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Comparacin entre hibridizacin clsica y la transgnesis

Plantas transgnicas
Dr. Mauricio Gonzlez Agero
Departamento de Mejoramiento y Biotecnologa
Laboratorio de Postcosecha
Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) La Platina

Puntos de comparacin

Hibridizacin Clsica

Transgnesis

Nmero de genes
transferidos

Una docena de millares de genes para


encontrar el gen de inters

Uno o varios genes de inters en


una construccin gentica

Eleccin de la caracterstica a
transmitir

Se limita a la compatibilidad sexual


(confinada al interior de una especie)

En principio ilimitada (franquea la


barrera de las especies)

Tiempo para estabilizar la


nueva variedad

10-20 aos o ms

3 - 4 aos

Bacteria

Logros de la hibridizacin clsica

DNA
plasmidial

Clula donante

Gen de
inters

Clula vegetal
Plsmido portando
el gen de inters

Clula vegetal
transformada

Teosinte

Cob

Maz

Tomate silvestre
(Lycopersicon pimpinellifolium )
D = 1 cm.

Planta transgnica

Organismo genticamente modificado (GMO):


es un organismo al que se le ha introducido uno o
ms genes utilizando tcnicas de ingeniera
gentica o del DNA recombinante

Plsmido portando
el gen de inters

Transformacin directa: Biobalstica


Se busca penetrar las clulas vegetales con el DNA adherido a micro esferas
(oro o tungsteno).

Clula vegetal
Clula vegetal
transformada

Ampliamente usada en monocotiledoneas (maiz, arroz, trigo, excepcin: soya);


permite la introduccin de mltiples genes e insertos grandes (> 20 kb)

Mtodos de transformacin:
permite introducir el DNA
dentro de la clula

+
Partculas de oro
o tungsteno

Directos:

DNA

Microcarriers
cubiertos por DNA

Indirectos:

- Biobalstica
- Electroporacin
- Whiskers de carburo
de silicio

- Agrobacterium tumefaciens

Desventajas:

- Agrobacterium rhizogenes

No se puede controlar el nmero de


copias integradas y su numero es alto.

- Sistemas basados en virus


vegetales.

Se pueden integrar como repeticiones


en tandem generando inestabilidad y
silenciamiento de genes.

- Microinyeccin.

Transformacin directa: Biobalstica

Proyectiles
conteniendo DNA

Transformacin indirecta: Agrobacterium tumefaciens

Eyector

Agrobacterium tumefaciens
Cartucho de
plvora
Proyectil
Microcarriers
cubiertos con DNA
Respiradero
Placa de
detencin
Clulas
blanco

Es una bacteria Gram negativa.


Infecta plantas dicotiledneas (tomate, tabaco,
soya, excepcin: arroz y maz), a travs de
heridas, e induce la formacin de tumores.

Tumor de tallo provocado


por Agrobacterium tumefaciens

Las cepas virulentas contienen un plsmido,


denominado Ti (Tumor-inducing).
Su mecanismo de infeccin involucra la
transferencia y la integracin de la regin TDNA (Transfer-DNA) al genoma nuclear de la
clula vegetal en un nmero reducido de
copias.

Biologa de Agrobacterium tumefaciens

Mapa gentico del plsmido Ti de octopina

A. tumefaciens vive alrededor


de la superficie de las races
(rizosfera) donde utiliza los
nutrientes tomados de la raz.

El plsmido Ti determina las


caractersticas del tumor y la
produccin de aminocidos poco
comunes denominados opinas
(nopalina, octopina).
Una cepa de A. tumefaciens que
produce la formacin de un tumor
que sintetiza octopina, tiene
tambin
la
capacidad
de
catabolizar octopina.
Las plantas son incapaces de
catabolizar stos aminocidos,
por lo que A. tumefaciens puede
desviar el metabolismo de la
planta para producir compuestos
que nicamente la bacteria
puede utilizar.

Infecta solamente a travs de


sitios
en
la
herida
y
activamente quimiotctico a
ellos.
El plsmido Ti produce
receptores para acetosiringona
La
planta
herida
produce acetosiringona

Estructura de la regin T de un plsmido Ti de


octopina
El T-DNA contiene
genes que pueden
ser sustituidos por
genes de inters.
El DNA entre los
bordes I y D es
Transferido a la
planta como ssDNA.

