrica y silente


2. Estudios de sensibilidad a antirretrovirales
3. Estudios de cintica de replicacin y fitness
4. Estudios de tropismo celular y fenotipo viral (cepas SI y NSI)
5. Crecimiento del virus para estudios moleculares y caracterizacin biolgica de variantes
6. Otros
Cepas SI, formadoras de sincitios. Cepas NSI, no formadoras de sincitios.

La desventaja de la tcnica del cocultivo como mtodo diagnstico es el tiempo que


se tarda en obtener viriones, que es cerca de 4 semanas, lo que retrasara mucho la
emisin del informe al paciente. Otro inconveniente del cultivo viral es el riesgo que lleva la
manipulacin del virus y el manejo de altos ttulos virales, que ha de realizarse en un
laboratorio especializado con nivel de seguridad biolgica apropiado. Por tanto, el
aislamiento de VIH presenta como principal inconveniente, la necesidad de laboratorios
con complejos sistemas de contencin biolgica. Adems, podran detectarse peor en
cultivos ciertos subtipos del VIH-1 que crecen ms lentamente en algunas lneas celulares,
as como variantes virales resistentes a los antirretrovirales con ciertas mutaciones que
disminuyen el fitness o capacidad replicativa viral.

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10. FENOTIPO VRICO


La definicin de tropismo ha evolucionado desde que a finales de los aos 80 se
identificasen dos variantes fenotpicas del VIH-1. Al principio el tropismo haca referencia al
efecto citoptico del virus en clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMC). As que
las variantes capaces de formar sincitios (clulas muntinucleadas gigantes resultantes de
la fusin de varias clulas) se llamaron variantes formadoras de sincitios (SI), mientras
que el resto se denominaron variantes virales no formadores de sincitios (NSI).

Figura 12. Sincitios inducidos por el VIH en un cultivo celular.

Una segunda clasificacin de las variantes del VIH-1 se estableci en base a las
diferencias en la cintica de replicacin observadas en los PBMCs, denominada
replicacin alta/rpida o replicacin baja/lenta. Ms recientemente se propuso una
nueva clasificacin basada en la capacidad del virus de replicar en dos lneas celulares:
monolito-macrfagos y clulas TCD4+, diferenciando las variantes en cepas M-trpicas
de las cepas T-trpicas.
En 1996 se identificaron los receptores de quimocinas CCR5 y CXCR4, que junto
con el receptor celular CD4, eran requeridos por el VIH-1 para entrar en la clula. Ello
aclar las bases moleculares del tropismo en funcin del receptor de quimocinas usado
para infectar la clula. El tropismo del VIH-1 por los correceptores CCR4 y CXCR4
rpidamente

se

relacion

con

algunas

caractersticas

fenotpicas

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previamente

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establecidas. Se observ que las cepas clasificadas como NSI y M-trpicas utilizaban
preferentemente el coreceptor CCR5 para entrar en la clula, mientras que aquellas que
utilizaban CXCR4 eran generalmente cepas SI y T-trpicas. Esos hallazgos permitieron
una nueva clasificacin de los aislados del VIH-1 basados en el uso del correceptor,
estableciendo tres categoras: cepas CCR5-trpicas (cepas R5),

CXCR4-trpicas (cepas

X4) y duales/mixtas (cepas R5/X4) que poda usar ambos correceptores en la entrada a la
clula (Fig. 13).

En los ltimos aos se ha relacionado el tropismo viral por los receptores de


quimocinas CCR5 y CXCR4 con la evolucin de la infeccin y con la progresin de la
enfermedad. As, las variantes R5-trpicas parecen ser las responsables de la transmisin
y establecimiento de la infeccin por VIH-1, independientemente de la ruta de transmisin.
Predominan durante la etapa asintomtica y se han asociado al fenotipo biolgico NSI. Las
variantes X4-trpicas son poco prevalentes durante las primeras fases de la infeccin,
emergen en un 40-60% de los individuos en etapas ms avanzadas de la enfermedad,
presentan un fenotipo viral SI, y su aparicin se ha asociado con una cada ms rpida de
los linfocitos T CD4+ y con una progresin ms rpida de la enfermedad (Fig. 14).

