UNIVERSIDAD AUTNOMA DE OCCIDENTE

Facultad de Ingeniera
Departamento de Energtica y Mecnica

Laboratorio de Microbiologa
II Periodo de 2015

Laboratorio 2: Cuantificacin microbiana y Control de crecimiento microbiano

Alejandro Ordoez Julin Muoz Pedro Garca
Fecha de Entrega: 4/11/2015
RESUMEN
La prctica de laboratorio No. 2 se divide en 2 prcticas (cuantificacin microbiana y control de
crecimiento microbiano). En la prctica de cuantificacin microbiana se hace la estimacin de
poblaciones en matrices acuosas, a travs de una tcnica llamada filtracin por membrana, este mtodo
se fundamenta en el principio de exclusin por tamao, en el cual se hace pasar una muestra de agua
(preferiblemente con baja turbiedad) por un elemento filtrante conocido como membrana, la cual tiene
un tamao de poro de 0,45 micrmetros que retendr bacterias y microorganismos de mayor tamao; se
coloca el elemento filtrante sobre la superficie de un medio de cultivo selectivo que favorezca el
crecimiento de los microorganismos de inters. En la prctica de control de crecimiento microbiano se
efecta un proceso denominado INHIBICIN o destruyendo los organismos por ESTERILIZACIN.
En este proceso los agentes bactericidas eliminan las clulas pero no generar lisis celular (prdida de la
integridad celular, generalmente por rompimiento de la pared), este tipo de compuesto no se elimina
por dilucin puesto que se unen fuertemente a sus objetivos celulares. Estos agentes denominados
bacteriolticos provocan la muerte celular por lisis, que se establece por el decrecimiento en el nmero
de clulas o en la turbidez del medio de crecimiento.
Palabras claves: Cuantificacin microbiana, matrices acuosas, filtracin por membrana, control
de crecimiento microbiano, inhibicin, esterilizacin, decrecimiento y muerte celular.
INTRODUCCIN
Identificar microorganismos a simple vista es imposible para el ojo humano, y son necesarias tcnicas o
uso de herramientas especializadas como los microscopios para su identificacin, no obstante en
algunos casos es tal la cantidad de microorganismos que tiende a ser un poco difcil identificar la
cantidad de individuos (microorganismos) en una poblacin, cuando se dan casos de este tipo se llevan
a cabo la estimacin microbiana mediante tcnicas que implican la concentracin de analito, con un
volumen ya establecido con anterioridad.
Se da en algunos casos en que hay diferencia de tamaos en los microorganismos, para este tipo de
casos se aplica el principio de exclusin por tamao, en la cual se establece la muestra de agua la cual
se va a tratar en el experimento (si es posible con una baja turbiedad), mediante la utilizacin de un
elemento filtrante o membranas filtrante la cual posee gran cantidad de poros con un tamao de 0,45

Laboratorio de microbiologa 2: Cuantificacin microbiana y Control de crecimiento microbiano

micrmetros, las cuales debido a su tamao son capaces de retener tanto bacterias como
microorganismos con un tamao mayor.
METODOLOGIA
METODOLOGA CUANTIFICACIN MICROBIANA
Materiales:
Embudos de filtracin estriles.
Pinzas para membrana.
Membrana estril nitrocelulosa o equivalente con tamao de poro de 0,45 micras.
Agua de dilucin.
Medio de cultivo selectivo (Ejemplo: endo, cromocult, Colistant).
Incubadoras.
Probetas estriles en caso de requerirse.
Procedimiento:
1. Recolectar una muestra de agua de acuerdo con las indicaciones del instructor.
2. Reconocer los materiales y equipos. Rotule adecuadamente las cajas petri.
3. Colocar una membrana filtrante estril, sobre el porta filtro, usando pinzas estriles
(cuadriculada hacia arriba). Ensamblar nuevamente el embudo.
4. Homogeneizar la muestra agitndola con movimientos de arriba hacia abajo.
5. Hacer un lavado preliminar para humedecer la membrana con 20 50 mL.
6. Encender la bomba y proceder a filtrar al vaco que no se exceda una presin de 15 PSI.
7. Verter la cantidad de la muestra requerida o establecida (100 mL, 50 mL, 20 mL) en el vaso
(embudo) del filtro y filtrar con vaco.
8. Lavar el embudo con aproximadamente 50 mL de agua peptona estril al 0,1% u otro diluyente.
9. Remover el filtro, y con una pinza estril transferir la membrana a la placa de Petri que contiene
el medio de cultivo correspondiente al microorganismo que se va a identificar. La membrana se
coloca suavemente sobre la superficie del agar con el fin de evitar la formacin de burbujas.
10. Esperar 10 minutos para permitir la adhesin de la membrana al filtro.
11. Realizar un control positivo y un control negativo dependiendo del microorganismo a analizar.

METODOLOGA CONTROL DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Materiales:
Caja de petri con medio no selectivo.
Cepas de bacteria gram positiva y gram negativa.
Hisopo estril.

Laboratorio de microbiologa 2: Cuantificacin microbiana y Control de crecimiento microbiano

Papel filtro estril (crculos aprox. 1 cm dimetro).

Pinzas estriles.
Soluciones comerciales de compuestos (hipoclorito, perxido, etanol, creolina).
Incubadora.
Mechero.