Regin de virulencia: genes Vir


Los genes vir constituyen un reguln con 8 genes principales (virA, virB, virC, virD,
virE, virF, virG y virH) regulados por una secuencia promotora que contiene 12 pares
de bases conservadas a la que se une especficamente la protena VirG fosforilada.
La protena de membrana VirA interacta de forma directa o indirecta con
compuestos fenlicos producidos por las plantas como lignina, precursores de
flavonoides y acetosiringona.
La protena citoplasmtica VirG es fosforilada por VirA y permite la transduccin de
seales que activan los genes vir.
VirD2 y VirD1, actan como endonucleasas, unindose al plsmido Ti en los bordes
del T-DNA liberandolo. La protena VirD2 se une covalentemente al extremo 5 del
T-DNA hasta su transferencia a la planta y media la su integracin dentro del
cromosoma de la planta.
Las protenas VirE2 tambin se unen al T-DNA y posiblemente cubren la cadena
formando junto con VirD2 un complejo de transferencia.
11 protenas VirB y al menos una protena VirD (VirD4) forman el complejo de
secrecin (tipo conjugativo, T4SS).

El T-DNA contiene genes que codifican para algunas fitohormonas (auxinas y citoquininas) y
para la sntesis de opinas. Estos genes se expresan nicamente al ser integrados al genoma.

La funcin de VirC,VirF y VirH son an desconocidas.

Mecanismos moleculares implicados en la transformacin


por Agrobacterium tumefaciens

Uso del plsmido Ti como vector de transformacin


Mediante la manipulacin del mecanismo natural de infeccin de A. tumefaciens
se han podido generar una serie de vectores que permiten la introduccin de
secuencias de DNA de inters a los genomas nucleares de varias plantas
superiores.

Sistema Binario: utiliza 2 vectores

Vectores basados
en plsmido Ti

Vectores co-integrados

poco utilizado

(El gen de inters se encuentra en un plsmido intermediario)

El sistema binario se ha podido desarrollar gracias a dos caractersticas del


mecanismo de transferencia del T-DNA:
1) Las secuencias necesarias para la integracin al genoma se encuentran en
los bordes del T-DNA (secuencias repetidas terminales), pudiendo ser
reemplazado el resto de la secuencia del T-DNA.
2)
Los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia del T-DNA,
actan en trans, por lo que no tienen que estar situados en el mismo plsmido
que el T-DNA.
Tzfira y Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002

Sistema binario

Expresin estable v/s transitoria: ventajas y desventajas

Una cepa de A. tumefaciens con un plsmido Ti helper. Este plsmido contiene


todos los genes vir pero no contiene el T-DNA, por lo que no es oncognico pero es
capaz de transferir el T-DNA presente en otro plsmido ms pequeo (plsmido
desarmado).
Plsmido desarmado: contiene los bordes del T-DNA, es pequeo y de fcil
manipulacin en E. coli. No presenta los genes para la produccin de fitohormonas
ni opinas. Presenta sitios de restriccin mltiples dentro de los bordes del T-DNA
para el clonado de secuencias. Contiene tambin un marcador para la seleccin, por
ejemplo resistencia a kanamicina.

Expresin gnica estable:


Ventajas: Expresin gnica en todos los tejidos de la planta.
Desventajas: Gran consumo de tiempo, labor intensiva, influenciada por efectos
de posicin, grandes volmenes de produccin, requiere de un sistema de
regeneracin, requiere de un grandes instalaciones de trabajo.

Expresin gnica transitoria:


Ventajas: Rpida, flexible, no est influenciada por efecto de posicin, provee
grandes cantidades de protena para una caracterizacin detallada, no requiere
de un sistema de regeneracin
Desventajas: Expresin gnica limitada a tejidos especficos de la planta (segn
especie).

Plsmido Ti desarmado

Plsmido Helper

Expresin estable: transformacin mediante floral dipping


Las
plantas
de
Arabidopsis se crecen
en maceteros hasta que
comienzan a florecer.