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Figura 13. Clasificacin de las variantes del VIH-1 en funcin del uso del correceptor.

Figura 14. Evolucin del tropismo viral a lo largo de la historia natural del VIH-1.

CD4

dual/mixta

Funcin Inmune

X4

R5
Tiempo

(Cedida por la Dra. Vernica Briz).

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A medida que la infeccin por VIH-1 progresa, se ha observado una evolucin en el


fenotipo viral de variantes R5 a X4, cambio asociado a una evolucin en el uso del
correceptor CCR5 a CXCR4. Sin embargo, este cambio de fenotipo viral no es
imprescindible para la progresin de la enfermedad. Por el momento no se conocen los
factores que determinan la restriccin de la infeccin por cepas R5-trpicas en etapas
iniciales de la infeccin. Sin embargo, diferencias en la expresin de ambos correceptores
en las clulas diana durante la transmisin podran explicar dicha restriccin. El inicio de la
infeccin podra deberse al transporte de partculas virales a los ndulos linfticos a travs
de clulas dendrticas, donde el virus podra pasar a las clulas T CD4+ activadas que
expresan ms CCR5 que CXCR4. Por ello, los virus R5-trpicos podran infectar un mayor
nmero de clulas que virus X4 inmediatamente despus de la transmisin,
independientemente de la ruta a travs de la cul llegue a los ndulos linfticos.

Como resumen, los aislados del VIH pueden infectar a distintos tipos celulares.
Aunque el VIH presenta un marcado tropismo por las clulas del sistema inmune, a
medida que progresa la infeccin puede infectar otras clulas. En la infeccin del VIH a
distintos tipos celulares, juegan un papel esencial los correceptores, que son molculas de
la superficie celular requeridas para la entrada del virus en la clula diana junto con el
marcador CD4 localizado en la superficie celular de los linfocitos CD4+. Interaccionan con
la glicoprotena de superficie gp120 del VIH dando lugar a la primera interaccin virusclula. Los correceptores ms importantes, pero no los nicos, son los llamados CCR5 y
CXCR4 y son receptores de quimioquinas. Algunos aislados SI pueden usar tanto el
CXCR4 como el CCR5, e incluso otros. Se sabe que los monocitos carentes de receptores
CD4+ pueden ser infectados mediante interaccin del complejo VIH-IgG con los receptores
Fc celulares y subsiguiente endocitosis. La necesidad de conocer previamente el tropismo

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viral constituye un requisito imprescindible antes del uso de los frmacos antagonistas de
los correceptores disponibles actualmente y de otros que puedan aparecer en un futuro.
Segn el ltimo documento de consenso de GeSIDA/Plan Nacional sobre el Sida respecto
al tratamiento antirretroviral (TAR) en adultos infectados por VIH en Espaa del 2014, se
debe efectuar siempre una prueba de resistencia y un tropismo viral en el momento del
diagnstico de la infeccin aguda o reciente, se vaya a iniciar TAR o no.

11. INDICADORES DE LAS PRUEBAS DIAGNSTICAS

11.1. EN EL DIAGNOSTICO DE LA INFECCION VIH

El VIH desde el momento en que penetra en el organismo humano prolifera de una


forma continua, aunque a velocidades diferentes segn el estadio evolutivo de la infeccin.
Se distinguen tres fases: a) primoinfeccin; b) asintomtica, de varios aos de duracin, y
c) sintomtica, que clnicamente se corresponde con el complejo relacionado o el SIDA.
Una vez el VIH penetra en el organismo humano, por los mecanismos de transmisin
actualmente reconocidos, inicia una replicacin activa a consecuencia de la cual se
desarrolla el cuadro clnico de la primoinfeccin, que suele ser asintomtica o bien su
sintomatologa es tan leve que suele pasar desapercibida.

