Tecnicas de Cultivos Celulares e Ingenieria de Tejidos

TCNICAS DE CULTIVOS CELULARES E
INGENIERA DE TEJIDOS
Elaborado por:
Dra. Nohra Elsy Beltrn Vargas.
Departamento de Procesos y Tecnologa
nbeltran@correo.cua.uam.mx
Dra. Claudia Hayde Gonzlez de la Rosa.

Departamento de Ciencias Naturales
cgonzalez@correo.cua.uam.mx
Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Cuajimalpa

Av. Vasco de Quiroga 4871, Col. Santa Fe Cuajimalpa,
Deleg. Cuajimalpa de Morelos, C.P. 05348, Mxico, D. F.
Febrero de 2016
ISBN 978-607-28-0688-7
ndice de contenido
Presentacin
1. Seguridad y biotica
8
9
Normas de trabajo en un laboratorio de cultivos celulares
Seguridad biolgica
10
Clasificacin de los agentes biolgicos
11
Niveles de bioseguridad
12
Medidas de proteccin
12
Riesgos del trabajo con cultivos celulares
14
Riesgos en los procedimientos de cultivos celulares
15
Contencin
15
Desinfeccin y desecho de residuos de cultivos celulares
16
Regulacin en cultivos celulares e ingeniera de tejidos
16
2. Regulaciones
20
Generalidades
20
Experimentacin con animales
21
Legislacin a nivel mundial
22
reas de la investigacin con clulas troncales
22
Regulaciones en India
22
Regulaciones en Mxico
24
Regulacin en Europa
25
3. Biologa de los cultivos celulares
30
El medio ambiente del cultivo
30
Adhesin celular
31
Proliferacin y diferenciacin celular
33
Sealizacin celular
35
Iniciacin de un cultivo celular
35
Evolucin de los cultivos celulares
36
Desarrollo de lneas celulares continuas
37
2
4. Laboratorio de cultivo celular
39
Campanas de flujo laminar
39
Incubadoras
41
Microscopios
42
Centrfugas
43
Autoclaves
44
5. Tcnica asptica
46
Definiciones importantes
46
Cmo evitar la contaminacin masiva?
47
Tcnica asptica
47
Elementos del ambiente asptico
47
Pasos para reducir problemas de contaminacin
48
6. Preparacin y esterilizacin
50
Esterilidad
50
Manipulacin estril
51
Mtodos de esterilizacin
51
Mecanismos de accin
52
Factores que afectan la potencia del desinfectante
52
7. Recipientes de cultivo y sustratos
54
Adhesin y crecimiento
54
Materiales usados como sustrato
54
Recipientes de cultivo
55
Superficies con matriz
58
Matrices tridimensionales
60
Sustratos no adhesivos
61
8. Medios y suplementos
62
Desarrollo de los medios de cultivo
62
Propiedades fisicoqumicas de los medios de cultivo
62
Soluciones salinas balanceadas
66
Medio completo
66
Suero
67
Seleccin del medio y suero

9. Medio libre de suero
68
69
Desventajas del suero
69
Ventajas del medio sin suero
70
Desventajas del medio sin suero
71
Subcultivo libre de suero
71
Seleccin del medio libre de suero
72
Sustitutos de suero
72
Adaptacin al medio libre de suero
72
10. Cultivos primarios
74
Introduccin
74
Aislamiento del tejido
76
Explante primario
76
Disgregacin tisular
77
Sembrado
77
11. Subcultivo y lneas celulares
79
Propagacin
79
Terminologa
79
Edad del cultivo
81
Designacin
81
Seleccin
81
Rutina de mantenimiento
82
Morfologa celular
82
Remplazo del medio
83
Medio de mantenimiento
83
Subcultivo
83
Ciclo de crecimiento
85
Propagacin en suspensin
86
Estandarizacin de las condiciones de cultivo
86
Uso de antibiticos
86
12. Clonacin y seleccin
88
Clonacin celular
88
Aislamiento de las clonas
89
13. Caracterizacin
91
Autentificacin
91
Morfologa celular
92
Anlisis de cromosomas
93
Marcadores antignicos
93
14. Introduccin a la Ingeniera de tejidos
95
Alcances de la ingeniera de tejidos
95
Tipos de tejidos del cuerpo humano
96
Obtencin de un tejido con fines teraputicos
96
Origen celular para aplicacin en ingeniera de tejidos
98
Anlisis del tejido
101
Descelularizacin
103
Retos en la ingeniera de tejidos
104
15. Aplicaciones teraputicas
106
Clulas humanas
106
reas de aplicacin de ingeniera de tejidos
107
Aplicaciones en el sistema msculo-esqueltico
108
Clulas troncales
112
Aplicaciones en gastroenterologa: Trasplante de clulas hepticas
114
Aplicaciones en el sistema renal
118
Opciones de tratamiento basadas en clulas
119
Bioingeniera de rgano completo
120
16. Biomateriales aplicados a la medicina
124
Introduccin
124
Requisitos del biomaterial para utilizarse dentro del cuerpo humano
125
Aplicaciones de los biomateriales en medicina
126
Tipos de biomateriales
126
Tipos de pruebas a los biomateriales
128
Generacin de andamios para cultivos celulares
129
Pruebas para evaluar las interacciones clula-biomaterial
132
17. Inflamacin y excesos de la inmunidad
134
Mecanismos de defensa
134
La inflamacin mejora la inmunidad
135
Dao tisular
136
Fases de la reparacin tisular
137
Los excesos de la inmunidad causan enfermedades
138
Hipersensibilidad
139
Hipersensibilidad a biomateriales
140
Respuesta del tejido a los biomateriales
141
18. Biorreactores para ingeniera de tejidos
143
Generalidades
143
Aplicaciones de los biorreactores en ingeniera de tejidos
147
Requerimientos bsicos en los biorreactores
151
Acondicionamiento mecnico
152
Objetivo final del uso de biorreactores en ingeniera de tejidos
152
19. Corazn artificial
154
Infarto
155
Ingeniera tisular
157
Cultivos 2D
159
Cultivos 3D
159
Biomateriales utilizados en ingeniera de tejido cardiaco
160
Caracterizacin
162
Biorreactores en ingeniera de tejido cardiaco
162
20. Sangre artificial
166
Generalidades
166
Sangre del cordn umbilical
169
Fundacin para la Acreditacin de Terapia Celular
170
Avances en investigacin
170
Sustitutos artificiales
171
21. Piel artificial
175
Generalidades
175
Quemaduras
178
Tratamientos para daos crnicos de la piel
178
Cultivos de piel
179
Sustitutos de Piel
181
Piel artificial natural
181
Piel artificial sinttica
182
Biorreactores en la generacin de piel artificial
183
Abreviaturas y smbolos de uso frecuente en este libro
187
Glosario
189
Presentacin
La capacidad de disear y planear la enseanza es una de las competencias distintivas de un

ejercicio profesional de la docencia. Mediante el diseo y la planeacin de cursos, los
profesores estn en mejores condiciones de capitalizar los conocimientos y la experiencia
que van adquiriendo a lo largo de su carrera docente.
El propsito de este libro enfocado a los cultivos celulares e ingeniera de tejidos, es
proporcionar al lector algunos recursos tiles y material bibliogrfico en espaol. Est
organizado en 21 captulos, y en cada uno de ellos se contemplan los objetivos, el
contenido, las actividades sugeridas y la bibliografa utilizada. Se recomienda que
conforme se avance en la lectura, se relean los captulos anteriores, con el fin de integrar los
conocimientos y obtener una visin global de los elementos tratados. Debido a la naturaleza
multidisciplinaria de los temas abordados y a que el lector puede tener diferentes
formaciones acadmicas, incluimos un glosario y un listado de abreviaturas y smbolos al
final de la obra, diseados como una referencia rpida para la nomenclatura. El lector
debera familiarizarse con el contenido de ambos, para utilizarlos seguidamente como
referencias rpidas al leer secciones relacionadas en el texto principal.
1. Seguridad y biotica
Objetivos
Que el alumno conozca las normas de seguridad para el adecuado uso del cuarto de
cultivos celulares y la regulacin que existe para el trabajo en experimentacin con clulas.
Que el alumno discuta sobre las responsabilidades bioticas que se tienen al trabajar con
clulas humanas, con fines de investigacin o teraputicos.
Que el alumno conozca la regulacin nacional e internacional para el trabajo e
investigacin con clulas.
Contenido
Es importante definir normas o reglas de trabajo en los laboratorios de cultivos celulares a
fin de evitar riesgos o peligros y contaminacin de los cultivos.
Se le considera peligroso a las fuentes de dao potencial o situacin que potencialmente
puede causar dao, mientras que se habla de riesgo cuando se refiere a la combinacin de la
probabilidad de ocurrencia de dao y la severidad del dao. Es importante analizar los
peligros y riesgos con el objetivo de disminuirlos. La seguridad se debe garantizar en todo
momento.
Normas de trabajo en un laboratorio de cultivos celulares
Es de extrema importancia lavarse las manos antes, despus, y frecuentemente durante el
trabajo con cultivos, para evitar contaminaciones en los experimentos, y contaminacin del
usuario con material biolgico, y posible diseminacin de ste. Se debe hacer uso de bata
exclusiva para el cultivo celular, guantes, cubrebocas y lentes protectores.
Las personas que estn involucradas con el trabajo en cultivos celulares y tisulares deben
tener las uas de las manos cortas y limpias, evitar el uso de pantalones cortos o faldas, ya
que las piernas quedan desprotegidas de cualquier salpicadura, deben tener el cabello corto
o recogido y usar zapatos que cubran totalmente el pie con suela anti-derrapante.
Otras normas de trabajo generales son lavarse las manos con agua y jabn al ingreso y
egreso del laboratorio, aun cuando haya utilizado guantes para la realizacin de sus
actividades; con esto se minimiza la contaminacin biolgica.
Hay que trabajar siempre con material estril (pipetas, puntas, etc). El material estril slo
puede abrirse, lgicamente, dentro de la campana de cultivos, o a la llama del mechero.
Por defecto, todo aquello de lo que no se est seguro al 100% de su esterilidad ha de ser
considerado como no estril. Asumir que algo est estril cuando no lo est supone, sin
ninguna duda, contaminar (esto es, destruir) el experimento.
En caso de contaminar algo involuntariamente (o incluso sospechar que sto ha pasado), se
debe poner inmediatamente en conocimiento del responsable del laboratorio, para evitar
problemas que puedan trascender a otros usuarios del laboratorio.
Marcar siempre cualquier tubo o recipiente que contenga algo til, de la forma ms segura
posible, por ejemplo tanto en la tapa como en el tubo. Marcar siempre las placas de cultivos
en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar
intercambiar tapas.
Si se ha de pipetear repetidamente un stock de una solucin (p.ej. botella con medio de
cultivo) es conveniente sacar de una vez la alcuota que se vaya a usar a una botella o tubo
de menor volumen, para disminuir el nmero de veces que se introducen pipetas en la
botella con el stock, y el consiguiente riesgo de contaminacin.
Seguridad biolgica
Es obligatorio lavarse las manos despus del trabajo de laboratorio, para evitar
contaminacin del usuario con material biolgico, y la potencial dispersin de ste.
Todo el material biolgico, p. ej. clulas o material que haya estado en contacto con stas,
debe ser inactivado con hipoclorito antes de tirarlo.
Tanto el plstico desechable como el vidrio que haya estado en contacto con material
biolgico deber ser inactivado antes de tirarlo, o disponerlo para su lavado y esterilizacin.
Los residuos acumulados en vasos de precipitados deben ser inactivados con hipoclorito
antes de tirarlos, y los vasos se dejarn con un poco de hipoclorito hasta su prximo uso. La
10
mesa de trabajo y las campanas se descontaminarn antes y despus de trabajar con

material biolgico. Cualquier material biolgico derramado deber ser descontaminado
inmediatamente con hipoclorito, antes de proceder a secar y lavar con jabn la superficie
manchada.
Clasificacin de los agentes biolgicos
Los agentes biolgicos se clasifican, en funcin del riesgo de infeccin, en cuatro grupos:
Agente biolgico del grupo 1: aqul que resulta poco probable que cause una enfermedad
en el hombre.
Agente biolgico del grupo 2: aqul que puede causar una enfermedad en el hombre y
puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la
colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
Agente biolgico del grupo 3: aqul que puede causar una enfermedad grave en el hombre
y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la
colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz.
Agente biolgico del grupo 4: aqul que causando una enfermedad grave en el hombre
supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se
propague a la colectividad y sin que exista generalmente una profilaxis o un tratamiento
eficaz.
Los riesgos en los que se puede incurrir de acuerdo a los agentes biolgicos se enlistan en
la Tabla 1.1.
Grupos
de riesgo
Riesgo infeccioso
Ejemplo
Poco probable que cause

enfermedad
Pueden causar
enfermedad y constituir
un peligro para los
trabajadores
Puede provocar
enfermedad grave y
constituir un serio peligro
para los trabajadores
Virus de
Epstein-Barr
Virus de la
hepatitis A
Virus del
dengue
Riesgo de
propagacin a
la colectividad
No
Profilaxis
o tratamiento
eficaz
Innecesario
Poco probable
Posible
generalmente
Probable
Posible
generalmente
11
Provocan enfermedad
grave y constituyen un
serio peligro para los
trabajadores
Virus de la
inmunodeficiencia humana
Elevado
No conocido
en la
actualidad
Tabla 1.1. Grupos de riesgo de los agentes biolgicos.
Niveles de bioseguridad
Atendiendo a los agentes biolgicos con los que se va a trabajar, los laboratorios se
clasifican como sigue:
Laboratorio bsico nivel de bioseguridad 1
Laboratorio bsico nivel de bioseguridad 2
Laboratorio de contencin nivel de bioseguridad 3
Laboratorio de contencin mxima nivel de bioseguridad 4
Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinacin de las
caractersticas de diseo, construccin, medios de contencin, equipo, prcticas y
procedimientos de operacin necesarios para trabajar con agentes patgenos de los distintos
grupos de riesgo.
Medidas de proteccin
Se reducir el riesgo de exposicin al nivel ms bajo posible para garantizar adecuadamente
la seguridad y la salud de los trabajadores, por medio de las siguientes medidas:
a) Establecimiento de procedimientos de trabajo adecuados y utilizacin de medidas
tcnicas apropiadas para evitar o minimizar la liberacin de agentes biolgicos en el lugar
de trabajo.
b) Reduccin, al mnimo posible, del nmero de trabajadores que estn o puedan estar
expuestos.
c) Adopcin de medidas seguras para la recepcin, manipulacin y transporte de los
agentes biolgicos dentro del lugar de trabajo.
d) Adopcin de medidas de proteccin colectiva o, en su defecto, de proteccin individual,
cuando la exposicin no pueda evitarse por otros medios, utilizando siempre las medidas de
contencin adecuadas en funcin del grupo de riesgo en que el agente biolgico haya sido
clasificado.
12
Sustitucin de los agentes biolgicos por otros de menor peligro.
Confinamiento de los agentes biolgicos, obligatorio en el caso de utilizacin

deliberada de los mismos, utilizando las medidas de contencin adecuadas en
funcin del grupo de riesgo en que el agente biolgico haya sido clasificado.
Aplicacin de procedimientos de trabajo que permitan el encerramiento o

aislamiento de operaciones potencialmente peligrosas.
Extraccin localizada, que consigue reducir las concentraciones de contaminantes

antes de difundirse en el medio de propagacin. Implica la utilizacin de cabinas de
seguridad biolgica.
La desinfeccin de los locales, vehculos de transporte, ropa, equipos de proteccin,

que debe realizarse siguiendo un protocolo que asegure la accin especfica y eficaz
sobre los agentes biolgicos.
Desinsectacin (control y eliminacin de insectos y otros artrpodos) y

desratizacin (control de roedores), que tienden a eliminar los vectores, como
transportadores de la enfermedad. La realizacin de estas operaciones, puede
ocasionar problemas de salud a los ocupantes de los lugares de trabajo, por lo que
dichas operaciones han de efectuarse segn procedimientos seguros.
Limpieza adecuada, que conduce en muchos casos a una disminucin de los niveles
de contaminacin.
Las medidas de proteccin a nivel individual se basan fundamentalmente en los
equipos individuales de proteccin. Su eleccin corresponder a dos criterios:
seguridad, es decir, proteccin adecuada al riesgo especfico, y confort.
e) Utilizacin de medios seguros para colectar, almacenar y desechar residuos por parte de
los trabajadores, incluido el uso de recipientes seguros e identificables, previo tratamiento
adecuado si fuese necesario.
f) Utilizacin de medidas de higiene que eviten o dificulten la dispersin del agente
biolgico fuera del lugar de trabajo.
g) Utilizacin de una seal de peligro biolgico as como de otras seales de advertencia
pertinentes.
13
Riesgos del trabajo con cultivos celulares

Los cultivos celulares son el resultado del crecimiento in vitro de clulas obtenidas de
organismos pluricelulares. Tienen la categora de agentes biolgicos y se refiere, tanto a los
cultivos celulares primarios, como a los de lneas continuas o cepas celulares bien
definidas.
Los cultivos celulares no contaminados generalmente no presentan un riesgo significativo,
y aun la inoculacin drmica origina slo una inflamacin local. Adems, estos cultivos
pueden contribuir sustancialmente al riesgo de exposicin a agentes biolgicos ya que
pueden actuar como la base de crecimiento o ayudar a la supervivencia o la replicacin de
agentes oportunistas, o ser origen de otros riesgos potenciales. Los agentes oportunistas
ms caractersticos son los virus y entre los otros riesgos pueden citarse la contaminacin
por micoplasmas o productos celulares que pueden ser molculas biolgicamente activas
con propiedades farmacolgicas, de inmunomodulacin o sensibilizantes.
El nivel de riesgo que presenta el trabajo con cultivos celulares es variado. Por un lado se
debe considerar si las cepas o lneas celulares utilizadas tienen una procedencia lo
suficientemente documentada para garantizar y evitar la problemtica asociada con la
contaminacin cruzada de la lnea celular original por otro tipo de clulas.
Respecto a los cultivos celulares habr que considerar asimismo tanto su origen anatmico
como el de la especie, ya que est directamente relacionado con su potencial infeccioso por
virus u otros agentes patgenos en humanos. En ningn caso el trabajador que realice los
cultivos celulares podr utilizar sus propias clulas para el desarrollo in vitro. Las clulas
humanas para cultivo debern obtenerse solamente de individuos que no tengan relacin
con el trabajo experimental.
Los cultivos celulares de mayor riesgo son los que proceden de primates y humanos,
especialmente si derivan de sangre perifrica, tejido linfoide y nervioso. Cuando se
sospeche la infeccin del cultivo celular por un agente patgeno para el hombre, dichos
cultivos debern ser manejados en un nivel de contencin adecuado al agente en cuestin.
La eleccin del nivel de contencin, segn el origen del cultivo celular, se muestra en la
Tabla 1.2. Hay un riesgo adicional en el caso de cultivos celulares genticamente
modificados.
14
Cultivo celular
Contencin
Lneas celulares bien caracterizadas de

origen humano o de simios.
Lneas celulares no humanas ni de simios
Nivel de contencin 2 y empleo de cabina
bien caracterizadas, con bajo riesgo de
de bioseguridad.
infeccin endgena con patgenos

humanos.
Lneas celulares o cepas no totalmente
Nivel de contencin 2 y empleo de cabina
caracterizadas o autentificadas.
de bioseguridad.
Clulas con patgenos endgenos y clulas
Contencin apropiada al patgeno.
deliberadamente infectadas.
Clulas sanguneas humanas, clulas
Contencin apropiada al riesgo potencial.
linfoides, tejido nervioso de origen humano

o simio.
Tabla 1.2 Nivel de contencin de acuerdo al origen del cultivo.
Riesgos en los procedimientos de cultivos celulares

En la manipulacin de cultivos celulares debern minimizarse todas las tareas que
contribuyan a la formacin de aerosoles o salpicaduras: trasvases, derrames, pipeteos
continuados y rpidos. Las agujas no debern utilizarse si existe una alternativa razonable.
Como en todo trabajo con material infeccioso o potencialmente infeccioso, debern
utilizarse cabinas de seguridad biolgica, las cuales estarn correctamente instaladas y
regularmente mantenidas y comprobadas.
Algunos productos celulares pueden ser alergnicos por lo que en estos casos se requerirn
unos estrictos niveles de contencin primaria y/o proteccin personal de los trabajadores
para prevenir la inhalacin o el contacto con las mucosas.
Contencin
Como se indic en la Tabla 1.2, cuando hay evidencia o sospecha de la presencia de
patgenos (por ejemplo: Herpes virus simiae en tejidos de simios o VIH en clulas blancas
de sangre perifrica), los cultivos celulares se manipularn en el nivel de contencin
15
requerido para el patgeno en cuestin. Todos los procedimientos implicados en la

propagacin y manipulacin de cultivos celulares que estn contaminados deberan llevarse
a cabo como mnimo en el nivel de contencin 2.
Cuando se utilice slo un pequeo nmero de clulas con un bajo riesgo de infeccin y no
se encuentren en fase proliferativa podr no ser necesaria la cabina de seguridad.
Desinfeccin y desecho de residuos de cultivos celulares
Es necesaria la existencia de normas efectivas para la descontaminacin de todos los
materiales utilizados en relacin con los cultivos celulares y fluidos de desecho.
Los procedimientos de descontaminacin debern ser capaces de inactivar virus y otros
agentes contaminantes aun en presencia de fluidos con una elevada carga de material
orgnico. La descontaminacin qumica es por esta causa menos efectiva que la que se
obtiene por calor.
Regulacin en cultivos celulares e ingeniera de tejidos
Las regulaciones son el resultado de un sistema de ordenamiento, el cual cuenta con
procesos e instituciones a travs de los cuales estas son desarrolladas, promulgadas y
llevadas a cabo, son instrumentos legales, decisiones, leyes parlamentarias, legislaciones
subordinadas, decretos, rdenes, normas, licencias y cdigos mediante los cuales los
gobiernos establecen condiciones en la conducta de los ciudadanos, las empresas y el
gobierno mismo.
La ingeniera de tejidos es una innovacin biomdica emergente rodeada de potencialidad y
riesgos. El uso de tejidos y clulas humanas para investigacin y terapias han resultado ser
de gran importancia, por lo que muchas cuestiones ticas y de regulacin se han visto
envueltas en estos, en diversas culturas algunas partes del cuerpo o de tejidos son
consideradas sagradas, como es el caso de la placenta, por esto se considera que el tejido
humano se merece cierto grado de respeto y por razones de dignidad de la persona que dona
el tejido, se crean ciertas regulaciones y reglas, que comnmente se encuentran indicadas
en leyes, normas y procedimientos.
16
En cuanto a regulaciones, en Mxico no se cuenta con alguna norma o ley puntual que
indique los procedimientos que se pueden realizar con clulas troncales o en cultivo de
tejidos, as como en cuestiones de donacin o venta de clulas o tejidos.
A nivel mundial, en algunos pases no existen y en otros tienen unas regulaciones
meticulosas y constantemente revisadas. En la Unin Europea (UE) se realiz un anlisis de
riesgos sobre la ingeniera tisular segn la opinin de mdicos y cientficos. En 2003 la UE
comenz a implementar un control unificado de reglamentos para productos provenientes
de la ingeniera de tejidos, y productos medicinales biolgicos. En ciertos pases como el
Reino Unido ya hay un gran nmero de productos que se encuentran en el mercado.
Existen dos puntos importantes para la regulacin en la ingeniera tisular:
El primero es el control de la calidad, los aspectos de seguridad de los tejidos humanos y
las clulas propuesta por la Direccin Responsable de Salud Pblica de la Comisin
Europea. El segundo es que se pueda facilitar la comercializacin de los tejidos, producto
de la ingeniera.
En Estados Unidos, la regulacin de investigaciones de clulas troncales est influenciada
por la poltica establecida en el momento, la sociedad y sobretodo el congreso que ejerce
presin, puesto que los decretos cambian de acuerdo al gobierno del momento.
En los pases asiticos la investigacin prevalece ante la mencin de que es el continente
donde las investigaciones sobre clulas troncales y en especial embrionarias humanas,
lograran tener resultados trascendentales, debido a las estrategias que implementan en
biotecnologa y ciencias mdicas e incluso podra ser la primera oportunidad de ejercer un
dominio total en este campo, pues poseen caractersticas muy peculiares, como el hecho de
que son sumamente competitivos, cuentan con niveles de excelencia cientfica y la
convergencia del mismo objetivo en la ciencia.
Las clulas troncales las consideraron como un potencial econmico, hoy en da Singapur
es el centro de investigaciones a nivel internacional en este mbito. La reglamentacin
implementada est basada en un marco legal y tico fundado en el ao 2000 sobre clulas
troncales por la Ley de prohibicin de clonacin humana y otras prcticas, quien limita y
prohibe prcticas que no sean dispuestas en dicha ley por lo que estipula La clonacin
humana reproductiva est formalmente prohibida, as como la exportacin e importacin de
embriones clonados y la comercializacin de embriones, ovocitos y esperma humanos. La
17
clonacin teraputica est autorizada. Se permite la investigacin en embriones humanos,

mientras que stos no excedan los 14 das. La ley exige determinados puntos que se deben
de cumplir sin excepcin: es necesario tener la informacin de los donantes as como su
aprobacin, tener justificacin alguna para la utilizacin y la derivacin de clulas troncales
embrionarias con base a un objetivo cientfico y de beneficio potencial, la autoridad que
rige esta ley otorga licencias que aseguren la regulacin y el debido control de las
investigaciones sobre las clulas troncales humanas. Siendo as su reglamento uno de los
ms atractivos para los investigadores extranjeros ofrecindoles circunstancias estables para
el desarrollo de sus investigaciones.
En Japn la situacin con respecto al marco reglamentario fue definido de forma rpida lo
que origin un desarrollo dinmico en la investigacin pblica. Su marco reglamentario
sobre clulas troncales se elabor en el ao 2000 bajo la jurisprudencia del Consejo
Cientfico de Japn (SCJ) quien aprobaba la investigacin en clulas troncales humanas
utilizando embriones supernumerarios provenientes de procesos de fecundacin in vitro. En
2001, qued prohibida la clonacin de clulas humanas, pero no la clonacin teraputica ya
que esta ley autoriza la creacin de clulas troncales embrionarias humanas con fines
teraputicos siempre y cuando estuvieran bajo el control del gobierno. La regulacin en los
centros de investigacin estaba dada bajo el Consejo de Ciencia y Tecnologa (SCJ), que
aprobaba los programas de investigacin y quien tena la facultad de decidir interrumpirlo
en cualquier momento.
Para el manejo seguro de los cultivos celulares es necesaria una valoracin adecuada de los
riesgos, una buena organizacin del trabajo y la aplicacin de los principios de las buenas
prcticas en el laboratorio. Es importante adoptar procedimientos de separacin que
prevengan la transmisin accidental de agentes infecciosos de un cultivo a otro. Para evitar
dicha transmisin as como la contaminacin cruzada entre clulas, slo deber
manipularse
una
lnea
celular
cada
vez,
utilizando
mtodos
adecuados
de
descontaminacin, especialmente en las operaciones desarrolladas entre diferentes tipos de

clulas.
18
Actividades sugeridas
! Investigar sobre las normas que existen en Mxico y otros pases para el trabajo con
clulas y tejidos.
! Realizar lectura sobre riesgos en cultivos celulares.
! Realizar lecturas sobre biotica y tica en experimentacin animal y humana.
! Revisar el artculo de Yandell K. Privacy and the HeLa Genome. 2013. Disponible en:
http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/34840/title/Privacy-and-the-HeLaGenome/ Consultado Junio 14, 2014.
! Identificar los diferentes tipos de agentes biolgicos que pueden poner en riesgo al
personal que trabaja en un laboratorio de cultivo celular.
! Consultar el manual de bioseguridad para laboratorio de investigacin biomdica de la
Facultad de Medicina de la Universidad Autnoma de San Luis Potosi y hacer un resumen
de los aspectos generales de seguridad que se deben considerar en los laboratorios de
cultivos celulares/tisulares.
! Describir los tipos de proteccin que se deben tener al vestir y manipular sustancias en
los laboratorios biomdicos.
Bibliografa
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Riesgo
biolgico
en
laboratorios.
Universidad
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Salamanca.
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http://ec.europa.eu/health/index_en.html
http://www.moga.mo.gov/
http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Bioseguridad/MBLIB-v5.pdf
http://www.msssi.gob.es/ciudadanos/saludAmbLaboral/docs/agentes_biologicos.pdf
19
2. Regulaciones
Objetivos
Que el alumno conozca la regulacin existente en ingeniera de tejidos y los aspectos a
considerar para generar y comercializar tejidos artificialmente.
Contenido
Generalidades
Mucho de lo que se realiza actualmente en ingeniera de tejidos y medicina regenerativa
tiene que ver con la investigacin, ya que an falta por conocer muchas cosas del cuerpo
humano y su correcto funcionamiento para poder sustituirlo artificialmente.
Los ingenieros como investigadores, tienen el inters de asegurar que cualquier
investigacin biolgica se lleve de manera responsable y que avance en beneficio de la
sociedad.
La moral se extiende ms all de la legalidad. Hacer lo que es "correcto" es ms que
simplemente evitar lo que est "mal". Se requiere un enfoque proactivo y preventivo. La
biotica debe integrar todo el proyecto de investigacin.
El entorno regulado en el que los investigadores trabajan pueden tentarlos a simplemente
"seguir las reglas". Ciertamente, las reglas son importantes, pero la legalidad y la moralidad
no son totalmente inclusivas.
En la Declaracin de Helsinki se menciona que para realizar investigacin biomdica en
seres humanos es necesario basarse en principios cientficos aceptados, una exhaustiva
revisin bibliogrfica y en experimentacin previa en animales. Se debe realizar un
protocolo experimental en donde se expliquen los objetivos y los riesgos en contra de los
beneficios para los voluntarios. Este protocolo debe ser revisado por un comit
independiente de la institucin que llevar a cabo la investigacin. La investigacin debe
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realizarse por personal calificado y la responsabilidad de los voluntarios recaer siempre en

el personal mdico y no en el investigador.
Se deben respetar los derechos de los voluntarios y los mdicos deben ser los encargados de
informar a los voluntarios sobre los objetivos, los mtodos, riesgos y beneficios del
estudio.
Los voluntarios deben firmar un conocimiento informado al cual pueden renunciar en
cualquier momento del estudio. En caso de que el mdico considere no obtener el
conocimiento informado, la razn especfica debe ser declarada en el protocolo
experimental. En caso de que el voluntario sea un menor o una persona discapacitada el
consentimiento lo puede autorizar un representante legal.
En el tratamiento de las personas enfermas el mdico debe tener la libertad de ajustar su
diagnstico y medidas teraputicas de acuerdo a su juicio con el fin de salvar la vida y
restablecer la salud. En cualquier estudio mdico los voluntarios que participan deben
contar con los mejores diagnsticos y mtodos teraputicos.
Con la obtencin del consentimiento informado se da la autorizacin legal para proceder
con el estudio, para la utilizacin legal de los datos obtenidos para fines profesionales o de
investigacin, esto, sin que el voluntario pueda llevar a cabo cualquier demanda por lesin
o agresin y protegiendo al investigador frente a cualquier reclamacin.
Experimentacin con animales
Se deben tener en cuenta los requisitos que establecen las normas (NOM-062-ZOO-1999)
de las instituciones de salud. Hay que cuidar los siguientes aspectos:
Se debe evitar al mximo el sufrimiento de los animales
Para sacrificar un animal se debe usar un procedimiento que garantice una muerte
sin sufrimiento
Los bioterios deben proporcionar un mximo de comodidad, excepto cuando las

variables experimentales justifiquen la situacin
La NOM-062-ZOO-1999 considera lo siguiente:
Reglamentacin de bioterios para el cuidado de los animales
Especificaciones sobre personal encargado de los animales
Especificaciones sobre cuidados e higiene de los animales
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Obtencin de animales con documentacin
Marcaje de los animales
Aplicacin de eutanasia con procedimientos que causen el menor sufrimiento

posible
Legislacin a nivel mundial

En la actualidad se han demostrado distintas legislaciones que prevalecen en muchos
pases; sin embargo para el uso de clulas troncales, Estados Unidos y Reino Unido cuentan
con amplias aprobaciones tanto en investigacin como en el campo de aplicaciones. Caso
contrario sucede con las normatividades de pases como Alemania, Mxico, Panam,
Nicaragua y Centroamrica que bajo sus normas limitan a la ciencia tratando de proteger la
integridad del individuo.
reas de la investigacin con clulas troncales
Actualmente se est trabajando ampliamente en investigacin con clulas troncales debido
a la capacidad que tienen de dividirse y diferenciarse en diversos tipos celulares
especializados, adems de autorrenovarse para producir ms clulas troncales. La mayora
de tejidos de un organismo adulto tienen una cierta poblacin residente de clulas troncales
que permiten su renovacin peridica o su regeneracin cuando se produce algn dao
tisular. Algunas clulas troncales adultas son capaces de diferenciarse en ms de un tipo
celular como las clulas troncales mesenquimales y las clulas troncales hematopoyticas,
mientras que otras son precursoras directas de las clulas del tejido en el que se encuentran,
como por ejemplo las clulas troncales de la piel, msculo o las gonadales.
Regulaciones en India
a) reas permisibles de investigacin
Los estudios sobre clulas troncales pluripotentes en lneas celulares troncales

embrionarias, conocidas como hES, clulas germinales embrionarias (hEG), iPS o
clulas troncales fetales o de adulto, puede llevarse a cabo con la revisin y
aprobacin del Pacto Internacional de Derechos Econmicos Sociales y Culturales
conocido por sus siglas IC-SCR, Institute Committee Stem Cell Research de la
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India, siempre que la lnea celular sea registrada en el, National Apex Committee for
Stem Cell Research and Therapy (NAC-SCR) de la India.
El establecimiento de nuevas lneas de clulas hES de embriones que provienen de

sobrantes no utilizados en el programa de fecundacin in vitro, o lneas celulares
iPS con la aprobacin previa de la IC-SCR y del Institutional Ethics Committee
(IEC). Una vez que la lnea celular se ha establecido, ser registrada con el IC-SCR
y SCR-NAC y depositada en un banco de clulas para su uso por otras personas.
Los niveles de manipulacin celular se dividen en tres tipos, los cuales estn descritos a
continuacin:
Tipo de manipulacin
Descripcin
Mnima
No se hacen alteraciones mayores a la poblacin celular, esto incluye el uso de reactivos

de grado clnico adems de lavado, centrifugacin, etc. Todos los procedimientos de
laboratorio que no excedan de unas pocas horas, evitar el uso de productos de origen
animal y se lleva a cabo bajo condiciones aspticas estrictas.
Ms de mnima
Se definen como alteraciones en la poblacin de clulas (por ejemplo el agotamiento de

las clulas T, cancerosas etc.), se llevan a cabo expansiones que resultan en alteracin de
la funcin, todo se lleva a cabo bajo condiciones aspticas estrictas y en pocos das.
Manipulacin mayor
Cultivo de clulas a largo plazo a travs de mltiples subcultivos, acompaado de

modificaciones genticas mediante insercin de genes o siRNA.
b) reas restringidas de investigacin
Estudios con quimeras, en donde las clulas troncales de diferentes especies estn
mezcladas y son introducidas en animales, lo cual requiere la aprobacin de la
NAC-SCR.
Estudios que requieran de la importacin de clulas troncales, los cuales tienen que
ser aprobados por la NAC-SCR.
Estudios que requieran la creacin de un cigoto humano por fecundacin in vitro y

transferencia de clulas somticas nucleares (SCNT) o cualquier otro mtodo para
obtener lneas celulares hES. En este caso la justificacin debe ser aprobada por la
NAC-SCR a travs del IEC y el IC-SCR, explicando por qu la creacin del cigoto
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es crtica y esencial para la investigacin propuesta, indicando el procedimiento

para la donacin de vulos, espermas, etc.
Estudios que requieran la introduccin de clulas hES-/hEG-/iPS a animales para

estudios de diferenciacin e integracin de clulas humanas a tejidos no humanos.
Para que estos sean aprobados deben contar con un justificacin muy fuerte. No se
puede permitir que los animales se reproduzcan. Estos estudios son aprobados por
NAC-SCR y revisados por la IAEC y IC-SCR/IEC.
c) reas prohibidas de investigacin
Cualquier investigacin relacionada con ingeniera gentica germinal humana o

clonacin reproductiva.
Transferencia de blastocitos humanos a un tero humano o no humano.
Cualquier cultivo in vitro de embrin humano intacto o estructuras organizadas

celulares que tengan el potencial de convertirse en rganos humanos sin importar su
derivacin despus de los 14 das de la derivacin de la lnea primitiva.
Investigaciones con clulas que no fueron donadas para investigacin.
Cualquier investigacin que implique la implantacin del embrin humano en el

tero despus de la manipulacin in vitro, en cualquier etapa del desarrollo ya sea
en tero humano o animal.
Regulaciones en Mxico
Para que los tejidos puedan ser utilizados con fines teraputicos en seres humanos tienen
que ser sometidos a diversos tratamientos mecnicos para destruir y remover clulas
nativas, eliminando riesgos sanitarios. Estos procesos engloban el trmino disposicin, que
es el conjunto de actividades relativas a la obtencin, recoleccin, anlisis, conservacin,
preparacin, utilizacin y destino final de rganos, tejidos etc. con fines teraputicos de
docencia o de investigacin.
En Mxico, los tejidos que son sometidos a procesos de disposicin, se consideran insumos
para la salud, que son los medicamentos, substancias psicotrpicas, estupefacientes,
materias primas y aditivos que intervienen en su elaboracin, as como equipo, material
quirrgico entre otros. Debido a esto las regulaciones de insumos, caen dentro del
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Reglamento de Insumos para la Salud, el cual es regulado por la Comisin Federal para la
Prevencin contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS).
As mismo existe otro organismo regulador, que supervisa la distribucin y asignacin de
rganos y tejidos donados y que mantiene los registros de donante-receptor. Este
organismo es el Centro Nacional de Trasplantes (CENATRA), que depende de la Secretara
de Salud. Por lo tanto para tejidos con fines teraputicos ambos organismos regulan
diferentes etapas del proceso, el CENATRA regula la parte de identificacin del donador y
procuracin del tejido, por medio de la Coordinacin de Donacin de rganos y Tejidos
con Fines de Trasplante, mientras que la COFEPRIS regula el procesamiento,
almacenamiento y distribucin final del tejido, por medio del Reglamento de Insumos.
Regulacin en Europa
En Europa, la Asociacin Espaola de Bancos de Tejidos (AEBT), que es una de varias
asociaciones
encargada de establecer las normas de calidad y de seguridad para la
donacin, obtencin, evaluacin, procesamiento, preservacin, almacenamiento y

distribucin de clulas y tejidos humanos, hace hincapi en los tratados y propuestas hechos
por el Parlamento Europeo y El Consejo de la Unin Europea. Entre los puntos tratados en
la AEBT, esta las obligaciones de los estados miembros de la asociacin para con el uso de
las clulas y tejidos.
La Directiva 2004/23/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 31 de marzo, establece
normas de calidad y de seguridad para la donacin, la obtencin, la evaluacin, el
procesamiento, la preservacin, el almacenamiento y la distribucin de clulas y de tejidos
humanos. Considera la supervisin de la obtencin de rganos y tejidos, as como la
acreditacin y autorizacin para la generacin de establecimientos de tejidos, y es muy
rigurosa en la trazabilidad que se de a los tejidos o clulas utilizadas en un procedimiento.
A continuacin se describen brevemente los aspectos que involucra la legislacin europea.
Con la modificacin al artculo 152 del Tratado CE (ahora artculo 168 TFUE), la Unin
Europea establece altos niveles de calidad y seguridad para la utilizacin de sangre, rganos
y sustancias de origen humano. Especialmente hay varias disposiciones en relacin a la
sangre humana y sus componentes.
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En 1998, el Grupo Europeo de tica de la ciencia y de las nuevas tecnologas (GEE) plante
la importancia de efectuar un control de las condiciones de circulacin de clulas y tejidos
humanos, cuya donacin, annima y gratuita, deba ser un acto voluntario. Adems, la
utilizacin creciente de clulas y tejidos humanos en tratamientos teraputicos como ciruga
reconstructiva, tratamiento del cncer o de la diabetes, as como el aumento de
intercambios intracomunitarios de dichas sustancias, hicieron necesario definir una base
reglamentaria mnima.
Los tejidos proceden de donantes que pueden estar vivos o haber fallecido, y pueden ser:
huesos y elementos musculoesquelticos (cartlagos, tendones), tejidos cardiovasculares
(arterias, venas y vlvulas cardiacas), tejido ocular (crnea), clulas nerviosas y cerebrales,
piel, tejido fetal, clulas reproductivas (semen, esperma y vulos) y clulas troncales.
La Directiva se aplica adems a productos elaborados derivados de clulas y tejidos
humanos destinados a su aplicacin en seres humanos. En cuanto a los productos
industriales derivados de tejidos y clulas, la Directiva solamente se aplica a la donacin, la
obtencin y la evaluacin de los mismos.
Se excluyen la sangre y sus componentes, los rganos, los tejidos y las clulas utilizadas
como injertos autlogos dentro del mismo procedimiento quirrgico, as como las clulas
autlogas destinadas a la fabricacin de medicamentos.
Los Estados miembros garantizarn que la obtencin y la evaluacin de clulas y tejidos
sean efectuadas por personal con formacin y experiencia adecuadas y que se realicen en
las condiciones acreditadas por autoridad competente.
Todos los establecimientos de tejidos debern estar acreditados, designados o autorizados
por una autoridad competente, la cual tambin podr suspender o retirar la acreditacin, la
designacin o la autorizacin si al realizarse inspecciones se demostrara que el
establecimiento no cumple los requisitos de la Directiva.
Las autoridades competentes deben organizar inspecciones y controles en los
establecimientos cada dos aos. Cuando la Comisin u otro Estado miembro lo solicite, los
Estados miembros debern facilitar la informacin correspondiente a los resultados de
dichas inspecciones y controles.
Los Estados miembros garantizarn la trazabilidad del donante al receptor, y viceversa, de
todas las clulas y tejidos obtenidos, tratados, almacenados o distribuidos en su territorio.
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Esa trazabilidad tambin se aplicar a los productos y materiales que entren en contacto con
tejidos y clulas. Para esto, garantizarn la puesta en prctica de un sistema de
identificacin de donantes que asigne un cdigo nico a cada donacin y a cada uno de los
productos asociados con ella. Todos los tejidos y clulas debern estar identificados con
una etiqueta que contenga la informacin correspondiente a los procedimientos de
obtencin y de recepcin, a su procesamiento, almacenamiento y distribucin. Toda la
informacin de trazabilidad debe ser guardada por mnimo 30 aos a partir de la fecha en
que fueron utilizados.
En cuanto a la importacin y exportacin de clulas y tejidos, los Estados miembros
velarn por que todas las importaciones y exportaciones de clulas y tejidos humanos
procedentes de terceros pases o dirigidos a ellos cumplan los requisitos de calidad y
seguridad establecidos en la Directiva. Las importaciones/exportaciones debern ser
efectuadas por establecimientos de tejidos acreditados, designados o autorizados, a fin de
garantizar la trazabilidad de los tejidos y las clulas.
Tambin se debe garantizar la existencia de un sistema para notificar, registrar y transmitir
informacin sobre incidentes relacionados con la obtencin, la evaluacin, el
procesamiento, el almacenamiento, la distribucin y trasplante de tejidos y clulas.
Directiva 2006/17/CE de la Comisin, de 8 de febrero de 2006, por la que se aplica la
Directiva 2004/23/CE del Parlamento Europeo y del Consejo en lo relativo a determinados
requisitos tcnicos para la donacin, la obtencin y la evaluacin de clulas y tejidos
humanos [Diario Oficial L 38 de 9.2.2006].
En esta Directiva de aplicacin se establecen requisitos tcnicos especficos para cada uno
de los pasos del proceso de preparacin de clulas y tejidos humanos. Se trata, en
particular, de:
los requisitos en materia de obtencin de clulas y tejidos humanos;
los criterios de seleccin de donantes de clulas y tejidos;
las pruebas de laboratorio necesarias para los donantes;
los procedimientos de donacin y obtencin de clulas y tejidos y recepcin en el

centro de tejidos;
los requisitos para la distribucin directa al receptor de clulas y tejidos especficos.
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Directiva 2006/86/CE de la Comisin, de 24 de octubre de 2006, por la que se aplica la