Las plantas se sumergen en


el cultivo con Agrobacterium
suplementado con sacarosa
por hasta 3 minutos.

Expresin transitoria: transformacin mediante infiltracin


CaMV 35S
RB

1 Verificar la expresin
de un gen de inters (o
parte de l).

Firefly luciferasa Nos t


LB

Promotor

Gen reportero

T-DNA

Vector Binario

~3 das
1mM luciferina

Agrobacterium

Infiltracin

Las semillas germinan


en el medio que contena el agente
de seleccin (ej: kanamicina)

Plantas son crecidas por algunas


semanas para permitir el desarrollo de
la semilla. Se colectan las semillas.

pBI121
E. coli

A. tumefaciens

ba

cte

ria

luciferasa

luciferina + ATP + O2

Expresin transitoria: transformacin mediante infiltracin


2 Verificar la localizacin
subcelular del producto de
un gen de inters (o una
parte de l).

ro
Ag

oxy-luciferina + CO2 + luz

Plsmido portando
el gen de inters
Clula vegetal
Clula vegetal
transformada

Mtodos de
transformacin

transformacin

Cepa GV3101

GFP/pBI121

Mtodos de
regeneracin

LEXa-GFP/pBI121
A. tumefaciens
Infiltracin

Mtodos de
seleccin

PpCobra-GFP/pBI121
Visualizacin
ro
Ag

ba

ria
cte

Transformacin de plantas: Regeneracin


Regeneracin: induccin del crecimiento y multiplicacin de las clulas
transformadas, mediante la utilizacin de fitohormonas que estimulan la produccin
de callos y brotes. Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro
de clulas y tejidos vegetales:
1. Totipotencialidad celular: toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una
planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciacin
alcanzado. Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio del
cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc.
2. Desdiferenciacin: consiste en la transformacin y prdida de las caractersticas
de especializacin de un tipo celular (ej: clulas epidrmicas) para dar lugar a
clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado en la regeneracin de
una planta es la rediferenciacin de las clulas previamente desdiferenciadas.
3. Balance entre reguladores del crecimiento: todo proceso de diferenciacin est
regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores, fundamentalmente de
auxinas y citocininas.

auxinas < citocininas


auxinas > citocininas
auxinas = citocininas

tallos
races
Callo indiferenciado

Vas morfogenticas implicadas en la diferenciacin de novo


de brotes y/o plantas completas.
Posibles vas morfogenticas:

- Organognesis
- Embriognesis

Diferencias entre las dos vas:


-La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo de clulas del explante inicial
se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un rgano
vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas.

- La embriognesis se presupone de origen unicelular. Una clula del explante se


asla y constituye el punto de partida para la obtencin de un embrin somtico. Se
diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las
etapas implicadas en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es una planta
completa.

Tcnicas de cultivo de clulas o tejidos vegetales

Plsmido portando
el gen de inters
Clula vegetal

Cultivos diferenciados:

- races
- tallos

Clula vegetal
transformada

Mtodos de
transformacin

- embriones
- races
- tallos.

Cultivos indiferenciados:

Mtodos de
regeneracin

- callos
- suspensiones de clulas vegetales
- protoplastos.

Mtodos de
seleccin

Transformacin de plantas: Seleccin


Seleccin mediante genes reporteros:

Aplicaciones

La secuencia codificante de un gen cuya actividad es fcilmente medida (gen


reportero, ej: GFP, GUS) es frecuentemente utilizada en plantas transgnicas donde
se desea evaluar la expresin de un gen o la capacidad del promotor de controlar la
expresin. Un gen frecuentemente utilizado es el gen GUS (gusA, uidA). Gen de
origen bacteriano que codifica para la b-glucuronidasa. La actividad de esta enzima
se detecta fcilmente utilizando sustratos cuyos productos pueden ser cuantificados
por mtodos colorimtricos, espectrofotomtricos o fluorimtricos.

