2015/PCU/3452

TCNICAS INSTRUMENTALES
ANLITICOS. NIVEL BSICO

RECURSOS

Josefa Mara Navarro Acosta

M del Pilar Flores Fernndez-Villamil
Mara Josefa Jordn Bueso
Mara Pilar Helln Garca

Los contenidos de este manual estn bajo una licencia Creative Commons de tipo Reconocimiento No Comercial Sin
Obra Derivada. Se permite su copia y distribucin por cualquier medio siempre que mantenga el reconocimiento de sus
autores, no haga uso comercial de las obras y no realice ninguna modificacin de ellas

NDICE
1. INTRODUCCIN. TCNICAS ANALTICAS
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.

Clasificacin de los mtodos analticos.

Tcnicas Instrumentales.
Componentes bsicos de un instrumento analtico.
Consideraciones para la seleccin de un mtodo analtico.
Estandarizacin de un mtodo analtico.
Validacin de un mtodo analtico.

2. ESPECTROFOTOMETRA VIS-UV
2.1. Luz y longitud de onda.
2.2. Qu es la espectrofotometra?
2.3. Espectrofotmetro VIS-UV.
2.4. Ventajas e inconvenientes de la espectrofotometra VIS-UV.
2.5. Tipos de medida.
2.6. Errores en el anlisis espectrofotomtrico.
2.7. Procedimiento a seguir.
2.8. Prctica. Medida de la capacidad antioxidante de muestras vegetales (ensayo
ABTS).
2.8.1. Objetivo
2.8.2 Fundamento de la metodologa
2.8.3. Pasos a seguir.
2.8.4. Preparacin de patrones y reactivos.
2.8.5. Clculos.
3. CROMATOGRAFIA LQUIDA HPLC.
3.1. Fundamentos del anlisis cromatogrfico.
3.1.1. Definicin.
3.1.2. Nomenclatura bsica utilizada en cromatografa.
3.1.3. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos.
3.1.3.1. Segn el soporte.
3.1.3.2. Segn la naturaleza de la fase mvil y estacionaria.
3.1.3.3. Segn el tipo de equilibrio que se establece en la separacin.
3.2. Cromatografa Lquida de Alta Eficacia (High Pressure Liquid ChromatographyHPLC).
3.2.1. Caractersticas de un sistema de HPLC
3.2.2. Elementos de un sistema de HPLC.
3.2.2.1. Eleccin y preparacin de solventes para cromatografa lquida.
3.2.2.2. Sistema de bombeo.
3.2.2.3. Sistemas de inyeccin.
3.2.2.4. Columnas.
3.2.2.5. Sistemas de deteccin.
3.3. Parmetros cromatogrficos.
3.4. Determinacin de la concentracin de un compuesto.
3.4.1. Normalizacin de rea.

3.4.2. Calibracin con patrones o estndar.

3.4.3. Patrn interno.
3.5. Problemas ms comunes encontrados en HPLC.
4. INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA DE GASES ACOPLADA A LA
ESPECTROMETRA DE MASAS.
4.1. Cromatografa de gases. Generalidades
4.2. Instrumentacin
4.2.1. Gas portador
4.2.2. Puertos de inyeccin
4.2.3. Columnas cromatogrficas
4.2.4. Detector
4.3. Optimizacin de la separacin y la deteccin
4.4. Aplicaciones de la cromatografa gas lquido
4.5. Acoplamiento de la cromatografa de gases a la espectrometra de masas
4.6. Componentes de un espectrmetro de masas
4.6.1. Sistemas de introduccin de muestras
4.6.2. Fuente de iones
4.6.3. Analizador de masas
4.6.4. Detector
4.7. Aplicaciones de la espectrometra de masas
4.8. Interpretacin de un espectro
5.
ESPECTROMETRA DE EMISIN DE PLASMA ACOPLADA
INDUCTIVAMENTE (ICP).
5.1. Tcnicas espectromtricas.
5.2. Espectrometra atmica de emisin con plasma acoplado inductivamente
(ICP-AES).
5.2.1. Fundamentos de la tcnica.
5.2.2. Descripcin del equipo.
5.2.2.1. Plasma.
5.2.2.2. Fuente de alimentacin.
5.2.2.3. Sistema de introduccin de la muestra.
5.2.2.4. Sistema ptico.
5.2.2.5. Sistema de tratamiento de la seal.
5.2.3. Caractersticas del plasma de acoplamiento inductivo (ICP).
5.2.4. Aplicaciones del ICP-AES.
5.3. Aspectos a estudiar en anlisis mediante ICP-AES.
5.3.1. Preparacin de la muestra.
5.3.2. Rectas de calibrado e interferencias.

1. INTRODUCCIN. TCNICAS ANALTICAS

1.1. Clasificacin de los mtodos analticos.

De forma general, los mtodos analticos se clasifican como mtodos clsicos o
instrumentales. Los primeros corresponden al grupo de mtodos qumicos ms
antiguos, donde el analito era separado de la muestra mediante precipitacin, extraccin
o destilacin. Posteriormente, el analito era determinado mediante mtodos
gravimtricos (ej. determinacin sulfatos mediante precipitacin con cloruro de bario) o
volumtricos (ej. determinacin de la alcalinidad del agua).
En los mtodos instrumentales, a menudo se suelen utilizar tcnicas de separacin mas
eficaces como son las tcnicas cromatogrficas y la determinacin de los compuestos de
inters se basa en la medicin de una determinada propiedad fsica del analito, como
son conductividad, absorcin o emisin de luz, fluorescencia, potencial de electrodo y
relacin masa carga. Las propiedades que se utilizan para conocer la composicin
qumica de una muestra se denominan seales analticas. Los mtodos instrumentales
presentan numerosas ventajas frente a los clsicos como presentar mayor selectividad,
proporcionar lmites de deteccin ms bajos o permitir el anlisis de un mayor nmero
de muestras gracias a la instrumentacin automatizada.

1.2. Tcnicas Instrumentales.

En funcin de la seal analtica que utilicen, las tcnicas instrumentales quedan
englobadas en dentro de dos reas principales: tcnicas espectroscpicas y tcnicas
electroqumicas. Sin embargo, algunas tcnicas muy utilizadas como la espectrometra
de masas y el anlisis trmico, no se ajustan exactamente a estas reas. Otro tipo de
tcnica analtica es la cromatografa que habitualmente se utiliza de forma acoplada a
otras tcnicas instrumentales extendiendo as su utilidad (ej. GS-MS, L-MS, MS-MS,
etc.).
5

TCNICASINSTRUMENTALES
ESPECTROSCPICAS
Espectrofotometradevisibleyultravioleta
Espectrofotometradefluorescenciay
fosforescencia
Espectrometraatmica(emisinyabsorcin)
Espectrofotometradeinfrarrojo
Espectroscopa Raman
Espectroscopa derayosX
Tcnicasradioqumicas
Espectroscopa deRMN
Espectroscopa deresonanciadeespin
electrnico

ELECTROQUMICAS
Potenciometra
Voltamperometra
Tcnicasvoltamperomtricas
Tcnicasderedisolucin
Tcnicasamperomtricas
Coulombimetra
Electrogravimetra
Tcnicasdeconductancia
Anlisistrmico
Espectrometrademasas

CROMATOGRAFA
GCMSICPMS
GCIRMSMS

Comparando los mtodos instrumentales y no instrumentales, ambos tipos de mtodos

tienen sus ventajas e inconvenientes. En general, los mtodos instrumentales son ms
rpidos y ms sensibles. Sin embargo, aunque mucho ms lentos, los mtodos clsicos
pueden llegar a ser mas exactos y ofrecer lmites de deteccin mejores que los de
mtodos instrumentales.

1.3. Componentes bsicos de un instrumento analtico.

Un instrumento analtico convierte una seal analtica no detectable o cuantificable por
el ser humano en otra forma que si lo es. De forma general, todos los instrumentos
analticos estn, constituidos por cuatro componentes fundamentales:

Generador de seales: Producen seales analticas a partir de los componentes

de la muestra, por la aplicacin de una seal externa a la muestra (ej.
espectrofotometra VIS/UV) o bien por la creacin de un ambiente sobre la
muestra, que permite al analito producir una seal (ej. potenciometria).

Transductor de entrada: Convierte una seal determinada en otro tipo de seal.

Ej. en un espectrofotmetro la seal analtica (haz de luz atenuado) se convierte
en el transductor de entrada (fotocelda) en una seal elctrica.

Procesador de seales: Modifica la seal transducida para hacerla ms adecuada

para el dispositivo de lectura. La modificacin ms frecuente es la
amplificacin.

Transductor de salida: Se trata de un dispositivo de lectura que transforma la

seal modificada por el procesador de seales en otra seal que el analista puede
entender.

Seal
analtica
Generador
deseales

Seal de entrada
mecnica o elctrica

Transductor
deseales
(detector)

Seal de
salida

Procesador
deseales

Escala

Transductor
desalidao
lectura
Registrador

2.674

Unidad digital

1.4. Consideraciones para la seleccin de un mtodo analtico.

El empleo de una instrumentacin analtica compleja implica a menudo la necesidad de
aumentar la destreza del analista en el laboratorio. Antes de seleccionar la
instrumentacin requerida para el anlisis de un compuesto determinado, se deben
considerar otros aspectos previos que son tambin una parte fundamental del mtodo
analtico:

Definir el problema analtico

Especies que deben analizarse: propiedades fsicas y qumicas del analito.

Naturaleza de la muestra: propiedades de la matriz de la muestra, la presencia

de interferencias probables, el intervalo de concentraciones esperado para el
analito.

Uso final de los resultados: exactitud, precisin y lmites de deteccin

requeridos, coste del anlisis, tiempo requerido para efectuar el anlisis, nmero
de muestras.
Muestreo

Medidas necesarias para proporcionar la informacin deseada.

Representatividad de la muestra.

Procedimientos de toma de muestras que aseguren la integridad de los

resultados analticos.

Etiquetado y registro correcto.

Preparacin de la muestra

Procedimientos de procesado de muestras que aseguren la integridad de los

resultados analticos.

Procedimientos adecuados para almacenar y preservar las muestras y los

estndares.

Operaciones previas al anlisis final (separacin, dilucin/concentracin,

derivatizacin, etc.).

Control del ambiente (luz, T) y del medio (pH, complejacin de componentes,

T, etc.).
Otros

Limpieza adecuada del material.

Uso y el conocimiento de las tolerancias de las balanzas analticas, del material

volumtrico y de los aparatos de filtrado.
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1.5. Estandarizacin de un mtodo analtico.

Una vez que se ha seleccionado el mtodo ms adecuado segn nuestras necesidades,
debemos asegurar la precisin deseada para el anlisis. Para ello, se ha de seleccionar el
mtodo de estandarizacin ms adecuado que permitan determinar experimentalmente
la relacin entre la seal y la cantidad de analito. Existen dos tipos de mtodos de
estandarizacin:
1. Estndares externos, en los que se utilizan uno o varios patrones externos que
contienen concentraciones conocidas de analito y que se analizan separadamente
de las muestras.
2. Estndares aadidos, que a su vez se dividen en dos categoras:

Estndar interno, en la que un estndar, suficientemente diferente al

analito para que no interfiera con este y suficientemente similar al analito
para que tenga el mismo comportamiento, se adiciona a la muestra y a
una disolucin en blanco. El estndar interno puede aadirse antes de la
preparacin de la muestra o antes de la medida.

Adicin estndar, en la que, despus de una medida inicial, se aaden

cantidades fijas de analito a cada muestra y por extrapolacin se averigua
la concentracin de analito

1.6. Validacin de un mtodo analtico.

La validacin es el proceso por el cual se demuestra que los procedimientos analticos
son aptos para el uso indicado. Los mtodos que deben ser validados son:

Mtodos no estandarizados

Mtodos que han sido desarrollados en el laboratorio

Mtodos estandarizados para otro rango de concentracin diferente

Extensiones de mtodos estandarizados a otros analitos

Las caractersticas analticas que se deben estudiar para la validacin de un mtodo son
las siguientes:

Rango til: rango de concentracin comprendido entre el lmite de

cuantificacin y el lmite de linealidad (mximo valor de la concentracin a
partir de la cual no tiene significado cuantitativo).

Lmite de deteccin: mnima concentracin detectable del analito a partir de la

cual puede cuantificarse.

Lmite de cuantificacin: valor de la concentracin a partir de la cual tiene

significado cuantitativo.

Exactitud: es el grado de proximidad entre una medida y el valor verdadero o

esperado.

Sensibilidad: corresponde a la mnima cantidad de analito que puede producir

un resultado significativo.

Selectividad: Es la capacidad para originar resultados que dependen de forma

exclusiva del analito para su identificacin o cuantificacin en la muestra.

Precisin: refleja la medida en la que los valores de una serie repetida de

ensayos analticos que se realizan sobre una muestra homognea son semejantes
entre s:

Repetibilidad: refleja la precisin de un mtodo cuando se desarrolla

bajo las mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada
por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos
equipos y reactivos y durante una misma sesin de trabajo en un
perodo corto.

Reproducibilidad. medida de la precisin de los resultados de

ensayos realizados sobre la misma muestra homognea, pero
ejecutados por diferentes analistas en das diferentes.

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2. ESPECTROFOTOMETRA VIS-UV

2.1. Luz y longitud de onda.

La luz es un conjunto de radiaciones que se mueven por todo el espacio. Estas
radiaciones se pueden describir como partculas y como ondas pero, a nivel analtico,
sus propiedades como onda son ms utilizadas. Los conceptos que describen a una onda
son: longitud de onda (), definida como la distancia entre dos picos de una onda; el
tiempo que tarda un punto en describir una oscilacin completa es el periodo (T) y la
inversa del periodo es la frecuencia (f o ) que representa el nmero de oscilaciones por
segundo; por ltimo, la amplitud (A) es la distancia desde el punto ms alto de la onda
(desde el pico) hasta la base de la onda (el eje horizontal de equilibrio).

cresta

valle

Al conjunto de radiaciones electromagnticas se le llama espectro electromagntico.

La luz visible es solamente una pequea parte del espectro electromagntico:

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2.2. Qu es la espectrofotometra VIS-UV?

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones
biolgicas. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y la
cantidad de radiacin absorbida depende de forma lineal de la concentracin de la
sustancial absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a travs de
la disolucin. La ley de Lambert-Beer, relaciona la absorcin de luz con las
propiedades del material atravesado mediante la ecuacin:

A=lc
donde:
A es la absorbancia o densidad ptica y es adimensional. En el rango entre 0 y 2
unidades de absorbancia se cumple la ley de Lambert-Bert.

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l es la distancia recorrida a travs de la disolucin (espesor de la capa absorbente) y se

mide en cm.
c es la concentracin del analito en la disolucin
es la absortividad molar que tiene un valor constante para cada sustancia a una
determinada longitud de onda (). Si la concentracin (c) se expresa en mol L-1, se
denomina coeficiente de extincin molar (mol L-1 cm-1) y coeficiente de extincin
especfico (g L-1 cm-1) si la concentracin se expresa en g L-1.
La medida real que realizan los instrumentos para mediar la absorcin de luz por la
muestra es la transmitancia (T) que se define como la relacin entre la intensidad de
luz inicial que incide en la muestra (Io) y la intensidad de luz transmitida (If):

SUSTANCIAABSORBENTE
RADIACIN
TRANSMITIDA

Io

If

% T = (If / Io) x 100

Cuya relacin con la absorbancia (A) es:
A = -log T
La medida de transmitancia es transformada a absorbancia. El empleo de la absorbancia
presenta una ventaja fundamental: la relacin entre la absorbancia y la concentracin es
lineal.

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Absorbancia

Transmitancia

Concentracin

Concentracin

2.3. Espectrofotmetro VIS/UV.

El espectrofotmetro es un instrumento que permite la determinacin cuantitativa de
compuestos absorbentes de radiacin electromagntica, para longitudes de onda
comprendidas aproximadamente entre 200 y 1100 nm, comparando la radiacin
absorbida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto con una
que contiene una cantidad conocida. Sus componentes principales son:

FUENTE: dispositivo emisor de radiacin electromagntica. Pueden ser:

Lmpara de filamento Tungsteno o Wolframio (VIS).
Lmpara de Hidrgeno-Deuterio (UV)
Lmpara de Xenn (VIS y UV)

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MONOCROMADOR: o selector de longitud de onda. A menor ancho de banda se

consigue mayor pureza de radiacin emitida. Consta de lentes, espejos y rendijas para
dispersar, separar, restringir y enfocar la radiacin deseada.
CELDA: para colocar la muestra a medir, son transparentes en la regin de . Pueden
ser de vidrio (VIS) o de cuarzo (VIS y UV), suelen ser de 1 cm de lado.
DETECTOR: produce una seal elctrica cuando recibe un fotn que posteriormente
es convertida en unidades de potencia transmitida o absorbida. Para la zona VIS-UV se
utilizan:
Fototubo o tubo fotomultiplicador (fototubos en serie).
Fotodiodos array, seal simultnea para un amplio rango de .
SISTEMA DE LECTURA: o registrador, los instrumentos actuales disponen de un
display digital o conectados a un ordenador con software especfico.