Directiva 2004/23/CE del Parlamento Europeo y del Consejo en lo que se refiere a los
requisitos de trazabilidad, la notificacin de las reacciones y los efectos adversos graves y
determinados requisitos tcnicos para la codificacin, el procesamiento, la preservacin, el
almacenamiento y la distribucin de clulas y tejidos humanos.
La presente Directiva se aplica a la codificacin, el procesamiento, la preservacin, el
almacenamiento y la distribucin de clulas y tejidos humanos, as como a los productos
preparados a partir de ellos.
Real Decreto 1301/2006, de 10 de noviembre, por el que se establecen las normas de
calidad y seguridad para la donacin, la obtencin, la evaluacin, el procesamiento, la
preservacin, el almacenamiento y la distribucin de clulas y tejidos humanos y se
aprueban las normas de coordinacin y funcionamiento para su uso en humanos.
! Investigar sobre las normas que existen en Mxico y otros pases para el trabajo en
ingeniera de tejidos.
! Realizar lectura sobre riesgos en cultivos celulares.
! Realizar lecturas sobre biotica y tica en experimentacin animal y humana.
Bibliografa
Vallero DA. Biomedical ethics for engineers. Elsevier; 2007.
Mathur J. Guidelines for Stem Cell Research. ICMR: 1- 45; 2012.
Ley General de Salud. Ttulo XIV: Donacin trasplante y prdida de la vida: Captulo I.
Disposiciones comunes. Artculo 314 Fraccin XVII. (ltimas reformas DOF 11-06-2009)
Ley General de Salud. Ttulo XII: Control sanitario de productos y servicios de su
importacin y exportacin: Captulo I. Disposiciones Comunes. Artculo 194 Bis. (ltimas
reformas DOF 11-06-2009).
Directiva 2004/23/ce del parlamento europeo y del consejo. Captulo III: Obligaciones de
las
autoridades
de
los
estados
miembros.
Disponible
en:
http://www.aebt.org/web/info/legal/DirectivaTejidos.pdf
www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/compi/rlgsmis.html
28
www.senasica.gob.mx/?doc=743
http://europa.eu/legislation_summaries/public_health/threats_to_health/c11573_es.html
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3. Biologa de los cultivos celulares
Objetivos
Que el alumno conozca un panorama global del cultivo de clulas de mamfero.
Que el alumno sea capaz de identificar las diferentes estructuras celulares y
macromolculas de relevancia en el cultivo.
Que el alumno sea capaz de reconocer que las clulas son dinmicas y no estticas, que
sus molculas estn constantemente en movimiento, recibiendo seales externas y
respondiendo a ellas.
Que el alumno sea capaz de distinguir que las clulas no se encuentran aisladas, sino que
forman parte de tejidos, y que stos tienen diferentes caractersticas morfolgicas y
funcionales.
Contenido
El medio ambiente del cultivo
Se le llama cultivo celular a la propagacin de clulas fuera del organismo de origen. Su
utilidad es mltiple y dentro de sus ventajas encontramos las siguientes:
a) Fcil manipulacin bajo condiciones controladas
b) Alternativa al uso de animales
c) Permite trabajar en pequea, mediana y gran escala
d) Las clulas pueden mantenerse congeladas por largos perodos de tiempo con mnima
prdida de viabilidad
e) Menor variabilidad debido a que se tiene un cultivo de un linaje celular definido
f) Se cuenta con acceso fcil a mltiples lneas celulares en bancos internacionales
En ocasiones, la validez del cultivo celular (Figura 3.1) como modelo de funciones
fisiolgicas es limitada, porque puede ocurrir que el fenotipo no sea el correcto por cambios
en el microambiente. Esto se debe a que las interacciones clula-clula y clula-matriz que
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ocurren en un organismo vivo no son las mismas que se establecen in vitro, hay menor
heterogeneidad, se pierde la arquitectura tridimensional y no estn los mismos estmulos
hormonales y nutricionales (Figura 3.2).
Este cambio de microambiente favorece la migracin, expansin y proliferacin de clulas

no especializadas, y no la expresin de funciones diferenciadas. El microambiente del
cultivo puede estar influenciado por la naturaleza del sustrato (slido, semislido o lquido),
el contacto con otras clulas, la constitucin del medio y la temperatura.
Adhesin celular
La mayora de las clulas en cultivo, provenientes de tejidos slidos, crecen en monocapa,
adheridas a una superficie, y despus de subcultivar (transferir clulas de un recipiente de
cultivo a otro), requieren volver a adherirse al sustrato antes de proliferar. A su vez, antes
de adherirse deben secretar protenas de MEC y proteoglicanos. Las clulas cuentan con
receptores de superficie especficos para molculas en la MEC. En general, las clulas
epiteliales adems de la adhesin a la superficie, son muy dependientes de las adhesiones
intercelulares, por ello, cuando son subcultivadas a baja densidad crecen en parches, pues
les permite formar uniones clula-clula.
Hay 3 principales clases de protenas transmembranales de adhesin:
a) CAMs (cell-cell adhesion molecules, calcio independientes) y cadherinas (calcio
dependientes, Figura 3.3). Ambas participan en interacciones entre clulas homlogas.
b) Integrinas. Participan en interacciones clula-sustrato (por ejemplo, receptores para
fibronectina, laminina, colgeno). Son heterodmeros (subunidad alfa y beta) y su dominio
extracelular es muy polimrfico.
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c) Proteoglicanos. Participan en interacciones clula-sustrato a travs de dominios

diferentes a las integrinas. Pueden ser receptores de factores de crecimiento de baja afinidad
y pueden estabilizar o translocar al factor a su receptor de alta afinidad.
Las protenas transmembranales de adhesin son el motivo por el cual, para subcultivar
clulas en monocapa, se requiera de proteasas que puedan digerir MEC y algn grado de
dominios extracelulares de protenas de adhesin. Esto explica el por qu los epitelios
suelen ser ms resistentes al tratamiento con proteasas (tienen ms molculas de adhesin,
como uniones adherentes, desmosomas y uniones estrechas). Adems de las proteasas, se
suele agregar un agente quelante, como el EDTA, porque muchas de estas molculas de
adhesin dependen de calcio.
Las uniones intercelulares tienen diferentes funciones:
a) Funcin mecnica (desmosomas y uniones adherentes). Mantienen a las clulas
epiteliales juntas, stas crecen confluentes en cultivo y van incrementando el nmero de
desmosomas, por lo que luego es difcil desagregarlas.
b) Funcin de sellado (uniones estrechas). Sellan el espacio entre clulas epiteliales, por
ejemplo, entre clulas secretoras en un acino o ducto o entre clulas endoteliales.
c) Funcin comunicante (gap junctions). Permiten que iones, nutrientes y molculas
sealizadoras pasen entre las clulas en contacto.
En los espacios intercelulares encontramos a la MEC, su constitucin depende del tipo
celular y a su vez, esa composicin regula el fenotipo celular. Los fibroblastos secretan
principalmente colgena tipo 1 y fibronectina, mientras que los epitelios producen laminina
en mayor proporcin. La complejidad de la MEC es un componente significativo en la
expresin del fenotipo de las clulas unidas a l (y en los tejidos, hay una mezcla de tipos
celulares). Las lneas celulares en cultivo generan su propia MEC, pero los cultivos
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primarios, la propagacin de algunas clulas especializadas y la induccin de su

diferenciacin, puede requerir provisin exgena de MEC (como colgena, laminina,
fibronectina, cido hialurnico, proteoglicanos, matrigel, etc.)
La importancia de la MEC radica en que permite la unin necesaria para que ocurra la
proliferacin celular y se lleve a cabo la proliferacin. Adems, la interaccin con ella es
necesaria para la expresin de algunas funciones especializadas de las clulas. Su uso en el
cultivo celular puede ser muy benfico para incrementar proliferacin, sobrevida o
diferenciacin.
Otro componente importante en las adhesiones intercelulares y clula-sustrato, es el
citoesqueleto, pues las molculas de adhesin se unen a l. La unin de integrinas a
microfilamentos de actina se asocia con sealizacin recproca entre superficie celular y
ncleo. Las cadherinas tambin se unen a actina en uniones adherentes, mediando cambios
en la forma celular. Los desmosomas emplean cadherinas, pero se unen a los filamentos
intermedios (como las citoqueratinas), los cuales son especficos de linaje celular y pueden
ser usados para caracterizarlos. Los microtbulos se asocian principalmente a motilidad y
trfico intracelular de organelos.
Las clulas en cultivo se pueden mover en el sustrato y las ms mviles son los fibroblastos
a baja densidad (es decir, cuando no estn en contacto), mientras que las menos mviles
son las monocapas epiteliales densas. Los fibroblastos migran con polaridad (lamellipodio
en el borde lder, fibras de estrs en el polo posterior para retraer, pero la migracin es
errtica. La inhibicin por contacto es el cese de movimiento en la confluencia, cuando toda
el rea de crecimiento disponible se utiliza y las clulas hacen contacto cercano una con la
otra. La inhibicin por contacto se acompaa de reduccin en los ruffles de membrana y
eventualmente lleva a cese de ciclo celular.
Las clulas epiteliales, a menos que estn transformadas, no muestran migracin aleatoria
ni se polarizan, sino que migran hasta hacer contacto con otra clula y eventualmente se
acumulan en parches.
Proliferacin y diferenciacin celular
Cuando se realizan cultivos celulares, es importante recordar las 4 fases del ciclo celular:
G1, S, G2 y M. La progresin a travs de estas fases es controlada por ciclinas y regulada a
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travs de puntos de control, en los que participan protenas supresoras de tumores como
p53 y Rb. Cuando las clulas detectan un dao en los puntos de control que no les es
posible reparar, recurren a la muerte celular por apoptosis.
De especial importancia es recordar que en la fase G1 la clula progresa a la sntesis de
ADN (fase S), o bien, sale del ciclo celular para comprometerse a la diferenciacin. Tanto
la baja densidad celular como la presencia de factores de crecimiento mitognicos,
promueven la entrada al ciclo celular, mientras que la alta densidad inhibe la proliferacin
de clulas normales. La expresin de propiedades de diferenciacin en los cultivos
celulares es limitada por la promocin de la proliferacin celular, que es necesaria para la
propagacin de la lnea celular y expansin de stocks, es decir, su induccin es antagnica
de la proliferacin. Las condiciones para la induccin de diferenciacin son: alta densidad
celular, incremento en las interacciones clula-clula y clula-matriz y presencia de factores
de diferenciacin. Si la diferenciacin se requiere en algn momento de un cultivo celular,
puede ser necesario definir 2 distintos grupos de condiciones: uno para proliferacin y otro
para diferenciacin.
En los casos en que se desea mantener la diferenciacin de un cultivo, no se debe olvidar el
uso de medios selectivos apropiados, con inductores de diferenciacin y usualmente libres
de suero. Es conocido que las funciones especficas se retienen ms tiempo cuando la
estructura tridimensional del tejido se mantiene, como en un cultivo de rgano.
Desafortunadamente, los cultivos de rganos no pueden ser propagados, se deben preparar
de novo en cada experimento y es ms difcil cuantificar el nmero de clulas empleadas en
cada experimento. Una alternativa es el uso de andamios para recrear la estructura
tridimensional, por ejemplo, con matrices de geles de colgeno, celulosa o esponjas de
gelatina. Aunque tienen limitaciones, cuentan con la posibilidad de introducir interacciones
heterotpicas.
Histricamente, la inhabilidad de las primeras lneas celulares para expresar caractersticas
fenotpicas propias del rgano de origen, se tom como sinnimo de desdiferenciacin.
Segn este concepto, las clulas diferenciadas pierden sus propiedades especializadas
cuando se cultivan in vitro. Ahora se sabe que en muchas ocasiones esto se deba a que los
cultivos carecan de agentes inductores especficos, lo que causaba la prdida,
potencialmente reversible, de propiedades diferenciadas (fenmeno conocido como
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desadaptacin). Aunado a lo anterior, sola ocurrir que al realizarse el aislamiento a partir

del rgano, las clulas no diferenciadas sobrepasaban a las diferenciadas, de reducida
capacidad proliferativa. En las correctas condiciones de cultivo, las funciones diferenciadas
pueden ser re-expresadas.
Sealizacin celular
En condiciones fisiolgicas, las clulas estn bajo la influencia constante de seales que
llegan va vasculatura sistmica, o bien, que difunden de clulas adyacentes. Estas seales
moleculares se clasifican en:
a) Molculas de adhesin
b) Factores solubles
Parcrino (homotpico cuando la seal molecular interacta con el mismo tipo de

clula que liber la seal o heterotpico cuando las seales vienen de diferente tipo
celular de las que respondern)
Endcrino
Autcrino
En cultivos in vitro slo se puede contar con las seales autcrinas y parcrinas
homotpicas. Esta puede ser la razn por la cual algunos tipos celulares fracasan en
adherirse cuando se cultivan a bajas densidades (dilucin de factores autcrinos y
homotpicos). Para subcultivar esas clulas, puede ser necesario el uso de medios
condicionados, que consiste en utilizar medio fresco mezclado con medio usado. En los
casos del mantenimiento y proliferacin de clulas especializadas y la induccin de
diferenciacin, que pueden depender de factores endcrinos o parcrinos, stos deben
identificarse y agregarse al medio de cultivo.
Iniciacin de un cultivo celular
Todo cultivo celular inicia con un cultivo primario, ste se obtiene ya sea por la
propagacin de clulas que migraron de un fragmento de tejido o por la dispersin
enzimtica o mecnica de un tejido, como se explica ampliamente en el captulo 10 de este
libro. Independientemente del mtodo empleado, el cultivo primario es el inicio de una
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serie de procesos selectivos que pueden dar lugar en ltima instancia a una lnea celular
relativamente uniforme.
Un cultivo primario est constituido por clulas seleccionadas con base a su capacidad para
migrar de un fragmento de tejido, o bien, a su capacidad para sobrevivir a la tcnica de
disgregacin y adherirse al sustrato. Si el cultivo dura ms de unas horas, aparece la
seleccin por la capacidad de proliferacin. Un cultivo primario es muy inestable, pues las
clulas que lo constituyen se estn modificando continuamente para adaptarse, por lo que
no son poblaciones homogneas.
Despus de alcanzar la confluencia, las clulas cuyo crecimiento es sensible a la inhibicin
por contacto dejarn de dividirse, mientras que cualquier clula que haya sufrido
transformacin (insensibles a la limitacin por densidad) tender a proliferar ms. Mantener
la densidad celular baja (por ejemplo, mediante subcultivos frecuentes) ayuda a preservar el
fenotipo normal. Algunas funciones especializadas se expresan fuertemente en el cultivo
primario, particularmente cuando llega a la confluencia, y en ese momento ocurre la
semejanza morfolgica ms cercana al tejido progenitor.
Evolucin de los cultivos celulares
Una vez que las clulas del cultivo primario llenan el recipiente donde estaban creciendo,
se realiza un pase, tambin llamado primer subcultivo, que consiste en tomar una muestra
de esas clulas y ponerlas a crecer en otro recipiente, como se explica en el captulo 11 de
este libro. En ese momento, el cultivo primario cambia de nombre y ahora es conocido
como lnea finita. Los cultivos evolucionan siguiendo un comportamiento como el de la
figura 3.4, en donde podemos ver que con cada subcultivo sucesivo, las clulas se
seleccionan en base a la habilidad para proliferar ms rpidamente. Al tercer pase, la
poblacin celular es ms estable. En presencia de suero y ausencia de condiciones de
seleccin especficas, las clulas mesenquimatosas derivadas del tejido conectivo
predominan. Este sobrecrecimiento de clulas mesenquimatosas es uno de los principales
retos del cultivo de tejidos.
36
Las clulas derivadas de tejido normal mueren despus de un nmero fijo de doblaje
poblacional, evento genticamente determinado y conocido como senescencia. La
senescencia puede ocurrir en cualquier momento: en los fibroblastos diploides humanos
ocurre entre los 30 a 60 doblajes celulares (aproximadamente 10 a 20 semanas de cultivo).
Desarrollo de lneas celulares continuas
Algunas lneas celulares finitas pueden dar lugar a lneas celulares continuas. Una lnea
celular continua en general aparece alrededor de la semana 14 de cultivo (Figura 5), pero
puede ocurrir en cualquier momento. La capacidad de una lnea celular de proliferar
continuamente probablemente refleja su capacidad de variacin gentica. La variacin
gentica implica a menudo la sobreexpresin del gen de la telomerasa y la eliminacin o
mutacin del gen p53, que normalmente detiene la progresin del ciclo celular cuando el
ADN est daado. Una caracterstica comn de muchas lneas celulares continuas de
humano es el desarrollo de un nmero de cromosomas subtetraploide. La alteracin de un
cultivo que da lugar a una lnea celular continua se denomina comnmente transformacin
in vitro y puede ocurrir de forma espontnea o ser inducida qumica o viralmente. En
cultivo celular, la inmortalizacin significa la adquisicin de un tiempo de vida infinito y
la transformacin implica una alteracin adicional en las caractersticas de crecimiento
37
(independencia de anclaje y prdida de inhibicin por contacto) que a menudo, pero no

necesariamente, se correlacionan con la tumorigenicidad.
Las lneas celulares continuas suelen ser aneuploides y con frecuencia tienen un nmero
cromosmico entre los valores diploides y tetraploides. Hay una variacin considerable en
el nmero de cromosomas entre las clulas de la poblacin (heteroploida).
! Realizar un dibujo cientfico de una clula eucarionte.
! Observar videos sobre motilidad celular y sobre la inhibicin por contacto:
Pushing with the lamellipodium cellix.imba.oeaw.ac.at
http://cellix.imba.oeaw.ac.at/fileadmin/conferences/Videotour_CellMotility/Figura7a.mov
http://www.4shared.com/video/OWK82Thv/2002_inhibicin_por_contacto.html
Observar y comentar en clase un video sobre la dinmica celular:
http://multimedia.mcb.harvard.edu/anim_innerlife_Hi.html
! Observar al microscopio ptico de luz, diferentes preparaciones de tejido humano.
Bibliografa
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Cultivos%20Celulares/cien_a_culitvos.pdf
38
4. Laboratorio de cultivo celular
Objetivo
Que el alumno sea capaz de identificar y conocer la utilidad de diferentes equipos
utilizados en un laboratorio de cultivo celular.
Contenido
Los equipos necesarios en un laboratorio de cultivo celular dependen de la aplicacin
particular que se le d al cultivo, el ahorro de tiempo que el equipo podra producir, la
calidad necesaria de los datos a procesar, los requisitos de la muestra, el ahorro de tiempo y
personal, el nmero de personas que utilicen el equipo, el presupuesto disponible y las
necesidades especiales de los experimentos a realizar. A continuacin se mencionan
brevemente 5 equipos que suelen ser necesarios en todo laboratorio de cultivo celular:
campanas de flujo laminar, incubadoras, microscopios, centrfugas y autoclaves.
Campanas de flujo laminar
Son cmaras de circulacin forzada que segn su diseo y especificaciones, proporcionan
un rea libre de partculas o de probables contaminantes que puedan alterar el producto con
el cual se trabaja, afectar la salud del usuario o contaminar al medio ambiente. El flujo
laminar se consiguen mediante un motor ventilador de impulsin de aire controlado, un
distribuidor de aire y un filtro absoluto o HEPA (High Efficiency Particulate Air), que
determina la pureza y la laminaridad del aire. Las campanas de flujo se clasifican segn el
nivel y tipo de proteccin en clase I, II y III (Figura 4.1).
a) Clase I. La campana de gases (o vitrina extractora de gases) es una cmara que captura
los humos y vapores procedentes de la manipulacin de los productos qumicos en el
laboratorio.
39
b) Clase II. Son cmaras que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a travs de
un filtro HEPA, para proporcionar un volumen constante de aire limpio que fluye a una
velocidad uniforme y laminar en la superficie de trabajo.
c) Clase III. Son cmaras diseadas para limitar al mximo el riesgo del personal de
laboratorio expuesto a agentes potencialmente riesgosos.
Las campanas de flujo deben situarse lo ms lejos posible de las rejillas de aire
acondicionado, campanas de gases, puertas y zonas de mucho trnsito de personas. Debe
existir al menos 0.3 m entre la salida de aire de la cabina y el techo del laboratorio. El aire
expulsado debe canalizarse al exterior siempre que se manipulen marcadores radioactivos o
frmacos citotxicos.
Debe encenderse con al menos 3 minutos de anticipacin antes de su uso, a fin de purgar
los filtros y limpiar la zona de trabajo. Despus, se debe limpiar la superficie de trabajo con
alcohol etlico al 70% o equivalente. Es aconsejable descontaminar el exterior de todo el
material que sea necesario introducir en la cabina (Figura 4.2). No debe utilizarse el
mechero Bunsen dentro de la cabina, porque su flama crea turbulencias en el flujo de aire y
adems puede daar el filtro. Al finalizar el trabajo, la cabina se debe vaciar por completo
de cualquier material, limpiar y descontaminar la superficie de trabajo con alcohol etlico al
70% o equivalente y dejar en marcha la cabina durante al menos 3 minutos.
40
Incubadoras
Son cmaras con ambiente controlado, cuyo propsito es conservar organismos vivos en un
entorno que resulte adecuado para su crecimiento. El ambiente controlado se logra con un
sistema de resistencias elctricas que se regulan mediante dispositivos como termostatos o
controles microprocesados. Los sistemas de transferencia de calor utilizan la conduccin y
la conveccin natural o forzada (Figura 4.3).
Las incubadoras se pueden clasificar de acuerdo a la temperatura a la cual operan (intervalo

de -10 C a 75 C), la composicin atmosfrica utilizada (los cultivos hipxicos son
aquellos con 1% a 2% de O2 y los hiperxicos con 50% a 90% de O2; tambin las hay con
inyeccin de gases como CO2 y N2), si tienen o no agitacin, el tipo de chaqueta empleada
41
(para distribuir el calor en la cmara, las hay con chaqueta de agua o de aire) y el tipo de
ambiente (hmedo o seco). La mayora de las clulas de mamfero en cultivo, que crecen en
monocapa, requieren una incubadora sin agitacin, con 5% de CO2, a 37 C y con ambiente
hmedo.
Microscopios
Se pueden clasificar en estereoscpicos y compuestos. Los estereoscpicos amplifican de 5
a 50 veces las imgenes mediante la utilizacin de una o ms lentes convergentes en un
solo sistema ptico y se utilizan para disectar tejidos (Figura 4.4).
Los microscopios compuestos se denominan as porque la imagen se forma mediante la

utilizacin de tres sistemas de lentes, el condensador, los objetivos y el ocular (Figura 4.5).
42
Existe una gran variedad de microscopios compuestos; los que suelen usarse rutinariamente
para examinar los cultivos celulares son los microscopios invertidos (Figura 4.6).
Centrfugas
La centrifugacin es el mtodo ms rpido, cmodo y limpio para separar un slido en
suspensin con un lquido. Consiste en aplicar una cierta velocidad angular a la suspensin,
de forma que las partculas ms pesadas se depositen en el fondo del recipiente
(precipitado), mientras que las sustancias ms ligeras quedan por encima (sobrenadante).
La condicin previa para que esta separacin ocurra es una diferencia de densidad lo
suficientemente grande entre los componentes (Figura 4.7). La fuerza centrfuga generada
por estos equipos se puede expresar como revoluciones por minuto (rpm) o como fuerza
centrfuga relativa (g).
43
Las centrfugas se usan rutinariamente para obtener suero o plasma a partir de sangre total
(con 1,000 g durante 10 min), concentrar clulas de lquidos que tengan un bajo nmero
(con 1,000 a 5,000 rpm durante 5 min) o separar fases cuando se usan tcnicas en las cuales
se utilizan disolventes orgnicos (con 13,000 rpm durante 10 min). La centrfuga
refrigerada a 4 C se utiliza en el laboratorio de cultivo celular principalmente para separar
las clulas del medio de cultivo o buffer de lavado en una suspensin celular. La velocidad
no puede ser muy elevada ya que las clulas podran lisarse; por otro lado, el aumento de
fuerza de gravedad en el proceso de centrifugacin induce un aumento de calor en la
suspensin celular que tambin podra daarlas. Al ser un equipo refrigerado, debe situarse
alejado de las campanas de flujo laminar y las incubadoras, para evitar que las corrientes de
aire caliente que genera el proceso de refrigeracin puedan contaminar la zona de cultivo.
Toda centrfuga requiere cuidados y precauciones generales, por ejemplo, los rotores deben
mantenerse limpios y libres de residuos, para eliminar potenciales fuentes de contaminacin
o desequilibrio en el eje de giro. Los tubos que se utilicen deben resistir la fuerza centrfuga
que se aplique y su colocacin debe ser de forma equilibrada, es decir, igual peso en
posicin opuesta dentro de la centrfuga (Figura 4.8).
Autoclaves
Son recipientes de cierre hermtico, que permiten trabajar a alta presin para realizar una
esterilizacin con vapor de agua (Figura 4.9). Un ciclo de esterilizado estndar dura 15 a
20 min a 121 C, con presin interna de 103 kPa. Segn su sistema de operacin, se
clasifican en manuales, semiautomticas y automticas. Algunas recomendaciones prcticas
44
para esterilizar usando un autoclave, son las siguientes: comprobar el nivel de agua
destilada, las botellas no deben tener tapn o deben estar desenroscadas, evitar que las
botellas se toquen y colocar cinta testigo al material a esterilizar. Por seguridad, nunca abrir
un autoclave a menos que el manmetro indique cero.
! Realizar una visita al laboratorio de cultivo celular para conocer los diferentes equipos
utilizados rutinariamente.
! Observar un video introductorio sobre el cultivo celular (Video 1: Introduction to Cell
Culture):
http://es-mx.invitrogen.com/site/mx/es/home/References/gibco-cell-culture-basics.html
! Organizar exposiciones orales sobre los equipos ms utilizados en cultivo celular
(centrfugas, autoclaves, microscopios, campanas de bioseguridad e incubadoras de CO2).
! Investigar el fundamento ptico del por qu no es posible visualizar clulas con un
microscopio invertido si stas estn cultivadas en cajas multipozos.
Bibliografa
45
5. Tcnica asptica
Objetivos
Que el alumno entienda la importancia de mantener una tcnica asptica en el
laboratorio de cultivos celulares para evitar contaminacin.
Conocer las tcnicas aspticas utilizadas en un cuarto de cultivos para evitar
contaminacin.
Contenido
La tcnica asptica ayudar a eliminar la contaminacin mediante el establecimiento de un
cdigo de prctica estricto, asegurndose de que todos utilicen las instalaciones apegados a
los lineamientos.
La contaminacin por microorganismos es un problema muy importante en los cultivos
celulares. Pueden ser por bacterias, esporas fngicas, levaduras y micoplasma.
Definiciones importantes
Asepsia: sin infeccin o contaminacin. Ausencia absoluta de grmenes. Conjunto

de procedimientos o maniobras para evitar la contaminacin. Exclusin continua de
microorganismos contaminantes (Figura 5.1).
Esterilizacin: conjunto de procedimientos que destruyen los grmenes, impiden su

desarrollo y evitan contaminacin. Eliminacin de toda forma de vida de un
material o medio.
Desinfeccin: conjunto de procedimientos para destruir o eliminar agentes

contaminantes de todo lo que no pueda esterilizarse (mobiliario). Destruccin de
cualquier organismo vivo que pueda causar dao particular o infeccin (Figura 5.1).
Antisepsia: maniobras que se aplican a la piel, mucosas y manos del personal, el

cual debe usar guantes (Figura 5.1).
46
Cmo evitar la contaminacin masiva?
Checar cuidadosamente los cultivos visualmente y al microscopio invertido
Mantener los cultivos libres de antibiticos para poder evidenciar contaminaciones

ocultas.
Verificar la esterilidad de los reactivos antes de usarlos.
No compartir medios o reactivos con otros usuarios.
No usar los frascos de medio u otro reactivo para diferentes lneas celulares.
Mantener el estndar de esterilidad todo el tiempo.
Tcnica asptica
Combinacin de procedimientos diseados para reducir la probabilidad de infeccin. Las
causas de contaminacin son multifactoriales y las soluciones no son simples ni obvias. En
esos casos hay que continuar con los cuidados, as ser ms fcil identificar la fuente de
contaminacin.
Elementos del ambiente asptico
rea tranquila
Si no se tiene una campana de flujo laminar, se necesita un cuarto estril o por lo menos un
espacio tranquilo con poco movimiento de personal.
47
Si se tiene flujo laminar, debe estar libre de corrientes de aire de puertas y ventanas. No
debe tener cerca equipo que genere corrientes de aire, como centrfugas, refrigeradores,
congeladores.
Superficie de trabajo
La superficie de trabajo debe estar limpia y ordenada. Hay que limpiarla con alcohol al
70%. Slo colocar en la mesa el material para utilizar en el procedimiento. Tener una
superficie de trabajo al centro, libre de equipos y cosas que puedan contaminar. Si algo se
derrama, hay que limpiarlo inmediatamente con alcohol.
Higiene personal
Las manos deben lavarse frecuentemente. Usar guantes quirrgicos cuando haya riesgo o
peligro. De acuerdo a la Food and Drug Administration (FDA), para Good manufacturing
Practices (GMP) es necesario usar gorro, cubrebocas y ropa quirrgica. No es necesario si
se tiene campana de flujo laminar, pero se debe usar bata y recoger el cabello.
Reactivos y medio
Limpiar las superficies externas con alcohol. Hay que quitar las envolturas antes de colocar
los frascos en la campana.
Cultivos
Si vienen de otros laboratorios hay un alto riesgo de que estn contaminados ya sea por su
fuente o por el trnsito.
A continuacin se enlistan los aspectos que se deben considerar para el trabajo en el
laboratorio de cultivos celulares para reducir el riesgo de contaminacin.
Pasos para reducir problemas de contaminacin
1. Usa frascos de cultivo sellados siempre que sea posible, especialmente para cultivos
por largo tiempo.
2. Evita verter medio de cultivo, en su lugar, usa pipetas. Si no se puede evitar verter,
usa gasa estril para eliminar el medio de cultivo que haya quedado en el cuello del
frasco.
3. No uses la campana como rea de almacenamiento: las cajas, botellas, etc., adems
de agregar carga microbiana, alteran el patrn laminar del aire.
48
4. Usa bata de laboratorio limpia para proteger el cultivo de contaminantes

provenientes de la piel o de la ropa. Su uso debe ser restringido al rea de cultivo
celular.
5. Trabaja en la campana slo con una lnea celular a la vez. Para evitar posibles
contaminaciones entrecruzadas, usa recipientes separados de medios para cada lnea
celular. Usa desinfectante para limpiar la superficie de trabajo entre lneas celulares.
6. Transporta tus cultivos no sellados en bandejas, para minimizar el contacto con
contaminantes transportados por aire.
7. Usa medio de cultivo libre de antibitico para el mantenimiento rutinario.
8. Mantn los recipientes abiertos tan poco tiempo como sea posible.
9. Haz alcuotas de soluciones estriles con volmenes pequeos para reducir el
nmero de veces que debe ser abierto.
10. Deja el flujo laminar encendido durante el da. Apgalo slo cuando no sea usado
por periodos extensos.
11. Si se descubre un recipiente contaminado no se debe abrir.
12. Reduce los accidentes marcando cuidadosamente los cultivos y las soluciones.
Indica si han sido esterilizados.
13. Mantn el rea limpia
Las incubadoras, especialmente aquellas que mantienen altos niveles de humedad,
requieren limpieza peridica y desinfeccin. El agua de los baos usados para atemperar los
medios o inactivar los sueros debe ser cambiada peridicamente. Los frascos deben secarse
cuidadosamente antes de usarse. Los contenedores de pipetas de deshecho y otros
contenedores de basura son una fuente de material potencialmente contaminado. Debe ser
vaciado diariamente.
utilizados y el material con el que se trabaja.
Bibliografa
49
6. Preparacin y esterilizacin
Objetivos
Que el alumno conozca los pasos a seguir para realizar un buen uso del cuarto de cultivo
y prepare todo lo necesario antes de empezar a trabajar.
Que el alumno identifique los diferentes mtodos de esterilizacin y cul debe utilizar
para cada cosa que utiliza en el cuarto de cultivos.
Contenido
Para aislar un microorganismo de un proceso infeccioso, es necesario inocularlo en un
sistema estril.
Antes de la realizacin de un cultivo celular se debe llevar a cabo lo siguiente:
Preparacin de Medios de Cultivo.
Esterilizacin de Medios y Reactivos.
Lavado, esterilizacin y preparacin de materiales.
Esterilidad
Todo el material que est en contacto con el cultivo debe estar estril (Figura 6.1).
50
La manipulacin del cultivo debe realizarse de tal forma que se evite el contacto con zonas
no estriles.
Manipulacin estril
Limpiar la superficie de trabajo, frascos, matraces, y cajas que vengan de

refrigeradores, incubadoras o bao mara.
Tapar los frascos con rosca
Flameado de pipeta, cuellos de botella y tapas antes y despus de cerrarlos cuando

no se cuente con campana de flujo laminar.
Mtodos de esterilizacin
En general, tenemos 2 mtodos de esterilizacin: fsicos y qumicos; y cada uno tiene
formas o sustancias diferentes para esterilizar:
Fsicos
Calor: puede ser seco o hmedo. Dentro de las opciones de calor seco se encuentran la
incineracin, el flameado o el aire caliente (estufas). Dentro de las opciones de calor
hmedo se encuentran las autoclaves y la tindalizacin (tcnica de esterilizacin que
consiste en elevar la temperatura del material que se quiere someter a tratamiento, entre 60
y 100 C, varias veces seguidas a intervalos de 24 horas. Con lo cual se consigue la
destruccin de los microorganismos sin alterar la composicin qumica del material).
Radiaciones ionizantes: Se utilizan para elementos que no soportan el calor y la humedad
(jeringas, catter, materiales mdicos y de origen biolgico: medicamentos, alimentos).
Principalmente se utilizan las radiaciones gamma con cobalto 60 ya que son eficientes y
seguras.
Filtracin: La esterilizacin por filtracin se logra por el paso de un lquido o un gas a
travs de un material capaz de retener los microorganismos presentes. Se emplea para
materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de cultivo, azcares, soluciones de
antibiticos y otros medicamentos, etc. Hay varios tipos de filtros, entre ellos los que ms
se usan son los filtros de profundidad y los filtros de superficie o filtros de membrana.
51
Qumicos
xido de etileno: Se debe combinar con CO2. Tiene gran poder de penetracin. Es
importante airear los elementos antes de ser utilizados ya que es txico y mutgeno.
Glutaraldehdo: Se utiliza al 2% en solucin acuosa. Bactericida, tuberculocida y viricida
en 10 min. Tiene efecto esporicida pero necesita de 10 h a temperatura ambiente. Luego de
su uso se deben enjuagar los elementos con abundante agua estril. Se utiliza para objetos
de plstico e instrumentos de ciruga y tejidos.
Formaldehdo: Se utiliza para desinfeccin, pero debe ser utilizado con guantes y en
laboratorios con campanas de nivel I. Uso muy restringido. Los materiales deben seguir el
mismo tratamiento que para el xido de etileno y el glutaraldehdo.
Mecanismos de accin
Alteracin del DNA

o Radiaciones (UV, ionizantes)
o Alquilantes (glutaraldehdo, formaldehdo y xido de etileno)
Alteracin de protenas y enzimas

o Calor; cidos y lcalis
o Oxidantes: perxido de hidrgeno, Iodo
o Metales pesados: mercurio
Alteracin de la membrana celular

o Alcoholes
o Fenoles
o Agentes tensoactivos (amonios cuaternarios, jabones, detergentes)
Factores que afectan la potencia del desinfectante
Tiempo: depende de la concentracin del agente y del tipo de microorganismos a

eliminar, pues no todas las bacterias mueren al mismo tiempo.
Temperatura: normalmente al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los

desinfectantes. Depende del agente para determinar su eficacia con el aumento de
temperatura.
52
pH: el cual afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como al grado de
ionizacin del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables
pasan mejor a travs de las membranas biolgicas y por lo tanto, son ms efectivos.
Concentracin del agente: a partir de la cual se obtendr un efecto deseado. El rango

de concentraciones en que se puede demostrar un efecto especfico dependen del
tipo qumico del desinfectante, del mtodo de ensayo del efecto, y del tipo de
microorganismo a eliminar.
Presencia de materia orgnica: como por ejemplo sangre, suero o pus, afecta
negativamente la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante y a los
desnaturalizantes de protenas, hasta el punto que pueden llegar a hacerlos inactivos
en cuanto a su poder desinfectante y/o esterilizante.
Caractersticas del microorganismo: como especie empleada, nmero de

