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#s#u#bstances using column chromatography. As an example, methylene blue and methyl
orange will be separated using an alumina packed column. The separated substances
will then be analyzed spectrophotometrically using a visible spectrophotometer. 2.
Principle and TheoryChromatography is a technique in which compounds to be
separated are distributed between a mobile phase and a stationary phase. In such a
system, different distributions based on selective adsorption give rise to
separation. There are different types of chromatography, such as paper, thin layer,
or column chromatography, each with its own strengths and weaknesses. Column
chromatography is one of the most useful methods for the separation and
purification of both solids and liquids when carrying out small-scale experiments.
The separation can be liquid/solid (adsorption) or liquid/liquid (partition) in
column chromatography. The stationary phase, a solid adsorbent, is usually placed
in a vertical glass column and the mobile phase, is added from the top and let
flow down through the column by either gravity or external pressure (Figure 1). #
Figure 1. Column chromatography involves a mobile phase flowing over a stationary
phase.Column chromatography is advantageous over most other chromatographic
techniques because it can be used in both analytical and preparative applications.
It can be used to determine the number of components of a mixture and as well as
the separation and purification of those components.Column chromatography isolates
desired compounds from a mixture in such a way that the mixture is applied from the
top of the column. The columns are usually glass or plastic with sinter frits to
hold the packing. The liquid solvent (eluent) is passed through the column by
gravity or by the application of air pressure. The eluent, instead of rising by
capillary action up a thin layer, flows down through the column filled with the
adsorbent. Equilibrium is established between the solute adsorbed on the adsorbent
and the eluting solvent flowing down through the column. Stationary phases are
almost always adsorbents. Adsorbent is a substance that causes passing molecules or
ions to adhere to the surface of its particles. The mobile phase is a solvent that
flows past the stationary phase, dissolving the molecules of the compounds to be
separated some of the time.Because the different components in the mixture have
different interactions with the stationary and mobile phases, they will be carried
along with the mobile phase to varying degrees and a separation will be achieved.
The individual components, or elutants, are collected as solvent drips from the
bottom of the column. Many compounds are not visible to the eye when dissolved in a
solvent or adsorbed on a adsorbent. Visualization processes make these substances
visible. The used techniques for this purpose include UV lights that cause
fluorescence or phosphorescence and chemical reactions that give colored compounds.
2.1. AdsorbentSilica gel (SiO2) and alumina (Al2O3) are two adsorbents commonly
used by organic chemists for column chromatography. These adsorbents are sold in
different mesh sizes, indicated by a number on the bottle label: silica gel 60 or
silica gel 230-400 are a couple of examples. This number refers to the mesh of
the sieve used to size the silica, specifically, the number of holes in the mesh or
sieve through which the crude silica particle mixture is passed in the
manufacturing process. If there are more holes per unit area, those holes are
smaller, thus only smaller silica particles are allowed to pass the sieve. The
larger the mesh size, the smaller the adsorbent particles are.Adsorbent particle
size affects the way the solvent flows through the column. Smaller particles
(higher mesh values) are used for flash chromatography; larger particles (lower
mesh values) are used for gravity chromatography.Alumina is quite sensitive to the
amount of water which is bound to it; the higher its water content, the less polar
sites it has to bind organic compounds, and thus the less sticky it is. This
stickiness or activity is designated as I, II, or III with I being the most active.
Alumina comes in three forms: acidic, neutral, and basic. The neutral form of
activity II or III, 150 mesh, is most commonly employed.2.2. SolventThe polarity of
the solvent, which is passed through the column, affects the relative rates at
which compounds move through the column. Polar solvents can more effectively
compete with the polar molecules of a mixture for the polar sites on the adsorbent