La evolucin de los marcadores inmunolgicos y virolgicos durante la infeccin por


6T

6T17

VIH se mostraron en la Figura 1 y se explic brevemente en el apartado 2. La aparicin de


17T

anticuerpos en suero ocurre a las tres o cuatro semanas de la infeccin. Alcanzan su


concentracin mxima alrededor de los 3-4 meses despus de la exposicin al virus, y
salvo en raras ocasiones, persistirn durante toda la vida. A medida que aumenta el ttulo
de anticuerpos especficos frente a las protenas de envoltura y de core viral, disminuye
paulatinamente la concentracin en suero del antgeno p24 libre hasta su total
negativizacin en las tcnicas de ELISA. Sin embargo, con frecuencia en los nios y
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ocasionalmente en los adultos coexisten ttulos altos de antgeno p24 y de anticuerpos


anti-p24. La estrategia diagnstica ante la sospecha de primoinfeccin VIH incluir
necesariamente la deteccin de anticuerpos totales y de antgeno p24 libre en sangre por
ELISAS de 4 generacin, que puede detectar infecciones durante el periodo ventana y
permiten el diagnstico en el 80-90% de casos de infeccin aguda Si alguno de ellos o
ambos es negativo, se deben repetir en muestras posteriores. Las tcnicas de PCR
cualitativa pueden detectar al virus en esta fase al VIH y la cuantificacin viral durante este
momento de la infeccin permite valorar la evolucin posterior de la infeccin.

La fase asintomtica de la infeccin se caracteriza por la presencia de anticuerpos


frente al VIH y la ausencia de antgeno p24 libre, o presencia intermitente, no mantenida,
de dicha protena p24. Esta fase puede durar aos manteniendo dicho perfil srico. Los
niveles de antgeno y anticuerpos varan enormemente entre individuos. Un descenso en
el ttulo de anticuerpos anti-p24 y/o la positivacin del antgeno p24 libre en, por lo menos,
dos muestras consecutivas, son un indicador de progresin de la infeccin.

La fase sintomtica de la infeccin por VIH se inicia con un aumento de la


actividad replicativa del virus y se caracteriza por la positividad mantenida del antgeno p24
libre por tcnicas de ELISA. Esta se asocia, en un 60-70% de los casos, con un descenso
en los niveles de anticuerpos anti-p24 y presencia de anticuerpos frente a las protenas de
envoltura, asociado a una importante disminucin de los linfocitos T CD4+. Clnicamente
se manifiesta por la aparicin de una grave alteracin del estado general, infecciones
oportunistas, ciertos tipos de neoplasias o de trastornos neurolgicos.

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11.2. EN LA DONACION DE SANGRE/ ORGANOS

Para disminuir al mximo el riesgo de transmisin de la infeccin VIH mediante


sangre transfundida, hemoderivados, semen, vulos u rganos contaminados, desde 1987
es obligatoria la deteccin de anticuerpos VIH en todas las unidades a transfundir y en
suero de donantes de semen, vulos u rganos. Por ello es obligatorio que los Bancos de
Sangre incluyan protocolos de cribado o screening serolgico en un gran nmero de
muestras, y as localizar y desechar las unidades presumiblemente contaminadas. Las
guas vigentes recomendadas por Sociedad Espaola de Transfusin Sangunea y Terapia
Celular obligan a realizar en los bancos de sangre tcnicas serolgicas que detecten VIH-1
y VIH-2, y luego confirmar la infeccin por tcnicas moleculares que detecten cidos
nucleicos (NAT) en mezclas de varias sangres de donantes. Tras confirmar el diagnstico
positivo en la muestra infectada, se debe localizar al donante, explicarle la anormalidad
analtica y derivarle a la consulta correspondiente para su seguimiento clnico.