Tipos de espectrofotmetros:
De haz simple, el haz de luz sigue una nica trayectoria entre la fuente y el detector.
De doble haz, el haz de luz es dividida en dos haces despus de salir del monocromador
mediante un sistema de espejos divisores, uno que se dirige a la celda de referencia (con
el blanco), y el otro que se dirige hacia la celda de muestra.
La ventaja del espectrofotmetro de doble haz es que cualquier variacin, ajena a la
muestra, que sufra la luz (intensidad de la fuente, la reflectividad de los espejos, la
eficiencia del detector, etc.), afecta simultneamente a los dos haces y por lo tanto la
relacin de energa entre los dos haces permanece siempre constante.

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2.4. Ventajas e inconvenientes de la espectrofotometra VIS-UV.

Ventajas:
Gran aplicacin (muy verstil, aplicable a sustancias inorgnicas e
inorgnicas que absorben en la regin VIS y UV o que pueden ser
convertidas mediante tratamiento qumico en sustancias absorbentes).
Bajo coste.
Sensibilidad relativa elevada.
Facilidad para realizar mediciones rpidas y en continuo.
Inconvenientes:
Selectividad moderada.

2.5. Tipos de medida.

De tipo cualitativo: escasa utilidad, para una sustancia determinada existe un nmero
escaso de mximos y mnimos y por lo tanto es imposible la identificacin inequvoca
(baja selectividad).
De tipo cuantitativo: muy utilizadas
Aplicaciones a especies absorbentes:
Mediciones de la absorbancia de especies absorbentes y aplicacin de la ley de
Lambert-Beer, mediante recta de calibrado (ej. determinacin -caroteno) o
coeficiente de absortividad molar (ej. determinacin de la concentracin de
clorofilas mediante las ecuaciones ecuacin propuesta por Arnon, 1949).
Aplicaciones a especies no absorbentes:
Especies no absorbentes que mediante su exposicin a reactivos especficos se
transforman en especies que absorben fuertemente en las regiones VIS o UV (ej.
determinacin de hierro mediante la quelacin con o-fenantrolina).

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Las determinaciones a su vez pueden ser en discontinuo (tcnica batch) donde se mide
la absorbancia a tiempo final (ej. determinacin directa de especies absorbentes o de
especies no absorbentes transformadas a tiempo final), o en continuo, ofrece ms
informacin pero es ms tedioso (ej. valoraciones fotomtrica, cinticas enzimticas).

2.6. Errores en el anlisis espectrofotomtrico.

Los errores que se pueden producir durante el anlisis espectrofotomtrico pueden ser
debidos a errores instrumentales:

Desviaciones de la Ley de Lambert-Beer:

Altaconcentracin
deanalito

AltaAbsorbancia

Bajapotencia
radiante

Detectorenzonalmite
dedeteccin

Bajaconcentracin
deanalito

BajaAbsorbancia

Altapotencia
radiante

Detectorenzonalmite
desaturacin

Imposibilidad de seleccionar una radiacin de nica longitud de onda, lo que

produce interacciones con otras absorciones (radiacin policromtica) y
radiacin parsita.

o a errores qumicos:

Ionizacin o asociacin parcial del analito, con diferente absorbancia que la

especie molecular (fijar pH con disolucin tampn).

Interaccin entre iones o molculas que afecten al ndice de refraccin del

analito en disoluciones muy concentradas. Efecto matriz (dilucin de la muestra,
calibracin mediante adiciones mltiples).

Disminucin de absorbancia por radiacin emitida (fluorescencia) o aumento de

la absorbancia por partculas en suspensin (turbidez).

Limitacin de reactivo en caso de reaccin previa.

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2.7. Procedimiento a seguir.

1. Seleccin de la longitud de onda
Se realiza un espectro de absorcin (grfico en el que se representa A vs ). Para
ello se ajusta el 0 de absorbancia mediante blanco de reactivos, se reemplaza el
blanco por la muestra y se realiza un barrido de absorbancia a diferentes . Se
selecciona aquella donde la absorbancia es mxima y/o se minimizan las
interferencias.
2. Establecer el rango de linealidad
Es el intervalo de concentraciones dentro del cual se puede medir la
concentracin del analito en una muestra o patrn con elevado nivel de
certidumbre. Para establecerlo hay que realizar una recta de calibrado.
3. Comprobar la existencia o no de efecto matriz
Se debe a la presencia de sustancias ajenas al analito que aumentan o
disminuyen la seal de este. Para comprobar la existencia de un posible efecto
matriz se calcula la concentracin de una muestra y la de esa misma muestra a la
que se le ha aadido una cantidad conocida de analito. Se puede solucionar
mediante la dilucin de la muestra o mediante adiciones mltiples del analito a
la muestra.
4. Establecer el lmite de cuantificacin
Mnima concentracin que se puede medir con la tcnica. Se puede calcular
multiplicando por diez la seal correspondiente al ruido de fondo.
5. Otras recomendaciones
Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con
precipitados.
El volumen de la muestra en la cubeta no debe ser excesivo para evitar
que se desborde (mximo, hasta partes de la cubeta) pero suficiente
para que se realice bien la medida.
18

 La cubeta debe estar exenta de suciedad y marcas y se sujeta por los

lados opacos.
No se deben derramar lquidos, sobre todo solventes, cidos o bases;
dentro del contenedor de la cubeta.
Se debe mantener, el espectrofotmetro limpio y libre de humedad.

2.8. Prctica. Medida de la capacidad antioxidante de muestras vegetales (ensayo

ABTS)
2.8.1. Objetivo
El objetivo de esta prctica es medir la capacidad de un extracto vegetal mediante el
ensayo ABTS

2.8.2 Fundamento de la metodologa

La actividad antioxidante es una medida global in vitro de la capacidad de un extracto
para atrapar radicales libres. La actividad antioxidante no puede ser medida
directamente, pero puede determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un
proceso de oxidacin controlado.
La mayora de los ensayos para determinar de capacidad antioxidante pueden ser
divididos en dos categoras: 1) ensayos basados en la reaccin por transferencia de
tomos de hidrgeno (HAT) y 2) ensayos basados en la reaccin por transferencia de
electrones (ET). El ensayo ABTS pertenece a este ltimo grupo.
El compuesto cromgeno ABTS (2,2 cido azinobis-3-etil- benzotiazolin-6- sulfnico)
presenta color azul/verde con mximo de absorcin a 342 nm. Es soluble en agua y
disolventes orgnicos. A partir de ABTS se genera el radical catin (ABTS+) de color
verde intenso.

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El radical ABTS+ se puede generar enzimticamente (mioglobina, peroxidasa de

rbano), qumicamente (dixido de manganeso, persulfato potsico, radicales peroxilo)
y electroqumicamente.
Los antioxidantes se aaden una vez formado el radical ABTS+, y se determina la
disminucin de la absorbancia debida a la reduccin del radical (decoloracin)

2.8.3. Pasos a seguir.

Preparacin de recta de calibrado.

Preparacin de reactivos.

Comprobacin de la concentracin de las disoluciones de ABTS, H2O2 y

HRP preparadas mediante el uso del coeficiente de extincin molar (ABTS:

340=36 mM-1 cm-1; H2O2: 240=43,6 mM-1 cm-1 y HRP: 403=100 mM-1 cm1

).

Generacin enzimtica del radical ABTS+.

Puesta a punto de la metodologa al extracto a analizar (clculo de la

cantidad de extracto necesario y tiempo de reaccin).

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Determinacin de la AOX.

Clculos.

2.8.4. Preparacin de patrones y reactivos.

Disolucin madre de Trolox 5 mM

Disoluciones standard de Trolox de 0, 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5 mM

Tampn fosfato 50 mM pH 7,5

Perxido de hidrgeno 30 M

Peroxidasa de rbano (HRP) 0,25 M

ABTS 5 mM

2.8.5. Clculos.
Porcentaje de inhibicin:
% inhibicin= (A0-Af) x 100 / A0
ndice TEAC (AEAC):

% inhibicin = a + b [Trolox]
ndice TEAC = (% inhibicin a) / b

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3. CROMATOGRAFIA LQUIDA HPLC

3.1. Fundamentos del anlisis cromatogrfico.

3.1.1. Definicin.
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin de los componentes de una mezcla
compleja. La separacin de los componentes de esta mezcla se logra teniendo en cuenta
el diferente comportamiento de particin entre una fase mvil y una fase estacionaria de
dichos componentes.
En resumen, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que
se quiere separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se
denomina fase estacionaria y posteriormente, un segundo medio o fase mvil que es
inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para eluir a las
molculas en la muestra. Por lo tanto, los componentes bsicos de una cromatografa
son una fase mvil, una fase estacionaria y una mezcla de partculas. La fase
estacionaria se suele encontrar dentro de una columna u otro soporte y puede ser slida
o lquida y la fase mvil puede ser un lquido, un gas o un fluido supercrtico.
3.1.2. Nomenclatura bsica utilizada en cromatografa.
Cromatgrafo.

Es

el

instrumento

empleado

para

realizar

una

separacin

cromatogrfica.
Cromatgrama. Es una grfica u otro tipo de presentacin en la que se representa la
respuesta de un detector o la concentracin de un analito frente al volumen del efluente
o al tiempo. Cuando hablamos de cromatografa plana, "cromatgrama" se puede referir
al papel o capa con las zonas separadas.
Fase Ligada. Es una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las partculas
de soporte o a la pared interior de la columna.
Fase estacionaria (FE). Es una fase que est inmovilizada sobre las partculas del
soporte o sobre la pared interior de la columna, puede ser solida o lquida.
22

Fase Mvil (FM). Es el fluido que se filtra a travs o a lo largo la fase estacionaria en
una direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquida), un gas
(Cromatografa de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluidos
Supercrticos). En cromatografa de gases se usa la expresin Gas Portador para la fase
mvil. En la cromatografa de lquida se usa tambin la expresin eluyente.
Eluir. Aplicar la cromatografa de elucin.
Efluente. Es la fase mvil que abandona la columna.
Muestra. Es la mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin
se pretende.
Componentes de la Muestra. Son constituyentes qumicamente puros de la muestra.
Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos
parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente.
3.1.3. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos.
Las tcnicas cromatogrficas pueden clasificarse en funcin de la naturaleza de la fase
mvil y la fase estacionaria, del mecanismo de separacin de los componentes entre
fases, segn el soporte etc
3.1.3.1. Segn el soporte.
Cromatografa plana.
Ventajas: sencillas, rpidas, bajo costo.
Desventajas: poca eficiencia en la separacin y no se adapta a sistemas
automatizados.
Cromatografa en columna.
Ventajas: amplia versatilidad, adaptacin a sistemas automatizados, buena
resolucin y mayor capacidad de carga.
Desventajas: necesidad de equipamiento, alto costo inicial y necesidad de
personal capacitado.

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3.1.3.2. Segn la naturaleza de la fase mvil y estacionaria.

Fase mvil: gas. Cromatografa de gases.
Fase mvil: lquido. Cromatografa lquida.
En el siguiente esquema aparecen los diferentes mtodos cromatogrficos dependiendo
de la naturaleza de las fases mvil y estacionaria.

3.1.3.3. Segn el tipo de equilibrio que se establece en la separacin.

Cromatografa de adsorcin. Se basa en un fenmeno superficial por el cual las
partculas del soluto son adsorbidas por la fase estacionaria (que en este caso
tambin se denomina adsorbente). La fuerza con que es adsorbido un
componente depende de la polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de
la polaridad de la fase mvil. La fase estacionaria siempre es un slido, se
utiliza casi exclusivamente slice y en menor medida almina. Cuanto ms
polar sea un compuesto ms fcilmente es adsorbido. La fase mvil debe ser
polar o ms polar que la FE, los disolventes pueden ser H2O, metanol, etanol,
24

etc.. Es una tcnica para compuestos de polaridad baja o media (hidrocarburos,

derivados halogenados), estos deben ser menos polares que la FM para poder
ser retenidos por la FE.
Adsorbentes y disolventes ms comunes en cromatografa de adsorcin. Secuencia de
menor a mayor orden de elucin, actividad adsorbente y fuerza de elucin

Secuencia
-

Orden de elucin de Actividad adsorbente

compuestos
Celulosa
Alcanos
Alquenos
Hidrocarburos saturados
Hidrocarburos aromticos
Halogenados Aldehdos
teres
Sulfato clcico
Cetonas
Silice
steres
Florisil
Aminas
Oxido Magnesio
Alcoholes
Alumina
Tioles
Fenoles
Carbn Activo
cidos carboxlicos

Fuerza de elucin de
disolventes
Eter de petrleo
Ciclohexano
Benceno

Tetracloruro
de
carbono
Diclorometano
Cloroformo
Eter dietlico
Acetato de Etilo

Acetona
n-propanol
Etanol
Metanol
Agua
cido actico

Cromatografa de reparto. El soluto est en equilibrio en la fase mvil, (lquida o

gas) y la fase estacionaria (slida). La mayor o menor migracin de un
compuesto se produce por diferencia de solubilidades entre la fase mvil y la
estacionaria. En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan
compuestos unidos qumicamente a un soporte de slice. Se la subdivide en
cromatografa en fase normal y fase reversa.
En la cromatografa en fase normal, la fase estacionaria es altamente polar y
los compuestos menos polares eluyen primero.

25

En la cromatografa en fase reversa (RPC), se utiliza un empaque hidrofbico,

normalmente con un grupo funcional C8 o C18 y una fase mvil polar, en la
mayora de los casos solventes orgnicos (metanol, 2-propanol o acetonitrilo)
generalmente acidificados (TFA, cido fosfrico, actico o frmico). Los
solutos no polares tienden a adsorberse en la fase estacionaria y se mueven a
travs del sistema ms lentamente que los solutos polares, por lo que las
sustancias ms polares eluyen primero. La retencin hidrofbica del soluto en
la fase estacionaria puede disminuirse aadiendo un disolvente orgnico a la
fase mvil acuosa, es decir disminuyendo la polaridad de la fase mvil, de esta
manera cuanto menos polar sea la fase mvil menor ser la adsorcin de la
muestra a la fase estacionaria. Normalmente, la elucin del soluto se inicia con
un eluyente de elevada polaridad como es el caso de una solucin acuosa, cuya
polaridad se va disminuyendo mediante a adicin de solventes orgnicos,
siendo el acetonitrilo y el metanol los solventes ms utilizados.

En la figura anterior se muestra la relacin entre la polaridad y la elucin en fase normal

y fase reversa.
Cromatografa de exclusin molecular. No hay equilibrio de separacin. Las
partculas se separan segn su tamao molecular y geometra. La caracterstica
principal de las fases estacionarias utilizadas en este tipo de cromatografa, es
26

que poseen cavidades en las cuales las molculas de los compuestos a separar
pueden penetrar y ser retenidas. Las molculas grandes fluyen ms rpido que
las pequeas. Hay que ajustar muy bien el intervalo de pesos moleculares que
se quieren separar antes de elegir la fase estacionaria.

Direccin del flujo

En la figura se representa la elucin de molculas de diferente tamao en una

columna de exclusin molecular
Cromatografa de intercambio inico. Los iones del soluto son retenidos por los
grupos funcionales que se encuentran en la fase estacionaria. Se utiliza para la
separacin de sustancias inicas tanto orgnicas como inorgnicas. Las
partculas cargadas negativamente se unen a la matriz slida cargada
positivamente y son retenidas y las partculas con carga positiva son rechazadas
de la matriz, eluyndose. Para regenerar la matriz, se eluyen las partculas
retenidas haciendo circular una solucin que modifica el pH del solvente hasta
igualarlo a su punto isoelctrico o invertir su carga neta.

27

Cromatografa de afinidad: La base de esta cromatografa es una reaccin

inmunolgica donde el soluto es el antgeno y los anticuerpos se encuentran
adsorbidos en la fase estacionaria.