microorganismos iniciales, resistencia del microorganismo, entre otras.
utilizados y el material con el que se trabaja.
Bibliografa
Video: www.youtube.com/watch?v=ggpzNduZz_4
53
7. Recipientes de cultivo y sustratos
Objetivos
Que el alumno reconozca los diferentes tipos de recipientes y sustratos que pueden ser
utilizados en cultivo celular.
Que el alumno sea capaz de explicar la naturaleza y propsito de los sustratos.
Contenido
Adhesin y crecimiento
La mayora de las clulas de vertebrados cultivadas in vitro crecen en monocapas sobre un
sustrato. Por ello, el sustrato debe permitir la adhesin celular, o por lo menos, permitir la
adherencia de factores de unin producidos por las clulas para que a su vez, permitan la
adhesin celular. A las clulas que requieren adherirse para proliferar se les llama
dependientes de anclaje; las clulas transformadas frecuentemente se vuelven
independientes de anclaje y pueden crecer en suspensin.
Materiales usados como sustrato
El vidrio fue usado originalmente por sus propiedades pticas y la carga de su superficie.
Es barato, fcil de lavar, esterilizable y pticamente claro. Sin embargo, ha sido
reemplazado en la mayora de los laboratorios por plsticos sintticos, porque tienen mayor
consistencia y propiedades pticas superiores. Ejemplos de plsticos sintticos son el
poliestireno, el PVC, el policarbonato, etc.
Los recipientes estriles de un solo uso, hechos de poliestireno, proporcionan un sustrato
simple y reproducible para cultivo, por lo que son los ms usados. La superficie es
totalmente plana, as que las monocapas celulares quedan distribuidas uniformemente y son
reproducibles. El poliestireno es hidrofbico, no adecuado para adhesin celular, por eso
debe recibir un tratamiento qumico o con radiacin , para producir una superficie con
54
carga y capaz de humedecerse. Como el tratamiento y su resultado pueden variar entre

diferentes marcas comerciales, si se cambia de marca comercial se debe probar la eficiencia
de crecimiento de las clulas en medio sin suero o en concentraciones subptimas de ste
(altas concentraciones de suero pueden enmascarar imperfecciones en el plstico).
Recipientes de cultivo
En la Tabla 7.1 se enlistan algunos recipientes de cultivo tpicos. Las clulas HeLa (lnea
celular proveniente de carcinoma de crvix) se utilizan como referencia para conocer el
nmero esperado de clulas que puede contener cada recipiente (considerar slo una quinta
parte de ese nmero si se trata de una lnea celular finita).
Los factores que deben considerarse para elegir los recipientes de cultivo ms adecuados
para nuestro experimento son: la masa celular requerida, el tipo de crecimiento de las
clulas (suspensin o monocapa), si se requiere un cultivo sellado o ventilado, la frecuencia
del muestreo, el tipo de anlisis y el costo.
En cultivos en monocapas, el nmero de clulas es proporcional al rea de superficie
disponible. La relacin del volumen del medio y el nmero de clulas no es lineal: en los
recipientes ms pequeos se tiende a usar ms medio del que proporcionalmente es usado
en los recipientes grandes (Figura 7.1).
55
Por ejemplo, si el ensayo a realizar requiere mltiples repeticiones, es preferible usar cajas
multipozos que utilizan volmenes pequeos (Figura 7.2 y 7.3)
Si no es el caso, se pueden usar cajas Petri o frascos (nombradas segn su dimetro en mm

o su rea de superficie en cm2, respectivamente, Figura 7.4 y 7.5).
56
Si se requieren ms clulas (>1 x 109 clulas HeLa o su equivalente), se utilizan frascos

multicapas (Figura 7.5, derecha). Si se requieren cantidades an mayores de clulas, en vez
de utilizar mltiples frascos multicapas cada vez ms grandes, existen botellas especiales
(roller bottles) (Figura 7.6).
Si se trata de un cultivo en suspensin, para aumentar el nmero de clulas slo se requiere

aumentar el volumen del medio. Los cultivos en suspensin se mantienen en agitacin (60
rpm) y el contenedor no requiere de tratamientos especiales para permitir adhesin celular.
En cuanto a la ventilacin, los frascos de cultivo pueden tener tapas selladas, o bien, tapas
ventiladas que permiten la difusin de CO2 sin riesgo de contaminacin. En las cajas
multipozos y las cajas Petri slo se pueden realizar cultivos no sellados.
Por otro lado, tomando en cuenta el tipo de muestreo y de anlisis requerido, si las muestras
se procesarn simultneamente y de igual manera, se preferirn las cajas multipozos; en
cambio, si se requieren ser retiradas a diferentes tiempos y procesadas inmediatamente, es
mejor usar recipientes individuales. Si se requiere utilizar el microscopio de contraste de
fases, se debe tener en cuenta que su uso se dificulta en cajas multipozos, porque el
menisco que se forma es pequeo; tambin es difcil visualizar las clulas cultivadas en
botellas de cultivo (roller bottles) porque a menudo se requiere quitar el condensador del
microscopio. Finalmente, si el ensayo que se realizar sobre las clulas requiere solventes
como acetona o tolueno, es necesario planear el cultivo sobre superficies de vidrio, pues los
solventes pueden disolver el poliestireno.
Para evitar crecimiento desigual sobre la superficie de los recipientes, es importante evitar
vibraciones, como las causadas por abrir y cerrar la incubadora frecuentemente o por
vibracin del equipo.
57
En lo que respecta al costo, en general las cajas Petri son menos caras que los frascos con
equivalente rea de superficie, pero los cultivos en cajas Petri son ms dependientes del
ambiente hmedo dentro de la incubadora y de las condiciones de CO2 controladas, adems
de ser ms propensos a contaminarse. La ventaja del cultivo en cajas Petri es que es ms
fcil de examinar al microscopio y de procesarse. El cultivo sobre superficies de vidrio es el
ms barato, pero su mayor desventaja es que su preparacin es laboriosa, porque debe ser
cuidadosamente lavado y esterilizado.
Superficies con matriz
La adhesin y el crecimiento celular pueden ser mejorados si se utilizan matrices. Esta es la
razn por la cual el crecimiento celular mejora en las segundas siembras sobre un mismo
sustrato, ya que permanecen adheridos a l las molculas de la MEC secretadas por las
primeras clulas sembradas. El mismo razonamiento aplica para el uso de los medios
acondicionados, pues a veces contienen molculas de la MEC. Es por ello que para algunos
tipos celulares, se coloca sobre la superficie del recipiente algunas molculas que puedan
emular esta capacidad, como el colgeno, la gelatina o la poli-D-lisina (Figura 7.7). Como
se mencion antes, la funcin de la MEC no es slo mecnica, sino que las adhesiones
sealizan intracelularmente, por lo que no es de extraar que en ocasiones, su uso permita
la expresin de funciones diferenciadas.
Hay preparaciones comerciales de MEC, como el Matrigel (matriz preformada generada

por una lnea celular de sarcoma de ratn), que no estn qumicamente definidos, por lo que
pueden tener incluso factores de crecimiento unidos.
58
En ocasiones, puede ser necesario una MEC producida por una monocapa de clulas que se
adhieren fcilmente al plstico (por ejemplo, fibroblastos 3T3), para que otras clulas
especializadas (por ejemplo, endoteliales) lo hagan. En estos casos, antes de sembrar a las
clulas especializadas, se requiere remover los fibroblastos con un tratamiento de Tritn X100. Especial mencin merecen las clulas troncales (stem cell), que particularmente a
bajas densidades, adems de una MEC, requieren el soporte de clulas vivas, conocidas en
ingls como feeder layer (Figura 7.8), para mantenerse por varios pases sin comprometer su
pluripotencialidad.
En ocasiones pueden ocurrir alteraciones morfolgicas debidas al crecimiento sobre feeder

layers, como se puede apreciar en la Figura 7.9.
59
En (A) se muestra la morfologa de clulas endoteliales umbilicales y en (B) la morfologa

de fibroblastos murinos embrionarios, ambos utilizados como feeder layers. En (C) se
observan clulas troncales cultivadas sobre las clulas endoteliales y en (D) las mismas
clulas troncales pero cultivadas sobre los fibroblastos. Es fcil apreciar que las colonias de
clulas troncales exhiben diferencias: en (C) estn ms circunscritas y redondeadas que en
(D).
Matrices tridimensionales
Muchas caractersticas morfolgicas y funcionales se pierden durante el subcultivo serial
por la prdida de la arquitectura tisular y de las interacciones intercelulares. Debido a esto,
se han explorado diversas matrices tridimensionales para el cultivo celular, por ejemplo, las
esponjas de celulosa, el Gelfoam, los andamios de gelatina y los cogulos de plasma
(Figura 7.10)
Estos andamios, adems de permitir la adhesin, proliferacin y diferenciacin, es posible

su degradacin in vivo para ser reemplazado por matriz endgena, por lo que pueden tener
aplicaciones de ingeniera de tejidos.
Existen microtransportadores hechos de poliestireno, sefadex o poliacrilamida, que
permiten propagar clulas dependientes de anclaje en suspensin, sin embargo, aunque
tcnicamente son tridimensionales, funcionalmente siguen siendo monocapas de 2
dimensiones.
60
Sustratos no adhesivos
Son utilizados cuando queremos seleccionar a las clulas independientes de anclaje. El ms
comn es el agar, en el cual slo las clulas transformadas pueden formar colonias.
! Realizar una visita al laboratorio de cultivo celular para conocer los diferentes
recipientes de cultivo utilizados.
! Discutir en clase artculos de divulgacin cientfica sobre las clulas troncales:
Hochedlinger K. El poder teraputico de nuestras clulas. Investigacin y Ciencia 2010;
(406): 24-31.
Liras A. Aplicacin de las clulas madre en la teraputica Ficcin o realidad? 2012;[2
pginas]. Disponible en: http://www.sebbm.es/archivos_tinymce/enero2012-antonioliraspdffinal.pdf Consultado Junio 14, 2014.
Bibliografa
61
8. Medios y suplementos
Objetivos
Que el alumno analice la importancia del medio para las clulas en cultivo.
Que el alumno pueda contrastar las propiedades qumicas de los diferentes medios de
cultivo utilizados ms frecuentemente, para entender su importancia biolgica.
Que el alumno explique la importancia del pH y la temperatura de los medios de cultivo.
Contenido
Desarrollo de los medios de cultivo
Los primeros intentos de cultivar clulas se realizaron en medios naturales, por ejemplo,
con lquidos corporales tales como extractos de embrin de pollo, suero, linfa, etc.
Conforme fue avanzndose en el cultivo celular, se empezaron a requerir grandes
cantidades de medio, cuya calidad fuera ms consistente. Esto trajo como consecuencia la
aparicin del medio basal de Eagle en 1955 y despus, del medio esencial mnimo de Eagle
(MEM) en 1959, con una constitucin qumica definida, que fue ampliamente adoptada en
la mayora de los laboratorios de cultivo celular. Conforme ms lneas celulares empezaron
a estar disponibles, fue evidente que algunas de ellas requeran la optimizacin del medio
MEM. Actualmente, para aislar y propagar clulas de un linaje especfico puede requerirse
un medio selectivo libre de suero, pero en general, la mayora de los cultivos celulares se
pueden mantener en medio MEM, medio MEM modificado por Dulbecco (DMEM, 1959)
o RPMI (1967), suplementado con suero.
Propiedades fisicoqumicas de los medios de cultivo
La mayora de las lneas celulares crecen bien a pH de 7.4, pero el pH ptimo para una
determinada lnea celular puede variar, por ejemplo, las lneas de fibroblastos normales
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crecen mejor a intervalos de 7.4 a 7.7, mientras que las clulas transformadas crecen mejor
en intervalos de 7.0 a 7.4. El rojo fenol es un indicador de pH que se utiliza ampliamente en
los medios de cultivo comerciales (Figura 8.1): es rosa a pH 7.6, rojo a pH 7.4, naranja a
pH 7 y amarillo a pH 6.5.
El CO2 en la fase gaseosa se disuelve en el medio, establecindose un equilibrio con los

iones de bicarbonato y estabilizando el pH. Cada medio tiene una concentracin de
bicarbonato y porcentaje de CO2 recomendada para alcanzar el pH correcto. Aunque otros
buffers, como HEPES, pueden controlar el pH dentro del rango fisiolgico, la ausencia de
CO2 atmosfrico parece limitar el crecimiento celular. La inclusin de piruvato en el medio
L15 de Leibovitz permite a las clulas aumentar su produccin endgena de CO2,
hacindolas independientes de CO2 exgeno, as como de bicarbonato (HCO3-). Por ello,
este medio se recomienda para transportar muestras tisulares.
Es muy importante mantener el pH estable en el medio de cultivo a travs de un buffer,
porque hay condiciones que tienden a disminuirlo, por ejemplo, las lneas celulares
transformadas y a alta densidad sobreproducen CO2 y cido lctico. A pesar de la pobre
capacidad amortiguadora del bicarbonato a pH fisiolgico, sigue utilizndose por su baja
toxicidad y bajo costo.
El otro constituyente principal de la fase gaseosa es el O2. Aunque la mayora de las clulas
requieren oxgeno para respirar in vivo, el metabolismo de la mayora de las clulas en
cultivo est basado en la gliclisis anaerobia. Las clulas en cultivo se mantienen con el O2
atmosfrico, el cual se disuelve en el medio. Sin embargo, el cultivo de rganos,
particularmente de embriones tardos, neonatos y adultos, requiere hasta 95% de O2 en la
fase gaseosa. Este aumento en el requerimiento de O2 puede deberse a un problema de
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difusin, relacionado a la geometra y penetracin gaseosa en el cultivo de rgano (Figura

8.2), o reflejar la diferencia entre clulas diferenciadas y clulas rpidamente proliferantes.
El aumento de O2 puede ser txico para las clulas en cultivo por la formacin de radicales
libres, pero el suero en el medio puede disminuir este efecto. Por ello, el control de la
tensin de O2 es ms crtico en medio libre de suero.
Debido a que la profundidad del medio de cultivo puede influir en la tasa de difusin del O2
a las clulas, es aconsejable mantener la profundidad del medio entre 2 y 5 mm (0.2 a 0.5
mL/cm2).
La mayora de las clulas cultivadas tienen una tolerancia bastante amplia a la presin
osmtica. Como la del plasma humano es de 290 mOsmol/kg, es razonable asumir que ste
es el ptimo para las clulas humanas in vitro, aunque puede ser diferente para otras
especies (por ejemplo, alrededor de 310 mOsmol/kg para los ratones). En la prctica,
osmolaridades entre 260 mOsmol/kg y 320 mOsmol/kg son bastante aceptables para la
mayora de las clulas, pero una vez elegido, debe mantenerse con variaciones menores a
10 mOsmol/kg. Los medios ligeramente hipotnicos pueden ser preferibles para cultivos en
cajas Petri, para compensar la evaporacin del cultivo abierto.
La temperatura ptima para el cultivo celular depende principalmente de la temperatura
corporal del organismo del que se obtuvieron las clulas. As, la temperatura recomendada
para lneas celulares de ave es de 38.5 C y para clulas de humano es de 37 C. Es
importante controlar que la temperatura no sea mayor a la recomendada, porque las clulas
de mamfero no toleran estar 2 C por encima de lo normal ms que unas pocas horas (las
de humano mueren muy rpidamente a ms de 40 C). En cambio, pueden sobrevivir varios
das a 4 C e inclusive, pueden congelarse a -196 C bajo condiciones especiales para evitar
la formacin de cristales, adicionando dimetilsulfxido (DMSO).
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Para obtener resultados reproducibles, debe asegurarse consistencia en la temperatura

(dentro de 0.5 C). Las puertas de la incubadora no deben mantenerse abiertas por tiempos
ms largos que los estrictamente necesarios y la distribucin de la temperatura dentro de la
incubadora debe ser uniforme, permitindose que el aire circule, por lo que no se deben
amontonar los recipientes de cultivo.
Vale la pena mencionar que la temperatura tambin influye sobre el pH del medio de
cultivo, porque a bajas temperaturas el CO2 se disuelve ms. Por ello, a temperatura
ambiente el pH debe ajustarse a 0.2 unidades por debajo del pH deseado a 37 C.
La viscosidad de un medio de cultivo est influenciada principalmente por el contenido de
suero y en la mayora de los casos tendr poco efecto sobre el crecimiento celular. Sin
embargo, la viscosidad se vuelve importante cuando se agita una suspensin celular
(clulas tripsinizadas o en bioreactores agitados) y en cultivos en medios con poco suero o
libres de l. Cualquier dao celular que se produzca en estas condiciones puede reducirse
aumentando la viscosidad del medio con carboximetilcelulosa.
Los efectos de la formacin de espuma no han sido definidos claramente, pero la
desnaturalizacin de protenas puede aumentar, as como el riesgo de contaminacin si la
espuma alcanza el cuello del recipiente de cultivo (Figura 8.3).
La espuma puede limitar la difusin de gases si introduce lquido en el espacio capilar entre
la tapa y el frasco de cultivo, o entre la tapa y la base de una caja Petri.
La formacin de espuma es un problema comn en cultivos en suspensin y puede causar
dao celular (shear stress); se pueden agregar sustancias que reduzcan la tensin
superficial.
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Soluciones salinas balanceadas

Las soluciones salinas balanceadas se componen de sales inorgnicas y puede incluir
bicarbonato de sodio y en algunos casos, glucosa. Forman la base de muchos medios
completos. Ejemplos de ellas son las sales balanceadas de Earle, las de Hank y el PBS
(Phosphate-Buffered Saline). En ocasiones pueden usarse como diluyentes de aminocidos
o vitaminas, para lavados isotnicos, como medios de diseccin y para incubaciones cortas
de no ms de 4 h (siempre y cuando tengan glucosa). La eleccin depender de su uso, por
ejemplo, las que no tienen calcio suelen utilizarse para disgregar monocapas celulares o
tejidos.
Medio completo
El trmino medio completo indica que se le han agregado todo los constituyentes y
suplementos necesarios (aminocidos, vitaminas, sales inorgnicas, protenas, elementos
traza, glucosa, etc.). Los aminocidos que se agregan son los esenciales (que no pueden ser
sintetizados por las clulas) pero en ocasiones tambin se agregan no esenciales, para
compensar cualquier incapacidad particular de un tipo celular para producirlos.
Generalmente las vitaminas presentes en el medio son las hidrosolubles, y los dems
requerimientos se presume que provienen del suero. Algunos medios especiales tambin
contienen vitaminas liposolubles. Las sales son los principales componentes que
contribuyen a la osmolaridad y dependiendo del medio, su concentracin puede variar, por
ejemplo, para cultivos en suspensin, se reduce el calcio (para disminuir la agregacin
celular). La glucosa es la principal fuente de energa en la mayora de los medios, se
metaboliza por medio de la gluclisis formando piruvato, que puede ser convertido a lactato
o acetoacetato y entrar al ciclo del cido ctrico y oxidarse, formando CO2 y agua. La
acumulacin de cido lctico en el medio, sobretodo en clulas transformadas o
embrionarias, implica que el ciclo del cido ctrico no es la ruta prevalente.
En ocasiones, al medio completo se le pueden agregar antibiticos para reducir la
frecuencia de contaminacin, pero no es aconsejable su uso rutinario porque promueve la
aparicin de organismos resistentes, enmascara contaminantes crpticos, oculta infecciones
de micoplasma y promueve una tcnica asptica pobre. Por eso se recomienda restringir su
uso a cultivos primarios o experimentos a gran escala con alto costo de consumibles. Si las
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condiciones demandan su uso, quitar tan pronto como sea posible, o si sern usados por
largo tiempo, tener un cultivo paralelo libre de antibiticos. En los medios complejos
aparecen una variedad de otros compuestos, incluyendo protenas, factores de crecimiento,
pptidos, hormonas, nuclesidos, lpidos y productos intermediarios del ciclo del cido
ctrico. Estos componentes son muy necesarios en los medios libres de suero o con poca
concentracin del mismo.
Suero
El suero contiene factores de crecimiento (que promueven la proliferacin de clulas),
factores de adhesin y actividad antitripsina (que promueven la adhesin celular al
recipiente de cultivo). Es una fuente de minerales, lpidos y hormonas. La mayora de los
sueros usados en los cultivos son de ternera, caballo o bovino adulto. El suero fetal bovino
(SFB) es el ms utilizado particularmente para lneas celulares ms exigentes y para
clonacin.
Las protenas son el principal constituyente del suero. Ejemplos de ellas son la albmina
(que transporta minerales, cidos grasos y hormonas), la fibronectina (que promueve la
adhesin celular), la 2-macroglobulina (que inhibe a la tripsina) y la transferrina (que
transporta hierro, hacindolo biodisponible y menos txico). Las protenas del suero
incrementan la viscosidad del medio, reduciendo el shear stress durante el pipeteo y la
agitacin y pueden agregar capacidad buffer al medio.
Otros constituyentes importantes del suero son los factores de crecimiento, como el PDGF
(factor de crecimiento derivado de plaquetas), el FGF (factor de crecimiento de
fibroblastos), el EGF (factor de crecimiento epidrmico), el VEGF (factor de crecimiento
del endotelio vascular) y el IGF-1 (factor de crecimiento parecido a la insulina).
Durante la coagulacin (necesaria para obtener el suero a partir de sangre total), se libera
PDGF, razn por la cual el suero en cultivo celular tiene mayor poder mitognico que el
suero en el contexto fisiolgico del organismo de origen.
En el suero estn presentes diferentes hormonas (por ejemplo, en el SFB hay hidrocortisona
e insulina), nutrientes, metabolitos (glucosa, aminocidos, nuclesidos), lpidos (cido
oleico, cido linolnico, etanolamina, fosfatidiletanolamina), minerales (hierro, cobre, zinc,
selenio, usualmente unidos a la albmina) e inhibidores de proliferacin celular (que
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pueden ser artefactos de preparacin, como toxinas bacterianas o anticuerpos que tengan
reaccin cruzada con eptopos de superficie celular, o bien fisiolgicos, como el TGF-).
La inactivacin con calor remueve al complemento del suero y reduce la accin citotxica
de los anticuerpos sin daar factores de crecimiento, pero podra inactivar constituyentes
lbiles.
Seleccin del medio y suero
Siempre depender del tipo celular que se desea cultivar e informacin al respecto
generalmente se puede consultar en la literatura o bien, en los bancos de clulas de donde
se adquirieron. De entre todas las formulaciones comerciales disponibles, el 75% de las
ventas lo constituyen el RPMI, DMEM y MEM. El RPMI, aunque originalmente se dise
para cultivos celulares en suspensin (por ello, no contiene calcio), es muy usado en
cultivos en monocapa. El medio Hams F12, desarrollado para clonar clulas CHO, es muy
utilizado en cultivos primarios.
El suero siempre ser una fuente de variabilidad, por ello, cada que se cambie de lote, es
necesario verificar la eficiencia de sembrado (sobrevivencia) y el tamao de colonias
(proliferacin). Para eso, se requiere sembrar entre 10 a 100 clulas/ml, en un intervalo de 2
a 20% de suero y vigilarlas por hasta 10 das. Se recomienda realizar una curva de
crecimiento para verificar el tiempo de doblaje y la densidad de saturacin. Finalmente, es
necesario verificar que las caractersticas morfolgicas de las clulas en cultivo se
conserven y que no haya problemas de esterilidad.
! Buscar la formulacin de 2 medios de cultivo de marca comercial conocida y realizar
una comparacin entre ellas, resaltando las diferencias y las similitudes.
Bibliografa
R. Ian Freshney. Culture of animal cells, a manual of basic technique. Wiley; 2005.
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9. Medio libre de suero
Objetivos
Que el alumno mencione algunas de las razones por las que se han desarrollado los
medios libres de suero.
El alumno describir la metodologa bsica que se emplea en la adaptacin celular al
medio libre de suero.
Contenido
Aunque muchas lneas celulares se cultivan en medio suplementado con suero, hay 3
razones fundamentales para preferir su cultivo en medios libres de suero: a) necesidad de
estandarizar medios entre laboratorios, b) contar con medios especiales para tipos celulares
especficos, y c) eliminar la variabilidad inherente al suero. Algunos ejemplos de medios
que no requieren de suero son el M199, el CMRL 1066, el F10 de Ham, y el F12. En las
apropiadas condiciones hormonales y nutricias, las lneas celulares continuas pueden
adaptarse al medio sin suero sin sufrir seleccin indeseada.
Desventajas del suero
* Variabilidad fisiolgica. Los principales constituyentes del suero, como la albmina y la
transferrina, se conocen, pero el suero contiene una amplia variedad de componentes
menores que pueden tener un efecto considerable en el crecimiento celular y cuyas
concentraciones se desconocen. Estos componentes incluyen nutrientes, factores de
crecimiento, hormonas, minerales y lpidos.
* Consistencia y vida til. El suero vara de lote a lote y un lote dura mximo 1 ao (y
quiz se deteriore durante ese tiempo).
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* Control de calidad. El cambio de lote implica realizar muchas pruebas para asegurar que
el reemplazo sea similar al lote previo (eficiencia de plaqueo, de crecimiento, de funciones
especiales, en todas las lneas celulares en cultivo).
* Especificidad. Cada lnea celular puede requerir diferente lote de suero, lo que implicara
almacenar varios simultneamente.
* Disponibilidad. Peridicamente, el suministro de suero se restringe por diversas razones
(econmicas, polticas, o por propagacin de enfermedades entre ganado), por lo que un
laboratorio de investigacin promedio debe reservar de100 a 200 L de suero/ao.
* Contaminaciones. Es frecuente que el suero se contamine con virus inofensivos para el
cultivo celular, pero que representan un factor desconocido adicional para el control del
operador. A causa del riesgo de la encefalitis espongiforme bovina, suelen haber
restricciones para la compra de suero.
* Costo. El suero constituye la principal parte del costo de una botella de medio completo
(ms de 10 veces el costo de los constituyentes qumicos). Actualmente, los medios libres
de suero son muy caros, pero si aumentara la demanda bajaran los precios.
* Inhibidores del crecimiento. El suero puede tener actividad inhibidora del crecimiento. En
realidad, el efecto neto del suero es una combinacin no predecible de factores que
estimulan o inhiben el crecimiento (como la hidrocortisona o el TGF-).
* Estandarizacin. Con todas las variables antes mencionadas, es clara la dificultad para
estandarizar protocolos experimentales entre diferentes laboratorios.
Ventajas del medio sin suero
Todos los problemas mencionados previamente podran ser eliminados al utilizar medios
sin suero, pero adems, hay otros 2 beneficios:
* Selectivo para un tipo celular. Puede separar linajes e incluso estadios de desarrollo en
clulas hematopoyticas, a travs del uso correcto de factores de crecimiento particulares.
* Regulacin de proliferacin y diferenciacin. Permiten cambiar fcilmente de un estado
de proliferacin a uno de diferenciacin, alterando la concentracin de un factor de
crecimiento u otros inductores.
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Desventajas del medio sin suero

* Multiplicidad. Puede ocurrir que cada tipo celular requiera una receta diferente de medio
libre de suero, incluso an entre lneas celulares de tumores del mismo origen. Aunque este
grado de especificidad puede constituir una ventaja para aislar un tipo celular especfico, es
un problema para laboratorios que trabajan simultneamente diferentes lneas celulares.
* Selectividad. La transicin de los cultivos celulares a medios libres de suero, aunque
deseable, no es tan sencilla. Puede implicar la seleccin de un linaje celular que no sea la
tpica de la poblacin total.
* Pureza de los reactivos. La remocin de suero requiere que el grado de pureza de los
reactivos y del agua sea extremadamente alta (el suero tiene accin detoxificante)
* Menor proliferacin celular. En general, el uso de los medios libres en suero enlentece los
cultivos, e incluso, se logran menos generaciones con las lneas celulares finitas.
* Disponibilidad. Los medios libres de suero de adecuado control de calidad suelen ser
escasos y los reactivos para su preparacin, ms caros.
Subcultivo libre de suero
No debemos olvidar que el suero contiene factores de adhesin como la fibronectina, por lo
que al retirarlo del medio, puede ser necesario tratar la superficie de plstico del recipiente
de cultivo con fibronectina, laminina o poli-D-lisina, para que las clulas se adhieran
adecuadamente. Al subcultivar, requeriremos adems algunos inhibidores de proteasas,
pues para despegar las clulas del sustrato, se utiliza la enzima tripsina que luego es
inactivada por el suero. Al estar ste ausente, se requiere adicionar aprotinina o inhibidor de
tripsina de la soya. Como la tripsina cruda es una mezcla de proteasas, podra ser
necesario inhibidores diferentes o lavar las clulas por centrifugacin.
Las hormonas que se usan cuando se elimina el suero del medio son la somatotropina, la
insulina y la hidrocortisona, pero dependiendo del tipo celular, puede requerir T3,
estrgenos, andrgenos, progesterona, prolactina, o FSH. Los factores de crecimiento
pueden actuar sinrgica o aditivamente con hormonas y nutrientes.
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Seleccin del medio libre de suero

Si la razn para usar medio sin suero es porque deseamos promover el crecimiento
selectivo de un tipo de clulas particulares, entonces es conveniente guiarnos de la
informacin disponible en la literatura. Por otro lado, si la razn es simplemente evitar su
uso en lneas celulares continuas o hibridomas para reducir la probabilidad de protenas de
suero o virales en el producto celular, entonces la gama de posibilidades es mayor, pues hay
una gran cantidad de medios disponibles comercialmente, por ejemplo, el medio OptiMEM es muy utilizado para clulas hematopoyticas.
Muchas formulaciones fueron diseadas inicialmente para cultivo de hibridomas. Se debe
considerar que las formulaciones comerciales suelen ser secretos.
Sustitutos de suero
Aunque no sustituyen a los medios libres de suero, existen productos comerciales que se
han desarrollado para reemplazar todo o parte del suero en los medios convencionales, por
ejemplo, Excyte, Ventrex, Un-serum, etc. Proporcionan mayor consistencia, pero puede
haber variacin entre lotes. Su principal objetivo es abaratar los costos, pues disminuye la
cantidad de suero necesaria (Figura 9.1).
Adaptacin al medio libre de suero

Muchas lneas celulares continuas se pueden adaptar al crecimiento en ausencia de suero,
pero a menudo implica un perodo prolongado de seleccin de un componente minoritario
de la poblacin celular, por lo que es importante asegurarse de que las propiedades de la
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lnea celular no se pierdan durante este periodo de seleccin. La adaptacin se lleva a cabo
a lo largo de varios subcultivos en serie, disminuyendo la concentracin de suero
gradualmente. Una vez que la proliferacin celular se estabiliza a una concentracin de
suero inferior, las clulas se subcultivan en una concentracin ms baja, hasta que la
proliferacin celular se restablece, para nuevamente disminuir el suero en una nueva ronda
de subcultivo. Durante el proceso de adaptacin puede ser necesario suplementar el medio
con factores conocidos para reemplazar el suero.
! Buscar la formulacin de 2 medios de cultivo libres de suero de marca comercial
conocida y realizar una comparacin entre ellas, resaltando las diferencias y las similitudes.
Contrastar con las formulaciones de medios de cultivo convencionales.
! Discutir en clase artculos de divulgacin cientfica sobre clulas de linaje especfico
obtenidas gracias a su cultivo en medios libres de suero:
Gimpel J. Skin layer grown in lab could replace animal testing. 2014;[2 pginas].
Disponible en: http://www.kcl.ac.uk/newsevents/news/newsrecords/2014/April/Skin-layergrown-from-human-stem-cells-could-replace-animals-in-drug-and-cosmetics-testing.aspx
Consultado Junio 14, 2014.
Paddock C. Mature, functioning liver cells made from skin cells. 2014;[2 pginas].
Disponible en: http://www.medicalnewstoday.com/articles/273090.php Consultado Junio
14, 2014.
Bibliografa
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10. Cultivos primarios
Objetivos
El alumno reconocer los aspectos principales de la obtencin de un cultivo primario.
El alumno ejemplificar los efectos debidos a errores en la metodologa de la obtencin
de cultivos primarios.
Contenido
Introduccin
Se le llama cultivo primario a la etapa comprendida entre el aislamiento celular y el primer
subcultivo. Hay cuatro fases a considerar en cada cultivo primario: (1) obtencin de la
muestra (Figura 10.1), (2) diseccin del tejido (Figura 10.2), (3) disgregacin (Figura 10.3),
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y (4) sembrado en un recipiente de cultivo (Figura 10.4).

Despus de obtener la muestra, un cultivo primario puede lograrse permitiendo que las
clulas migren a partir de un fragmento de tejido adherido a un sustrato adecuado o
mediante la disgregacin del tejido mecnica o enzimticamente, para producir una
suspensin celular, algunas de las cuales se adherirn al sustrato. Las enzimas que se
utilizan con mayor frecuencia para la disgregacin del tejido son preparaciones crudas de
tripsina, colagenasa, elastasa, pronasa, dispasa, DNasa y hialuronidasa, solas o en
combinaciones. Las preparaciones crudas de las enzimas (con otras proteasas
contaminantes) son mejores disgregando el tejido que las enzimas purificadas
(generalmente menos txicas y ms especficas en su accin).
Aunque cada tejido puede requerir un conjunto diferente de condiciones, ciertos requisitos
son compartidos por la mayora de ellos:
a) Remover tejido necrtico y graso.
b) Cortar finamente con instrumentos especiales (causando el dao mnimo).
c) Despus de su uso, las proteasas deben eliminarse con centrifugacin gentil.
75
d) La concentracin celular debe ser mucho mayor que la normalmente usada para
subcultivo (porque muchas de ellas no sobrevivirn el proceso).
e) Es preferible utilizar un medio rico, como el F12, a un medio simple, como el MEM. Si
se requiere suero, es mejor usar el SFB.
f) Los tejidos embrionarios son ms fciles de disgregar y proliferan ms rpidamente que
los adultos.
Aislamiento del tejido
Antes de trabajar con tejido humano o animal, debemos cumplir con todas las normas de
tica mdica o de legislacin vigente sobre la experimentacin con animales. Se debe
esterilizar el sitio de reseccin, retirar el tejido aspticamente y transferirlo al laboratorio de
cultivo en medio de transporte tan pronto como sea posible. No se pueden diseccionar
animales en el laboratorio de cultivo, por el riesgo de contaminaciones microbianas. Si es
inevitable un retraso en la transferencia del tejido, ste puede mantenerse a 4 C durante un
mximo de 72 h. Los embriones de ratn son una fuente conveniente de clulas para cultivo
de fibroblastos no diferenciados (frecuentemente usados como feeder layer); por otro lado,
los embriones de pollo son ms fciles de disectar, por ser ms grandes que los de ratn en
el estadio de desarrollo equivalente.
Explante primario
La tcnica del explante fue el mtodo original para iniciar el cultivo de tejido. Consiste en
tomar un pequeo fragmento de tejido y embeberlo en plasma coagulado mezclado con
extracto embrionario, para mantenerlo fijo y visualizarlo con un microscopio convencional
(Figura 10.5).
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El plasma coagulado, junto con el extracto embrionario, proporcionan nutrientes y factores

de crecimiento que estimulan la migracin celular desde el explante. Sus principales
desventajas son la pobre adhesividad de algunos tejidos y la seleccin celular.
Disgregacin tisular
La adhesin clula-clula en los tejidos est mediada por una variedad de molculas de
adhesin, algunas de las cuales son dependientes de calcio (cadherinas) y por lo tanto son
sensibles a los agentes quelantes como EDTA o EGTA. Las integrinas, que se unen a la
matriz extracelular, tambin tienen dominios de unin dependientes de Ca2+.
El procedimiento ms sencillo de disgregacin tisular es por mtodos enzimticos,
partiendo de una solucin de disgregacin simple a una solucin ms compleja, con tripsina
o tripsina/EDTA como punto de partida, y la adicin de otras proteasas para mejorar la
disgregacin. En general, el incremento en la pureza de la enzima disminuye toxicidad,
pero tambin disminuye la disgregacin. Este mtodo de obtencin de cultivo primario
selecciona en base a la capacidad celular de soportar el tratamiento con proteasas. Entre
mayor sea el estrs requerido, los componentes ms frgiles del tejido se destruirn. La
tcnica a seguir consiste en incubar el tejido con tripsina a 37 C por hasta 30 min, o bien,
pre-incubar a 4 C por 6-18 h (para permitir su difusin en el tejido) y luego a 37 C por 20
min.
En muchas ocasiones, la disgregacin enzimtica requiere combinarse con mtodos
mecnicos, como se aprecia en la figura 10.3, en donde adems de la incubacin del tejido
con la solucin enzimtica, se agita con ayuda de una pipeta y luego con un agitador
magntico en una parrilla de agitacin.
Sembrado
Una vez que se obtiene una suspensin celular homognea, se determina la concentracin
celular y se siembran sobre recipientes adecuados para incubar en las condiciones
necesarias. Durante esta fase, el crecimiento celular y la aparicin de contaminaciones debe
vigilarse estrechamente. Puede ser necesario realizar cambios de medio de cultivo. Una vez
que el cultivo primario ha ocupado todo el sustrato disponible, es necesario subcultivar.
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! Realizar la diseccin de tejido cardiaco con microscopios estereoscpicos del laboratorio
de docencia, a partir de embriones de pollo E7.
! Observar videos sobre obtencin de cultivos primarios:
http://www.youtube.com/watch?v=eHDapIC6QvY
http://www.youtube.com/watch?v=iJrvPkpp4QA
Bibliografa
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11. Subcultivo y lneas celulares
Objetivos:
El alumno explicar cmo se realiza un subcultivo y en qu momento se debe realizar.
El alumno reafirmar temas previamente revisados.
Contenido:
Propagacin
El primer subcultivo representa una transicin importante. La necesidad de subcultivar
significa que el cultivo primario ha ocupado todo el sustrato disponible. La proliferacin
celular ha llegado a ser una caracterstica importante y despus de este primer pase, la
fraccin celular en crecimiento es alta, hasta del 80%. De un cultivo primario muy
heterogneo, emerge una lnea celular ms homognea, cuya importancia prctica es que
ahora se puede propagar, caracterizar y almacenar. El mayor nmero de clulas permite un
amplio rango de posibilidades experimentales.
Terminologa
Una vez que el cultivo primario es subcultivado (coloquialmente se dice que se ha realizado
un pase), se le conoce como lnea celular. Este trmino implica la presencia de varios
linajes celulares de fenotipos distintos o similares. Si una lnea celular es seleccionada (por
clonacin, separacin fsica u otra tcnica) por tener cierta propiedad especfica, esta lnea
celular se convierte entonces en una cepa celular. Si una lnea celular se transforma in vitro,
da lugar a una lnea celular continua y si sta es clonada y caracterizada, entonces es
conocida como cepa celular continua. Es vital confirmar la identidad de la lnea celular para
79
excluir la posibilidad de contaminacin cruzada. Las propiedades de las lneas celulares

continuas y finitas se muestran en la Tabla 11.1.
El primer subcultivo da lugar al cultivo secundario, y el segundo subcultivo al cultivo
terciario, y as sucesivamente. En la prctica esta nomenclatura es rara vez utilizada ms
all del cultivo terciario. Lo que es importante considerar es el nmero de pases que se han
dado a las clulas (o veces que se ha subcultivado), parmetro diferente al nmero de
generacin, que se refiere al nmero de doblajes que la poblacin celular ha llevado a cabo.
Si cada subcultivo se divide a la mitad, la relacin de divisin (o split ratio) es 1:2, y el
nmero de pases es el mismo que el nmero de generaciones. Pero si el subcultivo es
llevado a cabo en relaciones mayores a 1:2, el nmero de generacin (indicador
significativo de la edad del cultivo) incrementar ms rpido que el nmero de pase.
Propiedades
Finita
Continua
Ploida
Euploide, diploide
Aneuploide
Transformacin
Normal
Inmortal, tumorignico
Dependencia de anclaje
Si
No
Inhibicin por contacto
Si
No
Limitacin por densidad
Si
Reducida o perdida
Modo de crecimiento
Monocapa
Monocapa o suspensin
Mantenimiento
Cclico
Posible estado estacionario
Requerimiento de suero
Alta
Baja
Eficiencia de clonacin
Baja
Alta
Marcadores
Especfico de tejido
Antignico, enzimtico,
cromosmico
Funciones especiales
Frecuentemente perdidas
Pueden ser conservadas
Tasa de crecimiento
Lenta (24-96 h)
Rpida (12-24 h)
Rendimiento celular
Bajo
Alto
Parmetros de control
No. de generacin, marcadores
Caractersticas de cepa
especficos de tejido
Tabla 11.1 Propiedades de las lneas celulares continuas y finitas
80
Edad del cultivo