11.3. EN LA MONITORIZACIN DEL TRATAMIENTO ANTIRRETROVIRAL

Los pacientes en TAR presentan disminuciones de los niveles en suero del antgeno
p24 libre estadsticamente significativos. El uso de la CV es en la actualidad el mtodo
recomendado por la OMS para la monitorizacin de la eficacia del TAR y la deteccin de
fracasos teraputicos. En pacientes sin TAR previo es muy recomendable realizar una
determinacin basal, en ausencia de procesos infecciosos, vacunaciones o patologa
intercurrente. Si se dispone de muestra basal previa al tratamiento y el paciente ha
comenzado con TAR, la carga viral puede realizarse para valorar la reduccin de la viremia
plasmtica en respuesta al tratamiento en torno a los 3-6 meses, si ello facilita el
seguimiento clnico peridico de los pacientes. La excepcin es que presente algn dato

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clnico de progresin que justifique repetir la tcnica antes. As se podr identificar lo antes
posible el fracaso teraputico si ste sucede.

En pacientes con respuesta subptima, la CV tambin puede ayudar a identificar


problemas de adherencia al tratamiento, interacciones farmacolgicas y la posible
presencia en el virus de mutaciones de resistencia a frmacos, lo que evita una buena
supresin de la viremia. Los cambios mayores de 0,3 log 10 entre dos determinaciones
R

(cambios mayores del doble o la mitad) se consideran como significativos. Otros


consideran las fluctuaciones de CV significativas cuando son iguales o superiores a 0.5
log 10 .
R

Hay que sealar que un resultado de CV indetectable no significa que el virus haya
desaparecido del organismo, ya que el TAR no erradica al virus, sino que lo disminuye a
niveles bajos no detectables por ciertas tcnicas de cuantificacin (Tabla 17). Algunos
trabajos han podido cuantificar hasta 1 copia por ml de plasma mediante ensayos de CV
ultrasensible en pacientes con infeccin crnica y con buena respuesta al TAR. No hay
que olvidar que el virus permanece integrado en las clulas y la cuantificacin de la viremia
plasmtica no valora la cantidad de genoma viral (ADN proviral) integrado en los linfocitos
y dems clulas infectadas. Actualmente algunos estudios sugieren que estas partculas
no son producto de replicacin de bajo nivel del VIH, que no se suprime completamente
por las drogas ARV. Ms bien se tiende a considerar que representan virus liberados por el
reservorio celular latente bajo estmulos de activacin que no son bien conocidos por el
momento y por tanto no suponen, en la mayora de los casos, una indicacin de fracaso
teraputico.
Un 10-15% de pacientes con TAR y buen control virolgico, que mantienen CV
indetectable por periodos prolongados de tiempo, presentan ocasionalmente viremia
detectable de bajo nivel. Estos episodios conocidos como blips aparecen en
determinaciones aisladas sin cambios en el tratamiento, y no parecen relacionados con
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falta de cumplimiento ni peor pronstico a largo plazo. Son pequeas fluctuaciones de la


viremia e incluso de errores en el procesamiento de las muestras que resultan en CV de
bajo nivel. Para que un incremento no esperado de la CV pueda ser considerado como blip
debera ser inferior a 500-1.000 copias/ml y en la siguiente determinacin debera
producirse de nuevo la indetectabilidad.

11.4. EN EL DIAGNSTICO DE NIOS

Segn datos de la OMS actualmente viven en el mundo 3,3 millones de nios


infectados por el VIH. Slo en el ao 2012 ms de 260.000 nios menores de 15 aos se
infectaron con el virus durante el embarazo, parto, lactancia materna o por vas sexual o
parenteral. El nmero creciente de mujeres infectadas que se hallan en edad frtil ha
supuesto un importante incremento del SIDA en la poblacin infantil. As, la transmisin
vertical de la infeccin VIH (de madres a hijos) es la responsable de ms del 80% de los
casos de SIDA en nios menores de 1 ao de edad. El riesgo de trasmisin vertical
aumenta en madres sin TAR o en aquellas con mala situacin clnica, si el nio es
prematuro, si el parto ha sido vaginal, si la bolsa ha estado ms tiempo rota (riesgo
considerable si ha estado rota > 8 -12 horas), si en el parto ha habido sangrado o si ha
existido una infeccin del tracto genital concomitante.