Resumiendo lo anteriormente descrito:

Para pesos moleculares mayores a 10000 Da se utiliza cromatografa de
exclusin molecular y cromatografa de reparto en fase reversa.
Para pesos moleculares menores a 10000 Da y especies inicas se utiliza la
cromatografa de intercambio inico.
Para especies no inicas, polares y pequeas se utiliza la cromatografa de
particin o reparto.
Para especies no polares e ismeros estructurales, hidrocarburos alifticos y
alcoholes alifticos se utiliza la cromatografa de adsorcin o lquido-slido.

3.2.

Cromatografa

Lquida

de

Alta

Eficacia

(High

Pressure

Liquid

Chromatography-HPLC).
Esta cromatografa nace a partir del intento por optimizar la clsica cromatografa de
columna, en la cual el paso de un soluto por la columna poda tardar horas, incluso das.
La inclusin de un sistema de alta presin supone el aumento de la velocidad de flujo y
por tanto la aceleracin el proceso. Adems de aumentar el flujo, se utilizan columnas
altamente empacadas, muy selectivas y eficaces.

28

3.2.1. Caractersticas de un sistema de HPLC.

Elevada sensibilidad.
Elevada aplicabilidad.
Permite realizar anlisis cualitativos exactos.
Es adecuada para la separacin de especies termolbiles y no voltiles.
Ventajas en el anlisis cualitativo: separa materiales muy afines.
Ventajas en el anlisis cuantitativo: aplicacin amplia a los materiales menos
voltiles y al anlisis de multicomponentes.
Limitaciones del mtodo: se tarda en desarrollar el mtodo.
Limitaciones para la muestra: ninguna.
3.2.2. Elementos de un sistema de HPLC.
Un sistema de HPLC est compuesto por los siguientes elementos:
Depsito de solventes.
Desgasificador.
Bomba.
Inyector.
Compartimento de columnas.
Detector.
Registrador de seal.
Salida de solvente.

Diagrama de un sistema de HPLC

29

Fotografa de un sistema de HPLC

3.2.2.1. Eleccin y preparacin de solventes para cromatografa lquida.
El solvente es el lquido o la mezcla de ellos que transporta la muestra a travs del
sistema de cromatografa. Puede ser polar o apolar, cido o bsico, acuoso u orgnico.
Caractersticas que debe tener un solvente para HPLC.
Pureza y estabilidad. Productos de calidad y pureza cromatogrfica con un bajo
contenido en impurezas. Espectroscpicamente puros.
Capaz de disolver la muestra.
Que sea miscible con otros solventes para formar mezclas tiles para las diferentes
aplicaciones.
No degradar o disolver la fase estacionaria.
Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin en aplicaciones con
gradiente de solventes.

30

 Ser compatible con el detector utilizado. P.e., tener transparencia ptica cuando se
usan detectores UV o Diodos.
Tipos de solvente.
Los solventes ms utilizados suelen ser agua, disoluciones tampn acuosas y
disolventes orgnicos (metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas)
Preparacin de solventes para HPLC.
1. Filtrado. Eliminacin de partculas en suspensin que pueden ser perjudiciales para
los componentes del sistema HPLC, ocasionando costosos daos en la bomba y
capilares de la columna, y en general causar desgaste del sistema de HPLC.
Generalmente se utilizan los siguientes mtodos:
Filtro a la entrada del solvente.
Filtracin a vaco.
Filtracin en lnea.
2. Desgasificacin. Eliminacin de los gases disueltos en el solvente (principalmente
oxigeno y nitrgeno). Estos gases causan interferencias en detectores como de
fluorescencia y electroqumico y pueden producir burbujas en la columna de HPLC,
produciendo picos falsos y desviaciones de la lnea base. Generalmente se utilizan los
siguientes mtodos:
Ultrasonidos.
Burbujear helio.
Desgasificacin electrnica en lnea.
Desgasificacin a vaco en lnea.
Programacin del solvente
Existen dos mtodos de programacin de solvente en HPLC.
Isocrtico. Durante todo el anlisis el solvente se encuentra a la misma
concentracin.

31

 Gradiente de Elucin. La composicin de la fase mvil va cambiando durante el

anlisis. Los gradientes pueden ser de dos tipos:
Lineales (curva 5). La velocidad de cambio del disolvente fuerte es lineal en el
tiempo.
Exponenciales. (curvas 1 a 4 y 6 a 9). stos a su vez pueden ser:
o Convexos (curvas 1-4). Rpidas en alcanzar la composicin final de la
fase mvil. Se utilizan para separar picos superpuestos al final del
cromatograma.
o Cncavos (curvas 6-9). Lentas en alcanzar la composicin final de la fase
mvil. Se utilizan para separar picos superpuestos al principio del
cromatograma.
Para obtener buenos resultados con el mtodo de gradiente debemos seguir cinco pasos
fundamentales:
1. Determinar la composicin inicial y final del solvente.
2. Ajustar el tiempo del gradiente.
3. Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa).
4. Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolucin.
5. Regresar a las condiciones iniciales la columna.
3.2.2.2. Sistema de bombeo.
La bomba es la responsable de mantener el flujo de fase mvil y de efectuar las mezclas
de solventes en las separaciones con gradiente.
Caractersticas que debe tener una bomba de HPLC.
Los componentes de la bomba deben ser resistentes a la corrosin qumica.
Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
Poca variabilidad. Control y reproducibilidad del flujo de solvente.
Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min).
Flujo constante y libre de pulsaciones.
Buen mezclado de los solventes.

32

 Reproducibilidad en la formacin de los gradientes.

Clasificacin de las bombas que se usan en HPLC.
Reciprocas o de pistn. Se usan en el 90% de los equipos y consisten generalmente
en una cmara pequea (35 L a 400 L), en la que el disolvente se bombea hacia
delante y hacia atrs mediante un pistn movido por un motor. Dos vlvulas que
se abren y cierran alternadamente controlan el flujo del disolvente. Estas bombas
generan una alta presin de salida con caudales constantes y la posibilidad de usar
la elucin por gradiente.
Tipo jeringa o de desplazamiento. Son adecuadas para columnas pequeas y se
utilizan en aplicaciones con flujo constante.
Neumtica o de presin constante. La fase mvil es conducida a travs de la
columna mediante la presin de un cilindro de gas. Necesitan una fuente de gas a
baja presin.
Dentro de estas, segn el numero de solventes con los que pueden trabajar al mismo
tiempo se clasifican en isocrticas (1), binarias (2) y cuaternarias (4).
3.2.2.3. Sistemas de inyeccin
La introduccin de la muestras es uno de los factores de reproducibilidad de la medida
ms importante. Los volmenes a inyectar normalmente oscilan entre 5 y 100 L, esto
depende del tamao de la columna, concentracin de la muestras y presin del sistema.
Caractersticas que debe tener un sistema de inyeccin de HPLC.
Inyeccin rpida para evitar perturbar el rgimen de circulacin de la fase mvil.
Alta reproducibilidad.
Sistema de mantenimiento de altas presiones.
Vlvulas rotatorias de alta presin.
Bucle de inyeccin fijo o variable.
Tipos de inyectores de HPLC.
Inyector automtico. Permite la inyeccin de series de muestras en secuencia.

33

 Inyector manual. Prcticamente en desuso, se utiliza en cromatografa preparativa.

Altos volmenes de inyeccin (hasta 500 L).
3.2.2.4. Columnas.
La columna es el lugar fsico donde se produce la separacin cromatogrfica. Son de
tamaos y rellenos variables dependiendo del tipo de aplicacin y separacin que se va
a desarrollar.
Tipos de Columna.
Segn su relleno se clasifican en:
Peliculares. Este tipo de relleno se suele utilizar para precolumnas.
Partcula porosa. Consiste en un conjunto de micropartculas de slice porosas que
tienen dimetros entre 3 m a 10 m.
Segn sus caractersticas,
Precolumnas.
Se colocan antes de la columna analtica para incrementar su vida til.
Eliminan las posibles partculas y los contaminantes del solvente.
Sirven para saturar la fase mvil con la fase estacionaria.
La composicin del relleno debe ser similar a la de la columna analtica, pero el
tamao de partculas es generalmente ms grande.
Cuando se contamina, se rellena nuevamente o se descarta y reemplaza por una
nueva del mismo tipo.
Columnas analticas. Segn el tipo de separacin las columnas pueden ser:
Fase Reversa (FR)
Fase normal (FN)
Interaccin hidroflica
Intercambio inico
Ligando intercambio
Iones exclusin
34

 GPC
GFC
Multi modo
Afinidad
Quiral
Adems de estas, segn su tamao pueden ser:
Columnas capilares: Tienen un dimetro menor a 1 mm. Estas columnas
permiten trabajar con volmenes de muestra muy pequeos todo el sistema se
debe de adaptar a ellas.
Columnas de calibre estrecho: se usan para pequeos volmenes de muestra. El
dimetro tpico es de 1-2 mm. Como en las columnas capilares, los instrumentos
deben ser modificados para acomodarse a la pequea capacidad de estas
columnas.
Columnas estndar: son las que se usan comnmente. Las partculas pueden ser
de slica o de otros polmeros especiales que les confiere resistencia a pHs
extremos
Columnas rpidas: Estas columnas tienen el mismo dimetro interno pero son
mucho ms cortas que la mayora de las columnas. Las ventajas incluyen
incremento de la sensibilidad, descenso en el tiempo de anlisis, descenso en la
fase mvil usada, e incremento en la reproducibilidad.
Columnas preparativas: son columnas utilizadas con el objeto de permitir
purificar grandes cantidades de muestra (mg). Una columna preparativa
normalmente tiene un gran dimetro porque est diseada para facilitar grandes
volmenes de inyeccin.
3.2.2.5. Sistemas de deteccin.
Caractersticas que debe tener un detector para HPLC.
Sensibilidad.
Linealidad.
Confiabilidad.
Fcil de usar.

35

 Bajo volumen muerto.

La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la cantidad
fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de las caractersticas de
las seal de transferida.
Tipos de detectores.
En la siguiente tabla se enumeran los diferentes detectores que se suelen utilizar en
HPLC

Detector

Nombre Abreviado

Quimioluminiscencia

CL

Conductividad

CD

Electro Qumico

EC

Dispersin Luminosa

LS

Fluorescencia

FL

Espectrmetro de Masas

MS

Laser Multi Angulo de dispersin de luz

MALS

Rotacin ptica

OR

Fotodiodo Array

PDA

Indice de Refraccin

RI

Ultra Violeta

UV

Visible

VIS

De los anteriormente mencionados los ms habituales son los siguientes:

36

 Detector de ndice de Refraccin. En un detector universal, no depende del

caudal, robusto, sensible a cambios de temperatura, tiene menor sensibilidad que
otros detectores.
Detector de Fluorescencia, detecta compuestos que tengan fluorescencia nativa o
inducida por derivatizacin. El detector esta colocado perpendicularmente al haz
de excitacin.
o Detector de Fluorescencia Inducida por Lser.
o Segn la Fuente de Excitacin.
o Segn el sistema ptico.
Detector Ultravioleta, es utilizado en ms del 70% de los equipos HPLC. La
seal es proporcional a la concentration del compuesto. Se detectan alquenos,
compuestos aromticos y aqullos que tienen uniones mltiples de C, O, N, y S.
Se mide la absorbancia de los eluyentes de una columna y para minimizar el
ensanchamiento de banda, se mantiene el volumen lo ms pequeo posible, entre
1l y 10l y largos de celda entre 2 mm y 10 mm. Estn restringidos a presiones
debajo de 600 psi, por lo que se requiere un reductor de presin.
o Detector de Longitud de Onda Fija.
o Detector de Longitud de Onda Variable.
o Detector de Diodos. Permiten recoger el espectro completo en 1 segundo
(cromatografa tridimensional).
Detectores Electroqumicos. Pueden tener un electrodo indicador de platino, oro,
carbn vtreo o pasta de carbono, un electrodo de referencia y un contra electrodo
en el canal de flujo.
o Detector Amperomtrico.
o Detector Conductimtrico.
o Detector Potenciomtrico.

3.3. Parmetros cromatogrficos.

37

Coeficiente de distribucin o de reparto.

El coeficiente de distribucin de un componente A se define como:

DA= (Aest)/Amvil
Donde DA es el coeficiente de distribucin del componente A, y [Aest.] y [Amvil.] son
respectivamente las concentraciones del componente A en la fase estacionaria y en la
fase mvil. El valor del coeficiente de distribucin es caracterstico de un componente
para una fase estacionaria y una fase mvil determinadas.
Pico de aire.
Es el que corresponde a la deteccin de una cantidad muy pequea de aire que entra a la
columna cuando se introduce la muestra en el cromatgrafo.
Lnea de base.
Es la parte del registro que corresponde a la fase mvil pura.
Altura de pico (h).
Es la distancia entre la cima del pico y la lnea de base. Si el vrtice es redondeado se
trazan rectas tangentes a los dos puntos de inflexin de las laderas; el punto de corte de
las dos rectas determina la altura del pico.
Anchura de pico (w).
Es la longitud del tramo de la prolongacin de la lnea de base, comprendida entre las
intersecciones con la misma de las laderas del pico o, en su caso, de las lneas tangentes
antes mencionadas.
Anchura del pico en la semialtura (w/2).
Es la distancia paralela a la lnea de base, entre las dos laderas del pico, tomada a la
mitad de la altura del pico.
rea del pico (a).

38

Es la comprendida entre el pico y la prolongacin de la lnea de base. Precisamente a

obtener el valor de este parmetro, en los picos del cromatograma, se dedican los
dispositivos integradores.
Tiempo cero o tiempo de retencin del componente inerte (T0).
El tiempo cero (T0), es el tiempo de retencin del componente inerte.
Tiempo de retencin de un componente (Tr).
El tiempo de retencin (Tr) es el tiempo transcurrido entre el instante en que se
introduce la mezcla y el instante en que se detecta la seal propia del componente en su
mxima intensidad.
Tiempo de retencin corregido de un componente.
Es el tiempo que transcurre entre la aparicin de la seal que corresponde a un
componente inerte y a la del componente considerado.
Volumen de retencin de un componente (Vr).
Es el volumen necesario de fase mvil para transportar el soluto de un extremo a otro
del sistema cromatogrfico. Se define como:
Vr = Tr*Fm
Donde, Vr es el volumen de retencin expresado como el producto del tiempo de
retencin de un componente (Tr) y el flujo de la fase mvil (Fm).
Volumen cero o muerto (V0 o Vm).
Es el volumen de eluyente que se consume sin que se detecte ningn componente. Se
define igual que el volumen de retencin pero el tiempo utilizado es el tiempo muerto.

39

Seal del detector

TR
Pico

T0
h

h
a
h1/2

Lnea de base
Tiempo

Factor de selectividad ().

Es la relacin entre los tiempos de retencin de dos componentes:

Donde, es el factor de selectividad, tRy y tRx son los tiempos de retencin de los
componentes x e y, y Kx y Ky son los coeficientes de distribucin de los componentes.
Dependiendo del valor de se puede saber cmo ser la separacin:
> 2 se obtiene una mala separacin ya que son necesarios periodos muy largos
para realizarla.
1< <2 se obtiene una buena separacin cromatogrfica.
Eficiencia.
Se expresa como una cantidad adimensional llamada nmero de platos tericos. El
trmino proviene de un estudio terico en el que se trata a una columna como si
estuviera constituida de numerosas, capas contiguas denominadas platos tericos.
Refleja el nmero de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a
travs de la columna. Cuanto mayor sea el nmero de platos tericos de una columna,
mayor ser su eficiencia y por tanto se podr lograr una mayor resolucin. La eficiencia

40

de una columna puede determinarse a partir de un pico del cromatograma mediante la

siguiente ecuacin:

Donde, N es el nmero de platos tericos, L es la longitud de la columna, H es la altura

de cada plato, t'R es el tiempo corregido de retencin de un componente y ai es la
anchura del pico cromatogrfico.

Si H tiene un valor pequeo, la distancia entre platos es menor y por tanto la

eficiencia ser mayor.
Si H es grande, la columna es poco eficiente para separar ese componente ya que sus
molculas estarn muy difundidas.
La velocidad de la fase mvil influye en la eficiencia del sistema cromatogrfico, ya que
si la velocidad es pequea los componentes tendrn ms tiempo para que se pueda
realizar el equilibrio de reparto, por lo que el nmero de platos ser mayor y la altura de
los platos menor.
Factor de respuesta.
Los detectores dan una respuesta que es proporcional a la cantidad de sustancia (m):
Respuesta = a * m
El coeficiente de proporcionalidad a es caracterstico de cada sustancia
El factor de respuesta (Fr ) es la inversa del coeficiente a y corresponde a la cantidad de
sustancia por unidad de rea. Generalmente cada componente tiene un factor de
respuesta caracterstico Resolucin (R o Rs).