Las lneas celulares con nmero limitado de generaciones se conocen como finitas y su
comportamiento es muy reproducible. Usualmente llevan a cabo entre 20 y 80 doblajes de
poblacin antes de la extincin. El nmero depende de la especie, del linaje, de las
condiciones del cultivo y de la variacin clonal, pero es consistente para una lnea celular
bajo las mismas condiciones.
Por ello, es importante la referencia al nmero de doblaje aproximado desde el explante. En
cambio, las lneas celulares continuas perdieron el control de la senescencia, por lo que el
nmero de generacin es menos importante que el nmero de pases desde el ltimo
descongelamiento.
Designacin
A las lneas celulares nuevas se les debe de asignar un cdigo, por ejemplo NHB (para
Normal Human Brain); un nmero, si varias lneas celulares se obtuvieron de la misma
fuente (NHB1, NHB2, etc.), y si fue clonada, el nmero de clona (NHB1-1, NHB1-2, etc.).
En general, las iniciales del donante no se usan por razones de confidencialidad. Es
importante llevar una bitcora de biopsias o especmenes antes de iniciar un cultivo y
asegurarse que el nombre de la lnea celular sea nico.
Seleccin
Aparte de los requerimientos funcionales especficos, hay una serie de cuestiones que
deben responderse antes de elegir una lnea celular para trabajar, por ejemplo, hay una
lnea celular continua que exprese la funcin que necesitamos de manera correcta?, porque
en general, son ms fciles de mantener, crecen ms rpido, se clonan ms fcil, se adaptan
ms rpido al medio libre de suero y tienen mayor rendimiento por frasco. Si no es
importante la especie, es preferible escoger no humanas, porque requieren menos permisos
y podra ser ms accesible la obtencin de tejido original. Si se escoge una lnea finita, hay
suficientes stocks disponibles?, o generars tu propia lnea celular? Si escoges lneas
continuas, estn disponibles stocks autnticos?, qu tan bien caracterizada est la lnea?,
realizars la caracterizacin necesaria?, expresa las caractersticas correctas?; si estas
usando una transfectante, tienes el equivalente normal disponible?, ser requerido?, qu
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tan estable es?, ha sido clonada?, cunto requieres en trminos de tasa de crecimiento,
facilidad de cosecha, etc.?, cules son sus caractersticas de crecimiento (tiempo de
doblaje, densidad de saturacin, eficiencia de plaqueo, habilidad para crecer en
suspensin)?
Rutina de mantenimiento
Un cultivo celular necesita un cambio de medio peridico, seguido de un eventual
subcultivo, si las clulas lo requieren. An en los cultivos no proliferativos se requiere el
cambio peridico de medio, porque las clulas lo metabolizan. Dependiendo de la lnea
celular, puede requerirse un cambio de medio semanal, o bien, un subcultivo por semana.
Morfologa celular
Es vital examinar el cultivo cuidadosamente, para confirmar ausencia de contaminacin y
buscar signos de deterioro, como granularidad perinuclear, vacuolacin citoplasmtica y
redondeamiento con despegamiento del sustrato (Figura 11.1). Tales signos pueden
implicar que el cultivo requiere un cambio de medio, o podran indicar un problema ms
serio, como medio o suero txico o inadecuado, contaminacin microbiana o senescencia.
Las deficiencias en el medio pueden iniciar apoptosis. Todos estos cambios se deben
prevenir, pues es difcil revertir el deterioro. Para lograr la familiaridad a la lnea celular,
puede ser recomendable realizar fotografas a densidades celulares especficas.
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Reemplazo del medio

Son 4 los factores que indican la necesidad de reemplazar el medio: el pH, la concentracin
celular, el tipo celular y el deterioro morfolgico. La mayora de las clulas detienen su
crecimiento cuando el pH cambia de 7 a 6.5 y pierden viabilidad entre 6.5 y 6. Tambin es
importante la tasa del descenso (si cae 0.1 unidad/da, no hay prisa para cambiar el medio,
pero si cae 0.4 unidades/da, si es necesario). Las clulas normales paran de dividirse a alta
densidad, se bloquean en fase G1 y se deterioran poco, pero las clulas transformadas y
algunas embrionarias, se deterioran rpidamente a altas densidades, a menos que el medio
sea cambiado diariamente o se subcultiven. El deterioro morfolgico debe ser anticipado a
travs del examen visual regular y la familiaridad con la lnea celular.
El volumen de medio en un recipiente de cultivo debe de ser de 0.2 a 0.5 mL/cm2 (el lmite
superior depende de la difusin gaseosa, as que en clulas con alto requerimiento de O2, se
recomienda 2 mm de profundidad, mientras que en clulas con bajo requerimiento, la
profundidad puede ser de 5 mm.
Medio de mantenimiento
El medio de mantenimiento se utiliza en lneas celulares finitas cuando la estimulacin de
la mitosis no es deseable. Se trata de medio de cultivo convencional con menos del 2% de
suero, o bien, medios libres de suero con omisin de factores de crecimiento y otros
mitgenos. Las clulas transformadas no son aptas para este procedimiento, porque pueden
continuar dividindose exitosamente o bien, se pueden deteriorar. El medio de
mantenimiento puede promover la expresin de un fenotipo diferenciado.
Subcultivo
Cuando un cultivo celular est a baja densidad y creciendo lentamente, puede ser preferible
remover solamente la mitad de su medio de cultivo y reemplazarlo por medio fresco.
Cuando una lnea celular es subcultivada, el crecimiento de las clulas hasta el momento
del siguiente subcultivo usualmente sigue un patrn estndar (Figura 11.2). Un perodo de
latencia (fase lag) despus del sembrado es seguido por un perodo de crecimiento
exponencial (fase log). Cuando la densidad celular (clulas/cm2) alcanza un nivel en que
toda la superficie disponible est ocupada o cuando la concentracin celular (clulas/ml)
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excede la capacidad del medio, el crecimiento cesa o se reduce. Entonces el medio debe ser
cambiado o el cultivo debe dividirse. Para una lnea celular adherente, el subcultivo implica
la remocin del medio y disociacin de las clulas en la monocapa con tripsina (o alguna
otra proteasa). Es conveniente hacer pruebas y seleccionar el protocolo menos severo
compatible con alta viabilidad y buena suspensin celular.
La necesidad para subcultivar una monocapa est determinada por los siguientes criterios:
a) Densidad del cultivo: las clulas no transformadas deben subcultivarse tan pronto
como alcancen la confluencia. Si se dejan as por 24 h, se retiran del ciclo celular y tomar
ms tiempo recuperarlas cuando sean subcultivadas. Las clulas transformadas deben
subcultivarse en cuanto alcancen la confluencia, porque aunque continan proliferando ms
all de la confluencia, se deteriorarn despus de 2 doblajes y la eficiencia del resembrado
declinar.
b) Agotamiento del medio. El cambio de pH indica la necesidad de cambio de medio,
pero si la cada de pH es muy rpida, puede requerirse subcultivar. La cada de pH tambin
puede sugerir contaminacin microbiana.
c) Tiempo desde el ltimo subcultivo. Es recomendable establecer subcultivos rutinarios
bajo un estricto programa, para que el comportamiento celular sea reproducible. Una vez
que la rutina se establece, las desviaciones de ella indicaran deterioro de las clulas.
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d) Requerimientos experimentales. Cuando las clulas se requieren para propsitos

diferentes a la propagacin rutinaria, deben ser subcultivadas para incrementar el stock o
para cambiar el tipo de recipiente de cultivo o el medio. Nunca debe hacerse en el periodo
de latencia, lo ms recomendable es que se realice entre la segunda mitad de la fase log y
antes de entrar a la fase plateau. Cuando se subcultivan diferentes lneas celulares a la vez,
stas deben manejarse separadamente, por el riesgo de la contaminacin cruzada.
Ciclo de crecimiento
Los pases rutinarios llevan a la repeticin de un ciclo de crecimiento estndar (Figura 11.3).
Si las clulas estn creciendo correctamente, deben alcanzar la misma concentracin celular
despus del mismo tiempo en cada ciclo dado, si la concentracin de sembrado y el
intervalo de subcultivo permanecen constantes.
Es altamente recomendable familiarizarnos con el ciclo de crecimiento de cada lnea

celular, pues ste controla la concentracin de sembrado, la duracin de crecimiento antes
del subcultivo, la duracin de los experimentos y los tiempos apropiados para el muestreo,
permitiendo mayor consistencia, porque las clulas en diferentes fases del ciclo de
crecimiento se comportan diferente con respecto a proliferacin celular, actividad
enzimtica, gluclisis, respiracin, sntesis de productos especializados, etc.
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La concentracin celular que debemos utilizar para subcultivar debe ser la mnima que
permita entrar rpidamente a la fase de crecimiento logartmico pero que alcanzar la fase
de plateau justo en el momento que sea conveniente para el siguiente subcultivo.
Propagacin en suspensin
Los cultivos en suspensin tienen la ventaja de no requerir proteasas para realizar
subcultivos, lo que significa que el proceso es menos traumtico. Adems, no requieren
reemplazo total del medio de cultivo, basta realizar diluciones.
Como se mencion en secciones previas, el vidrio o plstico no requiere de un tratamiento
especial para cultivo de clulas en suspensin y si la profundidad del cultivo es 5 mm, se
requiere agitacin. Cuando se realiza el subcultivo en suspensin, se puede mantener en el
mismo frasco, pero aumenta la probabilidad de contaminacin.
Estandarizacin de las condiciones de cultivo
Esencial para mantener la estabilidad fenotpica. Por ello, se recomienda no variar el medio
de cultivo, usar el mismo lote de suero, utilizar la misma marca de recipientes para cultivo
y contar siempre con reemplazos de las lneas celulares en stocks congelados.
Uso de antibiticos
El uso continuo de antibiticos favorece las contaminaciones crpticas, particularmente
micoplasma y el desarrollo de organismos resistentes a antibiticos. Adems, puede
interferir con procesos celulares bajo investigacin. Sin embargo, puede haber
circunstancias especiales en las que se tenga que usar antibiticos; si este el caso, la
recomendacin es que no sea permanente y que se tengan stocks libres de antibiticos.
! Visita al laboratorio de cultivo para observar el subcultivo de una lnea celular
! Observar videos sobre el procedimiento del subcultivo (Video 3: Passaging Cells):
http://es-mx.invitrogen.com/site/mx/es/home/References/gibco-cell-culture-basics.html
http://www.youtube.com/watch?v=PC51Z5FKZXQ
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Bibliografa
87
12. Clonacin y seleccin
Objetivo
El alumno expondr claramente el significado de la clonacin y su relacin con la
seleccin celular.
Contenido
Clonacin celular
Un problema recurrente en el cultivo celular es la preservacin de un tipo celular especfico
y sus propiedades especializadas. Aunque el microambiente juega un papel importante en el
mantenimiento de estas propiedades especializadas en cultivo, el crecimiento excesivo de
clulas no especializadas y de clulas de linaje incorrecto sigue siendo un problema
importante. El problema de la heterogeneidad de un cultivo se puede afrontar aislando una
cepa celular pura por medio de clonacin.
Aunque la tcnica es relativamente fcil en lneas celulares continuas, su xito en la
mayora de los cultivos primarios es limitado, por su pobre eficiencia. Un problema mayor
en los cultivos celulares finitos, es que stos tienen un nmero limitado de generaciones,
por lo que cuando una clona ha producido suficientes clulas, stas estarn muy cercanas a
la senescencia.
La clonacin es utilizada para disminuir la heterogeneidad de un cultivo, en ensayos de
sobrevivencia,
para
optimizar
condiciones
de
crecimiento
para
determinar
quimiosensibilidad y radiosensibilidad. Las clulas adherentes pueden ser clonadas sobre

cajas Petri, multipozos, o frascos, y es relativamente sencillo discernir entre colonias
individuales. La micromanipulacin es el nico mtodo que asegura la clonalidad (que una
colonia deriva de una sola clula). La clonacin tambin puede realizarse en cultivos en
suspensin, sembrando sobre gel (agar) o sobre una solucin viscosa (MethocelTM).
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La clonacin por dilucin es la tcnica ms ampliamente utilizada, basada en la

observacin de que las clulas diluidas por debajo de cierta densidad, forman colonias
discretas. Se recomienda utilizar placas de microtitulacin para sembrar las clulas a baja
densidad.
Como la densidad durante la clonacin es baja, es razonable dejar el cultivo por hasta 2
semanas sin realizar cambio de medio.
Cuando las clulas son sembradas a baja densidad, la tasa de sobrevivencia disminuye. En
cultivos primarios y lneas celulares finitas, la eficiencia de sembrado puede ser tan
pequea como de 0.5 a 5%. Afortunadamente, conforme han mejorado los medios de
cultivo, la eficiencia de sembrado ha ido incrementndose. Otra opcin, es el uso de feeder
layer o medios condicionados.
Para mejorar el crecimiento clonal, es recomendable utilizar un medio de cultivo rico en
nutrientes, optimizado para la lnea celular que estamos clonando; si vamos a utilizar suero,
es preferible escoger el SFB; tambin se pueden agregar hormonas especficas, como
insulina. Durante la clonacin, cobra mayor relevancia el ajuste preciso del CO2 y puede ser
necesario utilizar sustratos (como fibronectina), medios condicionados o feeder layers (con
arresto en el ciclo celular).
Aislamiento de las clonas
Cuando clonamos, lo que se busca es realizar una seleccin especfica de clulas. Si el
procedimiento se realiza directamente en placas multipozos con clulas que crecen en
monocapa, el aislamiento de las clonas es sencillo, pues una clona se encontrar en un
pocillo (an as, es necesario confirmar el origen clonal por medio de visualizacin
rutinaria con un microscopio). En cambio, si las clulas fueron clonadas en cajas Petri, no
hay separacin fsica de clonas, pero se pueden usar anillos de clonacin (Figura 12.1). La
clonacin celular puede tener como finalidad el aislar clulas que son resistentes a una
determinada molcula.
Las clulas pueden hacerse resistentes a una gran variedad de molculas, como antibiticos,
antimetabolitos, metales txicos, etc., ponindolas bajo tratamientos especficos que
promuevan la aparicin de dicha resistencia.
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La interaccin de un tipo celular con determinadas molculas de adhesin tambin puede

ser un parmetro para seleccionarla. Por ejemplo, una suspensin de clulas primarias
puede sembrarse en un frasco y despus de 30 min ser transferido a un segundo frasco y as
sucesivamente; este procedimiento seleccionar a las clulas con mayor capacidad de
adhesividad en el primer frasco y con la menor capacidad de adhesin en el ltimo.
! Organizar en el saln de clase la lectura del tema por equipos, para presentar un resumen
en plenaria.
Bibliografa
90
13. Caracterizacin
Objetivo
El alumno reconocer la importancia de caracterizar un cultivo celular
Contenido
Hay 6 principales razones para caracterizar una lnea celular: demostrar la ausencia de
contaminacin cruzada, confirmacin de la especie, correlacin con el tejido de origen,
determinar si la lnea celular es transformada o no, buscar inestabilidad gentica y variacin
en el fenotipo y demostracin de caractersticas nicas. Se debe registrar la informacin de
la lnea celular desde el momento en que se aisl el tejido o desde el momento en que se
recibi, detallando su origen, sus caractersticas y el manejo requerido.
Autentificacin
Requiere que la lnea celular sea caracterizada al recibirse y luego peridicamente durante
su uso (esos datos deben agregarse a su procedencia). La caracterizacin (Tabla 13.1) es
vital para determinar la funcionalidad y autenticidad (descartando contaminacin cruzada).
Criterio
Mtodo
Cariotipo
Bandeo cromosmico
Anlisis de isoenzimas
Electroforesis de geles de agarosa
Antgenos de superficie Inmunohistoqumica

Citoesqueleto
Inmunocitoqumica para citoqueratinas especficas
DNA fingerprinting
Patrn de restriccin en microsatlites (VNTR)
DNA profile
PCR de minisatlites (STR)
Tabla 13.1 Algunas tcnicas de caracterizacin. STR, short tandem repeats; VNTR, variable
number of tandem repeats.
91
Morfologa celular
Observar la morfologa celular, es la forma ms simple y directa de identificar clulas Sus
inconvenientes son la plasticidad de la morfologa en respuesta a las condiciones de cultivo
y que las alteraciones en el sustrato y constitucin del medio alteran la morfologa celular.
Las observaciones con el fin de comparar morfolgicamente siempre deben realizarse bajo
las mismas condiciones. Al usar el microscopio invertido, la magnificacin mxima del
objetivo debe ser limitada a 40x. Para el microscopio de contraste de fases, el objetivo de
10x da el suficiente detalle para un examen rutinario. Es importante revisar la fase de
crecimiento, el estado de las clulas y el medio de cultivo. Es til tener un registro
fotogrfico en diferentes densidades celulares para cada lnea celular, que se pueden
complementar con fotografas de preparaciones teidas (Figura 13.1).
Los trminos fibroblastoide y epiteloide se utilizan con poco rigor en cultivo celular y a
menudo describen la apariencia ms que el origen de las clulas (Figura 13.2).
92
Por lo tanto, una clula migratoria bipolar o multipolar, con una longitud por lo general 2
veces mayor que su anchura, es llamada fibroblastoide, mientras que una clula poligonal,
con dimensiones ms regulares y que crece en parches junto con otras clulas es
generalmente considerada epiteloide.
Anlisis de cromosomas
El cariotipo es uno de los mejores criterios para identificar lneas celulares y relacionarlos a
especie y gnero (Figura 13.3). Adems puede distinguir entre clulas normales y
transformadas. La tincin de los cromosomas aumenta la resolucin y especificidad de la
tcnica.
Marcadores antignicos
Las inmunotinciones se encuentran entre las tcnicas ms tiles disponibles para la
caracterizacin de lneas celulares, pero es esencial verificar la especificidad del anticuerpo
que se utilice mediante el uso de controles apropiados. En las inmunotinciones, la
visualizacin de la localizacin del complejo antgeno-anticuerpo puede lograrse mediante
fluorescencia (si el anticuerpo est conjugado a un fluorforo como fluorescena o
rodamina) o por la deposicin de un producto precipitado, resultado de la actividad de una
enzima conjugada con el anticuerpo, como la peroxidasa de rbano picante (HRP) o la
fosfatasa alcalina. Las inmunotinciones pueden ser directas, es decir, el anticuerpo
especfico es el conjugado con el fluorforo o con la enzima, pero es ms comn el mtodo
indirecto, en el que el anticuerpo primario (especfico) se une al antgeno en la muestra,
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seguido de un segundo anticuerpo, obtenido contra la inmunoglobulina del primer

anticuerpo. El anticuerpo secundario puede estar conjugado a la enzima (Figura 13.4) o al
fluorforo (Figura 13.5)
! Organizar exposiciones orales sobre diferentes tcnicas de caracterizacin para cultivos
celulares.
Bibliografa
94
14. Introduccin a la ingeniera de tejidos
Objetivo
Que el alumno conozca el significado de la ingeniera de tejidos y los pasos que se
deben seguir para implementarla.
Contenido
Alcances de la ingeniera de tejidos
La ingeniera de tejidos tiene como objetivo promover la regeneracin funcional del tejido
daado utilizando clulas cultivadas in vitro dentro de andamios 3D para reparar y/o
reemplazar tejido daado de un paciente.
La medicina regenerativa, busca tratar enfermedades y eventos que involucren el
crecimiento de clulas y tejidos; la realizacin de tejidos en laboratorio y el desarrollo de
rganos artificiales, como vasos sanguneos (Figura 14.1) y piel artificial (Figura 14.2).
Durante los ltimos 50 aos uno de los principales logros de la medicina moderna ha sido
poder restaurar o mejorar la funcin de algunos tejidos y rganos lesionados por
enfermedades o traumatismos con la ciruga de trasplante a partir de rganos y tejidos
extrados de donantes.
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En la actualidad estas tcnicas han comenzado a ser no solo complementadas, sino incluso
sustituidas exitosamente mediante la ingeniera de tejidos, nueva disciplina que con sus
tcnicas basadas en el cultivo de clulas in vitro estn haciendo posible la produccin de
tejidos que sustituyan a los lesionados, abriendo la posibilidad de fabricar nuevos rganos.
A partir de un pequeo fragmento de tejido se puede lograr restaurar la funcionalidad
parcial o total de los tejidos u rganos daados, como lo ejemplifican los logros alcanzados
con los cultivos de piel, crnea, cartlago, hueso, msculo, tejido nervioso y tejido
glandular.
Tipos de tejidos del cuerpo humano
Un tejido es la unin funcional de clulas de un mismo tipo y todo rgano tiene los
siguientes 4 tipos de tejidos:
Tejido muscular: especializado en movimiento
Tejido nervioso: Inicio y transmisin de seales
Tejido epitelial: cubrimiento de superficies del cuerpo
Tejido conectivo: unin y fuerza mecnica
Obtencin de un tejido con fines teraputicos

Como se mencion, la ingeniera de tejidos busca restaurar, mantener o mejorar la funcin
de un rgano o tejido a partir de la manipulacin de matrices tridimensionales, clulas,
factores de crecimiento y diferenciacin. En la Figura 14.3 se observa el procedimiento
para la obtencin de un tejido con fines teraputicos.
Pasos:
1. Fuente celular: Cultivos primarios o lneas celulares. Para uso teraputico en
humanos las clulas deben proceder de: Clulas troncales embrionarias, clulas
troncales de adultos o clulas autlogas.
Las clulas troncales tienen la capacidad de auto renovarse mediante divisiones
mitticas o bien de continuar la va de diferenciacin para la que estn programadas
y, por lo tanto, producir uno o ms tejidos maduros, funcionales y plenamente
diferenciados en funcin de su grado de multipotencialidad. Las clulas autgas
provienen del mismo paciente, algunas pueden ser troncales. Las clulas troncales
96
multipotentes se obtienen o recolectan de la sangre perifrica del paciente mediante

afresis; se cultivan y luego se implantan va perifrica al paciente. A estos
pacientes se los consideran donantes autlogos, lo que significa que el donante y el
receptor son la misma persona, razn por la cual la compatibilidad es exacta.
2. Celularizacin: Consiste en realizar el crecimiento celular en andamios generados a

partir de biomateriales biocompatibles. Se debe seleccionar el material con base en:
Simular las propiedades de la matriz extracelular.
Promover la viabilidad celular y la proliferacin.
Se debe degradar de manera fcil y controlada.
Debe tener un alto grado de tolerancia inmune para ser implantado in vivo.
3. Maduracin fenotpica: Depende de los siguientes factores:
Colonizacin exitosa de las clulas en los andamios,
Viabilidad de las clulas durante su cultivo en el andamio
Habilidad de las clulas de mantener su fenotipo diferenciado
Habilidad de las clulas de interactuar funcionalmente con el biomaterial.
97
Se debe promover la formacin de tejido que funcione fisiolgicamente como el

tejido normal.
4. Vascularizacin y microperfusin: Esto se logra a travs de un biorrector, en donde
se controlan variables para favorecer el crecimiento del tejido. Se pueden generar
estmulos mecnicos, elctricos y qumicos/hormonales para que se pueda dar el
desarrollo funcional del tejido. El tipo de estmulos depende de las clulas de inters
y de las funciones que desarrollan en un tejido vivo.
Se debe buscar el desarrollo de sistemas de microcirculacin que reproduzcan las
condiciones fisiolgicas de flujo sanguneo necesarias para mantener los tejidos
vivos. La vascularizacin e inervacin son importantes cuando el tejido crece y
madura.
En general, es necesario controlar la biologa de la clula, ambiente, transporte y
sealizacin mediante la correcta identificacin de la fuente celular, el andamio de
acuerdo al tipo de tejido que se quiera generar y proporcionar las seales adecuadas
para el crecimiento y proliferacin (Figura 14.4).
Origen celular para aplicacin en ingeniera de tejidos

Se busca que se pueda obtener el nmero suficiente de clulas para reparar o regenerar el
tejido afectado, de preferencia que promuevan la proliferacin celular in vitro o cuando
sean implantadas en el husped, que se puedan diferenciar al tipo celular deseado y que
sean funcionales, que puedan adoptar la arquitectura 2D o 3D de acuerdo al tejido en donde
98
sean implantadas soportando las demandas mecnicas del tejido, y que se logren integrar
con las clulas nativas con la adecuada vascularizacin, inervacin y sin rechazo.
Las clulas troncales son clulas indiferenciadas que se encuentra en todo el cuerpo
despus del desarrollo embrionario. Estas clulas tienen la capacidad de replicarse y
convertirse en cualquier tipo de clula especializada. La mayora de las clulas adultas del
cuerpo son clulas especializadas, como son las clulas del corazn, pncreas, rin, hgado
o el cerebro; todas ellas tienen una funcin especfica. Las clulas troncales no son
especializadas, y hasta que reciban una seal para convertirse en un cierto tipo celular, stas
mantienen dicha condicin. Lo que hace nicas a las clulas troncales, es su capacidad de
proliferarse en otras clulas idnticas, adems de su especializacin especfica, es decir,
pueden diferenciarse en clulas especializadas de cualquier rgano o tejido del cuerpo.
Las clulas troncales multipotentes tienen las mismas caractersticas bsicas que todas las
clulas troncales, son clulas no especializadas que tienen la capacidad de auto-renovacin
por largos perodos y se diferencian en clulas especializadas con funciones especficas.
Las clulas troncales multipotentes se focalizan en producir diferentes tipos especficos de
clulas y varan de las clulas troncales pluripotentes, ya que stas pueden dar lugar a casi
cualquier tipo de clulas; o de las totipotentes ya que stas pueden dar lugar a cualquier tipo
de clula, incluyendo el potencial de crear un organismo completo. Las clulas troncales
multipotentes estn en la mayora de los rganos del cuerpo donde reemplazan a las clulas
enfermas o de edad avanzada, y por lo tanto su funcin es la de reponer las clulas del
cuerpo durante toda la vida de un individuo.
Las clulas troncales embrionarias se obtienen de la masa celular interna de un embrin de
4 a 5 das de edad y se encargan de formar todos los tipos celulares de un organismo adulto.
Pueden mantenerse de manera indefinida en condiciones de cultivo y al dividirse forman
una clula igual a la que le dio origen. Se pueden obtener de embriones, mediante tcnicas
de clonacin y forzando la divisin de vulos sin fecundar.
Las clulas troncales adultas (ASCs, por sus siglas en ingls) son unas de las clulas ms
abundantes en la mdula sea y probablemente las ms estudiadas, existiendo diferentes
tipos. Las clulas troncales hematopoyticas se utilizan para trasplantes a pacientes con
leucemia, generan linajes de clulas sanguneas (eritrocitos, leucocitos y linfocitos),
mientras que las clulas troncales del estroma de la mdula sea y clulas troncales
99
mesenquimticas ayudan en la diferenciacin de osteoblastos y adipocitos. Las clulas

mesenquimticas
son
precursoras
del
tejido
conectivo
no
hematopoytico
sorprendentemente inhiben la respuesta inmune. Por otro lado, las clulas troncales
embrionarias se toman de la parte interna del blastocito de un embrin muy temprano y
permiten entender cmo se desarrollan algunas enfermedades y a su vez permiten evaluar
medicamentos. Las clulas troncales epiblsticas provienen del epiblasto (capa externa del
blastodermo que al diferenciarse recibe el nombre de ectodemo y es el responsable de la
formacin de la epidermis, el sistema nervioso y de los rganos de los sentidos). Las
clulas troncales epiblsticas del ratn tienen muchas similitudes con las clulas troncales
de los humanos, permitiendo el estudio de diversas aplicaciones clnicas.
Los tipos celulares ms utilizados para la generacin de los diferentes tejidos son:
Clulas maduras diferenciadas (somticas): provienen de ciertos tejidos mediante

biopsias autlogas (del mismo individuo) o heterlogas (de otro individuo de la
misma especie). Tienen un bajo potencial de diferenciacin y proliferacin. En
ciertos casos son dificiles de obtener.
Clulas troncales hematopoyticas: (HSC por sus siglas en ingls). Se obtienen de

mdula sea, sangre perifrica, sangre del cordn umbilical y la placenta. Pueden
dar origen a diferentes tipos de clulas especializadas del sistema inmune.
Clulas troncales mesenquimales: (MSC por sus siglas en ingls). Son precursoras
de todos los tipos de tejido conectivo no hematopoyticos. Son uno de los tipos
celulares ms empleados en terapia celular. Son capaces de inhibir la respuesta
inmunitaria. Pueden dar origen a clulas especializadas como los osteocitos,
condrocitos y adipocitos.
Clulas Troncales Somticas Adultas: (ASC por sus siglas en ingls). Se dividen y
diferencian para formar los tejidos. Pueden reparar o ayudar en la reposicin celular
y tienen la capacidad de autorenovarse. Son multipotentes, es decir, pueden formar
a casi todas las clulas dentro de un tejido en particular.
Clulas fetales: Clulas germinales embrionarias del primer trimestre o de tejido

fetal especfico (EG por sus siglas en ingls). Son similares a las clulas troncales
hematopoyticas y a las mesenquimales, aunque estn menos desarrolladas
100
inmunolgicamente y pueden llegar a causar rechazo. Se obtienen de abortos

electivos, lo cual en muchos paises an no es permitido.
Clulas embrionarias tempranas: Clulas troncales derivadas de la pre-implantacin

del blastocisto (ES por sus siglas en ingls). Son clulas inmaduras, indiferenciadas
que permiten la autorenovacin o la reparacin de un tejido debido a que son
capaces de dividirse para producir clulas hijas idnticas a las clulas troncales. Son
totipotentes, es decir, pueden formar todos los tipos celulares.
Las clulas troncales proliferan rpidamente y pueden generar tumores. En ingeniera de

tejidos, el uso de clulas somticas adultas es relevante, debido a que los oocitos realizan
un proceso denominado reprogramacin que lleva al ncleo de la clula que ya est
diferenciada y un estado de pluripotencialidad y esto puede ser usado en la generacin de
tejidos.
Las clulas troncales cultivadas pueden proliferar o diferenciarse. Para diferenciarse
necesitan de estmulos como factores de crecimiento. Adems, el uso de clulas humanas y
animales en ingeniera de tejidos, requieren de una regulacin que justifique el uso, manejo
y balance riesgo - beneficio en la manipulacin de stos, considerando las normas ticas,
sociales y morales.
Anlisis del tejido
Hay que realizar anlisis funcionales in vitro para evaluar el desempeo fisiolgico del
constructo (clulas y andamio).
Se realizan pruebas mecnicas de fuerza, presin y compresin y pruebas de propiedades
biolgicas/histolgicas (expresin y distribucin de genes y protenas).
Luego se realizan pruebas en modelos animales para demostrar la habilidad del tejido
artificial de integrarse al tejido husped y promover la regeneracin del tejido daado.
Posteriormente se realizan pruebas en humanos para comprobar los resultados en animales.
La ingeniera de tejidos in vivo comprende la regeneracin y reconstruccin de tejidos y
rganos dentro del propio organismo. Esta rama mdica ha pasado progresivamente por 3
etapas. En la primera se empleaban biomateriales "inertes" con la nica finalidad de usarlos
como estructuras sustitutivas de algunas partes del cuerpo daadas.
101
En la segunda se inici la aplicacin de una matriz biodegradable o "andamio biolgico"

con una estructura porosa, trabecular o reticular, que se coloca en el tejido daado para
promover, en el microambiente apropiado, el crecimiento y propagacin in situ de las
clulas residentes sanas circundantes o bien de clulas troncales que pueden implantarse en
ese tejido o estar incorporadas al biomaterial que integra el "andamio biolgico", con la
finalidad de acelerar la regeneracin mstica. En esta combinacin, las clulas vivas
suministran los componentes biolgicos, mientras que el material del "andamio" sirve para
apoyar y favorecer la proliferacin celular. Estos "andamios biolgicos" pueden ser
sintticos o de procedencia natural. La tercera etapa naci con la reciente aparicin de la
nanotecnologa y su aplicacin en medicina, que ha llevado al concepto de "nanomedicina".
Se ha expuesto que la nanotecnologa es un medio excelente para producir nanomateriales
que se asemejen a las estructuras biolgicas y por lo tanto, sus productos resultan muy
prometedores como elementos complementarios para elevar la eficiencia de la terapia
celular. Se ha sugerido que la combinacin de la terapia celular con la nanotecnologa
permitira usar predominantemente la capacidad regenerativa del propio organismo con un
empleo mnimo de materiales artificiales.
Por su parte, la ingeniera de tejidos in vitro comprende la obtencin de tejidos al nivel de
laboratorio para su posterior implantacin en el sitio daado. Un ejemplo de esta prctica es
la obtencin de piel in vitro, que ha resultado de utilidad para el tratamiento de lesiones
extensas de la piel, como sucede en personas que han sufrido dao por quemaduras. Una
aspiracin de la medicina del futuro y que hoy parece ciencia ficcin, sera la preparacin
de rganos o parte de ellos in vitro.
Los tipos de injertos que se apliquen pueden ser:
Autotrasplante, autoinjeto o trasplante autlogo
Alotrasplante u homotrasplante
Xenotrasplante o heterotrasplante o trasplante xenognico
En el siguiente esquema se muestran los diferentes orgenes de la matriz extracelular de

soporte (Figura 14.5). Las matrices artificales pueden ser generadas a partir de cido
poligliclico (PGA), cido polilctico (PLA) y cido polilctico-poligliclico (PGLA).
102
Descelularizacin
Un tejido descelularizado es aquel al cual se le quitan todas sus clulas nativas dejando
nicamente la matriz extracelular de las mismas, es decir el molde, como se observa en la
Figura 14.6 para el caso del corazn, hgado, pulmn y rin. Las actividades celulares
como migracin, adhesin y crecimiento en tres dimensiones estn determinadas por la
matriz extracelular, la cual es una red estructural compleja que sostiene y rodea las clulas
del tejido conjuntivo. Su composicin puede variar de acuerdo al lugar anatmico y el
estado fisiolgo de un tejido. La MEC le permite a la clula saber dnde est y qu debe
hacer.
103
Para recelularizar y generar efectivamente un rgano o tejido, es importante que la

morfologa y arquitectura de la MEC se mantenga durante y despus de la
descelularizacin. Adicionalmente, se necesitan rganos alognicos (de un donador) para
que los componentes de la MEC no causen una respuesta inmune que genere rechazo del
rgano.

Retos en la ingeniera de tejidos
Reconstruir apropiadamente un microambiente para el desarrollo de las propiedades

y funciones bsicas de los tejidos.
Escalar para lograr el nmero adecuado de clulas para que sean clnicamente tiles.
Automatizar el sistema de operacin a escala clnica.
Implementar dispositivos automticos que permitan utilizar terapias basadas en

clulas en los hospitales.
! Realizar un cuadro comparativo entre los 4 tipos de tejidos que conforman los rganos
del cuerpo humano.
! Visitar el atlas: http://virtual.ujaen.es/atlas/ para identificar los diferentes tipos de tejidos
y clulas que conforman cada rgano del cuerpo humano.
! Realizar una tabla comparativa de diferentes andamios utilizados para generar tejidos,
describiendo sus caractersticas y composiciones.
! Realizar lecturas sobre aplicaciones en ingeniera de tejidos:
o
Kropp BP, Zwischenberger JB. Tissue-Engineered Autologous Bladders: New

Possibilities for Cystoplasty. Nat Clin Pract Urol 2006; 3(11): 588-589.
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implanting tissue-engineered vaginal organs into humans. 2014. Disponible en:
http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140410194352.html.
Bibliografa
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Palsson B, Bhatia S. Tissue Engineering. Pearson Prentice Hall Bioengineering; 2004.
Bronzino J. Tissue Engineering. Elsevier; 2008.
105
15. Aplicaciones teraputicas
Objetivos
Que el alumno identifique los requerimientos de crecimiento celular para aplicacin
teraputica.
Que el alumno conozca las principales reas de aplicacin de la ingeniera de tejidos a
nivel nacional y mundial.
Que el alumno identifique las principales aplicaciones e investigaciones realizadas sobre
el tema, incluyendo el uso de clulas troncales.
Contenido
Clulas humanas
Para hablar de consideraciones teraputicas en ingeniera de tejidos, no hay que olvidar
algunas de las caractersticas de las clulas humanas, que son la fuente celular autloga
ideal para realizar cultivos celulares que puedan crecer sobre andamios para la formacin
de tejido artificial:
La densidad celular de los tejidos humanos es de 1 a 3 billones de clulas / mL.
El volumen de una persona de 70 Kg es de aproximadamente 70,000 mL.
El cuerpo humano posee alrededor de 100 trillones de clulas.
El volumen de un rgano tpico es de 100 500 mL.
Cada rgano contiene de 100 a 1500 billones de clulas.
Cuando se piensa en realizar un tejido artificial, hay que considerar que el nmero de
clulas clnicamente aceptables en un tratamiento vara de acuerdo al rgano. Algunos
ejemplos son:
Para trasplantes de condrocitos se necesitan alrededor de 20 - 40 millones de

clulas.
106
Para realizar una terapia de linfocitos se necesitan alrededor de 500 billones de

clulas.
Para realizar un soporte de hgado se necesitan alrededor de 10 billones de

hepatocitos.
Para realizar un trasplante de mdula se necesitan alrededor de 200 300 billones

de clulas.
Para realizar un parche de piel se necesitan alrededor de 100 millones de clulas.
La densidad de cultivos tisulares debe ser de 10 millones /mL aproximandamente.
Adems, es importante tener en cuenta que existen algunas limitaciones en la produccin de

clulas ya que las clulas humanas pueden tener de 30 a 50 duplicaciones dependiendo de
la edad del donador. Otro aspecto relevante es que una clula tericamente puede producir
de 1010 a 1015 clulas en cultivo.
Debido a todo lo anterior, no es posible que los cultivos celulares en monocapa, como se
mencionan en captulos anteriores, satisfagan las necesidas clnicas que se tienen, ya que
como se mencion las densidades celulares deben ser mucho mayores para alcanzar un fin
teraputico particular. Es por esto que la ingeniera de tejidos busca realizar cultivos sobre
andamios en donde las clulas puedan crecer tridimensionalmente, y con la ayuda de
biorreactores y factores de crecimiento, se logre escalar la produccin de clulas humanas y
se logre la generacin de tejido para una aplicacin en particular.
A continuacin se analizarn las principales reas de aplicacin mdica de la ingeniera de
tejidos, de acuerdo al nmero de casos que se presentan anualmente y a la investigacin que
se est realizando en diversas partes del mundo para ayudar en la medicina regenerativa.
reas de aplicacin de ingeniera de tejidos
Las terapias clnicas convencionales para el sustucin de tejidos humanos usualmente han
sido implantes de origen no biolgico como prtesis, o implantes de origen biolgico como
los trasplantes de rganos completos. An cuando en los ltimos aos ha aumentdo el
nmero de trasplantes de rganos, existen problemas ya que hay escases de donadores y de
rganos, adems del alto costo del procedimiento y de la terapia de inmunosupresin a la
que deben ser sometidos los pacientes de por vida. Es por esto que la ingeniera de tejidos
busca imitar el ambiente natural de rganos y tejidos, disminuyendo la inmunosupresin y
107
disminuyendo los costos del tratamiento. Cada da hay ms candidatos a trasplante de

ganos o reparacin tisular. A continuacin se presenta la incidencia de procedimientos
mdicos realizados para diferentes tipos de tejidos y rganos en Estados Unidos, que es uno
de los pases en donde se cuenta con datos estadsticos anuales:
Transfusiones sanguneas: 18,000,000 de procedimientos
Implantes dentales:10,000,000 de procedimientos
Sustitucin de piel en quemados: 2,150,000 pacientes
Dao de tejido cardiaco: 754,000 pacientes
Problemas de pncreas por diabetes tipo I: 728,000 pacientes
Problemas renales: 600,000 pacientes
Reemplazo de articulaciones: 528,200 procedimientos
Debido al aumento en el nmero de casos de ciertos padecimientos que pueden llevar a la
muerte, las principales aplicaciones en ingeniera de tejidos son para la regeneracin de:
sangre artificial, piel artificial, parches cardiacos, articulaciones y tendones, pncreas
artificial y rin artificial.
Las aplicaciones en ingeniera de tejidos sobre las que ms se investiga y trabaja
actualmente incluyen los sistemas msculo-esqueltico, cardiovascular, tegumentario,
gastrointestinal, renal y se trabaja mucho sobre aplicaciones dentales. En este captulo se
analizan algunas aplicaciones y en otros captulos de este libro se abordan especficamente
los sistemas cardiaco y tegumentario, que son de los ms estudiados.
Aplicaciones en el sistema msculo-esqueltico
Debido al aumento exponencial de la poblacin, las enfermedades y fracturas del msculo
esqueltico son ms numerosas que en aos anteriores. Es por eso que recientemente se han
desarrollado nuevas tcnicas biolgicas en las cuales se realizan combinaciones de
biomateriales, clulas y otro tipo de molculas.
En particular civilizaciones antiguas ya aplicaban de alguna manera tcnicas sencillas de
Ingeniera de Tejidos. Por ejemplo, romanos y egipcios utilizaban madera como implantes,
civilizaciones mexicanas usaban piedras preciosas para sustituir componentes maxilares y
algunos huesos. Los hermanos gemelos Damin y Cosme aproximadamente por el ao 280
realizaron un reimplante de miembro inferior de un moro a un cristiano egipcio del cual no
108
se tienen muchos datos. Fue hasta el ao 1980 que se realiz el primer implante de cadera
total por Themistocles Gluckcon, la cual fue hecha de marfil adherida con una mezcla de
piedra, yeso y colofonia.
La ingeniera de tejidos, en donde se utilizan tcnicas especializadas para la regeneracin
de tejido a partir de clulas de la MEC sembradas sobre un andamio bioabsorbible,
incorpora factores de crecimiento que modulan la actividad celular. Sin embargo, se
necesita de la extraccin de tejido nativo a travs de una biopsia, para posteriormente aislar
algunas clulas en particular que sean sembradas in vitro en una MEC artificial generada a
partir de un biomaterial (andamio), luego se estimula el constructo (unin de clulas con
biomaterial) con molculas bioactivas con la finalidad de producir un tejido nuevo (Figura
15.1).
El sistema musculo-esqueltico se divide en dos elementos muy importantes: el sistema

esqueltico y el muscular. Estos dos sistemas trabajan en conjunto para darle ciertas
propiedades al cuerpo humano. El sistema esqueltico cuenta con los huesos, cartlagos y
ligamentos fibrosos. A continuacin se mencionan algunos de los componentes del aparato
msculo-esqueltico y sus funciones:
Huesos: Tienen la propiedad de dar estructura y movimiento al cuerpo
Ligamentos: Unen los huesos, rodeando los discos invertebrales
Articulaciones: Son conexiones entre los huesos que permiten el deslizamiento de

un hueso sobre otro.
109
Msculos: Son fibras que originan los movimientos del cuerpo
Tendones: Son cordones que unen los msculos a los huesos
Vasos sanguneos: Transportan oxgeno principalmente y otras biomolculas a los

msculos.
Nervios: Conectan los msculos y rganos perifricos con el cerebro.
El sistema msculo-esqueltico es de gran importancia mdica y humana ya que es uno de

los principales sistemas que confiere los movimientos coordinados y de locomocin, es por
esto que la ingeniera de tejidos se ha interesado mucho en este tema. Algunas de las
funciones del sistema seo son:
El tejido conectivo duro calcificado tiene como funciones proteger rganos vitales y
proveer soporte para la movilidad del cuerpo.
Almacena
calcio
otros
iones,
clulas
troncales
mesenquimticas
hematopoyticas.
Tienen propiedades auto-regenerativas.
Causas de dao del seo y requerimientos para la generacin de andamios y tejido seo
artificial:
Las principales causas de dao del tejido seo son traumas, osteonecrosis y tumores. Para
poder generar tejido seo el andamio que se genere a partir de un biomaterial para
aplicaciones en la generacin de tejido seo artificial debe ser biocompatible, con alta
porosidad, debe contar con propiedades mecnicas y ser biodegradable.
Las clulas troncales mesenquimales han sido muy utilizadas para la generacin de tejido
seo artificial, ya que puede diferenciarse a varios tipos celulares; entre ellos osteoblastos y
condrocitos. Los factores de crecimiento ms relacionados con la osteognesis son: BMP
(protenas morfognicas seas), IGF (factor de crecimiento insulnico), TGFB (factor de
crecimiento transformante tipo B), PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas),
FGF (factor de crecimiento de fibroblastos).
La produccin de mallas porosas y reabsorbibles se ha utilizado para contener las clulas y
favorecer as la formacin del tejido seo, tanto in vitro como in vivo. Se han diseado
mallas de materiales naturales, de polmeros sintticos y de fosfato de calcio para la
ingeniera de tejidos blandos y duros. Dentro de los puntos importantes que debe tener una
malla se encuentran:
110
Crear un espacio para que las clulas puedan sobrevivir
Dar soporte a tejidos
Ser biodegradable
Ser de fabricacin accesible
Las principales funciones de la malla son:
Favorecer la adhesin celular
Ser un molde temporal para mantener las clulas y mejorar la regeneracin del
tejido
Prevenir la distorsin del tejido circundante
Servir como barrera para prevenir la fijacin del tejido circundante
Mantener la forma del tejido daado
Facilitar los procesos de interaccin con la membrana extracelular
Arquitectura y fabricacin de mallas:

Se han utilizado varios biomateriales con ciertas ventajas y desventajas:
Colgeno: ayuda a regenerar tejidos blandos.
Acido hialurnico: ayuda a mejorar las propiedades mecnicas, pero por otro lado
perjudica la actividad celular y biolgica.
Las mallas generalmente tienen una estructura tridimensional (3D), lo ms importante que
debe tener una malla es la porosidad, el tamao del poro, la interconexin del poro para
permitir el paso del fluido que transporta clulas, nutrientes y oxgeno; y por ltimo un rea
superficial para que las clulas se adhieran y formen un tejido nuevo.
Se utilizan polisteres biodegradables para la reparacin de hueso y cartlago:
cido poligliclico (PGA)
cido polilctico (PLA)
cido polilctico-poligliclico (PGLA)
Entre los materiales inorgnicos que se han utilizado en la reincorporacin de tejido seo se
encuentran:
Hidroxiapatita
Tricalcio fosfato
Se han realizado estudios combinando diferentes tipos de clulas, soportes y factores de

crecimiento para realizar autoinjertos o aloinjertos. Adems, se han diseado microesferas
111
porosas de quitosano y PLGA que liberan factores de crecimiento ya que estos son
digeridos rpidamente por el medio.
Actualmente se han realizado combinaciones de clulas con mallas 3D para trasplantes de
condrocitos en matriz bioabsorbible de colgeno, cido hialurnico y copolmeros de
polilctico y glicnico.
Se han desarrollado implantes de clulas troncales mesenquimticas (CTM) que sirven
como vehculo, se transforman en fibroblastos y promueven la reparacin de ligamento.
Generalmente despus de haberse realizado la implantacin, se coloca un cemento
espaciador para generar un tejido vascularizado. Finalmente se coloca una malla con
clulas cultivadas para estabilizar la mecnica del hueso.
Clulas troncales
Clulas con potencialidad teraputica, tambin llamadas clulas troncales: embrionarias,
fetales, amniticas, las de la sangre del cordn umbilical, adultas y clulas pluripotentes
inducidas.
Se han utilizado desde hace 50 aos las clulas provenientes de la medula sea y las de la
sangre del cordn umbilical.
El tratamiento con clulas troncales se ha catalogado como un nuevo tratamiento de la
medicina regenerativa llamado: terapia celular regenerativa.
La medicina regenerativa pone ms nfasis en el uso de clulas troncales para producir
tejidos. Segn su estado evolutivo, las clulas trocales pueden clasificarse en embrionarias
y adultas. Entre las principales clulas troncales con potencialidad teraputica se han
sealado las embrionarias, las fetales, las amniticas, las de la sangre del cordn umbilical,
las adultas y ms recientemente, las clulas con caractersticas embrionarias que se han
obtenido mediante la reprogramacin de clulas adultas y que se han llamado clulas
troncales pluripotentes inducidas. Se ha reportado que la existencia de la clula troncal
hematopoytica fue propuesta en el ao 1908 por el histlogo ruso A. Maksimow. Desde
hace ms de 50 aos se han estado utilizando clnicamente las clulas troncales
hematopoyticas provenientes de la mdula sea, y ms recientemente las movilizadas a la
sangre perifrica o las obtenidas de la sangre del cordn umbilical, para el tratamiento de
leucemias, linfomas y otros tipos de enfermedades, mediante el trasplante convencional de
112
clulas troncales/progenitoras hematopoyticas. El tratamiento con clulas troncales ha

dado lugar a un nuevo tipo de tratamiento que se puede catalogar como terapia celular
regenerativa y que en la actualidad es uno de los temas ms excitantes de la medicina
contempornea, como lo fueron en su poca sus antecesores representados por la
transfusin sangunea y el trasplante de mdula sea, que son en la actualidad
procedimientos habituales y de reconocido valor.
En los ltimos aos se han obtenido evidencias de que la potencialidad de algunos tipos de
clulas troncales adultas es mayor de lo que se pensaba, pues ellas han mostrado en
determinadas ocasiones, capacidad para diferenciarse en clulas de diferentes linajes. El
mejor ejemplo de esta versatilidad celular est representado por las clulas troncales
hematopoyticas.
Se conoce que la mdula sea contiene clulas troncales hematopoyticas y de otros tipos.
Entre stos se encuentran las clulas progenitoras endoteliales, procedentes del
hemangioblasto embrionario, y las clulas troncales mesenquimales. Estas ltimas han
adquirido gran relevancia en los ltimos aos por su potencialidad teraputica. En el orden
prctico, las clulas mononucleares derivadas de la mdula sea pueden verse como
portadoras de un coctel de diferentes clulas troncales adultas.
Las clulas troncales derivadas de la mdula sea, con reconocida plasticidad y capacidad
proliferativa, pueden circular en la sangre perifrica y migrar a diferentes tejidos distantes,
en los que pueden asentarse y contribuir a la regeneracin de sitios daados. Adems, en las
clulas troncales de la mdula sea se ha identificado un receptor especfico para
quimiocina el CXCR4 (CX-chemoquine receptor 4), que mediante un sistema de
"llave/cerradura" se une con la quimiocina SDF-1, factor 1 derivado del estroma (stromal
derived factor 1). La identificacin de este sistema ha contribuido a conocer mejor los
mecanismos relacionados con la movilizacin, migracin, quimio-atraccin y fijacin de
estas clulas a los tejidos.
Se ha comprobado que las clulas troncales hematopoyticas pueden producir varios
elementos solubles que son esenciales para su accin y que incluyen factores que
intervienen en la citoproteccin, proliferacin, diferenciacin y migracin celular,
angiognesis, respuesta inflamatoria, asentamiento celular y quizs con otras funciones an
no conocidas.
113
Todos estos datos aportan evidencias de que las clulas troncales adultas pueden contribuir
a la regeneracin de tejidos mediante diferentes acciones, por ejemplo:
1. Diferenciacin en clulas del tejido daado, lo que podran hacer mediante
transdiferenciacin o fusin celular.
2. Asentamiento en el tejido lesionado con emisin de seales que favorezcan el
reclutamiento en ese sitio de otras clulas troncales o progenitoras que participen en la
regeneracin de los tejidos.
3. Liberacin de molculas solubles con efectos autcrinos/parcrinos.
4. Mantenimiento de su propia autorrenovacin, proliferacin y funciones.
5. Efecto anti-inflamatorio.
6. Inhibicin de la apoptosis.
7. Incremento de la vascularizacin del tejido daado.
8. Citoproteccin y estimulacin de las clulas sanas presentes en la regin lesionada,
incluyendo las que pueden estar en un estado quiescente o "dormidas" en un "rea de
penumbra".
Aplicaciones en gastroenterologa: Trasplante de clulas hepticas
El trasplante heptico convencional se ha visto reducido en los ltimos aos a consecuencia
del limitado nmero de donadores, la numerosa lista de espera, la inmunosupresin
necesaria durante y despus del trasplante, lo que conlleva a altas posibilidades de muerte
por alguna infeccin. Se han buscado nuevas alternativas para resolver dicho problema,
tales como: sistemas de soporte artificial heptico, xenotransplante, tratamiento gnico ex
vivo o in vivo, ingeniera de tejidos y el TCH (trasplante celular heptico).
Una de las alternativas ms prometedoras al trasplante heptico convencional es el
trasplante celular heptico o trasplante de hepatocitos humanos (TCH), el cual consiste en
trasplantar hepatocitos humanos totalmente diferenciados a un rgano receptor en cantidad
suficiente para que stos sobrevivan y restauren la funcin heptica normal, basndose en la
capacidad de regeneracin. Este procedimiento se encuentra en fase de experimentacin
clnica. Se ha realizado en pacientes con problemas metablicos congnitos, falla heptica
fulminante y falla heptica aguda o crnica.
114
Para la regeneracin heptica se deben usar hepatocitos adultos debido a que presentan
capacidad replicativa y son capaces de restaurar con rapidez la poblacin celular perdida,
pueden provenir de rganos de donantes que perdieron la vida. Las fases del trasplante
celular heptico son:
1.- Aislar los hepatocitos mediante perfusin del hgado con colagenasa. Los hepatocitos
deben tener una viabilidad igual o superior al 50%.
2.- Preparacin de las suspensiones celulares.
3.- Implante en el receptor.
Hasta ahora, los mejores resultados de TCH se han obtenido en problemas metablicos
congnitos, que se definen como un grupo de enfermedades genticas determinadas por el
bloqueo de un paso metablico. La causa del bloqueo es la mutacin de genes responsables
del funcionamiento de dicho paso metablico, porque el producto gnico (que puede ser
una enzima o coenzima), est cualitativa o cuantitativamente afectado.
Aplicando el TCH se ha logrado estabilidad en la actividad enzimtica y disminucin de los
niveles sricos de bilirrubina. En casos con alteraciones en el ciclo de la urea se ha logrado
la disminucin de amonio y la estabilizacin metablica con mejora psicomotora.
Las fuentes celulares para la sustitucin heptica o para la ingeniera de tejidos incluyen:
clulas troncales hematopoyticas, clulas progenitoras ovales, hepatocitos adultos, clulas
derivadas de hepatoblastoma, entre otras. En la Tabla 15.1 se resumen las fuentes celulares
para la ingeniera de tejido heptico.
Clula
Fuente
Aplicacin
Ventajas
Desventajas
Hepatocitos humanos
Deshecho de tejido
Hgado bioartificial,
Alta grado de
Reducida disponibilidad,
dispositivos
compatibilidad
proliferacin pobre in
humano heptico
implantables, trasplante
vitro
de clulas
Hepatocitos porcinos
Hgado porcino
Hgado bioartificial y
Mayor disponibilidad en
Transmisin de
dispositivos
comparacin con los
enfermedades,
implantables
hepatocitos humanos
incompatibilidad
protena-protena,
posible respuesta inmune
Lneas celulares de
Lneas celulares
Fcil almacenamiento,
Tumorigenicidad y
hepatocitos humanos
derivadas de carcinoma
dispositivos
mantenimiento y
reduccin en el
derivados de tumor
heptico humano
implantables
proliferacin in vitro
rendimiento funcional
Lnea celular
Hepatocitos humanos
Fcil almacenamiento,
Tumorigenicidad
inmortalizada de
inmortalizados por
dispositivos
mantenimiento y
potencial,
hepatocitos humanos
transfeccin de genes
implantables
proliferacin in vitro,
preocupaciones de
115
tumorigenicidad
seguridad a largo plazo,
reducida en
rendimiento funcional
comparacin con
reducido.
tumores derivados de
lneas celulares
Clulas troncales
Tejidos adultos
adultas (MSCs)
Dispositivos
Disponibilidad ilimitada
implantables y
y menos problemas de
Transdiferenciacin, baja
eficiencia de los
trasplante de clulas
seguridad
protocolos existentes y
mayor duracin de la
diferenciacin heptica
Clulas fetales
Hgado fetal humano
Hepatocitos fetales
Hgado fetal humano
humanos
Hepatoblasto
Hgado fetal humano en
Trasplante de clulas
Hgado bioartificial,
Puede diferenciar a
Difcil aislamiento,
amabos hepatocitos y
disponibilidad limitada y
clulas biliares
potencial tumorgeno
Fcil aislamiento de
Baja eficiencia
dispositivos
clulas y puede
funcional, menor
implantables, trasplante
someterse a pocas
disponibilidad,
de clulas
divisiones celulares in
preocupaciones ticas y
vitro
posible tumorogenicidad
Trasplante de clulas
Alta proliferacin in
Cuestiones ticas y
vitro
disponibilidad limitada
Disponibilidad ilimitada
Cuestiones ticas y
una etapa temprana de

la gestacin
Clulas troncales
Lneas celulares
embrionarias
pluripotentes derivadas
dispositivos
y proliferacin
posible formacin de
de embriones humanos
implantables
indefinida
teratomas
o clulas adultas
genticamente
modificadas
Tabla 15.1 Fuentes celulares para la ingeniera de tejido heptico.
Los hepatocitos son clulas dependientes de anclaje y si no cuentan con la composicin de

MEC adecuada que permita las interacciones protena-clula o contactos entre clula-clula
pierden su funcin especfica. Debido a esto, se ha desarrollado una gran variedad de
andamios 3D para proporcionar la MEC inicial que dar soporte a las clulas, as como la
micro o macro estructura de la ingeniera tisular del hgado.
El hgado es un rgano altamente vascularizado, por lo tanto el andamio debe estar dotado
de las siguientes caractersticas especficas: 1) qumica de la superficie a favor de la unin
celular, la diferenciacin y la proliferacin, 2) ser biodegradable para lograr la regeneracin
del tejido, 3) poseer estructuras porosas interconectadas con el fin de facilitar el suministro
de nutrientes y de oxgeno y la eliminacin de desechos, 4) tener canales vasculares
116
internos predefinidos para apoyar la vascularizacin y 5) no ser txico en s mismo ni en

sus productos derivados.
Las tcnicas para que el andamio tenga entre un 90-95% de porosidad son las de
liofilizacin y el lavado de sales, las cuales estn sujetas a la generacin de poros al azar, lo
que significa que no se puede controlar el tamao de poro. Adems, la red no tiene que
estar totalmente interconectada, ya que las clulas no podran migrar profundamente en el
andamio. Algunas investigaciones muestran que el mximo espesor de la red debe de estar
entre 150-200 m.
En el caso de la falla heptica fulminante que es un tipo de hepatitis poco frecuente la cual
se caracteriza por un avance rpido y presenta necrosis del hgado, los trasplantes celulares
buscan asegurar la supervivencia del paciente hasta conseguir un rgano para trasplante.
Con esta tcnica se ha observado mejora en el grado de encefalopata heptica (debida a la
toxicidad ya que afecta tanto al sistema nervioso perifrico como al cerebro) y una
disminucin en los niveles de amonio. Principalmente se infunden las clulas por la arteria
esplnica o por la vena porta, con un volumen aproximado del 5% de la masa heptica del
paciente. En diferentes casos se han visto mejoras considerables tanto en la funcin
heptica como en la disminucin de valores de bilirrubina, amonio, etc. Pero cabe destacar
que se han presentado complicaciones importantes que han llevado a la muerte a los
receptores de estos injertos celulares. En las valoraciones clnicas han demostrado que se
requieren varias infusiones, debido a que despus de 3 a 6 meses se hace presente una
disminucin de la funcin metablica adquirida posiblemente por rechazo o muerte de las
clulas trasplantadas. Este tratamiento no solo es menos invasivo, sino que es de menor
costo. Adems, las clulas utilizadas son maduras y completamente diferenciadas.
Existen limitantes en los trasplantes de rganos slidos, como es el caso de la supervivencia
tanto del injerto como del paciente. Esto se debe principalmente a enfermedades recurrentes
que atacan al paciente debido a la supresin inmune a la que se somete al paciente para
evitar en lo mnimo el rechazo del injerto, lo cual lo deja desprotegido. Por otro lado, la
respuesta inmune al injerto lo puede daar de forma irreversible teniendo que removerlo
para evitar complicaciones. Los xenoinjertos que se usan para trasplante heptico provienen
de cerdos, los cuales pueden tener infecciones que se transmiten a los pacientes. Para
disminuir el rechazo a los injertos antes mencionados, se ha recurrido a cerdos con genes
117
modificados, con lo que se reduce la frecuencia con la que se presenta el rechazo

hiperagudo. Aunque siguen existiendo problemas de otra ndole como lo son las
restricciones fisiolgicas, respuesta inflamatoria, prdida de la coagulacin por la
incompatibilidad tanto con cerdos como con primates. Se puede presentar la
trombocitopenia (sangrados espontneos). La falta de conocimiento sobre el mecanismo de
accin de algunas protenas propias de los cerdos se ha aunado a casos de insuficiencia
heptica.
En el caso de los islotes pancreticos, se ha recurrido a otra tcnica conocida como
trasplante celular (en enfermedades metablicas). En este caso los pacientes muestran
beneficios a corto plazo. Los islotes son difundidos por la vena porta para que lleguen al
mismo pncreas y reemplacen la funcin de los islotes nativos. Para los hepatocitos existen
ciertos problemas como los defectos en el ciclo de la urea, disminucin de la funcionalidad
al pasar un ao de que fueron trasplantados.
En el trasplante celular adems existen pocas fuentes para obtener hepatocitos viables
(actualmente se obtienen de rganos descartados para trasplante y tejido resultante de
reducciones hepticas).
Aplicaciones en el sistema renal
La prevalencia de la enfermedad renal crnica (ERC) ha impulsado el desarrollo de
estrategias de tratamiento eficaces. La ERC es la prdida lenta de la funcin de los riones
con el tiempo. Es causada comnmente por la diabetes y la hipertensin arterial. Como
consecuencia se acumula lquido y productos de desecho en el cuerpo, por lo que afecta el
funcionamiento del cuerpo.
Para los pacientes con enfermedad avanzada, las terapias se enfocan en reemplazo renal,
como la dilisis peritoneal o la hemodilisis, con el inconveniente de que no puede
restaurar
funciones
homeostticas,
de
resorcin,
metablicas,
endocrinas
inmonomoduladoras, y como resultado de estas deficiencias aumentan por otro lado las
enfermedades cardiovasculares o la muerte.
Para la ERC avanzada el nico tratamiento restaurador disponible es el trasplante
alognico, pero la escasez de donantes, la morbilidad quirrgica y la necesidad de la
inmunosupresin de por vida limitan significativamente la aplicacin clnica. El primer
118
trasplante renal lo llevo a cabo el doctor Joseph Murray. Con el trasplante se reducen los
costos del tratamiento, aumenta la esperanza de vida y mejora la calidad de vida en
comparacin con la dilisis.
Las tecnologas emergentes en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniera de
tejidos se esfuerzan para hacer frente a estas limitaciones y tienen como objetivo producir
un rin de bioingeniera capaz de restaurar la funcin renal en los pacientes con
enfermedad en fase terminal.
Opciones de tratamiento basadas en clulas
Una de las opciones para recuperar las funciones renales consiste en conseguir que de
forma natural, o lo ms cercano a esto por medio de clulas autgenas, se logre regenerar el
rgano. En 1953 J. Oliver logr demostrar que esto era posible. Su experimento demostr
que por medio de un tipo de tejido epitelial, el paciente logr regenerar una parte daada.
Estudios posteriores demostraron que la mesnquima del tbulo proximal, clulas
epiteliales tubulares, la cpsula de Bowman, papila renal y el estroma cortical, contienen
clulas capaces de regenerar.
Otra posible fuente para la regeneracin renal son las clulas de origen embrionario. Este
tipo de clulas son pluripotenciales; es decir, pueden generar cualquier tipo de clula al
diferenciarse, sin importar de qu capa embrionaria provengan. Para esto necesitan de un
proceso de diferenciacin que se ve mediado por diversos factores del microambiente,
desde molculas presentes en la MEC, hasta la comunicacin paracrina.
Para lograr sto en los laboratorios muchas veces se utilizan factores de nefrogeneracin in
vitro, esto es, que usan extractos de estos factores para luego reimplantarlos en el rea
daada. Uno de los grandes problemas de estos tratamientos es que se ha notado una alta
probabilidad de generacin de tumores, as como el polmico hecho de su origen.
Para evitar estas controversias, otra opcin es el uso de clulas de mdula espinal. Estas por
el contrario slo son multipotenciales; esto es, que no pueden diferenciarse en cualquier
tejido pero s en una amplia variedad de estos. Se ha demostrado que estas clulas
promueven la vascularizacin, reducen la inflamacin, inhiben la apoptosis y mejoran la
proliferacin. An no se sabe si estas clulas se diferencian in situ o bien emiten seales
que ayudan a la regeneracin. Otro inconveniente que se est estudiando es que estas
119
clulas podran ser las que generan las enfermedades renales desde el principio, por lo que
su implantacin podra generar mayores prejuicios que beneficios.
Un posible sustituto para esto son las clulas provenientes del lquido amnitico, las cuales
tienen acciones de origen medular, mayor eficiencia y menos problemas. El inconveniente
es su obtencin y el poco desarrollo que se ha presentado en esta rea.
Finalmente, se encuentran las clulas que son inducidas a ser desdiferenciadas para
posteriormente volver a implantarse y diferenciarse en otra parte del organismo. Esto se
consigue al infectarlas con factores virales de retrotranscripcin. Este proceso genera
muchas ventajas, como su fcil obtencin, fcil diferenciacin y presentar menor tendencia
a generar anormalidades que puedan llevar a cncer o a tumores. Su desventaja es que se ha
observado que generan una respuesta inmune mucho mayor, llegando a atacar el tejido
sano.
Bioingeniera de rgano completo
Los investigadores han reconocido que la MEC es crucial para el desarrollo del rin y de
su reparacin. La MEC es una estructura tridimensional que influye en la organognesis y
la reparacin por las siguientes razones:
a) Proporciona un andamio 3D para la organizacin espacial de las clulas.
b) Secreta y almacena factores de crecimiento y citoquinas.
c) Regula la transduccin de seales.
Los componentes de la MEC son: colgeno tipo IV, entactina, proteoglicanos y las
lamininas que interactan con las integrinas de la superficie celular; estas ltimas son
cruciales para la proliferacin del tejido metanfrico, la ramificacin y la epitelizacin
durante la organognesis.
Algunas de las ventajas de la MEC innata para estos fines son:
a) Caracterstica
bioqumica,
geomtrica
espacialmente
ideales,
por
ser
biocompatible, tiene componentes bsicos, factores de crecimiento y citocinas.

b) Mantiene una intacta y patente revascularizacin, que sostiene la presin arterial
fisiolgica cuando se implantan in vivo.
c) Capacidad de conducir a la diferenciacin.
120
Andamios de MEC de animal entero u rganos de cadver-humanos pueden ser generados

a travs de la descelularizacin a base de detergente. La descelularizacin es capaz de
eliminar ADN, material celular y antgenos de superficie celular del andamio de MEC,
preservando al mismo tiempo los sitios de unin, la integridad estructural y canales
vasculares.
La descelularizacin completa es esencial ya que el material celular residual puede contener
eptopos antignicos (macromolcula que es reconocida por el sistema inmunitario,
especficamente la secuencia especfica a la que se unen los anticuerpos, receptores de las
clulas B o de clulas T) que desencadenan respuestas inflamatorias y comprometen la
posterior recelularizacin. Se requiere una esterilizacin eficaz de la MEC, para la cual se
utiliza xido de etileno o cido peractico que no desnaturalizan las protenas o factores de
crecimiento, aunque el riesgo de contaminacin viral permanece.
Despus de la descelularizacin viene el proceso de recelularizacin, que puede llevarse a
cabo con clulas troncales o progenitores renales.
Se ha reportado la recelularizacin exitosa de los andamios de rin de rata intactos con
clulas troncales embrionarias murinas, xenotransplantados y perfundidos a travs de la
vasculatura innata.
El andamio de rin descelularizado apoy exitosamente el crecimiento y la migracin de
las clulas troncales embrionarias xenotransplantadas dentro de estructuras glomerulares,
vasculares y tubulares. Dentro de 10 das de la siembra, estas clulas presentaron cambios
morfolgicos brutos consistentes con la maduracin epitelial, as como marcadores
inmunohistoqumicos de diferenciacin renal.
El protocolo de descelularizacin conserva la permeabilidad y las estructuras jerrquicas de
ramificacin de la red vascular, que es imprescindible para su posterior trasplante,
perfusin y recelularizacin.
Existen protocolos eficaces para descelularizacin renal en ratones y cerdos pero no para
humanos, por eso queda la incgnita si la MEC de rin descelularizado puede soportar la
proliferacin y diferenciacin de clulas troncales en los 26 tipos de clulas que
comprenden el rin humano maduro, para establecer funciones homeostticas, de
resorcin, metablicas, endocrinas e inmunomoduladoras. Y finalmente, no est claro si la
121
recelularizacin de perfusin es suficiente para evitar los efectos trombognicos de la

estructura de colgeno observado despus de volver a la implantacin.
! Lectura: Medicina regenerativa y clulas madre. Mecanismos de accin de las clulas
madre adultas. Porfirio Hernndez Ramrez. Revista Cubana de Hematologa, Inmunologa
y Medicina Transfusional. 2009; 25(1).
! Lectura: Captulo 3 del Libro Foundations of Regenerative Medicine. Stem Cells
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! Discusin en clase de notas periodsticas de divulgacin cientfica:
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Khademhosseini A. Building a Better Blood Vessel. 2014;[2 pginas]. Disponible en:
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! Buscar aplicaciones de las clulas troncales en tratamiento de otras enfermedades.
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123
16. Biomateriales aplicados a la medicina
Objetivos
Que el alumno conozca los diferentes tipos de biomateriales, sus caractersticas y
propiedades.
Que el alumno identifique las principales aplicaciones de los biomateriales en ingeniera
de tejidos.
Contenido
Introduccin
Los biomateriales son productos empleados para reproducir la funcin de tejidos vivos en
los sistemas biolgicos de forma segura, mecnicamente funcional y aceptable
fisiolgicamente. Son temporal o permanentemente implantados en el cuerpo y tratan de
restaurar un defecto existente o conseguir la regeneracin tisular. Es un campo
multidisciplinario, que tiene varios objetivos como se muestra en la Figura 16.1.
Es importante estudiar los biomateriales que sern colocados dentro del cuerpo humano por
3 razones fundamentales:
Control de calidad, tanto en estructura como en superficie.
124
Propiedades mecnicas, definiendo parmetros que permitan evaluar las

interacciones entre un biomaterial con un sistema biolgico.
Anlisis de su comportamiento despus de la implantacin.
Requisitos del biomaterial para utilizarse dentro del cuerpo humano
Biocompatibilidad: capacidad del material de interactuar con tejidos vivos sin

causar dao, o con muy pocas reacciones biolgicas.
Tolerancia: debe ser aceptado por el organismo receptor sin generar fuertes
reacciones biolgicas.
Bioestabilidad tanto a corto como a largo plazo: debe ser qumicamente estable o
biodegradable en productos no txicos durante su tiempo de uso dentro del
organismo.
Mantenimiento de sus propiedades y estructura qumico-fsica en el entorno

biolgico durante el tiempo que permanezca en el organismo.
Poseer unas propiedades mecnicas y qumicas especficas que aseguren la funcin

para la cual se disean.
No ser txico, ni carcingeno.
Ser qumicamente estable, o biodegradable en productos no txicos.
La resistencia y propiedades mecnicas, caractersticas superficiales, el tiempo de

fatiga (tiempo necesario para que se formen fracturas que puedan hacer que el
material se rompa), y el peso deben ser adecuados de acuerdo a la aplicacin.
Diseo, tamao y forma adecuados.
Precio reducido, fabricacin reproducible y procesamiento fcil para su produccin

en gran escala.
Idealmente los biomateriales deben tener una superficie qumica dinmica que posibilite
cambios histolgicos en la interfase del implante con el tejido biolgico; o deben ser inertes
para que no perturben histolgicamente la secuencia de reacciones que se producen una vez
implantados en el organismo. Sin embargo, el comportamiento real de los biomateriales
involucra un desgaste corrosivo (por la actividad qumica de alguno de los componentes),
fatiga superficial (formacin de pequeas fracturas que pueden hacer que se rompa el
125
material), o desgaste abrasivo (en donde las partculas de una superficie son desplazadas
hacia otra a la que se adhieren).
Aplicaciones de los biomateriales en medicina:
Trasplantes de rganos,
Sustitucin de vlvulas cardacas,
Tratamiento de quemados con una piel biotecnolgica.
Implantacin de miembros amputados que pueden moverse con el pensamiento

(biomateriales inteligentes)
Vejigas artificiales creadas con clulas de los propios pacientes
Ojo binico
Suturas biodegradables
Aplicaciones odontolgicas y oftalmolgicas
Soportes para liberacin de medicamentos
Tipos de biomateriales
La clasificacin de los biomateriales puede realizarse atendiendo a su comportamiento
cuando se implantan o bien atendiendo a su naturaleza qumica. Se clasifican en:
Metales
Cermicas
Polmeros
Metales:
Han sido utilizados en aplicaciones mdicas desde el siglo XVI, en reparaciones dentales e
inmovilizacin de fracturas seas. Se han utilizado en la fabricacin de prtesis y rtesis, o
para la fabricacin de implantes utilizados en la estabilizacin y ayudua al proceso de
reparacin de un tejido.
Pueden sufrir procesis de corrosin liberando productos que generen una reaccin tisular o
afectar directamente el tejido circundante por alteracin del entorno qumico generando
cambios electroqumicos que afecten el comportamiento o la conducta de las clulas,
modificacin del metabolismo celular
mediante la liberacin de iones metlicos, o
generando una reaccin inflamatoria crnica por la liberacin de productos de la corrosin.

126
Cermicas:
A diferencia de los metales, las cermicas son materiales qumicamente inertes, los cuales
no desencadenan respuestas indeseadas en el tejido con el cual se relacionan, adems no
son susceptibles al ataque microbiano y son qumicamente estables en presencia del
oxgeno, de medios cidos, alcalinos, salinos y disolventes orgnicos. Estas caractersticas
favorecen el uso de las cermicas para la generacin de prtesis seas. Las cermicas
porosas posibilitan el crecimiento del tejido circundante y la adhesin celular al interior a
travs de sus poros. La existencia de los poros permite la vascularizacin del implante, por
lo que sirven como excelentes modelos en procesos de osificacin. El gran problema de
estas cermicas es la debilidad mecnica, sobre todo cuando se trata de productos de
elevada porosidad. Ejemplo de estas cermicas son los corales y la almina, pero debe ser
tratada para adquirir la porosidad caracterstica de estos compuestos.
Las cermicas bioactivas muestran una determinada reactividad qumica del implante frente
a los tejidos circundantes. La gran ventaja de este tipo de implantes es que se pueden
reabsorber a largo plazo desapareciendo los potenciales problemas de biocompatibilidad.
Este tipo de cermicas son utilizadas frecuentemente para la preparacin de implantes que
induzcan y posibiliten la formacin de estructuras seas; normalmente se destinan a
aplicaciones ortopdicas. El principal inconveniente que presentan es que los iones
liberados durante el proceso de reabsorcin deben encontrarse a una concentracin
compatible con el medio fisiolgico circundante y, a la vez, no resultar txicos. Ejemplos
de estas cermicas son la hidroxiapatita y los vidrios bioactivos.
Polmeros:
Las propiedades fsicas, el comportamiento y estabilidad qumica de este grupo de
biomateriales dependen de un conjunto de variables tales como la composicin qumica del
polmero y su grado de entrecruzamiento molecular. Una de las ventajas que presentan es
que se les puede dotar de una amplia variedad de propiedades por introduccin de aditivos
qumicos, macromolculas o segundas fases. La forma, la estructura, la textura, la rigidez y
la flexibilidad son propiedades que a priori pueden determinar su utilizacin. En general
poseen una alta biocompatibilidad al ser biodegradables. Los polmeros tienen diferentes
aplicaciones en odontologa, ortopedia, como suturas, adhesivos tisulares, se utilizan en el
127
transporte y liberacin de frmacos, en regeneracin tisular, y en la generacin de andamios

para ingeniera de tejidos.
Los polmeros son el principal tipo de materiales empleados en la ingeniera de tejidos
blandos. Se dividen en naturales y sintticos, as como en degradables y no degradables.
Los biopolmeros naturales poseen biocompatibilidad y resorcin, sin embargo tienen baja
capacidad de procesamiento y propiedades mecnicas pobres, mientras que los polmeros
sintticos superan lo ltimo, pero generan respuesta inmune debido a la degradacin de
productos cidos.
Tipos de pruebas a los biomateriales
Una vez desarrollado un biomaterial para aplicaciones mdicas, debe ser sometido a un
conjunto de pruebas para evaluar su correcto funcionamiento antes de ser implantado en un
ser vivo. Estas pruebas incluyen:
Simulaciones biomecnicas: para evaluar el esfuerzo al cual ser sometido el

material en condiciones reales de funcionamiento.
Modelos in vitro: en cutivos celulares, los cuales permiten determinar cmo

responden las clulas a la presencia de diferentes materiales, evaluando cmo se
produce la adhesin, proliferacin, y crecimiento celular en presencia del material;
as como tambin las actividades enzimticas y metablicas que puedan alterarse
por la presencia del material objeto de estudio.
Ensayos toxicolgicos: para evaluar que no generen productos txicos para el

organismo.
Ensayos de biocompatibilidad: para determinar la respuesta del organismo a la

implantacin del biomaterial. Se analiza el tipo de clulas presentes en el implante y
sus alrededores, y se evala si hay un proceso inflamatorio o de rechazo del
material. Lo que se busca es una intergracin entre el biomaterial y el tejido
adyacente.
Implantacin en animales de experimentacin: Se realizan pruebas en modelos

animales para evaluar la integracin, inflamacin, rechazo, o cualquier otro tipo de
reaccin del biomaterial con el ser vivo. Estas pruebas se realizan antes de realizar
estudios en seres humanos. Una vez se garantice la biocompatibilidad y que el
128
bimaterial no sea txico para el ser vivo, se puede proceder a realizar ensayos
clnicos.
Pruebas clnicas: Se realizan en pacientes mediante protocolos aprobados por

comits de tica, en donde se busca corregir un defecto existente, o la regeneracin
tisular.
Generacin de andamios para cultivos celulares

Para la ingeniera de tejidos es importante el desarrollo de andamios que imiten el
microambiente del tejido y que promuevan su regeneracin. Se busca la generacin de
andamios 3D, que promuevan la adhesin celular, interaccin con la matriz extracelular,
proliferacin celular y diferenciacin.
Se estudian diferentes tcnicas de microfabricacin, para generacin de estructuras
microporosas 3D, transporte de nutrientes e infiltracin celular; y tcnicas de
nanofabricacin, para crear superficies con propiedades qumicas especficas
nanotopografa.
Hay diferentes tipos de andamios: amorfos, basados en hidrogeles, fibrosos y con
geometra y estructura controlada. En la Figura 16.2 se observa un ejemplo de andamio de
alginato para crecimiento de clulas cardiacas.
En la creacin de un andamio se debe tomar en cuenta:
Tejido de origen.
129
Propiedades mecnicas.
Interacciones clula-clula y clula-matriz.
Estructura de los poros para el transporte de nutrientes.
En los andamios de fibras se busca:
Porosidad > 95%
Estructuras isotrpicas
Tamao de fibras es homogneo
Distribucin de los poros
Caractersticas topogrficas similares a las de la MEC.
Existen varios efectos de los andamios en el comportamiento del cultivo celular, entre los
que se encuentran:
Depende del tipo de cultivo (2D o 3D)
Propiedades de superficie (Qumica, geometra y topografa)
Funcionalizacin de las molculas biolgicas
Afectando la adhesin celular, migracin, proliferacin, diferenciacin y morfognesis.