Para evitar al mximo el riesgo de transmisin perinatal y adoptar medidas de


atencin al recin nacido, es necesaria la deteccin serolgica de anticuerpos frente VIH
en las mujeres embarazadas, ofreciendo esta prueba durante la gestacin. nicamente en
aquellas mujeres seronegativas que presenten prcticas de riesgo persistentes se repetir
peridicamente la determinacin, teniendo siempre en cuenta que se ha descrito
transmisin en casos que presentaban resultados indeterminados en western blot.

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Por ello, el diagnstico temprano de la infeccin perinatal por VIH-1, principalmente


en hijos de madres seropositivas, es esencial para instaurar el TAR lo antes posible,
prevenir infecciones oportunistas y reducir la mortalidad infantil. Ya que la progresin a la
enfermedad es rpida en los nios pequeos, es necesario que se tomen y procesen las
muestras lo antes posible para el diagnstico precoz del VIH. En cualquier caso, la OMS
recomienda dar TAR al nio tan pronto como se detecte un primer test virolgico positivo,
a la espera de confirmar la infeccin. Las tcnicas diagnsticas empleadas en nios se
muestran en la Figura 15.

Figura 15. Diagnstico del VIH en nios.

DIAGNSTICO PERINATAL DEL VIH-1

Tcnicas serolgicas (IgG)

Tcnicas virolgicas

> 18 meses

< 18 meses

Elisa

+
WB

Ind

- Cultivo viral
- p24
- Amplificacin gentica:
ADN-VIH-PCR
- Viremia plasmtica:
ARN-VIH-PCR

Cedida por la Dra. Vernica Briz

La estrategia de diagnstico serolgico en los hijos nacidos de madre seropositiva


incluir la deteccin de anticuerpos totales VIH en nios mayores de 18 meses. Sin
embargo, los nacidos de madre seropositiva menores de 18 meses necesitan
diagnosticarse por mtodos directos o virolgicos porque, como ya hemos dicho
previamente, los anticuerpos de la madre pueden persistir en ellos 15-18 meses o ms en
algunos casos, y podran dar falsos positivos en el diagnstico serolgico.
En Espaa las guas de consenso del 2013 para el seguimiento de la infeccin por
el VIH en relacin con la reproduccin, embarazo, parto y profilaxis de la transmisin
vertical del nio expuesto recomiendan como test virolgicos para el diagnstico perinatal
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la PCR a partir de ADN proviral, cuya sensibilidad aumenta con la edad y/o la PCR
cuantitativa que detecta RNA viral libre en plasma, siendo esta tcnica la que se usa en la
mayora de los centros. Se recomienda la determinacin de ARN y/o ADN viral en las
primeras 48 horas de vida (no utilizar sangre de cordn) y repetir la determinacin de ARN
viral y/o ADN proviral entre los 15-21 das de vida, a las 4 6 semanas de vida y 4
meses.

La OMS, en sus recomendaciones para el diagnstico perinatal precoz en nios


menores de 18 meses, tambin recomienda que todos los nios expuestos realicen
tcnicas de deteccin de ARN viral o ADN proviral (tcnicas NAT, ver Tabla 13) a las 4-6
semanas de vida y que sea posteriormente confirmado en otra muestra tambin por
tcnicas moleculares. En nios > 18 meses la obtencin de un test serolgico positivo y el
test confirmatorio (WB) implica un diagnstico positivo (Fig.15).