41

Es el parmetro que expresa el grado de separacin que se puede obtener en un sistema

cromatogrfico para dos componentes dados. Relaciona la capacidad separadora de un
sistema cromatogrfico para dos componentes. Se define como:

Donde Rs es la resolucin, tRA y tRB son los tiempos de retencin de los componentes A
y B, y aA y aB son las anchuras de los picos del cromatograma de los anteriores
componentes.
La resolucin puede observarse directamente sobre el cromatograma de picos. Se tendr
una buena resolucin si los picos no se solapan, y est perfectamente delimitado cada
pico, sin que coincida el final de uno con el principio del siguiente.
Si Rs est prximo a 0,7 se obtendr una mala resolucin quedando los picos
solapados.
Si Rs esta prximo a 1,5 se obtendrn unos picos bien delimitados.
Una pobre resolucin es debida principalmente a:
Hay demasiada muestra en la columna.
La columna es corta.
La fase mvil no discrimina entre los componentes.
La columna es demasiado gruesa.
3.4. Determinacin de la concentracin de un compuesto.
Los tres mtodos principales de evaluacin son:
3.4.1. Normalizacin de rea.
Se puede utilizar en los casos en los que el cromatograma representa la muestra
completa, en la que todos los componentes se han separado y que cada pico se ha
resuelto completamente y el factor de respuesta es el mismo para todos los
componentes. Procedimiento:

42

1. Se mide el rea bajo cada pico individual.

2. Se suman todas las reas de los picos obteniendo el rea total calculada.
3. Se obtiene el porcentaje en volumen de los componentes individuales.
rea individual *100/rea total
3.4.2. Calibracin con patrones o estndar.
En un sistema cromatogrfico estable, el tiempo de retencin de un soluto particular es
constante, y por lo tanto puede utilizarse para identificar ese soluto. En algunos casos,
los tiempos de retencin pueden predecirse a partir de los tiempos conocidos de otros
miembros de la serie homloga. Se utilizan compuestos, tanto de procedencia comercial
o purificados en el propio laboratorio. Cuando no se tienen disponibles los compuestos
de referencia debe recurrirse a la informacin estructural independiente que
proporcionan otras tcnicas espectroscpicas. Los estndares deben analizarse bajo las
mismas condiciones de operacin que la muestra.
1. Preparacin de soluciones patrn con concentraciones conocidas.
2. Obtencin del rea de cada componente y de su factor de respuesta.
3. Extrapolacin para determinar la concentracin del compuesto problema.
3.4.3. Patrn interno.
Este mtodo permite que varen las condiciones de operacin entre muestra y muestra y
no requiere de repetibilidad en las inyecciones. El patrn debe cumplir las siguientes
condiciones:

Que pueda resolverse completamente de los picos adyacentes.

Que no est presente en la muestra problema.

Que no produzca ningn efecto interferente.

El procedimiento es el siguiente:
1. Se obtienen los cromatogramas de cada estndar y se calcula el factor de
respuesta relativo(FRR):
FRR=(Concentracin comp rea pint)/(Concentracin pint rea comp)
43

2. Se aade una cantidad conocida del patrn interno a la mezcla

desconocida.
3. El cociente entre las reas del pico de componente a determinar y la de
patrn interno en la muestra problema se obtiene usando el factor F
Concentracin comp = FRR (Concentracin pint rea comp / rea pint)
3.5. Problemas ms comunes encontrados en HPLC.
Presin alta:
Posible causa: Obstruccin de la columna de HPLC o precolumna por partculas.
Solucin:

Limpiar con solvente compatible teniendo la columna desconectada del

detector.

Reemplazar la frita a la entrada de la columna.

Reemplazar la columna.

Solucin a largo plazo: Asegurarse que todas las fases mviles se filtren antes de la
entrada de la bomba. Filtrar todas las muestras antes de inyectarlas.
Prdida de resolucin
Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o precolumna por partculas.
La solucin es la misma que para el caso de la presin alta.
Variacin en los tiempos de retencin
Posible causa: Aire atrapado en la bomba debido a gases disueltos en fase mvil.
Solucin: Purgar la bomba y desgasificar la fase mvil.
Solucin a largo plazo: Asegurarse que la fase mvil est adecuadamente desgasificada.
Si se usa desgasificacin electrnica en lnea asegurarse que el flujo no es demasiado
elevado para evitar la desgasificacin completa.

44

Variaciones de la lnea base

Posible causa: Burbujas del aire atrapadas en la celda del detector debido a una mala
desgasificacin de los solventes de la fase mvil.
Solucin: Asegurarse que la fase mvil est adecuadamente y considerar el uso de un
controlador de presin a la entrada del detector.
Lnea base con mucho ruido
Posible causa: Aire atrapado en celda del detector o en la bomba.
Solucin: Enjuague del sistema y purgado de la bomba.
Picos falsos (detectores electroqumicos y de fluorescencia)
Posible causa: Oxgeno Disuelto
Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la concentracin
de oxgeno disuelto.
Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin de vaco en lnea.
Peridicamente chequear el nivel de oxgeno disuelto.
Baja o ninguna presin
Posible causa: Perdidas de fase mvil. Trabajar con bombas, sellos o pistones
defectuosos o gastados.
Solucin: Reemplazar los sellos o pistones.

45

4. INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA DE GASES

4.1. Generalidades.
La cromatografa agrupa a un conjunto de mtodos analticos que permiten al
investigador separar e incluso en algunos casos identificar los componentes presentes en
mezclas complejas. En toda separacin cromatogrfica intervienen dos fases, una mvil
y otra estacionaria. La fase mvil acta como disolvente y vehiculiza el paso de la
muestra a analizar a travs de la fase estacionaria, que ha de ser inmiscible, y
normalmente se ubica en una columna o un soporte slido.
La diferente afinidad de los analitos hacia las dos fases que conforman el sistema,
determina la desigual velocidad de migracin de estos componentes a travs de la fase
estacionaria, lo que facilita su separacin en bandas diferenciadas que pueden analizarse
tanto a nivel cualitativo como cuantitativo.
La cromatografa de gases es una variante dentro de la cromatografa, en la que la
muestra a analizar se volatiliza e inyecta directamente en la cabeza de una columna
cromatogrfica.
Es sin duda la tcnica de mayor capacidad de separacin y sensibilidad a la hora de
analizar componentes voltiles. El hecho de que los componentes de una mezcla se
separen en fase gaseosa establece los lmites de su utilizacin, entre ellos destaca la
estabilidad trmica de los compuestos a separar. Se suele trabajar con componentes de
peso molecular inferior a 1000 y una temperatura mxima de trabajo por debajo de los
400 C, dependiendo claramente de las caractersticas fsicas del relleno de la columna
cromatogrfica.
Como su propio nombre indica, en este proceso analtico de separacin, la fase mvil es
un gas inerte, que a diferencia de otras tcnicas cromatogrficas, no interacciona con el
analito, su nica funcin es la de transportar la muestra a lo largo de la fase estacionaria.
Atendiendo a la naturaleza de la fase estacionaria se pueden distinguir dos tipos de
cromatografa de gases:
9 Cromatografa gas-slido
9 Cromatografa gas-lquido

46

En la cromatografa gas-slido, la fase estacionaria es un slido en el que se produce la

retencin de los componentes a separar por adsorcin fsica. Su aplicabilidad es limitada
como consecuencia de la excesiva retencin de componentes polares, lo que genera una
inadecuada resolucin del cromatograma.
La separacin depende de los equilibrios de adsorcin /desorcin de los componentes
entre la fase mvil gaseosa y la fase estacionaria slida. La fuerza con la que es
adsorbido el componente depende de su polaridad y de la actividad del adsorbente, por
lo que es ms apropiada para la separacin de componentes de polaridad media y baja.
La cromatografa gas-lquido se basa en la distribucin de un componente entre una fase
mvil gaseosa y un lquido inmovilizado sobre un slido inerte, es decir en el
mecanismo de particin. La mayor o menor migracin de un componente a travs de la
columna depende del coeficiente de reparto del mismo entre la fase mvil y la
estacionaria. Este tipo de cromatografa es adecuado para componentes voltiles con
polaridad media alta.
La elucin de los componentes a travs de la columna conlleva el transporte de los
mismos como consecuencia de la entrada de forma continua de fase mvil, lo que
permite la distribucin o el reparto de los componentes en ambas fases. Dependiendo de
la afinidad del componente hacia la fase estacionaria (cuando esta sea polar) y/o de su
volatilidad, puesto que la fase mvil es un gas inerte, obtendremos diferentes
velocidades de migracin de los componentes a travs de la columna. Los compuestos
as separados salen de la columna y pasan a un sistema de deteccin -previamente
seleccionado en funcin de las caractersticas de la muestra analizada- para ser
posteriormente registrados y obtener as un cromatograma.

4.2. Instrumentacin.
Bsicamente, los componentes de un cromatgrafo de gases se esquematizan en:
9 Suministro y entrada de gas portador
9 Puerto de inyeccin
9 Columna cromatogrfica ubicada en cmara termostatizada (horno)
9 Detector

47

9 Sistema de tratamiento de datos

para analizar, registrar e imprimir el

cromatograma.

4.2.1. Gas portador.

Como ya ha sido comentado anteriormente el gas utilizado como fase mvil en
cromatografa gaseosa es un gas qumicamente inerte, los ms utilizados son helio,
argn, nitrgeno, dixido de carbono e hidrgeno. La eleccin del tipo de gas portador
depende fundamentalmente del sistema de deteccin que se utilice, aunque tambin
afecte a la velocidad de migracin de los componentes a lo largo la fase estacionaria.
Los gases se suministran normalmente en botellas de gas presurizado de elevada pureza
y que se conectan al sistema cromatogrfico mediante reguladores de presin,
manmetros y medidores de flujo.
El caudal de gas se controla normalmente con reguladores de presin colocados en la
bala de gas y algn regulador de presin o de flujo instalado en el propio cromatgrafo.
De esta forma el control de la velocidad de la fase mvil dentro de la columna se regula
mediante vlvulas que suministran el gas a un caudal constante (x ml/min) o bien
mantienen la presin constante en cabeza de columna.

4.2.2. Puertos de inyeccin.

La finalidad del inyector en cromatografa de gases es la de volatilizar la muestra e
incorporarla a la corriente del gas portador para poderla introducir en la columna
cromatogrfica.
Un inyector puede considerarse como una cmara termostatizada aislada trmicamente
en cuyo interior se sita el sistema de inyeccin. La muestra a analizar (tanto lquida
como gaseosa) se introduce en el sistema de inyeccin mediante una microjeringa que
atraviesa un diafragma perforable, conocido como septum. Este septum tiene la
capacidad de auto -sellarse cuando retiramos la aguja del inyector.
De esta forma la muestra entra en una cmara de vaporizacin, conocida como cmara
de mezcla o liner, vaporiza de forma inmediata y se mezcla con el gas portador para ser
arrastrada e introducida directamente en cabeza de columna. La cmara de mezcla est

48

fabricada con material inerte, vidrio, cuarzo, acero inoxidable y se mantiene a unos
50 C por encima del punto de ebullicin del componente menos voltil de la muestra.
El volumen de inyeccin de muestras en columnas analticas suele ser de microlitros
(entre 0.1-20L), pero para columnas capilares se requieren volmenes mucho menores
fundamentalmente por problemas de saturacin ( 10-3 L) y por los daos ocasionados
por volmenes importantes de disolvente.
En estos casos el propio sistema de inyeccin presenta sistemas capaces de introducir
nicamente pequeas cantidades de muestra dentro de la columna. Entre los ms
utilizados destacan:
4.2.2.1. Divisor de flujo
Situado al final de la cmara de mezcla, es un sistema tambin conocido como Split
que permite, como su propio nombre indica, dividir el flujo de gas portador mezclado
con la muestra vaporizada en dos fracciones, una entra directamente en cabeza de
columna y la otra se expulsa hacia el exterior mediante una vlvula de aguja que regula
la cantidad de muestra que entra en columna. De esta forma cuando indicamos en el
mtodo cromatogrfico que se aplica un Split 100:1, estamos introduciendo una parte de
la mezcla en columna y enviamos a la atmsfera el 99 restante.
Mediante este sistema se pierde bastante sensibilidad y lgicamente no pueden
analizarse componentes presentes a muy baja concentracin. En estos casos se acude al
sistema de inyeccin sin divisin de flujo, splitless
4.2.2.2. Splitless
Sistema de inyeccin diseado para que la totalidad de la muestra entre en cabeza de
columna, de tal manera que puedan identificarse componentes traza.
La temperatura de la columna ha de estar por debajo del punto de ebullicin del
componente ms voltil de la mezcla, favoreciendo as la condensacin de la muestra en
la columna y actuando el disolvente como trampa donde se concentran los componentes
voltiles a determinar. Transcurrido un tiempo, no superior normalmente a los 0.6 min,
la vlvula de purga del inyector se abre para eliminar el resto de disolvente acumulado
en el inyector y volver de nuevo a las condiciones cromatogrficas habituales.
4.2.2.3. Sistemas on-column

49

Dispositivo de inyeccin de la muestra directamente en cabeza de columna. Presenta

innumerables ventajas, ya que al no existir cmara de vaporizacin ni divisin de flujo,
la totalidad de la muestra entra en columna. El sistema est diseado para que una parte
de la propia columna acte como cmara de mezcla. El mecanismo de actuacin es
prximo al splitless, y se requieren de sistemas especiales de inyeccin, en el que se
incluyen vlvulas y agujas de silicona extremadamente finas que puedan introducirse en
la cabeza de una columna capilar.
4.2.2.4. Espacio de cabeza
El aislamiento de voltiles mediante la extraccin de un volumen de aire del espacio
libre sobre un recipiente, seguido de una inyeccin directa en un cromatgrafo de gases,
quiz sea el ms representativo de los anlisis de la composicin de la fraccin voltil
de una muestra.
La muestra a analizar se introduce en un vial hermticamente cerrado y provisto de un
septum por el que poder introducir la aguja de la microjeringa para extraer as la
fraccin voltil. Es importante, previo a la extraccin, dejar un tiempo prudencial la
muestra hasta que se alcance el equilibrio de concentraciones de los componentes entre
las fases del sistema (muestra/espacio de cabeza).
El portal de inyeccin cuenta con un horno y en ocasiones incluso tambin con sistema
de agitacin, para favorecer la migracin de los componentes voltiles desde la matriz
slida o lquida hacia el espacio de cabeza.
Para la inyeccin de la muestra el portal de inyeccin cuenta con una jeringa
termostatizada con sistema de desplazamiento del mbolo por presurizacin.

4.2.3. Columnas cromatogrficas.

En cromatografa de gases se emplean dos tipos de columnas, las empaquetadas y las
capilares. Por capacidad resolutiva, en la actualidad las columnas capilares han
sustituido casi en su totalidad a las empacadas o de relleno.
Las principales diferencias entre ambos tipos de columna son el grosor y la longitud.
Las columnas empaquetadas, normalmente de vidrio o acero, tienen un dimetro interno
que vara entre 2 y 5 mm y una longitud comprendida entre 1 y 15 m.
Sin embargo las capilares de forma generalizada, estn fabricadas con vidrio o slice
fundida y presentan un dimetro interno entre 0,2 y 0,8 mm y una longitud de 20-50m.