Seleccin mediante antibiticos y/o herbicidas:


Estos genes son tiles si se desea evaluar el mtodo de transformacin de plantas.
Antibiticos: todas las clulas vegetales son sensibles a antibiticos por que estos
inhiben la sntesis de protenas en los cloroplastos; las clulas transformadas con
genes de resistencia a antibiticos pierden esta sensibilidad.
Herbicidas: el gen incorporado elimina la sensibilidad al herbicida. Por ejemplo el
gen Bar de Streptomices hygroscopicus codifica para la enzima fosfonotricina
acetiltransferasa (PAT) que acetila al herbicida fosfonotrocina inactivndolo.

Organismos genticamente modificados de primera generacin

Organismos genticamente modificados de primera generacin

La casi totalidad (99%) de las plantas genticamente modificadas cultivadas en el


mundo son de cuatro especies: soya, maz, algodn y canola; son de primera
generacin, y fueron modificadas por motivos agronmicos, principalmente por su
tolerancia a herbicidas y resistencia a plagas de insectos.

Los GMOs mas comnmente usados en el procesamiento de alimentos son la lnea


Bt-176 de maz y la soya Roundup Ready (RRS).

Las cuatro especies se comenzaron a cultivar de forma intensiva a mediados de los


90 en algunos pases del mundo.
Organismos aprobados (fenotipos) ao 2002
Nmero TOTAL de liberaciones aprobadas
Tolerancia a herbicidas (2705)
Resistencia a insectos (2834)
Calidad del producto (1685)

La lnea Bt-176 de maz contiene protena especfica de Bacillus thuringiensis para


hacerlo resistente a insectos meta (larva de mariposas).

Maz Bt:
No es txico en humanos.
40% de Semilla de maz Bt
en EEUU.
Reduccin potencial de uso
de insecticidas.

Resistencia a virus (1187)


Propiedades agronmicas (664)
Resistencia a hongos (553)
Otros (444)
Gen marcador (376)
Resistencia a bacterias (98)
Resistencia a nemtodos(10)

La soya Roundup Ready (RRS) que es Soya GTS40-3-2, lleva el gen que codifica
para la enzima CP4 EPSPS (5-enolpyrovylshikimate-3-phospate sintetase de
Agrobacterium sp. Cepa CP4), la cual le confiere tolerancia a herbicidas con el
ingrediente activo glifosato.

Organismos genticamente modificados de segunda generacin


El arroz dorado (Golden Rice) es un arroz modificado genticamente para acumular
en su embrin beta caroteno y que es precursor de la vitamina A. Este beta caroteno
extra es el que le otorga un caracterstico y peculiar color dorado, y da origen a su
nombre. Este arroz acumula 1.6 miligramos/kilogramo de pro vitamina A.

Organismos genticamente modificados de segunda generacin:


Expresin de protenas heterlogas en plantas
(Molecular Farming)
Tipos de protenas obtenidas :

Ruta de sntesis de beta caroteno


IPP

Geranilgeranil di-fosfato
fitoeno sintasa

El arroz
normal no
tiene estas
enzimas

Genes insertados
al arroz dorado:
Gen de Daffodil
(Narcissus
pseudonarcissus)

Fitoeno
fitoeno desaturasa

Gen bacteriano con


ambas funciones

caroteno desaturasa
Licopeno
Licopeno-beta-ciclasa
- caroteno
(precursor vitamina A )

Gen de Daffodil
(Narcissus
pseudonarcissus)

- Reactivos de diagnstico
- Vacunas animales
- Alimentos animales
- Enzimas industriales
- Productos farmacuticos para el hombre

Fidelidad en la expresin de protenas humanas o animales en plantas.


Producto

Uso

Planta husped

Hemoglobina y
-interferon

Sustituto de la sangre
Anti-cncer, antiviral

tabaco
arroz

EPO

Estimulador del crecimiento de


glbulos rojos

Sero albumina
humana
Factor de crecimiento
epidrmico
Glucocerebrosidasa
Hirudina
NPI Defensina

Integridad
estructural
si
si

Actividad biolgica

Clulas de tabaco

si, (unin a O2/CO2)


Actividad antiviral in
vitro.
si, (glicanos) Sin testear

papa

si

Sin testear

Mitgeno

tabaco

Enfermedad de Gaucher
Anticoagulante
Antibitico

tabaco
canola
tabaco

Sin testear
si, (glicanos) si
si
si
si

Fin