Los nios no infectados que reciben lactancia materna de sus madres infectadas
estn en riesgo de infectarse. Por ello, segn recomendaciones de la OMS, se deben
realizar test diagnsticos moleculares al menos 6 semanas despus de haber cesado la
lactancia materna, pero se puede realizar diagnstico molecular si est an lactando. En
otras palabras, si el test molecular es positivo debera de confirmarse por una tcnica
molecular en otra nueva muestra, pero en caso de ser negativo durante la lactancia no se
puede asegurar la ausencia de infeccin porque el nio tiene riesgo de infeccin mientras
siga con lactancia materna. Por ello, si el nio nunca ha lactado, un test serolgico
negativo en nios > 9 meses descartara la infeccin. Sin embargo, si ha lactado habr que
volver a testar 6 semanas tras terminar la lactancia.
El cultivo viral se emplea para el diagnstico en nios menores de 18 meses slo
en ciertos laboratorios muy especializados. Sin embargo, la OMS no lo recomienda como
mtodo diagnstico perinatal debido a su alto coste, complejidad, problemas relacionados
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con la bioseguridad, necesidad de una infraestructura compleja y personal especializado.


Adems se tardan varias semanas en obtener los resultados, como dijimos en el apartado
9.3. Por ltimo, ciertos subtipos del VIH-1 (como subtipo C) y variantes virales mutantes
con baja capacidad replicativa pueden crecen poco en cultivo y podran dar falsos
negativos.

En cuanto a la determinacin del antgeno p24 libre en sangre, no se positiviza


hasta que los anticuerpos anti-p24 del tipo IgG de la madre disminuyen o desaparecen de
sangre, como consecuencia de la formacin de inmunocomplejos antigeno-anticuerpo
circulantes no detectados por las tcnicas de ELISA. En sta situacin, el tratamiento del
suero para disociar los inmunocomplejos (acidificacin, guanidina, etc.) puede ser de gran
ayuda. La disminucin del nivel de anticuerpos anti-p24 seguido de un aumento de stos,
en el transcurso de uno o dos meses, podr correlacionarse con la prdida de anticuerpos
maternos y la produccin propia de los mismos por parte del nio infectado por va vertical.
En lugares con infraestructuras limitadas para hacer ensayos moleculares, la deteccin de
antgeno p24 es considerada por la OMS como una alternativa a la deteccin de ARN viral
o ADN proviral en nios menores de 18 meses.

11.4.1. FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR AL DIAGNSTICO MOLECULAR EN


NIOS

Existen varios factores que pueden afectar a la eficacia de las tcnicas diagnstico
molecular basadas en la amplificacin del material gentico viral para el diagnstico precoz
de la infeccin del VIH en nios. Entre ellas se encuentran el tiempo de adquisicin de la
infeccin en el nio, la carga viral de la muestra, la variabilidad gentica del VIH-1, el tipo

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de muestra, el volumen empleado en el ensayo, el lmite de deteccin de la tcnica usada


y la tasa de transmisin vertical de VIH en la poblacin a estudiar.

Influencia del tiempo de adquisicin de la infeccin en el nio. Los nios se


pueden infectar con VIH durante el embarazo, parto, tras el nacimiento por lactancia
materna y por transmisin sexual o parenteral, como dijimos previamente. Los nios que
se infectan en el tero generalmente tienen VIH detectable en el nacimiento al alcanzar
mayores CV y progresan a la enfermedad ms rpidamente. Los nios que se han
infectado cerca o durante el parto tardan ms tiempo en tener virus detectable. Por ello, la
sensibilidad de todos los mtodos moleculares son menores si se hacen ms cerca del
momento del nacimiento. En nios infectados en el tero se puede detectar ARN viral y
ADN proviral en sangre a las 48 horas de nacer, pero si se infectan en el parto pueden
tardar de 1 a 2 semanas en ser detectables. En general, a las 6 semanas de edad se
debera detectar el virus (tcnicas ultrasensibles de p24, ARN viral, ADN proviral) en casi
todos los nios infectados en el parto. En la Tabla 24 se comparan los mtodos de
diagnstico en nios segn la edad.