50

Las columnas capilares, las de mayor inters, se presentan en dos formatos bsicos, uno
como capilares de pared recubierta (WCOT) y otra como capilares de soporte recubierto
(SCOT).
En las WCOT, la fase estacionaria por lo general es un lquido con unas pocas dcimas
de micrmetros de espesor que recubre uniformemente el interior del tubo capilar. En
las SCOT la superficie interna del capilar est recubierta por una capa fina ( 30 m de
espesor) de un soporte adsorbente sobre el que se impregna la fase estacionaria lquida.
La fase estacionaria tiene un papel fundamental en la cromatografa gaseosa, ya que
como se ha explicado anteriormente, la fase mvil es un gas inerte, por lo tanto la
capacidad resolutiva depende de las interacciones que se den entre la fase estacionaria y
los componentes de la mezcla.
Entre las caractersticas que ha de tener esta fase destacan: el ser estable trmicamente
con un amplio rango de temperatura de trabajo, normalmente entre 4 y 400 C,
tambin ha de ser qumicamente inerte y por su puesto selectiva frente a los
componentes a separar. El lmite de temperatura al que puede someterse la fase
estacionaria es aquella en la que no se produzcan descomposiciones que causen el
conocido sangrado de la columna, es decir la aparicin de artefactos o picos que
enturbian o contaminan nuestro cromatograma.
El tiempo de retencin de un componente depende de su coeficiente de distribucin, el
cual est directamente relacionado con la naturaleza qumica de la fase estacionaria, es
por tanto que para que exista una adecuada separacin la fase estacionaria ha de originar
diferentes coeficientes de distribucin para los distintos componentes. Estos
coeficientes no han de ser ni extremadamente grandes ni pequeos. Si el coeficiente de
distribucin es grande el componente tardar mucho tiempo en eluir (se obtendrn picos
cromatogrficos anchos y con cola), mientras que si el coeficiente de distribucin es
pequeo, el componente eluir muy rpido y no obtendremos una adecuada separacin.
Por lo tanto, para que un componente tenga un tiempo de retencin adecuado ha de
existir cierta compatibilidad entre el compuesto y la fase estacionaria, referida
fundamentalmente a la polaridad de ambos, es decir, generalmente la polaridad de la
fase estacionaria ha de ser prxima a la de los componentes de la muestra.

51

Cuando esto ocurre, el orden de elucin de los componentes viene determinada por su
volatilidad, es decir, por su punto de ebullicin.
Ejemplos de fases estacionarias de menor a mayor polaridad podran ser:
Polidimetilsiloxano, de uso general indicada para la separacin de hidrocarburos,
aromticos pluinucleares, esteroides..
Poli(fenilmetidifenil) siloxano, se emplea para la separacin de steres metlicos de
cidos grasos, alcaloides, compuestos halogenados..

Polietilen glicol, totalmente polar, adecuada para el anlisis de cidos libres, alcoholes,
aromas, glicoles..
Para impedir la prdida de relleno de la columna, es decir el sangrado, causado por el
paso de los disolventes en los que se encuentra diluidas las muestras a analizar, o bien
por el uso de elevadas temperaturas, en la actualidad la mayora de las fases
estacionarias que encontramos en el mercado son fases estacionarias polimerizadas o
enlazadas. La fase estacionaria se trata in situ mediante reacciones que permiten enlazar
la fase estacionaria a la superficie de slice de las columnas o bien por entrecruzamiento
de las molculas que componen la fase estacionaria para conseguir un retculo
tridimensional difcil de desplazar.
La columna enrollada, considerando su longitud, se sita en el interior de un horno que
permite mantener la columna ternostatizada, con gran precisin, de tal manera que el
sistema nos permita realizar rampas de temperaturas programadas en el tiempo para la
correcta separacin de los componentes a analizar. Esto nos permite separar
componentes por puntos de ebullicin.
As, si la naturaleza tanto de la fase estacionaria, como de los componentes es apolar, la
interaccin entre ambos ser escasa y por lo tanto la elucin y separacin de los analitos
en columna se deber fundamentalmente a sus diferentes puntos de ebullicin.

52

4.2.4. Detector
Una vez que los componentes abandonan la columna estos son redirigidos directamente
hacia un sistema de deteccin capaz de generar una seal directamente proporcional a la
concentracin del componente eluido.
La seal emitida por el detector nicamente varia con la llegada de un nuevo
componente, de tal manera que la seal producida por el paso del gas portador se
corresponde a la seal de fondo del detector, o lo que es lo mismo, a la lnea base del
cromatograma.
Por lo tanto, la seal emitida con la deteccin de un componente ser la suma de la seal
del gas portador ms la del propio analito.
Las caractersticas ptimas que ha de presentar un detector se pueden resumir en:
-

Adecuada sensibilidad

Estabilidad y reproducibilidad en el tiempo

Linealidad en la respuesta a varios rdenes de magnitud

Intervalo amplio de temperatura de trabajo

Tiempo de respuesta corto

Dependiendo de lo deseado, no selectivo, es decir que tenga respuesta semejante

para todos los componentes, o por el contrario selectivo, para la identificacin de
determinadas molculas, reduciendo significativamente la complejidad del
cromatograma.

No destructivo con la muestra.

En cromatografa de gases los detectores ms utilizados se pueden catalogar en dos

grandes grupos:
-Detectores universales
- Detectores especficos
Entre los detectores universales destacan:

detector de ionizacin de llama (FID) y el

detector de conductividad trmica (TCD).

Detectores especficos: detector termoinico (TID), selectivo de molculas orgnicas
que contienen fosforo y nitrgeno; detector de captura de electrones, sensible a

53

molculas que tienen en su estructura halgenos, perxidos, quinonas.., se utiliza

bastante en la determinacin de insecticidas clorados.
Dado el nivel bsico de este curso, nicamente se har referencia al detector universal
ms utilizado, el detector de ionizacin de llama (FID).
Este tipo de detector es selectivo para todos los componentes que tengan en su
estructura enlaces C-H, por lo tanto pocos componentes se escapan a la deteccin en
este sistema universal.
Consta de un quemador en el que el efluente de la columna se mezcla con nitrgeno y
aire para luego encenderse elctricamente. A nivel de llama los componentes orgnicos
se pirolizan produciendo iones y electrones que pueden conducir la electricidad a travs
de la llama. Por encima de la llama se sita un colector polarizado que recoge los iones
formados y de esta forma se mide la corriente inica entre la llama y el colector. El
nmero de iones que se producen es directamente proporcional al nmero de tomos de
carbono transformados.
Este detector no es adecuado para la deteccin de grupos funcionales carbonilo, alcohol,
halgenos y amina, ya que generan pocos iones en la llama o prcticamente ninguno.

4.3. Optimizacin de la separacin e identificacin.

Los principales parmetros a tener en cuenta para conseguir una adecuada separacin
croamtogrfica, seguida de la deteccin de los componentes, a parte de la eleccin de la
columna y el sistema de deteccin, han de tenerse en cuenta los siguientes parmetros:
-Velocidad del gas portador en columna.
-Temperatura de inyeccin
-Condiciones de temperatura en el horno: Isoterma o rampa de temperatura/ tiempo
-Temperatura del sistema de deteccin
Los actuales sistemas de inyeccin en cromatografa permiten controlar la velocidad de
flujo del gas portador en columna mediante el control del flujo, es decir se puede
trabajar a flujo constante, o bien mantener la presin de entrada del gas portador en
cabeza de columna constante.

54

Los gases, a diferencia de otros fluidos, aumentan su densidad con el incremento de la

temperatura, por lo tanto si se trabaja a flujo constante, por ejemplo 1 ml/min, la presin
en cabeza de columna ir aumentando con forme aumente la temperatura en el horno
para as mantener la velocidad de flujo constante. Por el contrario si se mantiene la
presin en cabeza de columna, la velocidad del flujo en columna disminuir tambin
con el aumento de la temperatura.
Esto afecta en gran medida a la separacin de los componentes y a la resolucin del
cromatograma. Como se ha comentado anteriormente, componentes retenidos en
columna generan picos anchos y aquellos que eluyen rpidamente no consiguen una
adecuada separacin.
Por lo tanto conviene establecer previamente la velocidad del gas en columna.
La temperatura del inyector debe ser lo suficientemente elevada para que se consiga la
total vaporizacin de la muestra. Normalmente una temperatura de 250 C es suficiente
para garantizar este hecho.
El empleo de rampas de temperatura/tiempo en el horno suele ser el ms indicado para
la separacin de componentes en mezclas complejas. La temperatura inicial del horno
depender del carcter voltil de los analitos, normalmente se comienza con el punto de
ebullicin del componente ms voltil, para seguidamente aplicar incrementos de
temperaturas en tiempos prefijados. Cuanto ms lento sea el incremento de temperatura
la separacin debe mejorar, pero siempre dentro de unos lmites, teniendo en cuenta los
problemas de retencin anteriormente mencionados.
La temperatura del detector siempre debe estar por encima de la del inyector, para de
esta manera evitar problemas de condensacin.
4.4. Aplicaciones de la cromatografia gas lquido.
La croamtografa de gases permite tanto el anlisis cualitativo como el cuantitativo de
los componentes presentes en las muestras analizadas.
A este respecto, el nico factor diferenciador entre la cromatografa lquida
anteriormente descrita y la de gases, es a nivel cualitativo la identificacin de los
componentes atendiendo a su ndice de retencin.

55

Este ndice, tambin conocido como ndice de Kovats, permite identificar componentes
a partir de los cromatogramas. Para ello han de inyectarse en el cromatgrafo una
mezcla de alcanos de cadena lineal, que tengan tiempos de retencin anteriores y
posteriores al de los componentes a identificar.
Por definicin, el ndice de retencin de un alcano es 100 veces el nmero de tomos de
carbono que posee, por ejemplo un hidrocarburo aliftico de 8 tomos de carbono tiene
un ndice de retencin de 800, por su puesto sin considerar las caractersticas de la fase
estacionaria, ni las condiciones de inyeccin en el cromatgrafo, es decir, este valor es
independiente de la columna y de las condiciones cromatogrficas establecidas. Sin
embargo, los ndices de retencin de los dems componentes varan considerablemente
dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria utilizada en la separacin y las
condiciones de temperatura aplicadas.
Para calcular estos ndices se realiza la inyeccin de una mezcla de n-alcanos en
condiciones isotermas, por ejemplo una mezcla del nC4 al nC20. La representacin del
logaritmo decimal del tiempo de retencin corregido TR= (TR-TM) frente al nmero de
tomos de carbono ha de ser lineal. Por interpolacin en la recta podemos conocer el
ndice de retencin del componente de inters.
En el clculo matemtico de los ndices de kovats para un determinado componente ha
de considerarse tanto el tiempo de retencin como el nmero de tomos de carbono de
los hidrocarburos que eluyen inmediatamente antes y despus del componente a
identificar, de esta forma se aplica la expresin:

TR (n)
TR (A)
TR (N)

I=100N+100

log T R(A) log T R (N)

log T R (n) log T R (N)

TR (A) Tiempo ajustado del analito A

TR (N) Tiempo ajustado del n-alcano con N tomos de C
TR (n) Tiempo ajustado del n-alcano con (n =N+1) tomos de C

Figura 4.1. Expresin matemtica para el clculo de los ndices de retencin.

56

Otra forma de determinar los ndices de retencin de los componentes de inters,

consiste en inyectar la mezcla de n-alcanos bajo las mismas condiciones
cromatogrficas que la muestra analizada. De esta forma la ecuacin obtenida,
normalmente, es exponencial de orden cuatro, y nos permite extrapolar el tiempo de
retencin del componente de inters con su ndice de retencin en condiciones ms
afines a la realidad de la columna y las condiciones cromatogrficas de inyeccin.

Figura 4.2. Clculo de los ndices de Retencin mediante ajuste cuadrtico

Algunos ejemplos de ndices de retencin para los mismos componentes eluyendo en
columnas con diferente polaridad se expresan en la Tabla 4.1.

Tabla 4.1. ndices de Retencin de hidrocarburos terpnicos en columnas de diferente

polaridad
Componentes

IR

IR

Columna Apolar

Columna Polar

- thujene

960

1064

-pinene

965

1071

camphene

973

1082

57

sabinene

987

1106

4.5. Acoplamiento de la cromatografa de gases a la espectrometra de masas.

Continuando con los mtodos de deteccin cualitativos utilizados en cromatografa de
gases, el mtodo espectroscpico brinda las posibilidades de conocer la estructura
molecular de componentes desconocidos y a su vez, de cuantificar compuestos
conocidos. Entre las ventajas de este sistema destaca el hecho de que la deteccin de
compuestos puede ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeas (del orden de
pmoles) de muestra y an as obtener informacin caracterstica como el peso molecular
y algunas veces la estructura del analito.
Esta tcnica se basa en la obtencin de iones a partir de molculas en estado gasesoso.
La tcnica ms empleada para la ionizacin de las muestras es la de impacto electrnico
(EI), por el que algunas molculas llegan a estallar generando fragmentos ionizados.
Estos iones se separan en funcin de su masa y su carga para ser posteriormente
identificados en el correspondiente sistema de deteccin. Como consecuencia
obtendremos un espectro de masas en el que aparecen los diferentes iones en funcin de
su relacin masa/carga, con los que podremos identificar el peso molecular y la
estructura molecular del componente de inters. La presencia de determinados iones y
su abundancia relativa dependen de la estructura de la molcula y por lo tanto pueden
considerarse como huellas qumicas para la identificacin de los componentes.
Los pesos atmicos y moleculares se expresan en unidades atmicas de masa (amu),
aunque tambin se nombran como dalton.
El proceso de la espectrometra de masas comprende bsicamente cuatro etapas:
9 Ionizacin de la muestra.
9 Aceleracin de los iones por un campo elctrico.
9 Dispersin de los iones segn su masa/carga.
9 Deteccin de los iones y produccin de la correspondiente seal elctrica.

58

4.6.- Componentes de un espectrmetro de masas.

En el diagrama de flujo correspondiente a la Figura 4.3 quedan esquematizados los
componentes bsicos de un espectrmetro de masas.

Figura 4.3. Diagrama de flujo de los componentes de un espectrmetro de masas.

4.6.1. Sistemas de introduccin de muestras

El objetivo del sistema de introduccin de muestras es el de permitir la entrada de una
pequea cantidad de muestra, previamente volatilizada, en la fuente de iones con la
menor prdida posible de vacio en el sistema.
Hoy en da, en el mercado, se encuentran tres sistemas de introduccin: indirecta,
directa, y a travs de un cromatgrafo.
Los sistemas indirectos de entrada son los ms clsicos y simples, en ellos la muestra se
volatiliza externamente y se introduce en la regin de ionizacin sometida a vacio. El
sistema de entrada es normalmente de vidrio para evitar posibles prdidas por
adsorcin.
En la entrada por sonda o directa los lquidos y los slidos no voltiles se pueden
introducir en la regin de ionizacin mediante un soporte para muestra o sonda, el cual
se inserta a travs de un cierre de vaco. Las sondas tambin se usan cuando la cantidad
de muestra es limitada ya que se pierde mucha menos cantidad.

59

El que nos ocupa es el sistema de entrada a travs del cromatgrafo y este es el que se
desarrolla a continuacin.
El acoplamiento directo del cromatgrafo de gases al espectrmetro de masas cuenta
con la ventaja de la volatilizacin previa de los componentes ya separados en la
columna cromatogrfica. Con el uso de columnas capilares, el flujo es tan bajo que
permite el acoplamiento directo del fin de la columna a la cmara de ionizacin. Si se
utilizan columnas empacadas, ha de instalarse previamente un separador de chorro que
permita eliminar la mayor parte del gas portador (He) que arrastra a los componentes.

4.6.2. Fuente de iones

Fundamentalmente existen dos tipos de ionizacin de una muestra en estado gaseoso,
una es por impacto electrnico (bombardeo de la muestra con electrones) y la otra por
ionizacin qumica.
En la ionizacin por impacto electrnico (EI), las molculas se ionizan por impacto de
un haz de electrones a elevada energa. Los electrones proceden de un filamento
incandescente que emite electrones acelerados por la existencia de una diferencia de
potencial entre la fuente y el filamento. De esta forma los electrones adquieren energas
entre 5 y 70 eV. Para enfocar la direccin de los iones se aplica un campo magntico
paralelo a movimiento de los electrones que describen un movimiento helicoidal hacia
el nodo que los recoge.
Los analtos separados previamente en columna atraviesan este haz de electrones de
elevada energa y al entrar en colisin con ellos pueden ocurrir los siguientes procesos:
1.- Eliminacin de un electrn: ABC + e2.- Eliminacin de dos electrones: ABC + e3.- Captacin de un electrn: ABC + e4.- Disociacin de la molcula: ABC + e-

ABC+ + 2 eABC2+ + 3 eABCAB+ + C-

60

De todas ellas lo que ocurre con mayor probabilidad es la primera, obteniendo de esta
forma un ion molecular ABC+
A continuacin, para poder separar los iones de los electrones se utiliza una placa con
carga positiva capaz de repeler a los iones. Para sacar las molculas ionizadas de la
fuente de iones se aplica una diferencia de potencial elctrico (1-10 Kv) entre el final de
la fuente y una placa situada a continuacin.
Dependiendo de la energa con la que se aceleren los electrones, es decir la energa de
impacto sobre las molculas, en muchas ocasiones se llega a superar la energa mnima
de ionizacin, por lo que las molculas ionizadas quedan cargadas de energa que les
permiten reaccionar posteriormente. Tambin ha de tenerse en cuenta que no todas las
molculas reciben la misma energa en el impacto, por lo tanto se obtienen molculas
ionizadas con amplios rangos de energa.
Pueden darse reacciones secundarias como la expresada en el siguiente disociacin, con
todas las posibles combinaciones.