Procedimiento:
1. Identificar y rotular adecuadamente cada uno de los materiales.
2. Limpiar y desinfectar su mesn de trabajo.
3. Encender el mechero y en un rea cercana a la llama, destape el hisopo estril e impregnarlo
con la suspensin del microorganismo.
4. Extender el microorganismo en toda la superficie de una placa de petri con medio no selectivo.
5. Impregnar un disco de papel estril con una de las soluciones desinfectantes y colocarlos en la
placa inoculada, permita al papel escurrir adecuadamente.
6. Repetir el procedimiento con los dems productos asegurndose de que los papeles queden lo
suficientemente distanciados unos de otros y alejados del borde de la caja.
7. Llevar a incubacin a 35 grados Celsius por 24 horas.
RESULTADOS
Tomando de muestra un poco de agua de perejil estacionada en un recipiente por ms de 7 das se
realiz la filtracin por membrana de esta agua, llevndola a la incubadora 8 das ms, despus de esto
se identifica los resultados obtenidos. Debido a eso se logr establecer que las muestras tomaron unas
coloracin azules y rojas (ver figuras 3 y 4), las cuales se les atribuye a la presencia de coliformes
totales (coloracin azul) y fecales (coloracin roja), cada una de ellas toma una cantidad de colonias
distintas entre s. Adems de identificar las 2 muestras de los coliformes tambin se estudi una tercera
muestra la cual hace referencia a una caja presi con una muestra inhibidora, donde se pudo apreciar una
formacin de un aro o halo alrededor de uno de los papeles usados en la muestra, donde mediante la
investigacin previa realizada se concluye que se dio debido a una inhibicin en el sector del aro, la
cual se puede atribuir a factores como la carencia de nutrientes en el sector de este ocasionando as la
muerte de los microorganismos dependientes de dichos nutrientes o por lo contrario la poca eficiencia
del inhibidor ante la muestra del agua siendo los microorganismos de esta ms poderosa que el
inhibidor.
Para la primera prctica se puede apreciar que es ms fcil hacer una contabilizacin de coliformes con
la muestra de 100 L que con la de 1000 L debido a que una es ms poblada que la otra, Entonces con
100 L se pudo contar 20 colonias de coliformes totales siendo stos familia de las enterobacterias y
150 colonias de coliformes fecales.
En la otra prctica usando la caja petri se deposit la muestra del agua de perejil y se colocaron cuatro
papelitos en distintos lugares de la caja, tres de ellos cubiertos con inhibidores de microorganismos y
uno sin inmersin de inhibidor, despus se llev a la incubadora 8 das. Como resultado se obtuvo que

Laboratorio de microbiologa 2: Cuantificacin microbiana y Control de crecimiento microbiano

para el primero que es sin inmersin tuvo una capa superficial e igualmente pas con el grupo nk2 a
diferencia que a la de ellas fue ms gruesa. Para el segundo que estaba inmerso en etanol al 78%
tambin obtuvo una capa superficial pero porosa mientras que para la del grupo nk2 estas obtuvieron
un aro alrededor de l evitando la formacin de bacterias dentro del radio del aro. Para el tercero que
estaba inmerso en hipoclorito se pudo observar que hubo una repelencia a bacterias pero no con una
medida especfica y una forma asimtrica del aro y tambin un poco agrietado, en comparacin con el
del otro grupo obtuvo un aro casi simtrico de 3 mm de radio. Finalmente para el que estaba inmerso en
etanol al 96% no hubo aro repelente pero la formacin de bacterias estuvo aglomerada a un solo lado
mientras al otro fue total repelencia mientras que para el otro grupo se cre un aro casi cubierto de
bacterias.
REGISTRO FOTOGRAFICO

Figura 1

Figura 2

Laboratorio de microbiologa 2: Cuantificacin microbiana y Control de crecimiento microbiano

Figura 3

Figura 4

NOTA: NK2 hace referencia al grupo conformado por Natalia Carmona, Katherin Giraldo y Katherine
Zambrano.
CONCLUSIONES

Cuando en la membrana se arrojan resultados de ms de 200 colonias se puede considerar

como un resultado errneo y hay que volverlo a repetir pero ya con una muestra ms

Laboratorio de microbiologa 2: Cuantificacin microbiana y Control de crecimiento microbiano

diluidas, debido a que hay superpoblacin y lo que parece una colonia puede ser originado
por varias bacterias bajo condiciones de hacinamiento. Tambin sucede lo contrario, cuando
es menos de 20 colonias por membrana se debe repetir la filtracin pero con un volumen
ms alto de la muestra.
Se concluy que para hacer cuantificacin microbiana uno de los mejores mtodos a utilizar
es la filtracin por membrana debido a su efectividad y para hacer control de crecimiento
microbiano es muy efectivo un proceso denominado INHIBICIN.
BIBLIOGRAFA

Gua de laboratorio 2: Cuantificacin microbiana y Control de crecimiento microbiano

(Luis Enrique Mora).
Laboratorio de Tecnologa Educativa. Departamento de Microbiologa y Gentica.
Universidad de Salamanca. Investigado el 3 de Noviembre del 2015 Recuento de
coniformes totales
http://virus.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html