Influencia de la carga viral. La viremia de la muestra para los ensayos moleculares


tambin es un factor limitante para los ensayos de diagnstico precoz en nios. La
deteccin de ARN viral y p24 depende de la replicacin viral y el TAR la inhibe. Aunque se
espera que el nio infectado tenga alta CV, si el nio ha recibido profilaxis al nacer puede
que su viremia se haya reducido a valores por debajo del lmite de deteccin de las
tcnicas moleculares. Ello podra originar falsos negativos en el diagnstico virolgico.
Algunos artculos indican que el n de falsos positivos en el diagnstico prenatal
empleando tcnicas de CV aumenta en muestras con viremia baja (<5.000 copias de ARN
viral/ml). Por eso en diagnstico precoz en neonatos expuestos suele ser ms frecuente

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hacer ensayos moleculares que detecten el ADN proviral en las primeras 4-6 semanas de
vida.

Tabla 24. Comparacin de mtodos de diagnstico directo en nios segn su edad.

Mtodo

Cultivo viral

Edad
< 15 das

50%

15 das-1 mes

70% - 85%

2-3 meses

70% -100%

> 6 meses

80% - 90%

< 1 mes

Antgeno p24

Aprox. 4 semanas para ver resultados.


Falsos negativos y alto coste.
Requerido personal especializado e
infraestructura adecuada. Laborioso.

100%

Nacimiento

22%

96%

4 das

42%

7 das

55%

14 das

73%

21 das

91%

1 mes

95%

99%

1as semanas

25% - 40%

96%

2-3 meses

90%-100%

99%

Inconvenientes

100%

18-20%

Deteccin de
ADN proviral

Deteccin y
cuantificacin
del ARN viral
(CV)

Sensibilidad Especificidad

Baja sensibilidad.
Elevada incidencia de falsos positivos
en nios < 1 mes.

Su eficacia diagnstica depende de la


edad del nio.
Falsos negativos por variabilidad
gentica viral.

Baja sensibilidad en las primeras


semanas.
Puede fallar en nios con CV bajas
(con profilaxis o TAR)
Falsos negativos o CV infraestimadas
por variabilidad gentica viral.

Influencia de la variabilidad gentica viral. La mayora de las infecciones en


nios ocurren en pases donde circulan un mayor tipo de variantes diferentes del VIH,
como es el caso de frica subsahariana. Como se explic previamente en el apartado 9.1,
la variabilidad gentica del virus puede conducir a falsos negativos en el diagnstico. No
todos los ensayos virolgicos detectan por igual a los tipos, grupos, subtipos y
recombinantes distintos del VIH. La mayora de los ensayos virolgicos comerciales no
detectan VIH-2, por lo que muchos laboratorios han diseado PCR no comerciales que
emplean para su diagnstico. La mayora de las tcnicas tampoco detectan todos los
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grupos no-M del VIH-1 y debera de ser validadas para los recombinantes complejos del
grupo M que estn apareciendo de manera creciente en la pandemia.

Influencia del tipo y volumen de muestra empleada. La sensibilidad del ensayo


puede verse afectada tambin por el tipo y volumen de muestra empleada en la tcnica
molecular. La mayor parte de ensayos virolgicos requieren normalmente de 0.5ml a 1ml
de plasma o suero. Ello requiere tomar al menos de 1 a 3 ml de sangre en el paciente, lo
que no es fcil en neonatos, nios con malnutricin o con bajo peso. Recientemente, en
pases en desarrollo se ha empezado a extender el uso de la sangre seca recogida en
papel de filtro especial (DBS, dried blood spots) en lugar de sangre para el diagnstico
perinatal. Por eso, el uso de DBS es una alternativa prctica al plasma o suero en el
diagnstico de nios menores de 18 meses. Se obtiene de un pequeo pinchazo en el
taln (neonatos) o dedo (nios ms mayores) con una lanceta estril, tomando un menor
volumen de sangre (slo unas pocas gotas por paciente) recogidas en un papel de filtro.
Ello evita la venopuncin, siendo una tcnica de toma de muestra ms segura y barata, y
de ms fcil almacenamiento y transporte.