ABC+

A+ + BC

Al trabajar en condiciones de alto vaco se impiden las reacciones bimoleculares, con lo

cual el ion molecular de mayor masa se corresponder con el pico molecular que nos
dar la informacin acerca del peso molecular del analito en cuestin.
La ionizacin qumica, se consigue por la transferencia de carga de un in bimolecular a
la molcula que queremos identificar.
Para ello se introduce metano CH4 en la fuente de iones a una presin de 1 mm de Hg,
los electrones ionizan al metano y posteriormente tiene lugar una reaccin bimolecular:

CH4+ + CH4

CH5+ + CH3
In metonio

61

Este ion metnio es el que reacciona con la molcula a estudiar dando lugar a su
ionizacin:

ABC + CH5+

ABCH+ + CH4
In molecular

4.6.3. Analizador de masas

Estos iones as generados han de separarse para poder analizarlos de forma individual,
por esto a la salida de la fuente de iones se incorpora un analizador de masas. De entre
los ms empleados destacan, el de campo magntico, el quadrupolar (el ms empleado
en sistemas acoplados a la cromatografa de gases), la trampa inica, y el tiempo de
vuelo (MS-TOF).
Analizador cuadrupolar: Formado por cuatro barras metlicas de seccin circular o
hiperblica dispuestas paralelamente dentro de una circunferencia, de tal manera que el
haz de iones las atraviesa por el centro.
Cada pareja de barras opuestas se conectan entre s elctricamente, y una tensin de
radiofrecuencia se aplica entre un par de varillas y el otro. Un voltaje de corriente
continua se superpone a continuacin, en la tensin de RF. Los iones viajan por el
cuadrupolo entre las barras. Slo los iones de una determinada masa/carga llegarn al
detector para una proporcin dada de tensiones: Otros iones tienen trayectorias
inestables y chocan con las varillas. Esto permite la seleccin de un ion con un
particular, m/z o permite que el operador busque un rango de m/z-valores variando
continuamente la tensin aplicada. As podremos trabajar en mtodo SIM (un solo in
molecular) o SCAN (cromatograma con todos los iones generados).
Analizador de triple cuadrupolo: Sistema formado por una serie lineal de tres
cuadrupolos conocido como espectrmetro de masas de triple cuadrupolo.
El primer y tercer cuadrupolo actan como filtros de masas, y el cuadrupolo de en
medio se emplea como una celda de colisin. En esta celda se producen colisiones
inducidas que conllevan a la disociacin de un ion precursor previamente seleccionado

62

Q1. Fragmentos posteriores se pasan a travs de Q3 en los que pueden ser filtrados o
totalmente escaneados.
Este proceso permite el estudio de los fragmentos que son cruciales en la elucidacin
estructural. Por ejemplo, el Q1 se puede establecer en "filtro" de un ion de drogas de
masa conocida, que est fragmentada en la Q2. El tercer cuadrupolo a continuacin,
puede ser configurado para analizar toda la gama de m/z, que da informacin sobre las
intensidades de los fragmentos realizados. Por lo tanto, se puede deducir la estructura
del ion original.
El analizador de trampa de iones se usa ms en cromatografa gaseosa como sistema de
deteccin que como analizador de masas. Se considera como una variante del sistema
cuadrupolar. Consta de tres electrodos dispuestos de tal forma que crean una cavidad en
la que ocurre la ionizacin, fragmentacin y anlisis de masas.

4.6.4. Detector
Dentro de los diferentes tipos de detectores que pueden encontrarse en el mercado
destacan:
9 Caja de Faraday
9 Multiplicador de electrones
9 Placa fotogrfica
La caja o copa de Faraday, como su propio nombre indica es una caja en cuyo interior
se encuentra un placa, sobre esta placa chocan los iones arrancando electrones de la
misma y as se neutralizan. La corriente electrnica desprendida es directamente
proporcional a la cantidad de iones neutralizados.
El multiplicador de electrones, consta de diversas placas recubiertas con xidos de
tierras raras. Cuando los iones inciden sobre la superficie de la primera placa provocan
la salida de electrones que son acelerados hacia una segunda placa y as sucesivamente.
Normalmente se emplean entre 10 y 16 placas. Las ventajas de este tipo de detector es
que consigue amplificar la seal de la corriente de iones del orden de 106 veces, aunque
no es muy preciso a niveles cuantitativos.

63

La placa fotogrfica se utiliza en contadas ocasiones, principalmente cuando se

requieren altas sensibilidades, por lo que no se desarrolla en la presente memoria.

4.7. Aplicaciones de la espectrometra de masas.

Esta tcnica es til en la identificacin y cuantificacin tanto de componentes conocidos
como desconocidos.
En el sistema acoplado de cromatografa de gases/espectrometra de masas, la
identificacin se realiza en base al espectro de masas obtenido, que puede ser
comparado directamente con el de un estndar de referencia analizado en las mismas
condiciones.
En la actualidad estos sistemas acoplados poseen libreras o bibliotecas informatizadas
comerciales, con las que comparar los espectros obtenidos y que ayudan a la
identificacin de los componentes. Existen libreras muy extensas, pueden considerarse
inespecficas y libreras muy especficas de componentes concretos como aromas o
plaguicidas con las que realizar la comparacin de espectros para la identificacin.
Tambin existe la posibilidad de que el propio usuario realice su librera mediante la
inyeccin de estndares de referencia puros. Si esto es posible la identificacin ser
mucho ms fiable, puesto que como se ha comentado anteriormente factores como la
temperatura de la fuente de iones, la energa del haz de electrones, todo esto afecta a
las proporciones relativas entre iones dentro del espectro.
A nivel cuantitativo, el espectrmetro de masas puede operar en dos modos diferentes,
el modo SIM y el modo SCAN, comentado en el apartado del analizador de masas.
Cuando tenemos clara la identificacin de un componente es posible seleccionar un
nico ion con m/z especfica para la cuantificacin, es decir, por el analizador de masas
nicamente se deja pasar este ion especfico para cada componente, sin efectuar
barridos de masas (SCAN). Por lo tanto, obtendremos seales cromatogrficas en el
tiempo correspondientes a iones especficos. El anlisis cuantitativo se realizar en base
a sistemas lineales de calibracin, puesto que el rea bajo el pico es directamente
proporcional a la concentracin del componente.

64

Este modo de trabajo (SIM) presenta la gran ventaja de cuantificar componentes de

forma ms exacta, puesto que se elimina la aportacin al rea bajo la curva de posibles
coeluciones de componentes que no han sido separados correctamente a su paso por la
columna cromatogrfica.
4.8. Interpretacin de un espectro.
La lectura de un espectro de masas, ms all de la propia identificacin de un
componente con la ayuda de las libreras comerciales, puede ser en ocasiones la nica
forma de dilucidar la estructura de un componente.
Como se ha comentado con anterioridad, un espectro de masas proviene de las
reacciones qumicas experimentadas por las molculas en estado de excitacin
energtica elevado. Como resultado los fragmentos que encontremos dependern del
comportamiento qumico de cada molcula.
Este comportamiento es predecible y puede interpretarse con conocimientos bsicos de
qumica orgnica.
Iones:
Ion Molecular: Es sin duda el ms importante de todos ellos, procedente de las
reacciones primarias ocurridas. Es el ion M+, de exactamente el mismo peso molecular
que la molcula inicial, en l solo se ha perdido un e-. Por lo tanto es primordial como
punto de partida a la hora de conocer la estructura del componente, puesto que sirve
para interpretar el resto de iones presentes en el espectro de masas. Las diferencias de
masas entre los fragmentos deben ser qumicamente lgicas.
El pico base es el de mayor abundancia relativa y se le asigna el 100%

65

Pico Base

M+

Figura 4.4. Espectro de masas del hexano. Identificacin del ion molecular y pico base

A nivel bsico, siguiendo las reglas generales de fragmentacin podemos llegar a

interpretar un espectro. Entre ellas destacan:
1. Los enlaces C-C se fragmentan con preferencia en los puntos de ramificacin,
quedando la carga positiva sobre el catin ms estable.

Fuente: http://datateca.unad.edu.co
2. Los sistemas de dobles enlaces (entre ellos los aromticos) favorecen la escisin
de los enlaces arlicos y benclicos. La carga positiva quedar normalmente
formando un carbocatin arlico o benclico. En este ltimo caso debemos hacer
notar que no es un catin bencilo lo que se forma sino que este sufre un
reagrupamiento dando lugar a la formacin del in troplio (C7H7+) que es ms
estable que aquel al ser aromtico.
66

Ion tropilio

Fuente :http://www.liceoagb.es/quimiorg/masas2.html
m/z= 91

En este espectro se observa claramente el ion molecular (108), el pico base (79). Con
respecto a las fragmentaciones, la prdida del grupo hidroxilo (OH) explica la
formacin del ion tropilio, la prdida del radical CH2OH, est reflejada en el ion 77,
catin fenilo.
3.- Los heterotomos (O, N, Cl y S) como donadores de electrones, favorecen la
fragmentacin de los enlaces del tomo de carbono que lo soporta.
Entre las fragmentaciones ms comunes podemos encontrar:
Prdida de un hidrgeno (M-1); eliminacin de un grupo metilo CH3 (M-15); prdida de
un grupo amino (NH), de un oxgeno, o de un metano (CH4) (M-16); eliminacin de un
hidroxilo (OH) (M-17); prdida de una molcula de H2O (M-18)..; eliminacin de un
metoxilo (MeO-) (M-31)..
Ejemplos de fragmentaciones de molculas con heterotomos:
Fragmentacin del 3-pentanol

67

Fragmentacin de la 4-heptanona

Fuente:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/4.2InterpretacionEspectrometriadeMasas_2
463.pdf

68

5. ESPECTROMETRA DE EMISIN DE PLASMA ACOPLADA

INDUCTIVAMENTE (ICP).
5.1. Tcnicas espectromtricas.
La espectroscopia se basa en el estudio de la interaccin entre la radiacin y la materia
como funcin de la longitud de onda (). La espectrometra es la tcnica
espectroscpica para cuantificar la concentracin o la cantidad de especies determinadas
mediante un instrumento denominado espectrmetro o espectrgrafo. Esta tcnica
instrumental permite determinar un gran nmero de elementos en una gran variedad de
matrices, basada en la identificacin de analitos mediante el espectro emitido o
absorbido por los mismos, pudindose diferenciar entre atmica o de masas.
En Espectrometra Atmica podemos medir la luz absorbida o emitida por un tomo al
pasar del estado fundamental al estado excitado o viceversa. En funcin de ello, se
clasifica en espectrometra de absorcin o de emisin atmica.
Espectrometra de Absorcin Atmica. Mide la luz absorbida por un tomo en estado
fundamental al pasar al estado excitado.

Figura 5.1. Trnsito electrnico en un proceso de absorcin de energa en un tomo.

Hay muchas maneras en que los tomos pueden ser llevados a un estado excitado.
Dependiendo de la procedencia de la fuente de excitacin, se pueden encontrar
diferentes tcnicas de espectrometra de absorcin atmica:

Espectrometra de Absorcin Atmica con Llama (F-AAS).

Espectrometra de Absorcin Atmica con Atomizacin Electrotrmica (ET-AAS).

Espectrometra de Absorcin Atmica con Generacin de Hidruros (HGAAS.)

69

Espectrometra de Absorcin Atmica con Vapor Fro (CV-AAS).

Espectrometra de Emisin Atmica. Mide la luz emitida por un tomo excitado al pasar
al estado fundamental.

Figura 5.2. Proceso de emisin de energa cuando un electrn recupera su estado

fundamental.
Analiza las longitudes de onda de los fotones emitidos por los tomos o molculas
durante su transicin desde un estado excitado a un estado de inferior energa. Cada
elemento emite un conjunto caracterstico de longitudes de onda discretas en funcin de
su estructura electrnica. Mediante la observacin de estas longitudes de onda puede
determinarse la composicin elemental de la muestra.
Las diferentes tcnicas de espectrometra de emisin se clasifican en funcin de la
fuente de excitacin:

Espectrometra de Emisin con Llama (F-AES).

Espectrometra Atmica de Emisin con Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICPAES). La energa que se transfiere a los elementos del analito proviene de un plasma
de acoplamiento inductivo (ICP) que proporciona altas temperaturas, evaporan y
calcinan los componentes de la muestra y convierten los tomos a su estado excitado
o ionizado. Estos estados tienen vida muy corta y alta energa, volviendo a su forma
relajada emitiendo una radiacin especfica. Para cada elemento, la longitud de onda
de la radiacin es caracterstica y la intensidad es proporcional a su concentracin en
la solucin de la muestra.

Espectrometra de Masas con Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-MS). La

energa se transfiere mediante un ICP a temperaturas an ms altas para producir
partculas cargadas elctricamente que se separan en funcin de su relacin

70

masa/carga y son analizadas por un espectrmetro de masas. Es el mtodo estndar

para el anlisis de elementos ultratraza ya que los lmites de deteccin estn en el
rango de partes por trilln, generalmente 2-3 rdenes de magnitud menores que con
ICP-AES. No obstante, la matriz puede causar un cierto nmero de interferencias.

5.2. Espectrometra atmica de emisin con plasma acoplado inductivamente (ICPAES).

Los trabajos pioneros sobre la formacin y estabilizacin de estos plasmas, se inician en
los aos sesenta (Reed, 1961), y fueron la base de los primeros estudios analticos para
determinaciones de trazas de elementos metlicos, mediante el uso de plasmas
acoplados inductivamente como fuentes de excitacin y que surgieron de forma
simultnea en Inglaterra y en Estados Unidos. A partir de los aos 70, comienza la
difusin de esta tcnica en los laboratorios de investigacin apareciendo los primeros
equipos comerciales en 1974.
Mediante esta tcnica es posible la determinacin cualitativa y cuantitativa de los
elementos qumicos que constituyen un material con gran rapidez, precisin y exactitud.
5.2.1. Fundamentos de la tcnica.
Es una tcnica de emisin espectroscpica basada en el hecho de que los electrones
excitados emiten energa a una longitud de onda dada cuando vuelven a su estado
fundamental despus de su excitacin por un plasma de argn de elevada temperatura.
La energa emitida es inversamente proporcional a la longitud de onda de la radiacin
electromagntica y viene dada por la expresin:
E = hc/
Donde h es la constante de Planck, c es la velocidad de la luz y es la longitud de onda
de la radiacin emitida.
La caracterstica fundamental de este proceso es que en cada elemento se producen
mltiples trnsitos electrnicos y por tanto se emiten mltiples radiaciones de mltiples
longitudes de onda ligadas a su carcter atmico. La energa transferida por los
71

electrones cuando vuelven a su estado fundamental y por tanto la es nica y

caracterstica para cada elemento y dependen de la configuracin electrnica del orbital.

Figura 5.3. Ejemplos de los mltiples trnsitos electrnicos que pueden ocurrir en los
procesos de absorcin y emisin de energa en un tomo.
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Aunque cada elemento emite energa a multitud de longitudes de onda, en la tcnica de
ICP-AES es normal seleccionar una nica longitud de onda (o muy pocas) para un
elemento determinado. Estas radiaciones, caractersticas de cada elemento, se separan
en funcin de su longitud de onda y finalmente se mide su intensidad. La intensidad de
la energa emitida a la longitud de onda elegida es proporcional a la cantidad
(concentracin) del elemento en la muestra. As, determinando qu longitudes de onda
son emitidas por una muestra y midiendo sus intensidades, el analista puede encontrar
cualitativamente y cuantitativamente el elemento de la muestra dada en relacin a unos
patrones de referencia. La seleccin de la longitud de onda nos permite determinar el
elemento cualitativamente, mientras que la intensidad de la radiacin emitida nos
proporcionar la informacin para poder cuantificarlo.
Las longitudes de onda usadas en AES van desde la parte baja del ultravioleta (160 nm)
hasta el lmite del visible (800 nm). Mediante la espectroscopia de emisin con plasma
de acoplamiento inductivo es posible determinar la mayora de los elementos de la tabla
peridica a niveles de traza y ultratraza.