Una vez generados, se evalan varias propiedades de superficie, como:
Nanoescala (<1 m), microescala (1-1000 m)
Porosidad
Tamao de poro
Dimetro de las fibras
Macroescala (>1 mm) dimensin del andamio y conFigurauracin.
Degradacin, cargas inicas, fuerza mecnica y la conductividad elctrica (si

aplica).
Existen estudios que demuestran los beneficios del crecimiento celular sobre cido
polilctico-poligliclico (PGLA) y tereftalato de polietileno (PET) en andamios 3D (Figura
16.3) vs. 2D a nivel microestructural, morfolgico, de adhesin y de organizacin celular,
entre los que se encuentran:
3D presenta alta densidad celular a diferencia de los 2D
3D aumenta la proliferacin, interconectividad de la estructura para la difusin de

nutrientes.
3D mejor distribucin espacial y migracin.
130
En los andamios fibrosos, se favorece la adhesin celular, formacin de puentes y

agregados celulares entre las fibras.
Se evidenci que el crecimiento celular, la organizacin espacial y la migracin afectan la

proliferacin, funcin, expresin de genes y la diferenciacin celular.
La proliferacin sobre andamios 3D es lenta. Se evala la interaccin, sealizacin, y
funcionalidad celular con la ayuda de biorreactores y de microfluidos para proveer al tejido
todas las condiciones necesarias para su aplicacin mdica.
El quitosano y la gelatina son de los biomateriales ms utilizados en ingeniera de tejidos

debido a su biocompatibilidad, biodegradabilidad, baja toxicidad y bajo costo. Pese a las
grandes ventajas que tienen los biomateriales de origen biolgico, tambin se han estudiado
polmeros sintticos biodegradables, que proporcionan flexibilidad, propiedades mecnicas
adecuadas as como de degradacin. Lo que se busca ahora es emplear biomateriales
compuestos, de tal manera que las propiedades se complementen y se mantengan por ms
tiempo la morfologa y funcin de las clulas.
131
Pruebas para evaluar las interacciones clula-biomaterial

Existen diferentes pruebas para determinar en qu medida se afectan las funciones celulares
al interactuar con un biomaterial. El siguiente esquema (Figura 16.4) describe los diferentes
tipos de pruebas que se pueden realizar.
La citotoxicidad es la capacidad que poseen ciertos compuestos de producir alteraciones de

las funciones celulares bsicas.
Las pruebas de citotoxicidad son utilizadas para determinar la proporcin de clulas que
mueren despus de la exposicin a un nuevo biomaterial.
La prueba de contacto directo es la ms simple. Primero se fabrica el biomaterial de ciertas
dimensiones, las clulas muertas se van de la superficie y flotan en el medio. Se necesita un
control negativo y uno positivo para poder estimar el grado de citotoxicidad de la muestra.
Otras pruebas adicionales son:
Evaluacin cualitativa de las clulas muertas mediante tincin.
Medicin de la cantidad de enzimas como la lactato deshidrogenasa.
En las pruebas de difusin en agar las clulas se adhieren a la superficie de la placa de

cultivo y despus son cubiertas por el agar. Los productos solubles de la muestra pueden
difundir en el agar y resultar en la muerte celular en las regiones localizadas por debajo del
material. La viabilidad de las clulas se examina despus de 1-3 das de exposicin.
La prueba de elucin se realiza para determinar la citotoxicidad de las molculas que se
encuentran en los biomateriales (como monmeros sin reaccionar o productos de
degradacin). Las clulas se colocan en un medio de cultivo en placas con pocillos durante
132
24 horas. Se prepara el extracto a una temperatura de 37 C y posteriormente se aade a las

placas con los pocillos. La viabilidad es evaluada despus de 1-3 das.
La adhesin celular se cuantifica permitiendo que las clulas se unan a la muestra durante
un tiempo determinado y luego se enjuaga quitando las clulas no adheridas.
La Cmara de Boyden cuantifica el nmero de clulas de una poblacin que se mueven
fuera de un rea determinada.
Las pruebas de ADN y ARN son un tipo de anlisis de mutagenecidad del material, usado
para determinar o evaluar cmo el ambiente del biomaterial afecta a la expresin gnica y
por lo tanto a las funciones celulares.
! Investigar sobre un biomaterial, propiedades y caractersticas y sus aplicaciones en el
rea mdica.
! Leer sobre la generacin de andamios para cultivos celulares
! Discusin en clase de artculos de divulgacin cientfica:
Serrano Lpez C. Biomateriales: Biologa y Qumica en el diseo de tejidos artificiales.
2011. Disponible en:
http://www.sebbm.es/archivos_tinymce/marzo2011_concepcionserrano.pdf
Lozano D. Se pueden emplear materiales sintticos para reemplazar un hueso daado?
2011. Disponible en: http://www.sebbm.es/archivos_tinymce/agosto2011_daniellozano.pdf
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133
17. Inflamacin y excesos de la inmunidad
Objetivos
Que el alumno conozca los procesos involucrados en la reparacin de un tejido.
Que el alumno conozca el efecto de implantar un cuerpo extrao en el organismo a
travs de la respuesta inmune e inflamatoria.
Contenido
Mecanismos de defensa
La respuesta inmunitaria es el conjunto de acciones que emprende el sistema inmunitario
ante agentes extraos o patgenos. Aunque la inmunidad es nica, sus componentes se
suelen asignar a 2 grandes bloques que trabajan en coordinacin para mantener nuestra
integridad: inmunidad innata o inespecfica e inmunidad adaptativa, especfica o adquirida.
La inmunidad innata es rpida pero sin memoria ni mucha especificidad, est mediada por
el complemento, los fagocitos, los interferones y los linfocitos NK. El complemento es un
grupo de protenas del suero capaces de unirse a los patgenos y destruirlos. Los
interferones son citocinas, pequeas hormonas inmunolgicas sintetizadas por diversas
clulas infectadas para comunicarse con otras clulas. Los fagocitos son clulas
especializadas en fagocitar patgenos, los principales son los neutrfilos, los macrfagos y
las clulas dendrticas. Otra importante funcin de los fagocitos es la de contribuir a las
respuestas adaptativas mediante la presentacin de antgenos al linfocito T. Consiste en
utilizar los restos ya digeridos del patgeno y exponerlos en membrana sobre unas
molculas especializadas llamadas MHC (Major Histocompatibility Complex). Ese material
antignico es al que responden los linfocitos T.
La inmunidad adaptativa est mediada por los linfocitos B y T y por molculas como los
anticuerpos o ciertas citocinas de linfocitos. Los linfocitos B y T utilizan para reconocer
patgenos receptores de membrana denominados BCR (B Cell Receptor) y TCR (T Cell
134
Receptor), respectivamente. Estos receptores son diferentes entre un linfocito y otro, de

manera que para un patgeno concreto slo uno o algunos linfocitos van a responder (se
activarn) y lo recordarn en el futuro (memoria inmunitaria). Para ello, necesitan primero
aumentar en nmero y constituir lo que se llama un clon de linfocitos.
La inflamacin mejora la inmunidad
La inflamacin es el proceso fisiolgico de un organismo por medio del cual el tejido
vascularizado responde a un agente irritante o infeccioso. Es un sistema de vigilancia
inmunolgica que permite detectar agentes extraos o patgenos, y reclutar al sitio
molculas y clulas inmunolgicas a travs de la rpida ruta de la sangre. La inflamacin
puede ser inducida por molculas del suero como el complemento o por molculas
producidas por clulas, como los fagocitos o los linfocitos, o por los tejidos daados que
liberan agentes qumicos, como resultado directo del traumatismo. La inflamacin modifica
los capilares que irrigan la zona comprometida aumentando su calibre (vasodilatacin), su
permeabilidad y su adhesividad. Los tejidos inflamados se enrojecen, se hinchan, se
calientan y duelen porque llegan ms molculas y clulas. Al aumentar el lquido que baa
el tejido inflamado, aumenta el flujo del lquido intersticial a los ganglios linfticos, lo que
permite recoger los patgenos y antgenos para su inspeccin por los linfocitos, que inician
as la inmunidad adaptativa. Por ltimo, la inflamacin se resuelve con la reparacin del
tejido afectado, por medio de cicatrizacin. La inflamacin es crucial para mantener la
salud e integridad de un organismo, pero cuando el episodio es controlado de modo
deficiente, puede resultar en destruccin masiva.
Las respuesta inflamatoria se divide tradicionalmente en aguda y crnica. La aguda es la
rplica rpida, de vida corta, relativamente uniforme al dao acentuado, se caracteriza por
la acumulacin de fluido, protenas plasmticas y neutrfilos. Por otra parte, la inflamacin
crnica se presenta cuando la inflamacin aguda persiste; es ocasionada por una
eliminacin incompleta del foco de inflamacin inicial, o como resultado de eventos
agudos mltiples que tienen lugar en el mismo sitio. Es de larga duracin e incluye la
afluencia de linfocitos y macrfagos y crecimiento de fibroblastos y de tejido vascular que
favorecen la cicatrizacin del tejido (Figura 17.1).
135
Dao tisular
Las clulas basales derivadas de las clulas troncales adultas, pueden seguir tres vas
diferentes: proliferacin, diferenciacin o apoptosis. Al recibir un dao tisular se pierde
parte de esta poblacin basal, tanto clulas diferenciadas como MEC; la consecuencia es la
activacin de mecanismos que permitan recuperar la funcin y la estructura del tejido.
La reparacin tisular vara dependiendo de si el dao es agudo o crnico:
I.
Lesiones agudas
a) Regeneracin: restitucin total del tejido perdido, por el mismo tipo de tejido, con la
misma arquitectura y en ausencia de depsito excesivo de tejido fibroso, bajo las
siguientes circunstancias:
Dao en clulas parenquimatosas, como el epitelio
Lesin de tejidos quiescentes si se mantiene la matriz, como los hepatocitos
Procesos inflamatorios
Heridas superficiales
Durante el desarrollo embrionario
b) Cicatrizacin: intento de regeneracin con la aparicin de tejido conectivo y la

formacin de cicatriz, en este caso no se logra una reorganizacin estructural. Se
produce en:
136
Dao en clulas parenquimatosas con lesin grave en la MEC.
Muerte celular en tejidos con capacidad limitada de regeneracin, como el

tejido nervioso.
II.
Heridas profundas con dao en el tejido conectivo importante.
Lesiones crnicas
a) Situaciones inflamatorias crnicas: no se logra restaurar la integridad funcional y
persiste la inflamacin, como ocurre en las lceras.
b) Fibrosis: se produce una respuesta excesiva, es decir una cicatriz exuberante; ocurre
en la cirrosis.
Fases de la reparacin tisular

La reparacin tisular se lleva a cabo en 3 fases, que se ven influenciadas por el
microambiente, la extensin del dao y la intensidad y duracin del estmulo lesivo, as
como por la presencia de infecciones o vascularizacin inapropiada.
1. Fase inflamatoria o reactiva:
Se producen la hemostasia y la inflamacin. La hemostasia es el control de la prdida de
sangre, debido a la vasoconstriccin, la activacin de la cascada de agregacin y activacin
plaquetaria, participando factores y protenas; y posteriormente la activacin de la cascada
de coagulacin. En el caso de la inflamacin, se aumenta la permeabilidad vascular y se
propicia la vasodilatacin, de tal manera que se presenta el rubor, tumor, calor y dolor.
El primer paso es la migracin de los neutrfilos al foco inflamatorio gracias a factores
quimiotcticos, de tal manera que destruyen MEC as como a los grmenes presentes y su
migracin cesa cuando la contaminacin es controlada, pero si sta persiste, se retrasa la
cicatrizacin y se prolonga la inflamacin, que puede llevar a destruir el tejido normal por
necrosis, favoreciendo una infeccin sistmica.
En la segunda etapa llegan los macrfagos, que liberan diversas citocinas, como IL-1,
TNF, IL-6, LI-8, PDGF y TGF, de tal forma que siguen eliminando contaminantes,
promueven la migracin y proliferacin de clulas parenquimatosas.
En la tercera fase llegan los linfocitos T que son esenciales para lograr la cicatrizacin.
2. Fase proliferativa, regenerativa o reparativa:
137
Se produce angiognesis, fibroplasia, epitelizacin y recambio de MEC. La angiognesis o

neovascularizacin se refiere a la formacin de vasos sanguneos en adultos, depende de la
ramificacin y crecimiento de vasos cercanos y los factores ms importantes implicados en
este proceso son: VEGF, angiopoyetinas, TGF-, IL-8 y cido lctico. La fibroplasia se
refiere a la proliferacin de fibroblastos, se produce colgeno, fibronectina y
metaloprotenas. Durante la sntesis de MEC, se inicia con una matriz provisional
compuesta fundamentalmente de fibrina, fibringeno, fibronectina y vitronectina, y
posteriormente se deposita colgeno, fibras elsticas y proteoglicanos; por ltimo, la
epitelizacin se produce sobre una lmina basal ntegra o reparada, que acta como una
barrera para evitar la prdida de lquidos y la entrada de contaminantes, participan: EGF,
TGF-, etc.
3. Fase de maduracin o remodelamiento:
Se producen la contraccin de la zona lesionada y la remodelacin del tejido. La primera se
debe a la interaccin entre la MEC y los miofibroblastos y el papel de las metaloprotenas
que rompen enlaces entre fibroblastos y la MEC quedando el tejido mas laxo. En la
remodelacin del tejido, la matriz laxa e hipervascular del tejido de granulacin es
sustituida por un tejido menos vascularizado.
El problema de la reparacin de tejido se ha intentado resolver potenciando los procesos de
reparacin endgenos y con la ingeniera de tejidos, a partir de la implantacin de clulas e
implantes de tejido creado in vitro.
Los excesos de la inmunidad causan enfermedades
El sistema inmunitario debe protegernos de las infecciones respetando nuestros propios
tejidos, pero a veces falla debido a disfunciones. Es el caso de cuando responde a sustancias
inocuas, inmunopata conocida como hipersensibilidad. Adems, transtornos en la
regulacin de la inflamacin pueden causar graves enfermedades autoinflamatorias sin
causa aparente. Otro ejemplo es cuando ataca los tejidos que se transplantan o transfunden
para curar un enfermo. Son las reacciones de rechazo, que va dirigido contra las molculas
MHC. Estas enfermedades son consecuencia de los avances biomdicos que permitieron los
transplantes.
138
Hipersensibilidad
Existe una gran proporcin de individuos que elaboran una respuesta inmune adaptativa
frente a sustancias inofensivas para el organismo. Este tipo de respuestas inmunes frente a
sustancias extraas no infecciosas puede producir una patologa clnica que se conoce como
reaccin alrgica o de hipersensibilidad. Las alergias se caracterizan porque generalmente
el primer contacto con el alergeno no origina ningun tipo de reaccin. Por ello el primer
contacto o fase de sensibilizacin no produce ningun tipo de manifestacin clnica, aunque
s se generan clulas de memoria y anticuerpos especficos para ese alergeno, de tal forma
que tras una reexposicin se producir la reaccin alrgica. Una vez que un individuo esta
sensibilizado, las reacciones alrgicas pueden agravarse con cada nueva reexposicin al
alergeno, ya que va aumentando el nmero de linfocitos T y B que reaccionan frente a esa
sustancia.
Las alergias se agrupan en 4 tipos distintos atendiendo a los componentes del sistema
inmune adaptativo que inician la respuesta y a la naturaleza del alergeno. Las 3 primeras
son mediadas por anticuerpos y la cuarta es mediada por clulas:
Tipo I: Anafilctico.
Tambien lIamada hipersensibilidad inmediata, ocurre despus de la combinacin de un
antgeno con un anticuerpo previamente unido a la superficie de mastocitos, clulas con
abundantes
grnulos
intracitoplasmticos
llenos
de
mediadores
de
inflamacin
preformados, como la histamina. La reaccin empieza con la exposicin del individuo a

ciertas sustancias que actan como antgenos que estimulan la produccin de IgE por parte
de los linfocitos B. Una vez que las IgE se forman, se unen a la superficie de los mastocitos
a travs de su Fc. Frente a una segunda exposicin, los alergenos se unen a las IgE y se
inicia la desgranulacin de los mastocitos.
Tipo II: Citotxico.
En este caso el alergeno es tambin una molcula soluble, pero se une a la superficie de las
clulas o de la MEC, donde genera neoantgenos, que son reconocidos por anticuerpos del
tipo IgG; los anticuerpos activan el complemento, la fagocitosis y la citlisis celular
mediada por anticuerpos, destruyendo las clulas que llevan unido el alergeno.
139
Tipo III: Inmunocomplejos.

Hipersensibilidad mediada por complejos antgeno-anticuerpo que al depositarse, causan
reacciones inflamatorias locales, activndose tambin el complemento y provocando la
destruccin de estos complejos por fagocitosis. A diferencia de lo que ocurre en la
hipersensibilidad de tipo I, las de tipo II y tipo III generalmente tardan unas cuantas horas
en producir sntomas tras la exposicin al alergeno.
Tipo IV: Celular tarda.
Hipersensibilidad originada por la respuesta de clulas T, tanto frente a antgenos solubles
como a antgenos asociados a clulas. Tarda varios das en producirse, causando dao en
los tejidos debido a la secrecin de citosinas inflamatorias o a procesos de citlisis. Dentro
de este tipo, se distinguen la hipersensibilidad por contacto (como la reaccin alrgica a
metales como el nquel y el cromo, Figura 17.2), la tuberculnica, la granulomatosa (como
en la inhalacin crnica de silicio) y la mediada por clulas T citotxicas.
Hipersensibilidad a biomateriales
En las reacciones de hipersensibilidad a los biomateriales se cree que liberan metales que
difunden muy bien y actan como haptenos unindose a molculas propias que actan
como portadoras (generando as neoantgenos). Estos complejos son degradados y
procesados por clulas dendrticas, que llevan el antgeno expuesto en molculas MHC
hasta los ganglios, donde se sensibilizan linfocitos T especficos. En cermicas se han
140
realizado pocos estudios de hipersensibilidad, mientras en polmeros la evidencia de las

respuestas del tipo IV son controvertidas.
La respuesta de un tejido ante un biomaterial genera:
Reaccin inflamatoria inmediata, que puede ser intensa si se induce el rechazo del
material implantado.
Se producen modificaciones hemodinmicas, edema local y varios mediadores

pueden incrementar la tensin capilar e hipoxia tisular.
La zona puede ser invadida por clulas sanguneas; la intensidad de llegada de

leucocitos y la reaccin proteoltica est correlacionada con las propiedades
irritantes del implante.
Respuesta del tejido a los biomateriales

Una vez se implanta un biomaterial en el organismo se desencadena una reaccin
inflamatoria inmediata, la cual puede llegar a ser intensa si se produce rechazo del material
implantado, en cuyo caso puede ocurrir la extrusin si el implante est en contacto con
tejido epitelial (en este caso el material es forzado a salir del organismo).
Al introducir un cuerpo extrao en el organismo, como ocurre con el implante de un
biomaterial, se producen modificaciones hemodinmicas, edema local y varios mediadores
pueden incrementar la tensin capilar y generar hipoxia (falta de oxigenacin) tisular.
Una vez se coloca el implante, los macrfagos y otras clulas involucradas en el proceso
inflamatorio generan seales quimioactivas para promover la migracin de fibroblastos y
clulas vasculares al rea en cuestin. A los 3 5 das, se inicia la formacin de tejido de
granulacin, el cual se genera por la neovascularizacin o angiognesis.
En algunos casos, se produce un encapsulamiento fibroso, el cual depende del grado de
dao original durante la implantacin, la cantidad de muerte celular generada, el lugar de la
implantacin y el tiempo de degradacin del implante.
Si el implante es biodegradable es posible que no se forme una cpsula fibrosa, esto
depende de la tasa de degradacin, o se forma pero se termina colapsando con el paso del
tiempo. En muy pocos casos ocurre la integracin, en donde no se forman cpsulas fibrosas
ni hay otra respuesta del tejido. Slo ocurre si hay una aproximacin muy estrecha entre el
tejido husped y el implante.
141
! Investigar sobre los diferentes tipos de citocinas y su funcin dentro del sistema
inmunitario.
! Realizar lecturas de artculos relacionados con la hipersensibilidad a biomateriales y
presentarlos en clase para discusin.
Bibliografa
Temenoff JS, Mikos AG. Biomaterials. Pearson Education; 2008.
Regueiro Gonzlez JR, Lpez Larrea C, Gonzlez Rodrguez S, Martnez Naves E.
Inmunologa: biologa y patologa del sistema inmune. Mdica Panamericana; 2012.
142
18. Biorreactores para ingeniera de tejidos
Objetivos
Que el alumno conozca los diferentes tipos de biorreactores utilizados en ingeniera de
tejidos y la forma en que puede aumentar la proliferacin celular en un ambiente
controlado.
Contenido
Generalidades
Cuando un tejido se produce en cultivos estticos (a pequea escala), las clulas ms
superficiales son ms viables y proliferan ms que las clulas crecidas en la zona ms
interna, dando como resultado tejidos de poco grosor. Esto se debe a la falta de vasos
sanguneos encontrados in vivo que entreguen la cantidad necesaria de nutrientes y oxgeno
a las clulas.
Con el fin de superar dichas limitaciones, se han utilizado a los biorreactores para el cultivo
de tejidos pues ofrecen diversas ventajas. Los biorreactores son dispositivos donde se
llevan a cabo procesos biolgicos o bioqumicos en un ambiente de condiciones de
operacin (pH, temperatura, presin, suministro de nutrientes, etc.) monitoreadas y
controladas. La posibilidad de su aplicacin a gran escala se debe a su alto nivel de
reproducibilidad, control y automatizacin de los procesos (Figura 18.1). Dentro de estos
recipientes (biorreactores) es importante que exista una gran capacidad de transferencia de
masa, momento, oxgeno y calor, homogeneidad en las distintas zonas del reactor,
factibilidad en la tcnica y volumen de operacin, y un bajo costo de generacin,
produccin y mantenimiento. Es importante calcular el coeficiente volumtrico de
transferencia de oxgeno (KLA) del biorreactor para evaluar la eficiencia en la transferencia
de oxgeno, lo cual es crucial para el mantenimiento de clulas simulando sus condiciones
fisiolgicas.
143
Adems, los biorreactores facilitan la proliferacin y diferenciacin de las clulas (a travs

de seales de regulacin fsicas y bioqumicas), pueden ayudar a superar las limitaciones en
trminos de viabilidad, y tienen la capacidad de aplicar estmulos mecnicos a las clulas.
Esto puede fomentar la produccin de MEC en las clulas en un menor periodo de tiempo y
de forma ms homognea que en un cultivo esttico. La importancia de la formacin de
MEC es, entre otras, incrementar la firmeza mecnica que le provee al tejido.
En el rea biomdica y de ingeniera de tejidos, los biorreactores tienen tres funciones
principalmente. La proliferacin celular a pequea escala, en la cual se busca obtener una
gran cantidad de biomasa sin importar el acomodo. Despus de ello se busca la generacin
de constructos tisulares en 3D, y finalmente se utilizan para el soporte y mantenimiento de
rganos completos, brindando estmulos fsicos a las clulas que formarn el tejido.
La estrategia clsica para la produccin de tejidos artificiales en biorreactores consiste en
aislar clulas especficas a travs de a biopsia de un paciente, crecerlas en andamios
biomimticos en condiciones controladas e implantar el tejido resultante al sitio a regenerar
del cuerpo del paciente.
Para poder conseguir un cultivo denso, es importante tener en cuenta el tamao de poro, y
de acuerdo al tipo celular a cultivar ser la geometra del soporte. El tipo de biorreactor
tambin depende del tejido a generar.
144
En el cultivo celular en biorreactores, las condiciones del biorreactor pueden afectar tanto el
crecimiento celular como el metabolismo de las clulas. Los niveles de agitacin y
aireacin del biorreactor pueden generar estrs hidrodinmico que puede daar las clulas.
La respuesta celular depende de la intensidad y duracin de la fuerza aplicada, as como de
las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de las clulas.
Una desventaja de algunos tipos de biorreactores es la distribucin heterognea de las
clulas, ya que pese a que se realice un cultivo homogneo, despus de un largo periodo, la
mayor parte de las clulas se encuentran en la periferia del andamio donde fueron
sembradas. Ello se debe a la necrosis y a la quimiostasis de las clulas. La necrosis ocurre
porque en el centro del andamio hay una deficiencia de entrega de nutrientes y remocin de
desechos. La quimiostasis se debe al gradiente de concentracin de nutrientes. Por lo tanto,
para incrementar la viabilidad de las clulas en el andamio, es necesario incrementar el
transporte de fluidos. Dentro de las limitantes en el uso de biorreactores para ingeniera de
tejidos y que hay que cuidar a la hora de realizar el diseo de un biorreactor para un tejido
en particular se encuentran: la tasa de crecimiento celular, la tasa de insumos, la sntesis de
produccin y la secrecin de productos. Hay que considerar que el consumo de oxgeno
vara dependiendo de la clula, del tipo de tejido y de la posicin de las clulas en el
constructo generado, ya que las clulas que no estn nutridas y bien oxigenadas morirn
ms rpido.
A continuacin se presentan los diferentes tipos de biorreactores utilizados en ingeniera de
tejidos y sus principales aplicaciones; su uso depende del tipo de tejido que desee
desarrollarse.
Matraz esttico
Es el tipo ms simple de biorreactor, donde el tejido est fijo en un matraz con medio de
cultivo. La transferencia de masa ocurre por difusin. Aunque es el mtodo ms usado, se
han reportado bajas eficiencias de sembrado y distribucin celular no uniforme en el
andamio.
Matraz agitado
En estos matraces se generan esfuerzos cortantes (fuerza aplicada por unidad de rea
necesaria para mantener el fluido a una velocidad constante), por ello hay un lmite mximo
145
en la intensidad del mezclado que puede usarse. En un matraz agitado los andamios estn
suspendidos al extremo de una aguja en un matraz para cultivo. La mezcla del medio se
realiza por un agitador magntico y los andamios estn fijos. El flujo da como resultado la
formacin de eddies, es decir, inestabilidades turbulentas que daan las clulas. Es por
estos eddies que puede incrementarse el transporte del fluido al centro del andamio. Sin
embargo, su mayor desventaja es una insuficiente transferencia de masa y las clulas
residen principalmente en la periferia del andamio.
Biorreactor de paredes rotantes
Est formado comnmente por dos cilindros donde los microacarreadores o andamios se
colocan en un espacio anular entre ambos cilindros. Son sistemas con rotacin horizontal
equipados con membranas de intercambio de gases por difusin para optimizar el
suministro de oxgeno. Los andamios se mueven en el biorreactor gracias a un balance
entre la cada libre del andamio debido a la gravedad y las fuerzas centrfugas debidas a la
rotacin del cilindro externo. La velocidad inicial de rotacin se ajusta para que el medio de
cultivo y la construccin del tejido roten de forma sincronizada con el biorreactor, lo que
permite proveer una transferencia eficiente de nutrientes y desechos. Las paredes rotan a
velocidades entre 15 y 30 rpm y proveen una distribucin celular ms homognea que en
un cultivo esttico. La velocidad rotacional se incrementa cuando el tejido crece para
asegurar que el andamio permanezca en suspensin.
Biorreactor de fibras huecas
El medio es perfundido a travs o alrededor de fibras huecas semipermeables para mantener
una alta funcin metablica celular al incrementar el transporte de masa tanto de nutrientes
como de oxgeno.
Biorreactor de flujo de perfusin
Consiste en hacer fluir el medio de cultivo a travs de la construccin andamio-clulas. Los
cultivos en un sistema de perfusin tienen gradientes de concentracin mnimos. Este
suministro continuo de nutrientes permite alcanzar mayores densidades celulares. Para
asegurar que el medio fluya exclusivamente a travs de la porosidad del material, algunos
diseos de este tipo de biorreactores incluyen el confinamiento del arreglo en cmaras.
En este biorreactor, las clulas migran hacia el interior del andamio, creando una
distribucin celular y de la MEC de forma homognea. Una ventaja adicional es que las
146
fuerzas hidromecnicas ejercidas por el flujo del medio a travs del constructo son
benficas para segregar MEC calcificada para aplicaciones de ingeniera de hueso.
Biorreactor de compresin
Se ha utilizado para la ingeniera de cartlago. Puede ser operado con carga de forma
esttica o dinmica. Este biorreactor da como resultado la formacin de tejido a niveles
cercanos a los cartlagos nativos. Consiste de un motor operado a travs de una
computadora que provee un movimiento linear y un mecanismo de control. Un generador
de seal se usa para controlar el sistema y la carga celular, la cual puede transferirse al
constructo para el crecimiento celular mediante platinas que distribuyen a la carga de
manera uniforme.
Biorreactores de presin hidrosttica
Es posible utilizar este biorreactor para aplicar estmulos mecnicos a los constructo. Su
objetivo es imitar las condiciones de presin encontradas in vivo. Permite que diferentes
tipos de constructos se expongan a diversas condiciones de presin fisiolgicas. Este tipo
de sistema puede facilitar el crecimiento y desarrollo de constructos necesarios para
producir injertos vasculares. La cmara puede presurizarse usando un pistn con una
membrana impermeable para que el pistn no est en contacto directo con el medio de
cultivo.
Biorreactores combinados
Es posible combinar diferentes tipos de materiales para obtener una mejor simulacin in
vitro del ambiente in vivo. En la mayora de los casos, los biorreactores de este tipo ms
complicados involucran la adicin de un bucle de perfusin en la parte superior de un
biorreactor estndar (ya sea hidrosttico, de compresin, etc.) con el fin de permitir un
mejor intercambio de nutrientes al mismo tiempo que ocurre una estimulacin por los
diversos estmulos mecnicos.
Aplicaciones de los biorreactores en ingeniera de tejidos
Los biorreactores se han utilizado para la produccin de diversos tipos de tejidos operando
bajo parmetros distintos segn los requerimientos de cada tipo celular. A continuacin se
describen algunos ejemplos de las caractersticas generales del desarrollo de los tejidos
147
mediante el uso de los biorreactores y la importancia de los estmulos proporcionados por

stos.
Tejido cardiovascular
Como una alternativa a las cirugas bypass para el tratamiento de las enfermedades
cardiacas coronarias, se ha buscado recrear la estructura de los vasos sanguneos in vitro
usando diversas estrategias. Por ejemplo, bajo flujos pulstiles para producir vasos
sanguneos con propiedades histolgicas y mecnicas similares al tejido nativo, o cocultivos de diferentes tipos celulares donde los andamios pueden cultivarse con clulas de
msculo liso y luego con una capa de clulas endoteliales cuando el periodo de cultivo est
por terminar.
Los biorreactores empleados estn inspirados en la expansin y retroceso de los vasos
sanguneos debido a un incremento y disminucin de la presin, respectivamente, dentro
del lumen. Se ha logrado un buen desarrollo de cultivo de tejidos vasculares en
biorreactores de paredes rotantes y combinado de presin y perfusin.
Cartlago
El cartlago es un tejido no vascularizado que consiste en condrocitos y matriz extracelular.
En el organismo, est sujeto a diversos tipos de estrs mecnicos, existe en un ambiente
cido y casi anaerbico, condiciones que son perjudiciales para su regeneracin, es por esto
que el cartlago adulto no se regenera eficientemente in vivo.
De ah la importancia de cultivar tejido de cartlago in vitro. Cuando las clulas son
sembradas en un sistema con flujo de perfusin, se observa una mejor calidad de la matriz
extracelular producida (especialmente cuando se encuentran bajo estrs mecnico) y una
mayor densidad celular.
Tejido muscular cardiaco
Cuando se da un infarto al miocardio (ataque al corazn), parte del suplemento de sangre al
msculo del corazn se bloquea y los cardiocitos (las clulas del msculo cardiaco) mueren
por la falta de oxgeno. El msculo cardiaco tiene una habilidad limitada para regenerarse y
la formacin de una cicatriz puede crear ms problemas al encoger otros vasos. Por ello, la
ingeniera de tejido muscular cardiaco es de gran inters para el desarrollo de un mtodo
para la reparacin de miocardio. La entrega de oxgeno en clulas cardiacas es vital para
mantener el crecimiento in vitro de una capa de tejido suficientemente gruesa.
148
Para su uso clnico, los injertos ideales de tejido muscular cardiaco deben tener una
distribucin uniforme y densa de cardiomiocitos, deben contraerse en respuesta a un
estmulo elctrico y una integridad mecnica para una implantacin adecuada.
Se ha cultivado tejido cardiaco en cultivo esttico pero, dado que el oxgeno disuelto solo
se transporta a travs de difusin, solo se alcanza un grosor del tejido de 100 m. Cuando el
cultivo se realiza en biorreactores de paredes rotantes se mejora la transferencia de masa
pero no se generan estmulos mecnicos tpicamente encontrados en un ambiente in vivo
porque este biorreactor proporciona condiciones de bajo esfuerzo cortante.
Los mejores resultados obtenidos han sido en los sistemas de perfusin pues permiten una
mejor y mayor distribucin uniforme de clulas y tambin pueden observarse contracciones
espontneas de manera sincronizada despus de algunos das del sembrado. Es posible que
ocurran contracciones espontneas en el tejido usando matraces agitados y un impulso de
propagacin debido a un impulso elctrico, pero solo en la regin perifrica. Esto
representa una desventaja importante porque solo parte del tejido desarrollado muestra la
funcin encontrada en condiciones intracorpreas. Lo ideal es que la totalidad del tejido
artificial tenga las propiedades del miocardio encontradas in vivo.
Vlvulas cardiacas
El cuerpo humano tiene cuatro vlvulas de corazn que mantienen el flujo sanguneo de
una forma unidireccional, del corazn a todo el organismo. Las caractersticas generales
deseables de una vlvula crecida in vitro es que cuenten con una geometra estable y con un
potencial de crecimiento y regeneracin una vez implantadas en el paciente. Ello es
importante para los pacientes con malformaciones congnitas de las vlvulas que requieren
de un reemplazo de larga duracin que pueda crecer conforme el paciente lo hace.
Por las razones anteriores, las vlvulas creadas por ingeniera tisular pueden ser la mejor
opcin.
En un cultivo bajo un flujo pulstil, ste se aplica al andamio mediante el bombeo de aire a
una cmara conectado a la cmara del andamio con un diafragma de silicn. La presin a la
que el pulso se aplica incrementa con el tiempo. Mientras ms fuerte sea el andamio, las
fuerzas aplicadas pueden ser incrementadas.
149
Hueso
El hueso es un tejido altamente vascularizado que se encuentra en constante renovacin. Se
ha cultivado en matraces estticos, en biorreactores de paredes rotantes y en matraces
agitados. En los matraces estticos las clulas se concentran solo en la capa ms superficial.
En el biorreactor de paredes rotantes se observa una distribucin celular ms uniforme pero
se form matriz extracelular poco mineralizada. Finalmente, en el matraz agitado se han
obtenido resultados satisfactorios, pues los constructos obtenidos mostraron una mayor
densidad celular, mineralizacin y diferenciacin. Esto se debe a la sensibilidad de los
osteoblastos al esfuerzo cortante causado por el mezclado, lo que activa factores de
crecimiento e induce a la formacin de fibras de estrs.
Las clulas cultivadas con estrs mecnico no siempre generan resultados perjudiciales para
su desarrollo sino que depende de las necesidades de cada tipo de clula y de las
condiciones intracorporales en que se encuentren. Por ello, tiene sentido que la presencia de
mayores esfuerzos cortantes sea un factor indispensable en el cultivo de tejido seo y de
cartlago, pues stos soportan mayor estrs mecnico que otros tejidos en el organismo.
Desarrollo de biorreactores para clulas hepticas
Para que la ingeniera de tejidos se convierta en un participante activo de las terapias de
reemplazo de rganos, los biorreactores tienen que desarrollarse de tal manera que puedan
satisfacer los requerimientos presentados, desde procurar una distribucin uniforme de las
clulas, hasta lograr que el proceso sea reproducible y fiable.
Para el cultivo de clulas hepticas existen diferentes tipos de biorreactores. Para los
dispositivos de hgado bioartificial extracorpreo (BLA) se utilizan biorreactores de fibra
hueca en su mayora cargados con hepatocitos porcinos y que estn inmovilizados. Otro
tipo de biorreactor es el de monocapa, andamios perfundidos y suspensiones celulares.
Muchos investigadores han demostrado el beneficio que tiene la siembra dinmica y
tcnicas de cultivo en un biorreactor de perfusin, que contiene un andamio 3D. Un mtodo
de siembra de clulas simple pero eficaz debe de ser compatible con la qumica, la
morfologa (tamao de poro), la geometra y la configuracin del biorreactor. Adems, este
mtodo debe de ser lo suficientemente suave para permitir una alta viabilidad de las clulas
inmovilizadas y que puedan expresar sus funciones.
150
Requerimientos bsicos en los biorreactores

Los principios generales al desarrollar un biorreactor son los siguientes:
Seleccin adecuada del material: los materiales deben ser biocompatibles o

bioinertes. Por ejemplo, el acero inoxidable puede utilizarse si es tratado de tal
forma que los iones de cromo no se filtren al medio. Otras condiciones que deben
cumplir es que puedan emplearse a 37C y en un ambiente hmedo y que adems
las partes del biorreactor puedan ser esterilizadas ya sea por el autoclave o
desinfeccin por sumersin en alcohol. De forma alternativa, pueden usarse partes
desechables que sean reemplazadas despus de cada uso. Otras opciones en la
seleccin es respecto a su flexibilidad y transparencia u opacidad.
Monitoreo de las condiciones en el biorreactor: se incorporan sensores para

monitorear parmetros como el pH, la temperatura, la concentracin de nutrientes o
los niveles de oxgeno.
Si se proveen los niveles adecuados en estas condiciones, se podra garantizar una
distribucin celular homognea.
Utilizacin de bombas: deben ser los suficientemente pequeas para caber en una
incubadoras y ser capaces de aplicar pequeas fuerzas de forma precisa.
Para cuantificar la transferencia de oxgeno al medio de cultivo se estima el

coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (KLA), donde A considera el
rea superficial total entre el gas y la fase lquida.
En el diseo de un reactor es importante considerar el tipo y velocidad de agitacin,

el esfuerzo cortante, el mezclado, la aireacin, la formacin de eddies. Todo esto
generar un efecto en las clulas y en su crecimiento.
Para asegurar que se mantenga la esterilidad durante la operacin del biorreactor, ste debe
disearse como un sistema cerrado con la posibilidad del monitoreo. Adems, es necesario
permitir la automatizacin del proceso para reducir el error humano.
En la figura 18.2 se ejemplifica el diseo de un biorreactor de perfusin, el cual puede
incluir estimulacin elctrica y/o mecnica al contructo.
151
Acondicionamiento mecnico
El introducir un estiramiento cclico para generar un esfuerzo mecnico en el cultivo celular
mejora la proliferacin y organizacin de la matriz celular, las propiedades mecnicas del
msculo esqueltico, y la organizacin del tejido y expresin de elastina en msculo liso. El
esfuerzo mecnico incrementa la actividad biosinttica de las clulas y ayuda en la
modulacin de la fisiologa celular.
No hay mucho conocimiento sobre el esfuerzo mecnico al que deben ser sometidos
diferentes tipos celulares para favorecer su funcionalidad, pero se sabe que ste vara de
acuerdo a la etapa de desarrollo del tejido en cuestin.
Objetivo final del uso de biorreactores en ingeniera de tejidos
El objetivo de utilizar biorreactores para el cultivo de clulas y las diversas aplicaciones en
ingeneiera de tejidos es transferir los modelos de investigacin a diseos de manufactura
clnicos de forma reproducible, efectiva, econmicamente aceptable y siguiendo las buenas
prcticas de manufactura (GMP: good manufacturing practice), logrando un control de
temperatura, pH, oxgeno, nmero de clulas, fenotipo, metabolismo y propiedades
mecnicas especficas. Hay que evitar el estrs celular al realizar el mezclado y la aireacin
del sistema, lo cual se puede lograr de una manera ms efectiva mediante la inyeccin de
152
una corriente gaseosa, que por lo general es aire, la cual se mezcla con el medio de cultivo.
En estos biorreactores no hay puntos de disipacin de enera y los esfuerzos cortantes son
homogneos por lo que causan poco estrs a las clulas.
! Investigar sobre diferentes aplicaciones de biorreactores en ingeniera de tejidos
! Realizar lectura sobre biorreactores en ingeniera de tejidos
Bibliografa
Martin I, Wendt D, Heberer M. The role of bioreactors in tissue engineering. Trends
Biotechnol. 22(2): 80-86; 2004
Plunkett N, OBrien FJ. Bioreactors in tissue engineering. Technol Health Care. 19(1): 5569; 2011
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Applications. Holanda: Elsevier; 2006.
Fisher JP, Mikos AG, Bronzino JD. Tissue engineering. Estados Unidos: CRC Press; 2007.
Chen J, Lin T. High-density culture of hepatocytes in a packed-bed bioreactor using a
fibrous scaffold from plant. Biochemical Engineering Journal. 30: 192-198; 2006.
153
19. Corazn artificial
Objetivo
Que el alumno conozca los avances en la generacin de tejido cardiaco artificial y de
otras aplicaciones de la ingeniera de tejidos en el sistema cardiaco.
Contenido
El sistema cardiovascular es uno de los principales sistemas del cuerpo humano, ya que es
el encargado de la distribucin de los nutrientes y la eliminacin de los desechos en todo el
cuerpo; este sistema est formado por el corazn, la sangre y los vasos sanguneos (venas,
vnulas, arterias, arteriolas y capilares).
Las enfermedades del corazn son una de las principales causas de muerte en Mxico y el
mundo, a nivel nacional mueren aproximadamente 87 mil personas al ao, a nivel mundial
17.5 millones. La insuficiencia cardaca es una condicin que refleja la incapacidad de
bombear o expulsar la sangre del corazn adecuadamente, la causa ms comn de la
insuficiencia cardaca es el infarto al miocardio, el cual est dado por una obstruccin en las
arterias coronarias, evitando el paso de la sangre a las paredes del corazn por un tiempo
suficiente para que esa parte del corazn sufra dao o muera.
Hay diferentes tratamientos para prevenir la insuficiencia cardaca, a pesar de esto, el nico
tratamiento que elimina el tejido daado es el trasplante de rganos, sin embargo, este
tratamiento tiene algunos inconvenientes, entre ellos la baja disponibilidad de rganos y el
elevado riesgo de incompatibilidad del rgano con el paciente.
Debido a esto, han surgido nuevas reas de investigacin para el tratamiento de las
enfermedades cardacas, la terapia celular y la ingeniera de tejidos son las nuevas
alternativas. La terapia celular consiste en inyectar directamente al tejido cardaco clulas
troncales adultas para promover la regeneracin celular del tejido daado. An no se ha
logrado obtener una regeneracin total, ni funcional.
154
Infarto
El infarto al miocardio es la muerte celular del tejido cardaco causada por falta de aporte
sanguneo a una zona del corazn que es consecuencia de la oclusin en la arteria que se
encarga de irrigarlo (Figura 19.1). La oclusin est dada por una trombosis, la cual puede
ser consecutiva al desprendimiento de una placa de lipoprotenas en un vaso sanguneo o
por el esfuerzo que el corazn ha presentado para realizar el bombeo de la sangre. El
trombo va por el torrente sanguneo hasta que se produce la obstruccin, suprimiendo el
aporte sanguneo. Si el msculo cardaco carece de oxgeno durante demasiado tiempo, el
tejido de esa zona muere y no se regenera.
Est enfermedad ocasiona la prdida de la capacidad de contraccin de una parte del

corazn, por lo tanto, el flujo sanguneo disminuye y el esfuerzo del corazn aumenta para
poder realizar el bombeo. Si esta enfermedad no se controla, genera la insuficiencia
cardaca, incapacidad del corazn para llenarse o contraerse de forma adecuada; afectando
la generacin de un gasto cardaco suficiente para satisfacer las demandas metablicas del
organismo, generando isquemia. En la Figura 19.2 se observan algunas alteraciones del
corazn durante la enfermedad.
El tratamiento tradicional de estas patologas consiste en ralentizar y controlar su progreso
mediante frmacos, pero no se puede prevenir o revertir el dao posterior del tejido
cardiaco ya que se ha comprobado que el corazn tiene una mnima capacidad para
regenerarse, 1 % por ao a la edad de 25 aos, lo cual decrece con la edad; y en caso de
insuficiencia cardiaca o cardiopata severa se requiere un trasplante, lo cual resulta limitado
debido a la escasez de donadores.
155
Lo anterior demuestra la necesidad primordial del desarrollo de nuevos y mejores

tratamientos que reparen y regeneren el tejido cardiaco. Uno de ellos es la inyeccin de
clulas troncales directamente al rea daada con el fin de restaurar la funcin cardiaca del
tejido infartado. Esta es una terapia ineficiente, pues se ha comprobado que el 95 % de las
clulas mueren, ya sea en el torrente sanguneo, por hipoxia o porque no se integran al
tejido nativo. Otra opcin es la terapia gnica con el fin de mejorar el potencial
regenerativo, por ejemplo induciendo la reentrada al ciclo celular o mediante la proteccin
de la apoptosis. Tiene como desventajas la formacin de tumores y que las clulas tratadas
no desarrollan la fuerza contrctil necesaria.
La regeneracin del miocardio inici mediante el cultivo de mioblastos de msculo
esqueltico ya que son fciles de obtener, su alta disponibilidad y que son clulas
contrctiles. Se encontr que su beneficio est limitado en zonas de infarto de corazones de
roedores y caninos. No se comprob unin entre cardiomiocitos y mioblastos en
regeneracin.
El msculo esqueltico es el primero utilizado en estudios clnicos. Se logra la generacin
de mioblastos diferenciados, pero sin acoplamiento electromecnico con el tejido cardiaco
adyacente.
Y finalmente otra opcin para los pacientes con cardiopatas, es la implantacin de tejido
cardiaco cultivado in vitro mediante la ingeniera de tejidos; que busca restaurar, mantener
o mejorar las funciones de los tejidos u rganos; mediante el trasplante de tejidos
cultivados in vitro en condiciones controladas que imitan el crecimiento dentro del
156
organismo. Por lo cual, para la creacin de tejido cardiaco se conjuga la seleccin de una
fuente celular, la proliferacin de las clulas in vitro, el uso de una estructura de soporte y
su correspondiente vascularizacin.
En el caso especfico del corazn, su ensamble requiere utilizar mltiples unidades
funcionales que incluyan la funcin contrctil y excitable del miocardio atrial y ventricular
adems, de una estructura que constituya al endocardio y epicardio.
Ingeniera tisular
Las unidades funcionales cardiacas creadas mediante la ingeniera de tejidos deben
conservar las caractersticas nativas de los cardiomiocitos, y adicionalmente, las estructuras
sobre las cuales crecen las clulas deben presentar caractersticas especiales:
1. La fuente celular debe ser autloga o no inmunognica. Una de las ms
prometedoras fuentes celulares son las clulas troncales embrionarias y adultas por
su capacidad de diferenciarse en cualquier tipo celular as como propagarse
infinitamente. Aunque por otro lado su naturaleza alognica en el caso de las clulas
embrionarias representa un problema, adems las clulas troncales generalmente
forman tumores y existe una baja eficiencia de diferenciacin.
2. Los cardiomiocitos se deben integrar y contraer in vivo.
3. Resulta esencial que los cardiomiocitos sean sensibles a la isquemia, por lo cual la
superficie en donde crecen, debe permitir la difusin sin obstculos de los nutrientes
y del O2.
4. El tejido implantado debe contar con capilares as como inducir la formacin de
capilares in vitro.
5. El material del andamio no debe inducir una respuesta inmune en el organismo ni
liberar productos txicos.
6. El cultivo en 3D requiere una estructura con una alta flexibilidad, extensibilidad,
estabilidad mecnica y duracin, la cual debe permitir la transmisin de cargas as
como la propagacin del potencial de accin.
Caractersticas de las fibras cardiacas:
Proliferacin escasa
Extremadamente sensibles a la hipoxia.
157
Poseen un dimetro de 25 mm y 100 mm de longitud.
Ncleos grandes y abundantes mitocondrias.
Los discos intercalares son sitios de adhesin celular.
Cuentan con depsitos de glucgeno
Caractersticas de la MEC cardiaca:

La MEC es una red compleja que rodea y sostiene al tejido conjuntivo y est formada por:
Fibras elsticas y colgenas
Proteoglicanos (p. ej., agrecano y sindecano)
Glucoprotenas adhesivas (como fibronectina o laminina)
Glucosaminoglicanos (por ej., dermatn sulfato, queratn sulfato o cido

hialurnico).
La MEC del corazn contiene aproximadamente 75-90% de colgeno (60-85% Tipo I y 1540% Tipo III) y 25% de elastina.
Cumple con diversas funciones como son:
Soporte mecnico y estructural
Fuerza tensora
Fija tejidos mediante molculas de adhesin
Provee vas para migracin
Fija y retiene factores de crecimiento que modulan la proliferacin celular
An persisten ciertos problemas en las construcciones de los tejidos desarrollados; pues an

no se tiene claro que fuente celular es la ideal para obtener tejido cardiaco; adicionalmente,
las funciones contrctiles y las fuerzas desarrolladas activamente en los tejidos construidos
son dbiles o no detectables, y al usar andamios la diferenciacin de las clulas no conduce
a un fenotipo adulto.
Respecto a la fuente celular, se considera un reto poder aislar cardiomiocitos, ya que estn
diferenciados y no proliferan en cultivo.
Adems, las tcnicas para el aislamiento de los cardiomiocitos han sido difciles de
establecer porque estas clulas estn firmemente conectadas una a la otra por discos
intercalares y por la matriz extracelular; por lo tanto esas conexiones son difciles de
separar sin daar a las clulas.
El xito de los experimentos de los cardiomiocitos depende de:
158
a) Nmero de clulas aisladas del corazn.

b) Su purificacin con respecto a otras clulas cardiacas.
c) Su habilidad para mantener sus principales caractersticas durante un razonable
tiempo.
Por lo cual es de relevancia clnica obtener cardiomiocitos de una fuente celular que
proporcione las suficientes clulas que conserven sus caractersticas morfolgicas y
fisiolgicas.
Cultivos 2D
Los cultivos 2D o tambin llamados cultivos en monocapa, permiten establecer
rpidamente los efectos biolgicos de diversas sustancias sobre las clulas. Pero entre sus
desventajas se encuentran que no hay gran compatibilidad en los resultados obtenidos
mediante cultivos 2D y los obtenidos en estudios directamente sobre animales, no pueden
reproducir lo que sucede en los cultivos 3D y an ms importante, en los tejidos y tienen
menor poder productivo que los cultivos 3D y son ms susceptibles a los efectos de
frmacos.
Cultivos 3D
Para el cultivo 3D de cardiomiocitos se han utilizado diferentes estrategias:
a) Cultivar a los cardiomiocitos en matrices prefabricadas (gelatina, alginato,
colgeno, cido gliclico, polietilenglicol, entre otros). Esta estrategia de cultivo
tiene como principales ventajas que puede construirse la matriz al menos en teora,
en cualquier forma posible y tamao, sus propiedades qumicas son definidas y se
puede controlar la integracin y liberacin de compuestos bioactivos. Hay sido
utilizado con xito en tejidos como cartlago, hueso, vlvulas artificiales, etc. Pero
para el cultivo 3D de cardiomiocitos no ha sido exitoso, pues no hay contraccin del
tejido, hay pobre morfologa tisular (no se llega al fenotipo adulto) y existen
limitaciones en el tamao de la matriz pues al aumentar el tamao de la misma no
hay una adecuada difusin de nutrientes, O2 y CO2.
b) Cultivo en matrices solubles (matriz de protenas, matrigel). Sus principales
ventajas son que los cardiomiocitos se diferencian correctamente, la geometra de la
159
matriz puede alterarse con moldes, y desarrollan una mayor fuerza contrctil
comparado con el uso de matrices prefabricadas, pero an es inferior a la fuerza
contrctil que presentan los cardiomiocitos en el corazn, adems, otra desventaja
que presenta es que la red capilar formada es insuficiente para la construccin y por
lo tanto se limita su tamao.
c) Apilar monocapas de clulas cardiacas: sus ventajas son que el tejido desarrollado
presenta funcin contrctil, se pueden apilar diferentes tipos de clulas y su
principal desventaja es que su estabilidad mecnica es mnima.
Biomateriales utilizados en ingeniera de tejido cardiaco
De manera natural ocurre el remodelado post-isqumico. Cuando ocurren procesos
isqumicos ocasionan una alteracin y con ello se reduce la proporcin de colgeno tipo I
de 80% a un 40%, mientras que en el colgeno tipo III se reduce de un 10% a un 35%.
Los principales requisitos en los biomateriales para aplicacin en ingeniera de tejido
cardiaco son:
Generar la menor respuesta inmune posible
Ser biocompatibles, biodegradables y no txicos
Favorecer la adhesin celular
Soportar la rigidez (entre 200-300 KPa) a la cual es sometida el miocardio

enfermo
Tener elasticidad para permitir la contraccin y relajacin
Favorecer la anisotropa y la integracin elctrica
Permitir la vascularizacin
Contar con una porosidad mayor al 90%
Poros homogneos con un tamao entre 100 m-150 m
Dentro de los biomateriales de origen natural ms utilizados para esta aplicacin se

encuentran:
Matrices gelatinosas
Matrices porosas de alginato
Matrices gelatinosas de alginato y polietilenglicol
Matrices de colgeno
160
Matrices de cola de fibrina
En cuanto a los biomateriales de origen sinttico se utilizan:
Compuestos de cido polilctico
Compuestos gelatinosos derivados del cido polilctico y sus ismeros
Matrices capaces de conducir impulsos elctricos compuestas de gelatina, alginato,

cido polilctico y colgeno.
Matrices de alcohol polivinlico.
Matrices de poliuretano.
Matrices de cido polihidrobutirato poligliclico.
Matrices de ismeros de caprolactona lctica
Los tipos de biomateriales ms usados son polimricos (como el PGA) o hidrogeles (como
el colgeno y el alginato). La ventaja de los andamios polimricos es su gran habilidad de
proveer soporte mecnico estable al cultivo, lo que promueve la formacin de tejido
cardiaco, mientras que los hidrogeles brindan un ambiente que estimula la formacin de
matriz extracelular del msculo cardiaco.
La Tabla 19.1 presenta algunos de los trabajos que se han realizado con diferentes
andamios generados a partir de los principales biomateriales utilizados para generar este
tejido. En la mayora de los casos la evaluacin se realiza en un periodo corto de tiempo y
en general no hay mejora en la funcin cardiaca ni generacin de vasos sanguneos.
Existen algunos andamios comerciales como: Tutopatch, hechos de pericardio de bovino y
compuestos principalmente de colgeno tipo I. Estos andamios estn disponibles en dos
formas: discoidales (de diversos dimetros) y rectangular (por ejemplo, de 20 mm de largo
y 30 mm de ancho). El grosor de ambos tipos vara de 0.1 a 0.2 mm.
Otro andamio comercial es Optimaix-3D, una esponja de colgeno biodegradable que
consiste en colgeno porcino tipo I. Tambin est disponible en forma discoidal (de
diversos dimetros) o rectangular, con grosores de 1.5 mm y 3 mm. Las dimensiones ms
grandes que manejan son de 30 X 40 X 3 mm de grosor o 3.6 cm3.
161
Clulas)cul4vadas)
y/o)4po)modelo)
en)que)se))
implant)
Volumen)de)
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Observaciones)
Referencia)
Cola)de)ratn)
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Sin)formacin)de)vasos)
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scaolds,!and!molecules!for!myocardial!3ssue!engineering.)
Clulas)madre)
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SD)
Mayor)densidad)capilar)
Kodis,)T.)et!al)(2005).!Novel!injectable!bioar3cial!3ssue!faciliates!
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1,)2,)4,)6)y)8) Clulas)madre)
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P r e s e n c i a ) d e)
m i o b r o b l a s t o s) e n) e l)
biomaterial)
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Engineering.)
Quitosano)
SD)
Mejora) la) funcin) cardiaca)

en) incremento) la) densidad)
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Boccaccini,)aldo)y)Harding,)Sian)(2010).)Myocardial!Tissue!
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Andamios)
valorados)
Periodo)de)
evaluacin)
Hidrogel)de)
colgeno) 6)semanas)
4po)I)y)III)
Matrigel)
17)minutos)
1)semana)
Ratn))
Tabla 19.1 Biomateriales utilizados para generar andamios en ingeniera de tejido cardiaco.
Se muestra el tiempo de evaluacin del andamio y los resultados obtenidos para mejorar la
funcin cardiaca.
Caracterizacin
Las diferentes tcnicas de caracterizacin se realizan con el fin de identificar propiedades
morfolgicas y funcionales especficas de la lnea celular cultivada, adems de demostrar la
ausencia de contaminacin cruzada, confirmar la especie de origen, determinar si es una la
lnea transformada e indicar si la lnea est propensa a variacin gentica, entre otras.
En el caso de los cardiomiocitos las pruebas realizadas frecuentemente son la
inmunotincin, reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR),
ensayos de viabilidad celular y pruebas electrofisiolgicas.
Dado que el corazn es uno de los rganos ms complicados estructuralmente y
funcionalmente, la ingeniera de tejidos se centra en desarrollar partes del rgano, como
tejido contrctil o vlvulas cardacas; ms que crear rganos completos, por lo cual
constituye el mayor reto de la ingeniera de tejidos.
Biorreactores en ingeniera de tejido cardiaco
Para imitar el suministro de oxgeno, que in vivo se da por la hemoglobina, el medio de
cultivo puede suplementarse con una emulsin de perfluorocarbono (PFC). Comparando
este medio con uno no suplementado (medio control), la presin parcial de oxgeno en la
162
fase acuosa fue menor en un 50%, con un valor de 28 mmHg en el suplementado y 45

mmHg en el control. Estos datos fueron medidos entre la entrada y salida del arreglo.
Los injertos ideales de tejido muscular cardiaco deben tener una distribucin uniforme y
densa de cardiomiocitos, deben contraerse en respuesta a un estmulo elctrico y una
integridad mecnica para una implantacin adecuada.
Se han utilizado andamios de cido poligliclico (PGA) para el cultivo de cardiomiocitos
en matraces agitados y biorreactores de paredes rotatorias. En ambos sistemas, las clulas
se concentran en su mayora en la regin perifrica y en menor medida en la regin central.
Es posible que ocurran contracciones espontneas en el tejido usando matraces agitados y
un impulso de propagacin debido a un impulso elctrico, pero solo en la regin perifrica.
Esto representa una desventaja importante porque solo parte del tejido desarrollado muestra
la funcin encontrada en condiciones intracorporales. Lo ideal es que la totalidad del tejido
artificial tenga las propiedades del miocardio encontradas in vivo.
Cuando el cultivo se realiza en biorreactores de paredes rotantes se mejora la transferencia
de masa pero no se generan estmulos mecnicos tpicamente encontrados en un ambiente
in vivo porque este biorreactor proporciona condiciones de bajo esfuerzo cortante.
Los sistemas de perfusin tambin permiten una mejor y mayor distribucin uniforme de
clulas mostrando contracciones espontneas de manera sincronizada despus de algunos
das del sembrado.
Para mantener una concentracin adecuada de oxgeno en el medio es necesario conocer la
velocidad de consumo de oxgeno de los cardiomiocitos. En la Tabla 19.2 se muestran
distintas velocidades de consumo a distintas concentraciones de oxgeno.
Sistema
Concentracin de oxgeno
Velocidad de consumo de oxgeno
en el medio (mol/L)
en nmol/(min*106 clulas)
Perfusin
100
2.2 0.2
Cmara celular
100
1.5 0.1
220
3.6
cerrada
Perfusin
Tabla 19.2 Tasa de consumo de oxgeno en diferentes concentraciones de oxgeno disuelto y

sistemas. En los 3 casos se usan cardiomiocitos de rata neonatal
163
Con el fin de evitar en lo posible el dao y muerte celular por las condiciones mecnicas de
operacin del biorreactor, es indispensable evaluar el esfuerzo cortante al que estn
sometidas las clulas. Se ha probado que a partir de un esfuerzo cortante mayor a 2.4
dinas/cm2, las clulas experimentan apoptosis.
Por otra parte, la estimulacin elctrica ha sido empleada para inducir contracciones
sincronizadas en constructos cardiacos y mejorar su funcin en cultivo in vitro. Los
resultados de algunos trabajos han demostrado que la estimulacin elctrica del constructo
debe ser iniciada durante un periodo de tiempo especfico del cultivo (despus de 3 das de
la cultivo). Si la estimulacin se aplica antes, se inhibe la acumulacin de protenas
cardiacas, dando pobre contractilidad y si se aplica despus, la estimulacin no tiene efecto
en las funciones de las clulas. Despus de periodos extendidos de estimulacin elctrica
con ritmos monofsicos, se observa un gradiente de pH, el cual tiene efectos significativos
en la funcin celular. Adems, debe tenerse en cuenta que altas corrientes pueden crear
subproductos dainos que afectan el crecimiento celular. En la Figura 19.3 se observa el
implante de tejido cardiaco para su validacin pre-clnica en un modelo animal.
! Realizar una prctica en laboratorio de diseccin de corazones de embriones de pollo en
donde se apliquen los temas vistos relacionados a cultivo celular y se observen al
microscopio los corazones latiendo.
164
! Realizar una tabla comparativa sobre los tipos de biomateriales utilizados como
andamios en cultivos celulares cardiacos, describiendo la metodologa utilizada y las
pruebas realizadas a los biomateriales in vitro e in vivo.
! Realizar una visita al laboratorio para observar el cultivo de clulas cardiacas en
biorreactores e identificar los parmetros controlados en el cultivo.
Bibliografa
Hecker L, Birla R. Engineering the heart piece by piece: state of the art in cardiac tissue
engineering. Regenerative Medicine. 2(2): 125-144; 2007.
Zimmermann W, Didi M, Dker S, Melnychenko I, Naito H, Eschenhagen T, et al. Heart
muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovascular
Research. 71(3): 419-429; 2006.
Smith R. Cardiac progenitor cells: In vitro and in vivo characterization. United States -Maryland: The Johns Hopkins University; 2008.
Kasper C, van Griensven M, Prtner R, Scheper T. Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology. Bioreactor Systems for Tissue Engineering. Alemania:
Springer; 2009.
165
20. Sangre artificial
Objetivo
Que el alumno conozca los avances en la generacin de sangre artificial en Mxico y en
el mundo.
Contenido
Generalidades
La sangre es un tipo especializado de tejido conectivo y es el nico tejido fluido en el
cuerpo, donde las clulas sanguneas estn suspendidas en un fluido llamado plasma. La
sangre es ms densa que el agua y aproximadamente 5 veces ms viscosa. Es ligeramente
alcalina, con un pH de 7.35 a 7.45 y su temperatura es de 38C, un poco ms alta que la
temperatura corporal. El volumen en un hombre adulto vara entre los 5 y 6 litros.
Los componentes de la sangre son:
Eritrocitos: Clulas rojas que transportan el oxgeno. Representa el 45% de la

sangre.
Leucocitos: Tambin llamadas clulas blancas cuya funcin es proteger al

cuerpo.
Plaquetas: Fragmentos celulares que detienen el sangrado. Junto con los

leucocitos, componen menos del 1% de la sangre.
Plasma: Lquido en el que estn suspendidas las clulas. Es el 55% del total de
la sangre.
En general, los leucocitos se subdividen en granulocitos, linfocitos y monocitos, pero en la

rutina clnica se distinguen 5 tipos de leucocitos:
Granulocitos neutrfilos
Granulocitos eosinfilos
166
Granulocitos basfilos
Linfocitos
Monocitos
La sangre posee las siguientes funciones:
Transporte.
o Transporta oxgeno desde los pulmones hacia las clulas del cuerpo y
dixido de carbono desde las clulas hacia los pulmones.
o Lleva nutrientes desde el tracto gastrointestinal hacia las clulas y hormonas
desde las glndulas endocrinas hacia otras clulas.
o Transporta calor y productos de desecho metablico hacia diferentes
rganos para que sean eliminados del cuerpo (a los pulmones para la
remocin del dixido de carbono y a los riones para la eliminacin de
compuestos de nitrgeno).
Regulacin.
o Ayuda a mantener la homeostasis de todos los lquidos corporales.
o Regula el pH mediante el uso de sustancias amortiguadoras.
o Contribuye en el ajuste de la temperatura corporal a travs de las
propiedades refrigerantes y de absorcin de calor del agua presente en el
plasma sanguneo y su flujo variable a travs de la piel, donde el excedente
de calor puede perderse y se transferido al medio ambiente.
Proteccin.
Contra la prdida de sangre por medio de la coagulacin realizada por plaquetas y
protenas del plasma; y contra las enfermedades por medio de los glbulos blancos
fagocticos y los anticuerpos).
Formacin de clulas sanguneas:

La formacin de clulas sanguneas es conocida como hematopoyesis o hemopoyesis,
proceso que ocurre en la mdula sea. Los eritrocitos se originan especficamente en la
mdula sea roja, que est compuesta en su mayora de tejido conectivo que recubre
capilares llamados sinusoides sanguneos. En esta red se encuentran las clulas inmaduras,
macrfagos, clulas de grasa y clulas reticulares (aqullas que secretan a las fibras).
167
Cuando maduran, migran a travs de las finas paredes de los sinusoides para entrar al
torrente sanguneo.
Aunque los diversos elementos formados en la mdula tienen funciones diferentes, son
similares en su origen. Todos surgen del mismo tipo de clulas troncales, las clulas
troncales hematopoyticas pluripotentes o hemocitoblastos, que residen en la mdula sea
roja. No obstante, sus rutas de maduracin difieren, y una vez que la clula se transforma
en una lnea celular sangunea, no puede cambiar.
La produccin de eritrocitos, la eritropoyesis, comienza cuando una clula troncal mieloide
(descendiente de un hemocitoblasto) se transforma en un proeritroblasto, el cual a su vez da
origen un eritroblasto previo que produce ribosomas. Se sintetiza la hemoglobina y se
acumula el hierro mientras que el eritroblasto final se transforma en un normoblasto.
Cuando el normoblasto ha acumulado casi toda su hemoglobina, expulsa la mayora de sus
organelos, su ncleo se degenera y da lugar al reticulocito. ste, entra al torrente sanguneo
para comenzar con el transporte de oxgeno y se convierte en el eritrocito maduro alrededor
de dos das despus de su liberacin.
El plasma sanguneo est constituido por un 90% de agua, el resto son 100 diferentes
solutos disueltos, como protenas, iones, nutrientes, hormonas, gases y desperdicios de la
actividad celular. Una de las protenas plasmticas ms importante es la albmina que,
adems de actuar como amortiguador en la sangre, transporta molculas a travs de la
circulacin.
La regulacin de la eritropoyesis es trascendental para mantener el balance en el nmero de
eritrocitos en la sangre, ya que un exceso de stos provoca que la sangre aumente su
viscosidad y una escasez conduce al tejido a la hipoxia (privacin de oxgeno).
Para asegurar que el nmero de eritrocitos en la sangre permanezca en el intervalo de
homeostasis, el proceso de la eritropoyesis se controla de forma hormonal y depende de un
correcto suministro de hierro, aminocidos y ciertas vitaminas B.
El estmulo directo para la produccin de eritrocitos es por la eritropoyetina (EPO),
hormona excretada por el hgado pero principalmente por los riones. Cuando algunas
clulas del rin se vuelven hipxicas, aceleran la liberacin de eritropoyetina.
Si bien la sangre es un rgano sencillo de sustituir, conlleva algunas dificultades, tales
como:
168
Efectos adversos a la transfusin de sangre y sus componentes.
Necesidad de su conservacin
Escasa vida media
Necesidad de realizar tipificacin del grupo sanguneo
Debido a todo lo anterior, la posibilidad de generar sangre artificial o de tener fuentes

alternas de sangre es de suma importancia. Algunos grupos se han enfocado en la obtencin
de sangre del cordn umbilical para diferentes aplicaciones teraputicas o la generacin de
sustitutos artificiales como se describen a continuacin.
Sangre del cordn umbilical
La recoleccin de la sangre del cordn es una oportunidad que se presenta slo una vez en
la vida, al momento del nacimiento del beb. Estas clulas genticamente nicas,
actualmente son utilizadas para tratar ms de 75 enfermedades, entre las que se encuentran
las cardiovasculares, las arteriopatas perifricas, enfermedades neurolgicas degenerativas,
diabetes mellitus, enfermedades y lesiones seas y lesiones de la crnea, siendo una
alternativa superior a los trasplantes de mdula sea, sin mencionar su futuro potencial en
terapia celular para regenerar nuevos vasos sanguneos y tejido cerebral. La recoleccin es
un procedimiento simple y seguro, sin riesgo alguno para la mam o el beb.
Los Bancos de Sangre de Cordn Umbilical empezaron a surgir en Mxico a partir del
2001 y se rigieron por la Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA2 para la disposicin de
sangre humana y sus componentes con fines teraputicos. A partir del 2003 se incluye en el
proyecto del NOM los requisitos bsicos para el manejo de clulas troncales que procedan
del cordn umbilical, basndose en los estndares internacionales y en la normatividad
mexicana. Se iniciaron verificaciones tcnicas a los BSCU con el objeto de unificar los
criterios de validacin de las unidades y sobre todo la seguridad transfusional.
La NOM-003-SSA2 es una norma que tiene por objeto uniformar las actividades, criterios,
estrategias y tcnicas operativas del sistema nacional de salud, en relacin con la
disposicin de sangre humana y sus componentes con fines teraputicos, esta norma oficial
mexicana es de observancia obligatoria para todos los establecimientos para la atencin
mdica y, en su caso, para las unidades administrativas de los sectores pblico, social y
privado del pas.
169
Fundacin para la Acreditacin de Terapia Celular

La Fundacin para la Acreditacin de Terapia Celular (FACT) fue formada en 1996 por
investigadores clnicos y laboratorios activos en el campo de terapia con clulas
progenitoras hematopoyticas, hematopoietic progenitor cell (HCP) therapy, para
promover y establecer la calidad de atencin al paciente a travs de un proceso de
acreditacin que evala los aspectos clnicos y de laboratorio. El progreso continuo en este
campo en rpida evolucin y los principales avances teraputicos han hecho que se funden
organizaciones importantes en el rea: La Sociedad Internacional de Hematoterapia y de
ingeniera del injerto (ISHAGE), y la Sociedad americana para trasplante de sangre y
mdula sea American Society for Blood and Marrow Transplantation (ASMBT).
El FACT, junto con el Comit Conjunto de Acreditacin Joint Accreditation Committee
(JACIE), que fue establecido en 1999, adopt estndares del FACT para as poder regir ms
pases a cargo del JACIE, como Austria, Blgica, Dinamarca, Finlandia, Francia, Alemania,
Italia. Holanda, Noruega, Espaa, Suecia, Suiza y el Reino Unido para poder llevar a cabo
el proceso de recoleccin de sangre de cordn umbilical para la obtencin de clulas
troncales y as, poder realizar terapias celulares.
En Mxico, no existe una ley o legislacin en donde indique el uso de clulas troncales,
terapia gnica en pacientes para tratamiento a alguna enfermedad, pero en el pas, existen
dos instituciones que cuentan con banco de sangre de cordn umbilical que se alinean con
los estndares de FACT y NetCord, que son el Centro Nacional de la Transfusin
Sangunea (CNTS) y el Centro Mdico La Raza del Instituto Mexicano del Seguro Social
(IMSS), siendo el primero el que recibe donacin altruista de cordn umbilical para la
obtencin de clulas troncales. Estas clulas se utilizan en el tratamiento de leucemia en
nios menores de 8 aos.
Avances en investigacin
Cientficos mexicanos del Centro Mdico Nacional Siglo XXI lograron transportar
artificialmente por el torrente sanguneo la molcula de la hemoglobina usando almidn
como transportador, que condujo el oxgeno por el sistema cardiovascular, logrando as
sustituir los glbulos rojos de la sangre. Los cientficos lograron crear sangre artificial
derivada bsicamente de dos materiales: La hemoglobina (extrada de los glbulos rojos de
170
sangre) y el almidn (producto que puede permanecer sin problemas en las arterias) que
procede de la papa y del maz. La unin de la hemoglobina al almidn, hace que sta
permanezca dentro de las arterias y no se filtre inmediatamente por el rin debido a su
pequeo tamao, por eso la naturaleza la coloc dentro de los glbulos rojos para evitar
que se escape. A falta de stos los cientficos mexicanos descubrieron que la hemoglobina
puede ser transportada artificialmente a travs del almidn. Despus de separar la
hemoglobina de los glbulos rojos fragmentados se mantiene a bajas temperaturas, una vez
obtenida se une qumicamente a su transportador (el almidn) para introducirla a las
venas como se hace con una transfusin normal. Mientras que en el proceso de transfusin
sangunea se requiere de una a dos horas para realizar las pruebas necesarias de grupo
sanguneo entre donador y receptor, la sangre artificial, en cambio, al carecer de glbulos
rojos (que son los que llevan en su superficie el grupo sanguneo) puede infundirse en
cualquier momento sin espera de pruebas y se puede aplicar a cualquier tipo de persona.
La transfusin sangunea es una fuente incierta de infecciones como el SIDA, la hepatitis o
la Enfermedad de Chagas, porque no se puede esterilizar. En cambio, la sangre artificial al
no tener clulas puede procesarse a travs de diferentes mtodos de purificacin que le
permite estar bajo condiciones estriles. Los cientficos mexicanos del IMSS lograron crear
sangre artificial, y las pruebas se han hecho slo en animales de laboratorio. Ahora se est
experimentando con perros, puercos y simios. De las transfusiones sanguneas realizadas en
Mxico, el 21% es rechazada por los pacientes que la reciben (1,515,199 personas). El
IMSS realiza un 43% de las transfusiones, la SSA un 26%, y los hospitales privados un
12%. Mediante el procesamiento de la sangre, los bancos obtienen cuatro componentes:
glbulos rojos, plaquetas, plasma y crioprecipitados. El anlisis de la sangre donada arroja
los siguientes resultados: 3% contaminada de VIH, 32% con hepatitis C, 19% con hepatitis
B, 4.5% con plomo. Tan slo el hospital Centro Mdico Siglo XXI necesita 250 donadores
diarios para las diez operaciones de corazn que se realizan.
Sustitutos artificiales
La sangre es uno de los rganos ms fciles y comunes de sustituir, pues es fluido y se
recupera en espacios cortos de tiempo. Existen an algunas dificultades tanto tcnicas como
sociales para realizar estos procesos. Entre estas dificultades se encuentra que se pueden
171
presentar efectos adversos a la transfusin por presencia de distintos antgenos o agentes

desconocidos. La sangre se debe de mantener en refrigeracin constante y su tiempo de
vida media es muy corta, por lo que se han presentado dificultades para tener la disposicin
de este medio. Se deben realizar varias pruebas de compatibilidad entre los sujetos, como
los tipos sanguneos y la presencia de algunos virus. Existen grupos que se reusan a recibir
sangre de otros individuos o de animales transgnicos; por lo cual se han buscado formas
de generar sustitutos a las distintas funciones de la sangre dependiendo de las necesidades
que se deban de cumplir en los distintos casos y tratamientos.
Para facilitar el estudio se dividen los sustitutos en 3 tipos: Sustitutos de eritrocitos, de
plaquetas y de plasma.
Sustitutos de plasma: Se pueden a su vez dividir en tres funciones a cumplir. La de
voumen, factores de coagulacin e inmunoglobulinas.
Comercialmente se encuentran ya algunos factores de coagulacin como factores VIII, IX,
VIIa. Y en fases ltimas de investigacin protena C, antitripsina, inhibidor de C1 y
antitrombina. La mayora de estos productos se generan en organismos transgnicos o
tambin llamados organismos genticamente modificados (OGM).
De igual manera, en OGM se generan las inmunoglobulinas y algunas protenas para
volumen como: Antitripsina, factor IX, fibringeno, albmina, antitrombina, anticuerpos
monoclonales, factor estimulador de colonias granulocticas, protena C, alfa glucosidasa,
inhibidor de la C1 esterasa. Dentro de las principales especies animales empleadas son:
carneros, cabra, vacas, conejos y cerdos.
De forma sinttica, se generan algunos polmeros que modifican la viscosidad de la sangre
y que son de accin rpida y de lento metabolismo. Segn la Organizacin Mundial de la
Salud los que se deben de utilizar son: Dextrano 70 y la poligelina. Esto para casos de
hemorragias y correcin de volumen sanguneo. Pese a esto, pueden presentar
contraindicaciones, sobre todo a nivel renal.
El Dextrano 70 es un polmero de glucosa ramificado. Su origen polisacaroso permite su
metabolizacin a largo plazo, lo que evita acumulaciones graves. La poligelina es un
polmero pequeo que debe de ser suministrado con electrolitos, el problema con ste es
que aumenta la viscosidad a tal grado que puede generar insuficienca cardiaca.
172
Sustitutos de eritrocitos: Otra funcin primordial a sustituir es el transporte de gases por el

torrente sanguneo, para ello se puede utilizar soluciones de hemoglobina pura, o bien
perfluorocarbonos.
La hemoglobina es la protena encargada dentro de los eritrocitos del transporte de los
gases, por lo que su funcin puede ser realizada de forma independiente, pero esto conlleva
a una mayor afinidad por los gases, lo que puede resultar txico adems de una corta
duracin en el sistema, de entre 2 a 4 horas antes de ser eliminado. Una medida para
contrarrestar esto es introducirlo en liposomas, los cuales disminuyen la afinidad y
prolongan su estada en el torrente sanguneo por varias horas.
Si bien otra solucin son los perfluorocarbonos, los cuales son molculas de hidrocarburos
que estn saturados de fluor, ste sustituye los hidrgenos, lo que permite una mayor
afinidad por el oxgeno pero no a niveles txicos. Otra caracterstica rescatable es que son
de pequeo tamao, lo que permite que llegue a lugares ms dificiles como porciones
distales del cuerpo o que estn obstruidas, ya sea por hematomas, trombosis o tejido
infartado. Algunas de las propiedades fsicas ms notables de los perfluorocarbonos son:
Lquidos claros.
Inodoros.
Qumica y biolgicamente inertes.
Alta solubilidad en gas.
Alta densidad.
Baja viscosidad.
Baja tensin superficial.
Radiopacos.
Fcilmente esterilizables.
Sustitutos de plaquetas: La mayora de los productos existentes en mercados son plaquetas
liofilizadas o congeladas obtenidad de muestras de sangres caducas. Otro de los
tratamientos existentes son microesferas de albminas y lpidos los cuales pueden ser
recubiertos con fibringeno o smiles, los cuales tienen accin de ligacin al acumularse.
En general, el estudio de la sangre es una de las grandes metas para la biomdica, pero es
tambin una de las que ms desarrollo est presentando a lo largo del tiempo.
173
! Realizar una visita al Centro Nacional de la Transfusin Sangunea.
Bibliografa
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http://biblio.juridicas.unam.mx/estrev/derint/cont/5/art/art5.html
http://www.celltherapysociety.org/index.php/about-us/related-organizations/fact
174
21. Piel artificial
Objetivos
Que el alumno conozca cmo est formada la piel y lo que se necesita para generarla
artificialmente.
Conocer los productos comerciales generados.
Contenido
Generalidades
La piel es el rgano ms grande del cuerpo humano, protegindolo del medio ambiente
contra fuerzas mecnicas, factores qumicos, radiaciones, cambios de temperatura y
microorganismos que pueden generar infecciones. Manifiesta signos y sntomas de
enfermedades sistmicas, previene la prdida de humedad, y protege al cuerpo de rayos
ultravioleta. Juega un papel importante en la sntesis de vitamina D, reserva de grasas,
eliminacin de desechos, equilibrio hidroelectroltico y secuestro de txicos. Adems acta
como receptora sensorial del tacto, temperatura, presin y dolor.
La piel es un rgano de vital importancia, estructura compleja y mltiples funciones. Es una
envoltura con propiedades nicas: compacta, resistente, pero a la vez elstica, sensible y
en continuo recambio.
Entre sus funciones se destacan las siguientes:
1) Barrera: Mantiene el medio interno, oponindose a las prdidas hidroproteicas.
2) Proteccin: Contra agresiones fsicas, qumicas y microbiolgicas.
3) Termorregulacin: Conserva el calor por vasoconstriccin y por la estructura
aislante de la hipodermis; y enfra por vasodilatacin y evaporacin del sudor.
175
4) Protege de los rayos ultravioletas por medio de 2 barreras: La melnica (fabricada

por los melanocitos) y la crnea (queratina) fabricada por los queratinocitos, que
impiden que los rayos ultravioletas ejerzan su accin daina sobre el ADN nuclear.
5) Percepcin mltiple: A travs de la informacin captada por millares de
terminaciones nerviosas distribuidas sobre su superficie.
6) Interviene en el metabolismo de importantes molculas, como la sntesis de
vitamina D.
7) Vigilancia inmunolgica: Por medio de las clulas de Langerhans.
8) Se la podra considerar como un rgano de expresin, por su capacidad de revelar
los estados anmicos muy diversos: vergenza (rubor), ira (enrojecimiento), temor
(palidez), ansiedad (sudor), etc.
En resumen, la piel, a travs de todas estas funciones asegura el mantenimiento de la
integridad y de la homeostasis del organismo.
La piel tiene una superficie aproximada de 2 m2, su espesor promedio es de 2 mm, su peso
representa el 30% del peso total de un adulto y sus vasos sanguneos pueden llegar a
contener 1800 ml de sangre. Es una estructura bilaminal, formada por la epidermis, la
dermis y la hipodermis (Figura 21.1).
La epidermis, que se encuentra en la superficie y es la capa ms delgada. Carece de vasos
sanguneos. Est compuesta por melanocitos, queratinocitos, y clulas Merkel que son un
tipo de receptor sensorial. Los queratinocitos sintetizan la queratina, la cual acta como
una barrera contra el agua, mientras que las clulas funcionan como una barrera contra las
infecciones. El grosor vara de 0.5 mm (en los prpados) hasta 1.5 mm en las palmas de las
manos y en las plantas de los pies.
La dermis, la capa ms gruesa e interna de la piel contiene a las glndulas sudorparas,
folculos de vello y vasos sanguneos. Se comunica con la epidermis mediante la membrana
basal. Las protenas que la conforman son laminina y colgeno IV y VII las cuales son
sintetizadas por los fibroblastos. Su grosor es de 0.6 mm en los prpados hasta 3 mm en la
espalda, palmas de las manos y en la planta de los pies.
La hipodermis es una capa rica en grasa ubicada debajo de la dermis y la separa de la
subyacente fascia muscular.
176
Alrededor del 97% de la epidermis est compuesta por queratinocitos y, dado que se
encuentran en la superficie de la piel, son uno de los tipos celulares ms fciles de obtener.
Los fibroblastos, adems de secretar los componentes de la matriz extracelular, sintetizan
factores de crecimiento que auxilian en el proceso de sanacin y de angiognesis.
Cuando la piel ha estado gravemente daada por enfermedades, accidentes, traumatismos,

cirugas extensas o quemaduras, el cuerpo no puede actuar lo suficientemente rpido para
fabricar las clulas de reemplazo necesarias, lo cual ha generado la necesidad de crear un
sustituto para la misma.
Inicialmente el cultivo de piel se realiz mediante cultivo celular a partir de explantes
celulares. Aun cuando este tipo de tcnica no permita una proliferacin epitelial suficiente,
se pudo demostrar que los cultivos celulares obtenidos eran vlidos y trasplantables a
animales. El rpido desarrollo de nuevas tcnicas hicieron posible realizar los cultivos a
partir de clulas disgregadas, establecindose diversos modelos, pero en lneas generales,
las colonias obtenidas por estos mtodos no permitan la realizacin de subcultivos
celulares por sobrecrecimiento de los fibroblastos o paradjicamente por ausencia de los
mismos.
Ahora analizaremos las quemaduras, que presentan gran incidencia y generan daos graves
a la piel, siendo una de las principales causas para generar piel artificial.
177
Quemaduras
Son una de las heridas fsicas ms complejas y doloras. El paciente experimenta dolor y
adems sufre de cicatrices tanto fsicas como emocionales. En casos extremos, las heridas
por quemaduras abarcan casi la totalidad del rea superficial del cuerpo del paciente y
podran llegar a causar la muerte. De acuerdo a la World Health Organization (WHO), las
quemaduras representan un grave problema de salud a nivel mundial, registrando 195 mil
muertes al ao, siendo as la 15va causa de muerte en nios y jvenes adultos. El 95% de
stas ocurren en pases de bajos y medianos recursos y son causadas por diferentes factores,
como exposicin a slidos o lquidos calientes, contacto
con sustancias qumicas,
descargas elctricas, explosiones, entre otros.