Los DBS, una vez secos y previamente identificados, se pueden almacenar a


temperatura ambiente con 1 o 2 desecantes dentro de una bolsita de plstico individual
con cierre durante periodos cortos, mandarlos a laboratorios de referencia o bien
almacenarlos en el congelador a -20C, o preferiblemente a -80C si se puede, hasta su
uso para el diagnstico. Cuanto mejor se tome el DBS y se preserve, mejor integridad
tendr el cido nucleico para su deteccin posterior por tcnicas virolgicas. Por ello,
trabajar con DBS requiere entrenamiento adecuado en la toma, transporte y
procesamiento de las muestras para realizar los ensayos moleculares. Cuanto menos
tiempo pase entre la toma de muestra y el ensayo y cuanto mejor haya sido criopreservado
el DBS, ms integridad tendr el ARN viral y ADN proviral. Ello aumentar las

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probabilidades de deteccin del cido nucleico en las muestras positivas, reduciendo el n


de falsos negativos.

Figura 16. Sangre seca recogida en papel (DBS).

Algunas tcnicas moleculares comercializadas (no todas, ver Tabla 17) para la CV y
diagnstico

molecular,

ya

estn

validadas

para

ser

realizadas

empleando

aproximadamente 0.05-0.1ml de sangre seca tomada en el DBS, que corresponden


aproximadamente a 1 o 2 gotas de sangre recogidas en uno de los crculos del papel.
Normalmente a partir de 2-4 gotas de sangre de nios o adultos infectados se pueden
realizar pruebas moleculares para el diagnstico molecular del VIH, para la monitorizacin
del TAR (CV, deteccin de resistencias virales) y para la amplificacin del virus en las
regiones de inters para identificar la variante viral. Las tcnicas serolgicas se pueden
realizar a partir de 1-2 gotas de sangre sin problemas, pero hay que tener en cuenta que
los cut off de las tcnicas de deteccin serolgica como el ELISA se deberan ajustar si
usamos DBS para el diagnstico del VIH como ocurre para otras infecciones.

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El pequeo volumen de muestra tomada en el DBS disminuye la sensibilidad del


ensayo de carga viral, calculado como copias de ARN de VIH-1 por ml de plasma. Se
requiere una validacin de cada tcnica molecular empleando plasma y DBS tomados en
paralelo a partir de la misma sangre de los pacientes, para poder estimar el lmite de
deteccin de cada ensayo empleando sangre seca, teniendo en cuenta el hematocrito en
la cuantificacin final. As podremos compararlo con el establecido en plasma por las
casas comerciales correspondientes.

Influencia del lmite de deteccin de la tcnica empleada. Si la muestra presenta


CV menores que el lmite de deteccin de la tcnica molecular empleada, como puede
ocurrir en nios que han tenido profilaxis en el periodo prenatal, podra dar lugar a falsos
negativos en el diagnstico molecular del VIH en esas muestras.

Influencia de la tasa de transmisin vertical del virus Hay trabajos que ya han
estimado que la tasa de falsos positivos en el diagnstico molecular detectando ADN
proviral puede aumentar a mayor tasa de transmisin vertical del virus en la poblacin de
estudio.

Por todo lo antes expuesto, existen unos retos para mejorar el diagnstico
molecular precoz del VIH en nios, con el fin de poder implantarse de manera
generalizada en pases de recursos limitados, donde se dan la mayora de los casos de
infeccin peditrica. Entre ellos, estara el disminuir su coste y complejidad, disear
tcnicas que requieran menos infraestructuras y equipos para llevarlas a cabo, que se
realicen a partir de pequeos volmenes de sangre manteniendo una buena sensibilidad,
que sean capaces de poder detectar todos los tipos, grupos, subtipos y recombinantes del
VIH y preferentemente en ms de dos regiones virales para que sean tcnicas de alta
especificidad. Todo ello con el objetivo de reducir el n de falsos positivos y de falsos
negativos al mnimo y de poder generalizar su uso en los pases que ms lo necesitan.
DIAGNSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCION POR VIH
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