72

5.2.2. Descripcin del equipo.

Un sistema tpico de anlisis elemental por espectroscopa con un plasma con fuente de
excitacin y atomizacin est constituido por un plasma, una fuente de alimentacin, un
sistema de introduccin de la muestra, un sistema ptico, un sistema de tratamiento de
la seal, gases y otros accesorios.

Figura 5.4. Espectrmetro de emisin de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES).

5.2.2.1. Plasma.
Qu es un plasma? El plasma se puede considerar el cuarto estado de la materia. Se
trata de un gas parcialmente ionizado, conductor de la electricidad, con una
concentracin significativa de cationes y electrones (la concentracin de ambos es tal
que la carga neta se aproxima a cero) y confinado en un campo electromagntico. Es un
estado de equilibrio entre partculas cargadas y neutras de un gas ionizado. El nmero
de iones y electrones en el interior del plasma no supera el 1%. Desde el punto de vista
analtico la caracterstica ms importante del plasma son las elevadas temperaturas que
se generan (hasta 10000 K).
En el plasma de argn que se emplea en los anlisis de emisin, los iones argn y los
electrones son las principales especies conductoras, aunque los cationes de la muestra
tambin estn presentes en menor cantidad. En el seno del argn tiene lugar el siguiente
proceso:

73

Ar Ar+ + eEn conjunto, en el plasma existen diferentes especies: electrones libres, iones argn,
tomos de argn excitados, tomos de argn en estado fundamental y molculas de
argn ionizadas y neutras. Las tres primeras especies ceden su energa a los tomos de
los elementos de la muestra introducida en el plasma, energa suficiente para excitar a la
mayora de los tomos del sistema peridico.
Los iones argn, una vez que se han formado en un plasma, son capaces de absorber
suficiente potencia de una fuente externa, como para mantener un nivel de temperatura
en el que la ionizacin adicional sustenta el plasma indefinidamente.
5.2.2.2. Fuente de alimentacin.
Para conseguir la ionizacin y mantener el anterior equilibrio es necesario un aporte de
energa. En espectroscopia de plasma de argn se han empleado tres tipos de fuentes de
alimentacin que aportan la energa externa:

Fuente de corriente continua (DCP).

Potente campo de microondas (MIP).

Potente campo de radiofrecuencias (ICP, Inductively Coupled Plasma). Plasma

acoplado inductivamente, es la fuente que parece ofrecer mayores ventajas en
relacin con la sensibilidad y la ausencia de interferencias.

Para conseguir la ionizacin se hace circular el gas por una serie de tubos concntricos,
que constituyen la antorcha, pieza clave en un equipo de plasma.
La antorcha consiste en tres tubos concntricos de cuarzo a travs de los cuales fluyen
corrientes de argn. Los tubos ms externos tienen la misin de transportar el argn; por
el tubo interno (inyector) llega la muestra en forma de aerosol hasta el interior de la
llama originada por el plasma. El dimetro del tubo ms grande es aproximadamente
de 2.5 cm. Rodeando la parte superior de este tubo se encuentra una bobina de
induccin refrigerada por agua, alimentada por un generador de radiofrecuencias capaz
de producir una potencia de 0.5-2 kW a unos 27-41 MHz.

74

Debido a las altas temperaturas que tiene que soportar, la antorcha ha de estar fabricada
forzosamente de un material refractario. El tubo interior, por donde asciende la muestra,
puede ser de cuarzo, almina o circonia, dependiendo de la solucin que se pretenda
analizar. La bobina de induccin que rodea al tubo exterior est colocada de forma que
pese a su proximidad, no origine contactos. Los tubos intermedio e interior suelen llegar
al nivel inferior de la bobina, siendo por tanto de menor longitud que el exterior.
La antorcha puede ser fija (tres tubos soldados formando una unidad) o desmontable
(tubos independientes). La antorcha desmontable se limpia con facilidad mientras que la
fija mantiene la altura de los tubos, factor que influye en la reproducibilidad de la
formacin del plasma.
Del diseo de la antorcha van a depender gran parte de las caractersticas del equipo, ya
que condiciona no slo el tiempo de permanencia de la muestra en la llama, que es la
zona de excitacin, sino que el mantenimiento del equilibrio en el seno del plasma
tambin depende de su configuracin.

Figura 5.5. Diferentes modelos de antorcha en los que se aprecian los tres tubos
concntricos as como la entrada de las corrientes de argn.
En una primera etapa es necesario iniciar la ionizacin del gas con una fuente energtica
auxiliar, chispa Tesla. La ionizacin originada de esta forma se mantiene mediante la
corriente de alta frecuencia que fluye a travs de la bobina de induccin. Esta corriente

75

produce un campo magntico, cuyas lneas de fuerza se orientan axialmente a la bobina.

Los iones resultantes y sus electrones asociados interaccionan con el campo magntico
oscilante que se produce por la bobina de induccin. Esta interaccin hace que los iones
y los electrones dentro de la bobina se muevan en trayectorias anulares cerradas que se
representan en la Figura 5.6. Este movimiento crea corrientes elctricas, que a causa de
los choques de los iones y electrones con las molculas de gas producen un
calentamiento de los gases por efecto Joule, proporcionando la continuidad del plasma.

Figura 5.6. Esquema de una fuente tpica de plasma de acoplamiento inductivo

denominada antorcha.
En el extremo superior de la antorcha aparece, debido a los tomos ionizados, una
especie de llama. El aspecto del plasma es el de una llama brillante y sin fluctuaciones
76

que tiene una forma toroidal, que se puede variar modificando el flujo de argn y la
potencia de la fuente de corriente de radiofrecuencia que genera el plasma. Una
disminucin excesiva del flujo produce un desplazamiento del plasma hacia las paredes
del tubo exterior, produciendo un deterioro del mismo. La luminosidad azulada del
plasma proviene de los tomos de argn en su continua excitacin-desexcitacin.
La temperatura del plasma as formado es suficientemente elevada como para hacer
necesario el aislamiento trmico del cilindro externo de cuarzo. Para lograr este
aislamiento se hace fluir argn por el tubo externo en forma tangencial alrededor de las
paredes como indican las flechas en la figura, con un caudal de argn de 5-15 L/min. El
flujo tangencial enfra las paredes interiores del tubo central y centra el plasma
radialmente. Por el tubo intermedio viaja la mayor parte del argn que es utilizado por
el plasma (flujo auxiliar) mientras que el que circula en vrtice se utiliza para
enfriamiento.
Como consecuencia de este diseo de la antorcha, las zonas axiales son relativamente
fras, si se comparan con las circundantes y es, por tanto, a travs de ellas por donde se
inyectan las muestras dentro de la fuente de excitacin y atomizacin, en forma de
aerosol.

Figura 5.7. Diferentes temperaturas en una fuente caracterstica de plasma acoplado

inductivamente.

77

La Figura 5.7 muestra las temperaturas en varias zonas del plasma. En el momento en
que los tomos de la muestra alcanzan la zona de observacin, habrn permanecido
unos 2 ms a temperaturas comprendidas entre 4000-8000 K. Estos tiempos y
temperaturas son aproximadamente 2-3 veces mayores que los que se dan en las llamas
ms calorficas utilizadas en los mtodos de llama. Por tanto, la atomizacin es ms
completa y hay menos problemas de interferencias qumicas. De manera sorprendente
los efectos de interferencia por ionizaron son pequeos o no se producen, debido
probablemente a que la concentracin de electrones que provienen de la ionizacin del
argn es grande en comparacin con la que resulta de la ionizacin de los componentes
de la muestra.
En un plasma caracterstico, el ncleo blanco brillante y muy intenso, que se extiende
algunos milmetros por encima del tubo, consiste en una emisin continua a la que se
superpone el espectro atmico del argn. El origen de la emisin continua proviene
aparentemente de la combinacin de los electrones con el argn y otros iones. En la
zona situada entre 10-30 mm por encima del ncleo la emisin continua se desvanece y
el plasma es pticamente trasparente. Las observaciones espectrales por lo general se
hacen a una altura de 15-20 mm por encima de la bobina de induccin. En esta zona la
radiacin de fondo est claramente libre de las lneas del argn y resulta adecuada para
el anlisis. La zona de observacin debe encontrarse alineada con la rendija de entrada
del espectrmetro.

Figura 5.8. Plasma acoplado inductivamente. A la derecha del plasma se aprecia la

rendija de entrada del espectrmetro (nariz).
78

5.2.2.3. Sistema de introduccin de la muestra.

La muestra, en forma liquida, es transportada por medio de una bomba peristltica hasta
el sistema nebulizador. La funcin del nebulizador es a travs de un flujo de argn crear
un aerosol con gotitas de tamao pequeo y uniforme, puesto que solo las gotitas
pequeas se transportan al plasma. Este aerosol es conducido a la zona del plasma por el
extremo superior de los tubos mediante un flujo de Ar de 0.3-1.5 L/min a travs del
tubo de cuarzo central. Este flujo de Ar tiene como misin proporcionar un flujo
constante de muestra al plasma. Este aspecto es fundamental a la hora de obtener
buenos resultados cuantitativos.
El sistema de nebulizacin debe aportar una cantidad suficiente de aerosol pero a una
velocidad de arrastre lenta, con objeto de que permanezca el mayor tiempo posible en
contacto con el plasma y de esta forma conseguir una excitacin correcta de la muestra.
La introduccin de la muestra es importante a la hora de estudiar las posibles
interferencias, ya que, en muchos casos, se deben a los efectos de nebulizacin y de
transporte de la muestra (tiempo que tarda la muestra en llegar al plasma, ...) y con
frecuencia constituye la mayor fuente de ruido en un mtodo de ICP.
Existen diferentes tipos de nebulizadores en funcin de sus caractersticas: eficacia
segn caudal de la muestra, tolerancia a slidos suspendidos o disueltos, tolerancia a
cidos y bases fuertes y a solventes orgnicos, posibilidad de que la muestra cause
efecto memoria, capacidad de aspiracin, etc.

Nebulizador concntrico. Pulverizacin de la muestra lquida introducida a travs de

un tubo central por medio de un flujo de Ar que viaja en un tubo externo y
concntrico al de la muestra. Mejora considerablemente la relacin seal/ruido y
minimiza el gasto de Ar, sin embargo se obturan fcilmente por acumulacin de
micropartculas o slidos disueltos. Adems estn construidos de vidrio por lo que no
son resistentes al HF y su cambio es caro.

79

Figura 5.9. Nebulizador concntrico. La cmara spray separa y desecha las grandes
gotas de disolucin que se han formado, para que solo las pequeas se encuentren en
suspensin en el flujo de gas y alcancen el plasma.

Figura 5.10. Nebulizador concntrico con cmara spray (a) donde se aprecian las
entradas de Ar y la de muestra (b). Cmara spray desmontada (c).
Aunque los nebulizadores concntricos son muy utilizados en ICP, se han desarrollado
otros con objeto de aumentar el rendimiento. Los nebulizadores ultrasnicos
incrementan la sensibilidad entre 3 y 10 veces.

Nebulizador ultrasnico. La muestra alimenta una superficie donde existe un

trasductor piezoelctrico que trabaja a una frecuencia de 0.2-10 MHz. La onda
longitudinal, que se propaga perpendicular a la superficie del transductor hacia la
interfase aire-lquido, produce una presin que rompe la superficie en un aerosol.

80

Nebulizador Cross-Flow. Se basa en un spray ascendente donde un chorro horizontal

de gas pasa o cruza la parte superior del tubo por donde se inyecta la muestra,
rompindose en una nube de pequeas gotas.

Nebulizador Babington. El gas introducido a presin convierte en aerosol una pelcula

de lquido que fluye sobre la superficie de una esfera.

Otro mtodo que se puede utilizar para la introduccin de muestras lquidas y slidas en
un plasma es la vaporizacin electrotrmica en la que se utiliza un horno electrotrmico
para la introduccin de la muestra.
5.2.2.4. Sistema ptico.
La tcnica ICP-AES se basa en la observacin de los espectros de emisin de los
tomos excitados o ionizados que emiten radiaciones caractersticas para cada elemento.
El sistema ptico tiene como finalidad separar cada una de las radiaciones
monocromticas que forman el haz policromtico y que una vez focalizadas sobre un
monocromador, se transforman elctricamente en datos que permiten la identificacin y
cuantificacin de cada uno de los elementos que constituyen la muestra, ya que la
radiacin electromagntica producida al liberar la energa absorbida en el plasma por los
tomos as excitados para pasar a su estado fundamental es caracterstica de cada
elemento.
Los aparatos utilizados en espectroscopia de emisin, se pueden dividir en dos tipos
desde el punto de vista ptico: monocromticos o secuenciales (con una rendija de
entrada y una de salida, red de difraccin mvil) y policromticos o multicanal (una
rendija de entrada y varias de salida, red de difraccin fija).

Figura 5.11. Esquema de trabajo de los instrumentos secuenciales (arriba) y multicanal

(abajo).

81

Instrumentos secuenciales. Son menos complejos y por tanto ms baratos, miden las
intensidades de lnea una por una. Se programan para ir de la lnea de un elemento a la
de otro, parando el tiempo suficiente (unos pocos segundos) para obtener una relacin
seal/ruido satisfactoria. La red hologrfica se acciona mediante un motor de pasos
que permite ir cambiando la longitud de onda en pequeos incrementos. Cuando se
han de determinar varios elementos, es evidente que el tiempo de excitacin ser
bastante mayor con los instrumentos secuenciales, por ello aunque estos instrumentos
son ms simples, resultan caros en trminos de consumo muestra y tiempo.

Figura 5.12. Ejemplo de monocromador secuencial (prisma de Bunsen).

Instrumentos multicanal. Se disean para medir simultneamente las intensidades de

las lneas de emisin de un gran nmero de elementos. La Figura 5.13 muestra
esquemticamente un instrumento caracterstico. En este caso la rendija de entrada, las
rendijas de salida y la superficie de la red se localizan a lo largo de la circunferencia
de un crculo de Rowland, cuya curvatura corresponde a la curva focal de la red
cncava. La radiacin que proviene de las distintas rendijas fijas se refleja mediante
espejos hacia los tubos fotomultiplicadores. Las rendijas vienen fijadas por el
fabricante para transmitir las lneas de los elementos elegidos por el usuario. La
rendija de entrada se puede mover tangencialmente al crculo de Rowland mediante
un motor de pasos. Este dispositivo permite el barrido a travs de los picos y
proporciona informacin para las correcciones del fondo.

82

Figura 5.13. Ejemplo de monocromador multicanal (crculo de Rowland).

En ambos tipos de instrumentos, las seales de los tubos fotomultiplicadores que
transforman la seal ptica en impulsos elctricos, se amplifican y se recogen mediante
circuitos condensador/resistor para su integracin; a continuacin los voltajes de salida
se digitalizan y se transforman en concentraciones.
5.2.2.5. Sistema de tratamiento de la seal.
Por ltimo, el equipo ICP posee un sistema de proceso de datos que ayuda al analista en
todo el proceso, no slo en el control del sistema ptico, introduccin de la muestra y
calibrado del equipo, sino tambin en la recogida y tratamiento de datos. Es capaz de
realizar la correccin de fondo o de solapamiento entre espectros y comprobar las
posibles interferencias entre los elementos antes de proceder a un anlisis cuantitativo.
5.2.3. Caractersticas del plasma de acoplamiento inductivo (ICP).
Las peculiares caractersticas del sistema de excitacin por plasma hacen de la tcnica
ICP-AES una valiosa herramienta universal para el anlisis de los elementos de la tabla
peridica. Es una tcnica con gran aceptacin, justificada por las caractersticas
83

analticas de la misma ya que se pueden detectar y determinar cuantitativamente la

mayor parte de los elementos.

Pueden detectarse y determinarse cuantitativamente la mayor parte de elementos de la

tabla peridica (> 70). Adems es una tcnica multielemental.

Produce la excitacin de las lneas ms sensibles para casi todos los elementos.

La mayor temperatura del ICP comparada con la combustin en llama permite la

determinacin de bajas concentraciones de elementos que tienden a formar
compuestos refractarios (esto es, compuestos que son muy resistentes a la
descomposicin trmica o por otros tratamientos rigurosos), tales como P, B, W, Zr,
U.

Determinacin de no metales como cloro, bromo, yodo y azufre.