Las lesiones por quemadura se clasifican segn su profundidad en:
1) Primer grado o de espesor parcial superficial: Afecta nicamente la epidermis.
2) Segundo grado o de espesor parcial profundo: Daa la epidermis y las capas de la
dermis. A su vez, las quemaduras de segundo grado se dividen en superficiales, o
profundas, donde se afecta la capa ms profunda de la dermis y el folculo piloso se
encuentra daado.
3) Tercer grado o de espesor total: Afecta la epidermis, dermis y el tejido subcutneo.
Tratamientos para daos crnicos de la piel
Los tratamientos para heridas de la piel, tales como lceras crnicas o quemaduras incluyen
autoinjertos, donde se toma el remanente de piel sana del paciente; aloinjertos que consisten
en trasplantar la piel de otra persona y colocarla en el paciente; y los xenoinjertos que son
sustitutos de piel obtenidos a partir de animales para uso temporal en humanos, siendo la
piel porcina la ms empleada para el tratamiento de quemaduras.
La opcin ideal en recubrimientos en quemaduras son los autoinjertos donde se remueve
epidermis y parte de la dermis de un rea no afectada y se coloca sobre la herida. Presenta
la desventaja de crear dos cicatrices: la de la zona donadora y la injertada. Los pacientes
con quemaduras severas no cuentan con la piel sana necesaria para llevar a cabo este
procedimiento, adems puede requerir mltiples y en consecuencia, costosas intervenciones
quirrgicas. Se han utilizado desde hace casi 40 aos los autoinjertos de epidermis
cultivada in vitro compuesta de una lmina de queratinocitos para cubrir la herida. Su
178
principal desventaja es el tiempo en realizar el injerto, que vara de 3 a 4 semanas. La

desventaja de los xenoinjertos es la necrosis que se genera despus de unos das por lo que
nicamente sirve como una cubierta temporal hasta que un autoinjerto est disponible.
Adicionalmente, existe el riesgo de rechazo inmunolgico, infecciones xenognicas as
como problemas ticos y sociales.
Como una alternativa a las limitaciones de los tratamientos mencionados, la ingeniera de
tejidos ofrece la posibilidad de emplear sustitutos de piel diseados para promover la
reparacin de la herida de forma temporal o permanente al proveer una barrera ante las
infecciones y prdida de fluidos y promueven la formacin de tejido nuevo al optimizar las
condiciones para la curacin. Adicionalmente, se reduce el nmero de operaciones durante
la aplicacin y despus de la misma, lo que a su vez disminuye los riesgos mdicos, tiempo
de recuperacin y costos.
Existen numerosos sustitutos de piel comerciales que, pese a su utilidad, an muestran una
tasa de integracin mucho menor a la esperada debido a que stos no presentan
adecuadamente las propiedades biolgicas y mecnicas del tejido nativo. Por ello, la meta
principal es la produccin de un sustituto de piel universal de la mejor calidad en el tiempo
ms corto posible.
Los injertos de piel fueron desarrollados como una manera de tratamiento de
quemaduras. El problema en muchas ocasiones reside en que se requiere cubrir una extensa
parte del cuerpo, y no siempre se cuenta con la cantidad y calidad suficiente de piel para
realizar los injertos.
Ahora hablaremos de las opciones de generacin de piel artificial a partir de cultivos
celulares y del uso de biorreactores.
Cultivos de piel
Los cultivos de piel in vitro (Figura 21.2) se iniciaron a partir de la estandarizacin de la
separacin enzimtica de la epidermis y la dermis y posteriormente con el cultivo de
queratinocitos. Ms adelante, se hicieron nuevos procedimientos que permitieron avanzar
en este campo. Uno de ellos fue propuesto por Rheinwald y Green, que optimizaron el
crecimiento y la expansin de clulas epidrmicas humanas, utilizando fibroblastos de
origen murino que proporcionan principalmente factores de crecimiento a los
179
queratinocitos. Ms adelante, Bell y colaboradores crearon un sustituto dermoepidrmico

que fue evaluado en un modelo animal. Esta tcnica se transform posteriormente en el
producto Apligraf.
En la misma poca se produce Integra, el primer equivalente drmico aceptado y

comercializado en Estados Unidos a partir de 1996. La obtencin y aplicacin de este
ltimo producto gener un nuevo campo de investigacin con el objetivo de proveer una
dermis sinttica a los pacientes, eliminando la necesidad de autoinjertos. Adems,
signific un gran avance para la ingeniera de tejidos, al generar una amplia gama de
sustitutos y biopolmeros que suministran un soporte mecnico adecuado para la migracin
y proliferacin celulares. Debido a la gran variedad de sustitutos, se han propuesto
diferentes clasificaciones (Tabla 21.1).
Estructura
Tipo de biomaterial
anatmica
Tiempo del
Fuente del sustituto
recubrimiento
de piel
Largo plazo
Celular
Epidrmicos
Biolgico autlogo
Drmicos
Biolgico alognico Mediano plazo
Celular
o xenognico
Dermoepidrmicos
Sinttico
Corto plazo
Acelular
Tabla 21.1 Clasificacin de los sustitutos de piel
180
Sustitutos de Piel
Se encuentran disponibles comercialmente diferentes tipos de sustitutos de piel. Los
acelulares, como Biobrane, Integra y Alloderm. Los celulares alognicos como
TransCyte, Dermagraft, Apligraf y Orcel. Finalmente, los celulares autlogos como
Epicel y Epidex, usados como recubrimientos epidrmicos. Todos ellos tienen el
propsito de restaurar la funcin, mejorar la apariencia esttica, controlar la prdida de
fluidos, infecciones, contraccin y formacin de cicatrices.
Asimismo, los sustitutos pueden clasificarse segn la capa que constituyen. Los
epidrmicos estn compuestos por queratinocitos. Un ejemplo es Epicel, un sustituto
autlogo que sirve como cubierta permanente pero tiene la desventaja de ser muy frgil y
carece de resistencia a largo plazo. Los drmicos, como Dermagraft, estn constituidos
por fibroblastos integrados en una matriz. Finalmente, los sustitutos de bicapa contienen
tanto queratinocitos como fibroblastos adheridos a una matriz. Un ejemplo es Apligraf,
que tiene un grosor de hasta 0.75 mm, pero su uso se limita para el tratamiento de lceras.
Los sustitutos como Dermagraft, cultivado con fibroblastos neonatales, Transcyte y
Biobrane nicamente son adecuados para quemaduras superficiales. Adems, pese a la
extensa variedad de sustitutos de piel disponibles en el mercado, la mayora es de uso
temporal y presentan limitantes importantes al compararse con injertos de piel nativa,
como: mayor posibilidad de contaminacin microbiana, fragilidad mecnica, mayores
tiempos para sanar y costos elevados. Idealmente, los sustitutos de piel deberan estar
disponibles cuando se requieran, producir resultados cosmticos aceptables, integracin al
tejido excelente, ser permanentes, permitir una sanacin rpida, no provocar reaccin
inmunolgica y no provocar el riesgo de transmisin de enfermedades. Todo lo anterior no
ha sido logrado por ningn sustituto de piel, por lo que su desarrollo sigue siendo un reto. A
continuacin se detallan algunos de los sustitutos comerciales.
Piel artificial natural
Xenograft: Son xenoinjertos de origen porcino utilizados para cubrir heridas limpias. El
Xenograft es usado como un producto reconstituyente que consta de dermis de porcinos
homogeneizados, que son moldeados en hojas y redes. Son usados ampliamente para la
cobertura temporal de heridas limpias como sitios de quemadura de segundo grado. Su uso
181
ha sido conocido como favorable en pacientes con necrosis por intoxicacin epidrmica y
ha sido combinado con plata para evitar la infeccin de la herida. El Xenograf tiene
algunas desventajas, como que no puede obtener alimentacin sangunea dejando en la
herida una brecha, siendo esto un transmisor potencial de enfermedades. Por otro lado, los
implantes con Xenograf sufren necrosis degenerativa tisular, dado que ste pertenece a
diferentes especies, por lo tanto ocurre rechazo del tejido.
Membrana Amnitica Humana: Esta cobertura biolgica es abundante en las maternidades
y salas de partos y es barata. Se adhiere pobremente a la herida y debe ser cubierta con
apsitos oclusivos. Aunque promueve angiognesis y la densidad capilar, su uso se hace
difcil debido a su friabilidad y efectos secundarios como licuefaccin y promocin de
infecciones por crecimiento bacteriano.
Allograft: Es piel de cadver humano, aplicada como un injerto de espesor grueso, que se
ha utilizado como un mtodo temporal para cerrar heridas.
AlloDerm: Es una matriz proteica formada por alodermis o dermis del donante
criopreservada y liofilizada, destruyendo con ello la totalidad de las clulas. No incluye la
capa epidrmica o sustitutoria de la epidermis.
Apligraf: Es proporcionado como un sustituto de piel viviente (bicapa). De la misma
manera que piel humana, consta de clulas vivas y protenas estructurales.
Piel artificial sinttica
Biobrane: Es una fibra sinttica bicapa sustituto de la piel, anloga a la epidermis externa,
construida de una delgada pelcula de silicona con funciones de barrera comparables a la de
la piel, la silicona presenta pequeos poros que permite la eliminacin de desechos,
permeabilidad para antibiticos de uso tpico.
Transcyte: Est formado por 2 capas, una capa externa que es una lmina de silicona y una
capa profunda que es una malla de nylon donde se introducen fibroblastos neonatales.
Durante 3 semanas esos fibroblastos van produciendo matriz proteica y factores de
crecimiento, entonces se somete el producto a un proceso de criopreservacin con lo cual se
destruyen los fibroblastos y quedan la matriz proteica, los factores de crecimiento y la
lmina de silicona superficial.
182
Integra: Es una plantilla de regeneracin drmica, la cual consiste en colgena bovina,

condroitin-6-fosfato y una membrana de silicona. Este producto es utilizado en heridas o
defectos parcialmente profundos. Mientras la dermis del paciente se integra con el colgeno
bovino, se va formando nueva piel, y cuando es satisfactoria la regeneracin, se retira la
capa de silicn. Despus una pequea capa de injerto propio se adhiere a la dermis
regenerada.
Omiderm: Es una lmina sinttica de poliuretano que permite de forma semipermeable
intercambiar con el medio ambiente pero deteniendo el ritmo de evaporacin y la
penetracin de bacterias. A medida que crece el tejido hacia la lmina, el Omiderm
aumentar su adherencia, su elasticidad y su transparencia. Permite una aplicacin fcil,
movimientos completos de las articulaciones y facilidad para inspeccionar las heridas.
Biorreactores en la generacin de piel artificial
Se considera que los constructos ms adecuados, es decir, aquellos compuestos
conformados por clulas sembradas en un andamio, son los cultivados con clulas
autlogas, pues existe un mnimo riesgo de rechazo inmunolgico, sin embargo, la mayor
limitante es la dificultad en expandir las clulas a un nmero suficiente para su posible
aplicacin clnica, por lo cual el uso de biorreactores podra ser de gran utilidad para
controlar las condiciones ambientales y generar las condiciones fisiolgicas necesarias para
el desarrollo de la funcin celular deseada.
No se han reportado muchos trabajos relacionados al cultivo de queratinocitos en
biorreactores, sin embargo, Kalyanaraman y colaboradores (2009) produjeron un sustituto
de piel compuesto de queratinocitos adheridos a un equivalente drmico formado por una
esponja de colgena-glicosaminoglicano bovino sembrada con fibroblastos. Para ello,
cultivaron queratinocitos empleando un biorreactor controlado por computadora conocido
como Kerator, compuesto de una cmara de crecimiento, conectado a reservorios de medio
a travs de mangueras de silicn, una bomba peristltica multicanal que lleva el medio y las
clulas a la cmara de crecimiento. Los queratinocitos fueron cultivados tanto en el
biorreactor como en matraces estticos a una densidad celular inicial de 4 X 103
clulas/cm2. El equivalente drmico se elabor sembrando fibroblastos en la esponja a una
densidad de 0.5 x 106/cm2 y despus de 24 horas, se adicionaron los queratinocitos
183
obtenidos del biorreactor y de los matraces para su comparacin, obteniendo as el sustituto

biolgico de piel deseado.
Los fibroblastos de la dermis son de fcil expansin en un cultivo in vivo. Sin embargo, las
condiciones de los cultivos estticos dan como resultado una distribucin celular
heterognea, donde la mayora de las clulas se encuentran en la superficie del andamio.
Por su parte, los biorreactores de perfusin, al proveer un flujo uniforme de nutrientes tanto
al interior como al exterior de los constructos, permiten obtener distribuciones celulares
homogneas, e incrementar la proliferacin celular.
Smith y colaboradores (2004) cultivaron fibroblastos en andamios de colgeno en un
biorreactor de perfusin y en condiciones estticas como control. El sistema de perfusin se
mantuvo a 37C y en una incubadora de CO2. La oxigenacin se llev a cabo mediante un
intercambio gaseoso a travs de una manguera de silicn. El medio de cultivo era
transportado hacia la cmara con el constructo y devuelto al reservorio del medio con una
bomba peristltica. El flujo utilizado fue de 1 mL/h, equivalente a las condiciones in vivo
de la dermis. Despus de 96 horas de haber sido sembrados los fibroblastos, observaron que
aquellos cultivados en el biorreactor alcanzaron una mayor densidad celular que en el
cultivo esttico.
Pu y colaboradores (2010) cultivaron fibroblastos de la dermis sobre andamios de cido
polilctico y colgeno empleando un biorreactor de perfusin y un cultivo esttico como
control por un periodo de 4 semanas.
Observaron que en el biorreactor, las clulas continuaban proliferando hasta el da 28,
mientras que en el cultivo esttico stas alcanzaron su mximo nmero al da 14.
Asimismo, las clulas cultivadas en el biorreactor migraron de manera homognea a travs
del andamio y los poros del constructo se encontraban ocupados por la matriz extracelular
excretada, lo que increment la integridad mecnica del mismo, a diferencia del cultivo en
condiciones estticas donde la densidad celular fue menor y heterognea y con una menor
cantidad de matriz extracelular.
Sun y colaboradores (2005) emplearon un biorreactor de perfusin para cultivar
fibroblastos y queratinocitos tanto en monocultivo como cocultivo. El sistema se mantuvo
en una incubadora de CO2 a 37 C y estaba compuesto por una cmara de sembrado que
contena al constructo, un reservorio de medio, una bomba peristltica para el transporte del
184
medio a travs del sistema y un sistema de aireacin compuesto por una manguera de
silicn para permitir el intercambio gaseoso. Con el biorreactor, realizaron diferentes
tcnicas de cultivo, en condiciones sumergidas y en interfase aire-lquido, donde
determinaron que el monocultivo de fibroblastos mostraba una mayor viabilidad celular en
condiciones sumergidas, mientras que el monocultivo de queratinocitos y el cocultivo con
fibroblastos y queratinocitos mostraron una mayor viabilidad al ser sembrados en una
interfase aire-lquido.
Pese a que los sustitutos biolgicos producidos en biorreactores de perfusin presentan
claros avances en comparacin con los cultivos convencionales en condiciones estticas, es
necesario que se realicen pruebas pre-clnicas de los constructos obtenidos a partir de cocultivos con estimulacin mecnica para la evaluacin de su integracin al tejido nativo y
de la regeneracin del mismo ante una quemadura.
! Realizar una tabla comparativa sobre los diferentes productos de piel artificial que hay
en el mercado a nivel nacional e internacional.
! Realizar un anlisis sobre los diseos de biorreactores generados para la generacin del
piel artificial y las pruebas realizadas para evaluar su funcionamiento.
! Realizar lecturas y presentaciones orales sobre avances en generacin de piel artificial.
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Smith MJ, Bodamyali T, Stevens C, Howell JA, Horrocks M, Chaudhuri JB. Human
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186
Abreviaturas y smbolos de uso frecuente en este libro
El uso de abreviaturas y acrnimos se ha difundido que sera imposible presentar una lista
completa aqu. Por lo tanto, la siguiente lista es incompleta y en cierta forma, arbitraria. Sin
embargo, debe servir para que el lector identifique muchos de los trminos y smbolos
usados.
ADN
cido desoxirribonucleico
APC
Clula presentadora de antgeno
Centgrados
CSF
Factor estimulante de colonias
EGF
Factor de crecimiento epidrmico
EDTA
cido etilenediaminotetraactivo
FDA
Administracin de drogas y alimentos
FGF
Factor de crecimiento de fibroblastos
Gramo(s)
Unidad de fuerza de gravedad
GMP
Buenas prcticas de fabricacin
Hora
HLA
Antgeno leucocitario humano
ICAM
Molcula de adhesin intercelular
IGF-1
Factor de crecimiento parecido a la insulina 1
Micro; 10-6
Metro; tambin mili-, 10-3
Molaridad (mol/L); tambin mega-, 106
MEC
Matriz extracelular
MHC
Complejo principal de histocompatibilidad

187
Nano-, 10-9
PDGF
Factor de crecimiento derivado de las plaquetas
PGA
cido poligliclico
PLA
cido polilctico
PLGA
cido polilctico-poligliclico
PVC
Policloruro de vinilo
TGF-
Factor de crecimiento transformante
VEGF
Factor de crecimiento del endotelio vascular
188
Glosario
cido desoxirribonucleico: Polmeros compuestos de 4 unidades moleculares diferentes,

denominadas desoxirribonucletidos (abreviados A, G, C y T), que contienen el azcar
desoxirribosa. Los genes son parte de las molculas de ADN y su codificacin viene dada
por la secuencia de los desoxirribonucletidos.
cido hialurnico: Constituido por unidades disacardicas que se repiten, cada una de ellas
contiene D-glucosamina o D-galactosamina. Tiene una elevada viscosidad, lo que favorece
una hidratacin masiva. En el tejido conjuntivo es el principal componente.
Adaptacin: Induccin o represin de la sntesis de una macromolcula (generalmente una
protena) en respuesta a un estmulo.
Adhesiones focales: Estructuras adhesivas caractersticas de las clulas en cultivo que se
pegan a la superficie de una caja de cyultivo. La membrana plasmtica en la regin de la
adhesin focal contiene agrupaciones de integrinas que conectan la matriz extracelular que
cubre la caja de cultivo con el sistema de microfilamentos que posee actina del
citoesqueleto.
Agar: Obtenido de la pared celular de varias especies de algas, es una mezcla heterognea
de dos clases de polisacridos: agaropectina y agarosa. Disuelto en agua caliente y enfriado
se vuelve gelatinoso.
Albmina: Protena globular soluble en agua, muy abundante en el plasma de mamferos y
aves y en los tejidos de reserva, como los huevos de las aves.
Alcuota: Muestra que se toma de un volumen inicial, cuyas propiedades fsicas y
qumicas, as como su composicin, representan las de la sustancia original.
Aloinjerto: Injerto derivado de un donante genticamente diferente de la misma especie
que el receptor.
Amortiguador: Solucin que puede interaccionar con el hidrgeno libre o los iones
hidroxilo y minimizar el cambio del pH.
189
Andamio: Estructura hecha de biomaterial natural o sinttico, la cual da forma y soporte

mecnico para la regeneracin de un tejido a partir de clulas.
Aneuploida: Dotacin cromosmica no mltiplo exacto de la haploide.
Apoptosis: Muerte celular programada que comprende la fragmentacin del ADN nuclear.
Asptico: Libre de infeccin microbiana
Autcrino: Respuesta mediada por receptor de una clula a un factor producido por la
misma clula.
Autoinjerto: Injerto de un individuo trasplantado de nuevo a la misma persona.
Biocompatible: Que no es txico ni genera dao y no causa rechazo inmunolgico.
Biorreactor: Recipiente de cultivo para la produccin a gran escala de clulas, ancladas a
un sustrato o propagadas en suspensin.
Cadherina: Protena que media la adhesin celular dependiente de calcio.
Cariotipo: Cantidad y caractersticas del juego completo de cromosomas de un organismo.
Clula eucariota: Clula caracterizada por una estructura interna basada en organelos
como el ncleo.
Clula germinal: Clula que tienen la capacidad de originar gametos, por ejemplo,
espermatoocito y oocito.
Clula troncal: Clulas situada en diferentes tejidos del organismo que constituyen una
poblacin de reserva capaz de dar lugar a diferentes clulas en ese tejido. Son clulas
indiferenciadas, capaces de autorrenovarse (producir clulas semejantes) y diferenciarse
(produciendo 2 o ms tipos celulares).
Clula troncal embrionaria: Clula que tiene la capacidad casi ilimitada de
diferenciacin, lo cual indica un estadio temprano de desarrollo embrionario. Corresponde
a los blastocistos de los mamferos.
Clula somtica: Las clulas del cuerpo, con excepcin de las clulas germinales.
Celulosa: Polmero de glucosa no ramificada con enlaces (1-4) que tienden a agregarse en
una formacin semejante a cables; sirve como el elemento estructural principal de las
paredes celulares de los vegetales.
Cepa celular: Lnea celular caracterizada, obtenida por seleccin o clonacin.
Ciclo celular: Secuencia de acontecimientos por los que una clula duplica su dotacin
cromosmica completa y se divide en 2 clulas semejantes, con el mismo material gentico.
190
Citoesqueleto: Red estructural de organizacin interna que presentan las clulas

eucariticas y que se encuentra implicada en el transporte interno, en la motilidad y en la
morfologa celular. Consta de 3 tipos diferentes de componentes: microfilamentos,
filamentos intermedios y microtbulos.
Citosol: Regin de contenido lquido del citoplasma fuera de los organelos membranosos.
Clon: Poblacin de organismos, clulas, virus o molculas de ADN derivados de la
replicacin de un nico progenitor gentico.
Clonacin: Procedimiento que permite la obtencin de un clon.
Colgena: Familia de glucoprotenas fibrosas conocidas por su gran fuerza de tensin.
Constituyen las protenas ms abundante del cuerpo humano, forman parte de la matriz
extracelular del tejido conjuntivo y el mineral. Tienen una estructura helicoidal.
Complejo principal de histocompatibilidad: Familia de genes que intervienen en la
mediacin de las respuestas inmunes de linfocitos T.
Confluencia: Monocapa de clulas en las que todas ellas estn en contacto con otras
clulas de todo su periferia y no hay sustrato disponible sin clulas.
Constructo: Crecimiento de clulas sobre un biomaterial que sirve como soporte.
Cromosomas: Estructuras presentes en el ncleo celular, que contienen una doble hlice de
ADN lineal muy condensada, asociada a protenas.
Cultivo celular: Tcnica usada para crecer clulas disociadas fuera del organismo.
Cultivo clonal: Tipo de cultivo primario en el cual relativamente pocas clulas se agregan
a la caja de cultivo, cada una de las cuales, despus de colocarse y unirse a la superficie, se
asla de sus clulas prximas. La proliferacin de las clulas genera colonias individuales, o
clonas, de clulas cuyos miembros derivan de la misma clula original.
Cultivo primario: Cultivo de clulas obtenido directamente del organismo.
Cultivo en suspensin: Cultivo en el que las clulas se multiplican suspendidas en un
medio de crecimiento.
Diferenciacin: Conjunto de procesos por los que las clulas precursoras adquieren
caractersticas fenotpicas y funcionales propias y especializadas, y que suele producirse
como consecuencia de cambios cualitativos y cuantitativos en la expresin gnica.
Difusin: Proceso espontneo en el que una sustancia se mueve de un rea de alta
concentracin a una de baja, hasta alcanzar la misma concentracin en todas las reas.
191
Diploide: Hace referencia a una clula o un organismo que contiene 2 juegos completos de
cromosomas homlogos.
Densidad celular: Nmero de clulas por cm2 de sustrato.
Desmosomas: Uniones adhesivas con forma de disco que contienen caderinas y se
encuentran en varios tejidos, sobre todo los epitelios. Las placas citoplsmicas densas en la
superficie interna de las membranas plasmticas en esta regin sirven como sitios de
fijacin para filamentos intermedios que se extienden hacia el citoplasma.
Endcrino: Factores de sealizacin, como las hormonas, liberados por un tejido y que
tienen un efecto en un tejido distante, al cual llegan a travs de la circulacin sistmica.
Endotelio: Capa de clulas parecidas a epitelio que revisten los espacios dentro de los
tejidos derivados del mesodermo, como los vasos sanguneos.
Epitelio: Tejido de revestimiento monoestratificado o pluriestratificado que recubre
superficies internas o externas y constituyen las glndulas de secrecin endocrinas y
exocrinas.
Eptopo: Regin de unin de un antgeno con el anticuerpo. Tambin llamado
determinante antignico. La mayora de los eptopos sobre la superficie de una estructura
proteica estn formados por 8 a 15 aminocidos.
Esfuerzo cortante: Fuerza aplicada por unidad de rea necesaria para mantener el fluido a
una velocidad constante.
Especies reactivas de oxgeno: Sustancias altamente reactivas que contienen oxgeno,
como el perxido, superxido y radical hidroxilo, formadas en el metabolismo celular
aerobio.
Estroma: Parte de un tejido con funcin puramente de soporte, por ejemplo, tejido
conectivo.
Euploida: Dotacin cromosmica mltiplo exacto de la haploide.
Explante: Fragmento de tejido trasplantado de su sitio original y mantenido en un medio
artificial.
Factor de crecimiento: Molcula de sealizacin intercelular, normalmente de naturaleza
proteica, que proporciona un estmulo mitgeno a las clulas diana para impulsar la
progresin a travs del ciclo celular y la entrada en mitosis. Los factores de crecimiento son
192
imprescindibles para la proliferacin de las clulas eucariticas, ya que en su ausencia stas

permanecen quiescentes.
Fase S: Etapa del ciclo celular eucaritico en la cual se produce la sntesis de ADN.
Fenotipo: Caractersticas observables de una clula o un organismo que son el resultado de
la expresin del genotipo celular.
Fibras de estrs: Estructuras formadas por la activacin de la GTPasa RhoA, que constan
de filamentos contrctiles de actomiosina, lo que permite la retraccin del polo posterior de
una clula en movimiento.
Fibroblastos: Tipo celular del tejido conjuntivo que secreta protenas, como el colgeno.
Fibronectina: Protena de adhesin de la matriz extracelular. Su funcin es anclar clulas
al colgeno.
Filamentos intermedios: Fibras fuertes del citoesqueleto de unos 10 nm de dimetro, que
segn sea el tipo celular, pueden componerse de una variedad de subunidades de protenas
capaces de ensamblarse en tipos similares de filamentos. Proveen estabilidad mecnica y
tienen funciones especficas de tejido. Un ejemplo es la citoqueratina.
Flujo laminar: Flujo de un fluido que sigue la forma de una superficie aerodinmica sin
turbulencias; dicho de campanas caracterizadas por un flujo estable de aire sobre el rea de
trabajo con el fin de minimizar la turbulencia y mantener la esterilidad.
Gap junctions:
Tambin llamadas uniones comunicantes, son sitios entre las clulas
animales especializados en la comunicacin intercelular. Las membranas plasmticas de las

clulas adyacentes tienen un espacio de unos 3 nm entre s y las uniones permiten que
existan comunicaciones, as como el paso de pequeas molculas.
Gelatina: Es un coloide gel (es decir, una mezcla semislida a temperatura ambiente),
incolora, translcida, quebradiza e inspida, que se obtiene a partir del colgeno procedente
del tejido conectivo de animales hervidos con agua. Tambin existe una gelatina vegetal
conocida como agar.
Gelfoam: Polvo estril comercial obtenido a partir de gelatina de piel de cerdo purificada,
para aplicacin en superficies sangrantes como hemosttico. Es insoluble en agua, de color
blanquecino, no elstico, poroso y flexible.
Genotipo: composicin gentica de una clula o un organismo.
Gliclisis: Ruta metablica de transformacin de la glucosa en cido pirvico
193
HEPA: Filtro de aire de alta eficiencia que evitan la propagacin de bacterias y virus a
travs del aire. Los sistemas de filtrado HEPA con fines mdicos suelen incorporar luz
ultravioleta, llegando a tener una eficiencia del 99.995%.
HEPES: Compuesto amortiguador que se utiliza ampliamente en muchas reacciones
bioqumicas y en algunos medios de cultivo celular.
Inhibicin por contacto: Inhibicin de movilidad celular y de formacin de ruffles de
membrana, cuando las clulas estn en contacto con clulas adyacentes, como en un cultivo
confluente.
Inmortalizacin: Adquisicin de una capacidad de divisin celular infinita. Puede ser
inducida en lneas celulares finitas por transfeccin con telomerasa, oncogenes, o por la
infeccin con SV40 o virus de Epstein-Barr. No necesariamente es una transformacin
maligna, aunque puede ser un componente de ella .
Inmunidad natural: Tambin llamada innata, es aquella de la que dependen las fases ms
tempranas de la respuesta inmunitaria frente a la enfermedad. Est presente en todo
momento y en todos los seres vivos, es inespecfica, no guarda memoria y reconoce
componentes microbianos comunes a varios grupos
Inmunidad especfica: Tambin llamada adaptativa, es la ejercida por los linfocitos T y B
de manera especfica de antgeno. Requiere una fase de latencia, mejora con exposiciones
sucesivas al antgeno, es muy eficaz, guarda memoria y funciona de manera coordinada con
el sistema inmunitario natural.
Integrina: Protena perteneciente al grupo ms importante de molculas de adhesin. Son
heterodmeros , con un dominio extracelular grande, responsable del establecimiento de
interacciones especficas, y un nico fragmento transmembrana que puede participar en
procesos de comunicacin intercelular.
In vitro: Literalmente, en vidrio. Se utiliza para referirse a que algo est realizndose
fuera del husped, como cultivos de clulas o de rganos; tambin se utiliza para indicar
reacciones bioqumicas y moleculares llevadas a cabo en un tubo de ensaye.
Laminina: Glicoprotena ms abundante de la lmina basal, formada por 3 polipptidos
que se unen entre ellos a travs de puentes disulfuro. Su ubicacin le permite participar en
la unin de las clulas epiteliales a la lmina basal.
194
Lamellipodio: Extremo gua de un fibroblasto en movimiento, el cual se extiende como una

proyeccin aplanada y amplia de la clula, que repta sobre el sustrato.
Lnea celular: Clon celular bien definido que puede perpetuarse en cultivo, durante
muchas generaciones e incluso, indefinidamente. Se obtiene despus del primer subcultivo.
Linfa: Lquido que llena los vasos linfticos.
Matrigel: Preparacin de membrana basal reconstituida que se extrae de una lnea celular
de sarcoma de ratn, rico en matriz extracelular. Esta constituido de aproximadamente 60%
de laminina, 30% de colgeno IV y entactina 8%. Tambin contiene heparn sulfato,
metaloproteasas, TGF-, EGF, IGF, FGF y otros factores de crecimiento.
Matriz extracelular: Macromolculas secretadas por clulas en su ambiente inmediato que
forman una regin de material no celular en el intersticio entre las clulas. La adhesin y
migracin celular y la formacin de tubos epiteliales dependen de la capacidad de las
clulas para formar uniones a la matriz extracelular.
Mesnquima: Tejido embrionario con capacidad migratoria, que da lugar en el adulto al
tejido conectivo, cartlago , msculo, clulas hematopoyticas, etc.
Micoplasma: Bacterias de gran inters evolutivo debido a la sencillez de su estructura
celular y a su tamao que oscila entre 0.2 y 2 m. Estn delimitadas solamente por una
membrana celular flexible resistente a la lisis osmtica. Carecen de pared celular y gracias
a ello pueden pasar fcilmente por filtros bacteriolgicos. El nombre micoplasma se deriva
de la propiedad de producir formas filamentosas, con aspecto de hongo.
Microfilamentos: Estructuras citoesquelticas de 8 nm de grosor, compuestas por un
polmero de doble hlice de actina. Juegan un papel clave en todos los tipos de
contractilidad y motilidad dentro de la clula.
Microtbulos: Estructuras proteicas cilndricas de 25 nm de dimetro, cuya pared se
compone de tubulina. Debido a su rigidez, actan a menudo en la capacidad de andamiaje.
Contribuyen a formar el citoesqueleto de la clula.
Mitosis: Mecanismo por el cual una clula sufre divisin nuclear para producir 2 clulas
hijas idnticas con complementos cromosmicos iguales.
Osmolaridad: Concentracin de partculas osmticamente activas en una solucin acuosa ,
expresada en osmoles/L.
195
Parcrino: Efecto de una clula sobre otra adyacente, mediada por un factor soluble, sin la
participacin de circulacin sistmica.
Parnquima: Parte de un tejido que lleva a cabo la funcin principal del mismo, por
ejemplo, los hepatocitos en el hgado; a diferencia del estroma, que proporciona tejido de
soporte.
Pase: Transferencia o subcultivo de clulas de un recipiente de cultivo a otro; por lo
general, implica la subdivisin de una poblacin de clulas en proliferacin, lo que permite
la propagacin de una lnea celular o cepa de clulas.
pH: Medida estndar de la acidez relativa, que en trminos matemticos es igual a log[H+]
Plasma: Fraccin lquida y acelular de la sangre. Se obtiene al dejar a la sangre desprovista
de eritrocitos y leucocitos. Est compuesto por un 90% de agua, un 7% de protenas y el
3% restante por grasa, glucosa, vitaminas, hormonas, O2, CO2 y nitrgeno, adems de
productos de desecho del metabolismo. Es el componente mayoritario de la sangre,
representando aproximadamente el 55% del volumen sanguneo total.
Ploida: Relacin de nmero de cromosomas de un tipo dado de clula a la que se
encuentra en las clulas somticas normales in vivo.
Poli-D-lisina: Poliaminocido que facilita la unin de las clulas a superficies slidas en
aplicaciones biolgicas, particularmente cuando se cultivan libres de suero. Mejora la
interaccin electrosttica entre los iones cargados negativamente de la membrana celular y
los iones cargados positivamente de factores de unin en la superficie de cultivo.
Proteoglicano: Macromolcula multimrica compuesta de una parte mayoritaria glucdica,
de glicosaminoglicanos y una parte peptdica minoritaria.
p53: Gen o protena oncosupresora implicada, entre otras acciones, en la induccin de los
mecanismos de reparacin del ADN o de la apoptosis.
Radical libre: Especie qumica muy reactiva que contiene uno o ms electrones
desapareados en su orbital externo.
Ruffles de membrana: Formacin de una superficie celular mvil que contiene una malla
de filamentos de actina recin polimerizados.
Senescencia: Proceso por el cul las clulas somticas normales pierden su capacidad de
proliferacin, despus de un nmero determinado de divisiones.
196
Suero: Remanente del plasma sanguneo una vez consumidos los factores hemostticos por
la coagulacin de la sangre. Es de color amarillento traslcido, transporta los elementos
formes y mantiene diferentes sustancias en solucin.
Subconfluente: Menos que confluente; no todo el sustrato disponible est cubierto.
Sustrato: Matriz o base slida sobre la cual un cultivo en monocapa crece.
Telomerasa: Enzima con actividad transcriptasa inversa, encargada de la replicacin de los
telmeros.
Telmero: Extremo de un cromosoma. Cada cromosoma tiene 2 telmeros. Impiden la
recombinacin con otros cromosomas y son capaces de mantener la capacidad proliferativa
de la clula. Se acortan progresivamente en cada divisin celular, excepto en las clulas
troncales y algunas clulas tumorales, por la telomerasa.
Tetraploida: Dotacin cromosmica equivalente a 4 dotaciones haploides.
Totipotencia: Capacidad de los oocitos fecundados y de las clulas resultantes de sus
primeras divisiones de dar lugar a todos los tipos celulares especializados y diferenciados
presentes en el organismo adulto.
Transformacin: Alteracin permanente del fenotipo celular, por un cambio gentico
irreversible. Puede ser espontnea o inducida por accin qumica o viral. Por lo general
produce lneas celulares con mayor tasa de crecimiento, inmortales, con menor
requerimiento de suero y una mayor eficiencia de plaqueo.
Tripsina: Endoproteasa de origen pancretico que participa en la digestin de las protenas
a nivel intestinal.
Tritn X-100: Detergente no inico suave.
Uniones adherentes: Tipo de uniones adhesivas especializadas y comunes del epitelio. Las
membranas plasmticas en esta regin estn separadas por 20 a 35 nm y son los puntos
donde se concentran las molculas de cadherina. Las clulas se mantienen juntas por medio
de las uniones entre los dominios extracelulares de las molculas de cadherina y forman
puentes en los espacios entre las clulas contiguas.
Uniones estrechas: Contactos especializados que ocurren en el extremo ms apical de los
complejos de unin formados entre las clulas epiteliales adyacentes. Las membranas
contiguas hacen contacto en puntos intermitentes, donde las protenas integrales de las 2
membranas adyacentes estn muy prximas.
197
Va de transduccin de seales: Pasos en los que interviene una serie de distintas

protenas, a travs de los cuales se transmite la informacin desde el punto de estimulacin
en la superficie de la clula hasta su interior.
198

Tecnicas de Cultivos Celulares e Ingenieria de Tejidos

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TCNICAS DE CULTIVOS CELULARES E

Dra. Claudia Hayde Gonzlez de la Rosa.

Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Cuajimalpa

Normas de trabajo en un laboratorio de cultivos celulares

Clasificacin de los agentes biolgicos

Riesgos del trabajo con cultivos celulares

Riesgos en los procedimientos de cultivos celulares

Desinfeccin y desecho de residuos de cultivos celulares

Regulacin en cultivos celulares e ingeniera de tejidos

Experimentacin con animales

Legislacin a nivel mundial

reas de la investigacin con clulas troncales

3. Biologa de los cultivos celulares

El medio ambiente del cultivo

Proliferacin y diferenciacin celular

Iniciacin de un cultivo celular

Evolucin de los cultivos celulares

Desarrollo de lneas celulares continuas

4. Laboratorio de cultivo celular

Campanas de flujo laminar

Cmo evitar la contaminacin masiva?

Elementos del ambiente asptico

Pasos para reducir problemas de contaminacin

Factores que afectan la potencia del desinfectante

7. Recipientes de cultivo y sustratos

Materiales usados como sustrato

Superficies con matriz

Desarrollo de los medios de cultivo

Propiedades fisicoqumicas de los medios de cultivo

Soluciones salinas balanceadas

Seleccin del medio y suero

Desventajas del suero

Ventajas del medio sin suero

Desventajas del medio sin suero

Subcultivo libre de suero

Seleccin del medio libre de suero

Adaptacin al medio libre de suero

10. Cultivos primarios

Aislamiento del tejido

11. Subcultivo y lneas celulares

Edad del cultivo

Remplazo del medio

Estandarizacin de las condiciones de cultivo

12. Clonacin y seleccin

Aislamiento de las clonas

14. Introduccin a la Ingeniera de tejidos

Alcances de la ingeniera de tejidos

Tipos de tejidos del cuerpo humano

Obtencin de un tejido con fines teraputicos

Origen celular para aplicacin en ingeniera de tejidos

Anlisis del tejido

Retos en la ingeniera de tejidos

15. Aplicaciones teraputicas

reas de aplicacin de ingeniera de tejidos

Aplicaciones en el sistema msculo-esqueltico

Aplicaciones en gastroenterologa: Trasplante de clulas hepticas

Aplicaciones en el sistema renal

Opciones de tratamiento basadas en clulas

Bioingeniera de rgano completo

16. Biomateriales aplicados a la medicina

Requisitos del biomaterial para utilizarse dentro del cuerpo humano

Aplicaciones de los biomateriales en medicina

Tipos de pruebas a los biomateriales

Generacin de andamios para cultivos celulares