La temperatura en la seccin transversal del plasma es relativamente uniforme y como

consecuencia de ello, no se producen los efectos de autoabsorcin y autoinversin, por
lo que se obtienen curvas de calibrado con amplios mrgenes lineales (hasta 6 rdenes
de magnitud a diferencia de otros mtodos que solo abarcan uno o dos). Este gran
margen lineal permite la determinacin simultnea de constituyentes mayoritarios,
minoritarios de trazas, en las mismas condiciones de excitacin y sin necesidad de
realizar diluciones ni otras operaciones sobre la muestra.

Alta precisin y reproducibilidad (hasta 0.3%).

Menos interferencias qumicas debido a que la elevada temperatura y el mayor tiempo

de residencia del analito en el plasma (2 ms a 4000-8000 K) hace que la atomizacin
sea ms completa. Adems la atomizacin tiene lugar en un medio inerte, que evita la
formacin de xidos.

Menos interferencias de ionizacin a pesar de la mayor temperatura, debido al efecto

tampn de los electrones procedentes de la ionizacin del argn.

Tcnica muy robusta (capaz de aceptar un cambio en la composicin de la matriz, sin

producir un cambio en la seal del analito) y por tanto con poco efecto matriz debido
a que entre 10-30 mm por encima de la bobina de induccin, la emisin debida al
fondo es mnima.

Al no haber electrodos, no hay problemas relacionados con su contaminacin, como

en los mtodos de arco o chispa.

84

La fuente presenta una gran estabilidad durante largos periodos de operacin. Por ello,
no es necesario un recalibrado frecuente, a diferencia de los mtodos de llama, arco o
chispa.

Los lmites de deteccin para muchos elementos son excelentes. Suelen ser mejores
que con otros procedimientos como llama, arco o chispa. Para niveles de 10 ppb o
menos se pueden detectar ms elementos mediante excitacin con plasma que con
otros mtodos de emisin o absorcin (excepto para la atomizacin electrotrmica).

Tabla 5.1. Lmites de deteccin para diferentes tcnicas espectromtricas (g/L).

Elemento

F-AAS

ET-AAS

F-AES

ICP-AES

Al

30

0.005

As

100

0.02

0.0005

40

Ca

0.02

0.1

0.02

Cd

0.0001

800

Cr

0.01

0.3

Cu

0.002

10

0.1

Fe

0.005

30

0.3

Hg

500

0.1

0.0004

Mg

0.1

0.00002

0.05

Mn

0.0002

0.06

Mo

30

0.005

100

0.2

Na

0.0002

0.1

0.2

Ni

0.02

20

0.4

Pb

10

0.002

100

Sn

20

0.1

300

30

20

0.1

10

0.2

Zn

0.00005

0.0005

Por tanto la tcnica ICP-AES proporciona gran calidad en anlisis multielemental, pues
con ella se obtienen ptimos resultados para muchos elementos. Adems, es posible
trabajar con casi las mismas condiciones de operacin para muchos de ellos. La calidad
de estos resultados radica en la gran estabilidad, bajo ruido, poca radiacin de fondo y
en la ausencia de interferencias de las fuentes, cuando se opera en las condiciones
experimentales apropiadas.
Sin embargo, cabe destacar entre los principales inconvenientes de esta tcnica analtica
que se requieren equipos ms complejos y caros que por ejemplo los utilizados en los de
absorcin atmica, adems de presentar mayores costes de operacin debido al alto
consumo de argn.
85

5.2.4. Aplicaciones del ICP-AES.

Esta tcnica se emplea para una amplia variedad de aplicaciones, ya que un gran
nmero de elementos pueden ser determinados rpidamente a niveles traza (ppm, ppb),
y adems permite el anlisis de una amplia variedad de tipos de muestras.

Agricultura y alimentos. Anlisis de suelos, fertilizantes, materias vegetales,

alimentos, etc. Determinacin de metales y posibles contaminantes. Requiere una
rigurosa preparacin de la muestra.

Biologa y anlisis clnico. Determinacin de elementos txicos en orina, sangre,

heces, leche materna, tejidos, etc. El mayor problema de los ensayos de este campo
est en la contaminacin de las muestras antes del anlisis. Ejemplos de
determinaciones: Cr, Ni y Cu en orina, Al en sangre, Cr en heces, Ni en leche
materna, B, P y S en huesos.

Geologa. Determinacin de la procedencia de sedimentos y rocas a travs de su

composicin. Las aplicaciones van desde los elementos mayoritarios, minoritarios y
las trazas.

Medio ambiente y aguas. Evaluacin de la contaminacin de suelos y aguas:

determinacin de metales y contaminantes en diferentes tipos de aguas: aguas
continentales, potables, vertido, salmueras y aguas de mar. Incluye anlisis de
sedimentos, tejidos animales y vegetales. Se requiere un tratamiento previo de la
muestra con digestiones cidas, microondas, etc.

Metales. Una dificultad asociada es el gran nmero de interferencias espectrales de

algunos metales. Aun as, se obtienen buenos resultados.

5.3. Aspectos a estudiar en anlisis mediante ICP-AES.

5.3.1. Preparacin de la muestra.
Muchos materiales de inters tales como suelos, tejidos animales, plantas, derivados del
petrleo y minerales requieren de un tratamiento previo laborioso para obtener una
disolucin del analito adecuada para la atomizacin. Esta parte es la ms conflictiva del
anlisis de tejidos. La descomposicin o disolucin de una muestra analtica debe ser
una parte integral de cualquier anlisis qumico y no se han encontrado mtodos nicos
86

que sean igualmente satisfactorios para todo tipo de material. De hecho, las etapas de
descomposicin y disolucin a menudo introducen ms errores que las propias medidas
espectroscpicas.
Los reactivos que se utilizan en la descomposicin de la muestra, pueden introducir
interferencias qumicas y espectrales. Adems el analito puede estar presente en estos
reactivos como impureza. Puede ocurrir que en el anlisis de trazas los reactivos
introduzcan ms elementos de inters que las propias muestras.
No hay mtodos generales de mineralizacin y posterior disolucin aplicables a la
valoracin simultnea de un conjunto de elementos minerales en diversos vegetales. En
la prctica se adoptan mtodos especficos para los diversos elementos y vegetales
estudiados. La eleccin del mtodo depender de la composicin de la matriz y de las
tcnicas analticas que se usarn posteriormente.
Para la descomposicin y disolucin de las muestras, algunos de los procedimientos
habituales que se utilizan incluyen el tratamiento con cidos minerales en caliente, la
oxidacin con reactivos lquidos como los cidos sulfrico, ntrico o perclrico
(mineralizacin por va hmeda), la combustin en una bomba de oxgeno u otro tipo de
contenedor cerrado (para evitar la prdida de analito), mineralizacin a alta temperatura;
y la fusin a elevada temperatura con reactivos como xido brico, carbonato de sodio,
perxido de sodio o pirosulfato de potasio. Aqu se describen dos de los mtodos ms
utilizados de mineralizacin de la muestra.
a)

Acenizacin en seco. Con la acenizacin de la muestra va seca el agua y

sustancias voltiles son evaporadas, mientras que las sustancias orgnicas son
incineradas en presencia del oxigeno del aire para producir CO2 y xido de nitrgeno.
La mayora de los minerales son convertidos a xidos, sulfatos, fosfatos, cloruros y
silicatos. La muestra en crisol de porcelana se calienta en horno mufla a 550C
durante 2 horas o ms. Para evitar la formacin de llamas se aumenta la temperatura
lentamente hasta aproximadamente 200C para quemar la materia orgnica,
aumentndola posteriormente hasta 550C. Las cenizas formadas se disuelven en HCl
o algn otro cido apropiado. En esta solucin pueden determinarse tanto macro como
micronutrientes de la muestra, a excepcin de los voltiles. Temperaturas entre 450-

87

550 C producen prdidas insignificantes para la mayora de los elementos, excepto

para As, Se, Hg, Sb y halgenos, principalmente.
Cuando se emplea la va seca en aquellos materiales vegetales con alto contenido de
silicatos (arroz, gramneas, pastos, cereales..., etc.), el residuo silceo puede adsorber
cantidades apreciables de algunos elementos y la extraccin cida subsecuente puede
no disolver todo el Zn, Cu, Fe o Mn. Se debe proceder a la eliminacin del SiO2 con
FH, calentando suavemente para expulsar este cido y disolviendo, finalmente, el
residuo en el mismo disolvente utilizado para poner en solucin la mayor parte de las
cenizas obtenidas.
b)

Acenizacin hmeda. Es un procedimiento en el cual se oxidan las sustancias

orgnicas usando cidos y agentes oxidantes o sus combinaciones. Los minerales son
solubilizados sin volatilizacin. El procedimiento consiste en oxidar la muestra en
presencia de HNO3, H2SO4 o HCIO4, calentando primero a baja temperatura, y
aumentndola progresivamente hasta lograr la destruccin de toda la materia
orgnica. Hay que tener la precaucin de no dejar secar la disolucin para no perder el
P y el As.
El empleo de H2SO4 en la destruccin de materia orgnica en matrices vegetales
produce alteraciones en los resultados de varios elementos debido a la formacin de
sales insolubles que adsorben especialmente micronutrientes. La utilizacin de mezcla
sulfo-ntrica (pequea proporcin de H2SO4 frente al HNO3) hirviendo hasta
desprendimiento de humos blancos y densos de SO3 suele funcionar bastante bien
para muestras vegetales, pero puede ser muy lento con tejidos animales.
Se ha establecido como mtodo de referencia la utilizacin de la mezcla HNO3HCIO4, debido a su eficacia ya que no altera prcticamente la composicin aninica.
Sin embargo, presenta el discutido problema de una posible explosin en el curso de
la mineralizacin, sobre todo en presencia de grandes contenidos de materia orgnica
por lo que se debe calentar con precaucin. Al principio comienza el proceso de
oxidacin el cido ntrico, desprendindose humos pardos de vapores nitrosos.
Cuando la temperatura alcanza los 150C deber haberse destruido la mayor parte de
la materia orgnica fcilmente.

88

En la eleccin de un mtodo de destruccin de la materia orgnica u otro se debern

tener en cuenta aspectos como los elementos a determinar, tipo y tamao de la muestra,
precisin y exactitud requeridos en los resultados, mtodo rutinario u ocasional, tiempo
y costo ya que cada uno de ellos presenta sus ventajas e inconvenientes:
Ventajas de la va seca frente a la hmeda:

La acenizacin va seca cuando deben determinarse elementos menores tiene la

ventaja de que no se aaden reactivos y, por tanto, se mantiene la contaminacin a un
mnimo.

La necesidad de vigilancia constante en la va hmeda y la posibilidad de altos valores

del blanco, lo sitan como mtodo de rutina menos adecuado.

En la va hmeda se emplean reactivos corrosivos y solamente se puede manipular un

pequeo nmero de muestras.

Aunque en la va hmeda el tiempo de la oxidacin es corto se toma virtualmente todo

el tiempo del operador.

Ventajas de la va hmeda frente a la seca:

Muy aplicado a muestras con alto contenido en grasas (carnes y derivados).

Se utilizan temperaturas ms bajas (menos de 350C) y hay poca probabilidad de

prdida de los elementos por volatilizacin.

Cuando se emplea la va hmeda, la slice formada est completamente deshidratada

y, por lo tanto, la adsorcin de micronutrientes es despreciable.

En cuanto al tiempo requerido en cada mtodo hay que destacar que en la va seca el
proceso total es de aproximadamente 4-6 horas. Los procedimientos por va hmeda no
consumen un mayor tiempo que los de va seca, considerado de una manera absoluta.
Ahora bien, desde un punto de vista real, los segundos son ms rpidos que los primeros
si tenemos en cuenta que la operacin de calcinacin de la muestra puede realizarse
durante la noche, restando para la jornada de trabajo solamente el proceso de disolucin
de las cenizas. Por tanto, el mtodo por va seca es ms rpido, de una muy aceptable
precisin y exactitud y debe usarse, preferentemente, a una temperatura de 450-550C
para la determinacin conjunta del mximo nmero de macro y micronutrientes.

89

5.3.2. Rectas de calibrado e interferencias.

Para realizar la cuantificacin de los analitos presentes en la muestra se utilizan rectas
de calibracin ya que, en teora, la intensidad de la radiacin emitida debe ser
directamente proporcional a la concentracin. Sin embargo, pueden encontrarse
desviaciones de la linealidad, y es arriesgado realizar un anlisis sin determinar
experimentalmente si existe o no una relacin lineal. Por consiguiente, se debe preparar
peridicamente una curva de calibracin que cubra el intervalo de concentraciones que
se encuentran en la muestra.
Idealmente, los estndares de calibrado deben aproximarse a la composicin de las
muestras a analizar, no solo respecto a la concentracin del analito sino tambin
respecto a las concentraciones de las otras especies de la matriz de la muestra, con el
objeto de minimizar los efectos de los diversos componentes de la muestra en la medida
de la absorbancia. Desgraciadamente, cuando se analizan materiales complejos la
preparacin de estndares que reproduzcan las muestras es, muchas veces, imposible o
extremadamente difcil. Entonces, debe verificarse que no existan interferencias que
comprometan la exactitud del resultado analtico.
Las interferencias surgen debido a las diferencias en composicin de la muestra
analizada y de los estndares externos y los blancos utilizados para la calibracin.
Pueden subdividirse en interferencia por el blanco o aditiva e interferencia por la matriz
o multiplicativa.
Una interferencia aditiva puede ser causada por los componentes de la matriz que
producen una seal no compensada independiente de la concentracin de analitos. Tal
interferencia puede corregirse usando un sistema de correccin del fondo (background)
o restando a la seal de la muestra, la seal de un blanco que contiene exactamente la
misma cantidad del interferente que la muestra. Debe mencionarse tambin que tanto la
contaminacin con el analito como la prdida de ste producen errores del tipo aditivo.
Las interferencias multiplicativas o de la matriz son causadas por componentes de la
matriz que alteran la respuesta de la seal del componente analito en una forma
proporcional a la seal (por ejemplo cambio en la pendiente de la lnea de calibracin).
La separacin del elemento objetivo de los elementos de la matriz es una forma

90

eficiente de evitar tales problemas pero por lo general, ocupa mucho tiempo y es
costosa. Por lo tanto, se escogen otros enfoques para minimizar las interferencias de la
matriz tales como el mtodo del estndar interno, la compatibilizacin de matrices o el
mtodo de adicin de estndar:

Mtodo del estndar interno. Una concentracin conocida de un elemento de

referencia xr se agrega a todas las muestras, estndares y blancos. La seal del analito
yj es comparada con la seal del estndar interno yr. La curva de calibracin se
prepara graficando la relacin entre la seal del analito y la seal de referencia yj/yr
frente a la concentracin del analito de los estndares xi. Las especies de referencia,
por lo general son escogidas por tener propiedades qumicas y espectroscpicas
similares a aquellas del analito de tal modo que la seal analtica del analito y del
estndar interno cambien proporcionalmente cuando ocurren los efectos de la matriz.

Mtodo de la compatibilizacin de la matriz. Los estndares se preparan para que se

asemejen lo ms posible a la matriz de la muestra donde se determina el analito. Este
mtodo se utiliza principalmente para muestras con una matriz simple.

Mtodo de adicin de estndar. Se utiliza para matrices complicadas o desconocidas.

Se toman volmenes iguales de solucin de la muestra; se agregan cantidades
conocidas y crecientes del elemento que ha de analizarse a todas las soluciones
exceptuando a una. Todas las soluciones son diluidas al mismo volumen y se miden.
La adicin de estndar puede aplicarse slo si existe una relacin lineal entre la seal
y la concentracin del analito. Es importante mencionar que el mtodo de adicin de
estndar no puede aplicarse para corregir las interferencias aditivas.

En el caso de soluciones, el concepto de matriz incluye no solo el elemento mayoritario,

sino los reactivos tales como solventes cidos u orgnicos, debido a que su naturaleza y
concentracin pueden influir en la intensidad de la seal del analito.
Tal y como se ha subrayado anteriormente, el ICP tiene una excelente reputacin con
respecto a los efectos de matriz y las interferencias qumicas, significativamente
menores que con mtodos alternativos como la Espectroscopia de Absorcin Atmica
(AAS). Sin embargo, a concentraciones de analito bajas, la emisin de fondo debida a la
recombinacin de los iones argn con los electrones puede ser lo suficientemente
intensa como para requerir correcciones cuidadosas.

91