surface and will also better solve the polar constituents. Consequently, a highly
polar solvent will move even the highly polar molecules rapidly through the column.
If a solvent is too polar, movement becomes too rapid, and little or no separation
of the components of a mixture will result. On the other hand, if a solvent is not
polar enough, no compounds will elute from the column. Proper choice of an eluting
solvent is thus crucial for a successful application of column chromatography as a
separation technique since compounds interact with the silica or alumina largely
due to polar interactions.2.3. Elution ChromatographyElution involves transporting
a species through a column by continuous addition of fresh mobile phase. Single
portion of sample contained in the mobile phase is introduced from the top of the
column whereupon the components of that sample distribute themselves between two
phases. Introduction of additional mobile phase (the eluent) forces the solvent
containing a part of the sample down the column where further partition between the
mobile phase and fresh portions of the stationary phase occurs (time t1).
Simultaneously, partitioning between the fresh solvent and the stationary phase
takes place at the site of the original sample. Continued additions of solvent
carry solute molecules move down the column in a continuous series of transfers
between the mobile and the stationary phases. Because the movement of the sample
can occur in the mobile phase, however, the average rate at which a solute zone
migrates down the column depends upon the fraction of time it spends in that phase.
This fraction is small for solutes that are strongly retained by the stationary
phase and it is large where retention in the mobile phase is more likely. Ideally
the resulting differences in rates cause the components in the mixture to separate
into bands, or zones located along the length of the column (t2). Isolation of the
separated species is then accomplished by passing a sufficient quantity of mobile
phase through the column to cause the individual zones to pass out the end, where
they can be detected or collected ( times t3 and t4) (Figure 2).2.3.1.
Chromatograms If a detector that responds to the presence of analyte (dye) is
placed at the end of the column and its signal is plotted as a function of time
(volume of added mobile phase), a series of peaks is obtained. Such a plot, called
a chromatogram, is useful for both qualitative and quantitative analysis.2.3.2.
Migration Rates of Solutes2.3.2.1. The Partit#i#o#n# #C#o#e#f#f#i#c#i#e#n#t##A#n#
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CM: molar concentration of analyte in
mobile phase#Figure 2. Diagram showing the separation of a mixture of components A
and B by column chromatography2.3.2.2. Retention TimeThe time it takes after sample
injection for the analyte peak to reach the detector is called retention time and
its symbol is # EMBED Equation.3 ###.# EMBED Equation.3 ###
# EMBED
Equation.3 ###where # EMBED Equation.3 ###: average linear rate of analyte
migration
# EMBED Equation.3 ###: length of column packing
#
EMBED Equation.3 ###: average linear rate of movement of molecules of mobile phase
# EMBED Equation.3 ###: time required for an ave. molecule of mobile phase to pass
through the column, dead time2.3.2.3. Relation between retention time & partition
coefficientsThe migration rate as a fraction of mobile phase velocity# EMBED
Equation.3 ### = # EMBED Equation.3 ### * (moles of analyte in mobile phase /
total moles of analyte)# EMBED Equation.3 ###2.3.2.4. The rate of Solute Migration
The capacity or retention factor, kA, is used to describe the migration rates of
analytes on columns for a species A.# EMBED Equation.3 ### then # EMBED
Equation.3 ###So, the following equation may be used to derive # EMBED Equation.3
### from a chromatogram,
# EMBED Equation.3 ### 2.3.2.5. Selectivity Factors
The selectivity factor, (, of a column for the two species A and B is defined as,#
EMBED Equation.3 ###where KB : the partition ratio for the more strongly retained
species B
KA : the partition ratio for the less strongly held or more
rapidly eluted species A. By this definition, ( is always greater than unity.

2.3.2.6. Variables that affect Column EfficiencyLinear velocity of mobile phase

Diffusion coefficient of mobile phaseDiffusion coefficient of stationary phase
Capacity factorDiameter of packing particle 3. EQUIPMENT3.1. MaterialsMethylene
blue (MW = 373.90 g/mol)Methyl orange (MW = 327.34 g/mol) Ethyl alcoholWaterAlumina
903.2. ApparatusColumnStopperGlass
woolFraction collecting tubesUV-visible spectrophotometer4. EXPERIMENTAL PROCEDURE
Pack a conventional size chromatography column with activated alumina. You will
need to use a glass wool plug in the bottom. The column has a clamp to stop the
flow of the solvent. Mix 10 ml ethanol and 10 g alumina to obtain slurry. Fill this
slurry to the column and wait until alumina settles down to 4-5 cm height. Always
keep some ethanol above the top of the alumina. Newer allow the alumina to be dry.
Allow the ethanol to come to about 1 mm at the top of the column and stopper the
bottom of the column with a hose clamp.You are given a mixture prepared with 0.6 ml
methylene blue and 0.4 ml methyl orange which have the same concentration, 0.25
mg/ml. Introduce gently 1 ml dye solution onto the top of the column. Carefully add
about 10 ml of ethanol to the column and allow it to drip through. Collect
uncolored eluent in the waste, but as soon as the colored compound begins to
emerge, collect this in a beaker. Record the time to reach first dye drop.You might
need to add an additional few ml of ethanol to the column to prevent it from
becoming dry.Record the rate of movement of colored rings through the packing.When
the first dye is either completely or nearly emerged from the column, add 10 ml of
water carefully to the top of the column. Once again, collect clear eluent in the
waste. The second dye should be collected in a separate beaker.Note the volume of
each of the two dye solutions. If they are too dark, they may need to be diluted.
To do this, take 1 ml of the solution and carefully dilute it to 5 or 10 ml with
the eluent in a clean tube.Using UV Spectrophotometer, find the concentrations of
the dye solutions. Plotting absorbance versus concentration of standard solutions,
draw the calibration lines. The calibration lines for methylene blue and methyl
orange should be drawn at 650 nm and 450 nm respectively. 5. QUESTIONS FOR
CONSIDERATIONWhich eluent is more polar? #Which dye is more polar? Why? Is this
reflected in their structures given below? Calculate average linear rate of
movement of the molecules of the mobile phase.Calculate average linear rate of
analyte migration. Calculate moles of analyte in mobile phase.Calculate the
partition coefficient and capacity factor for each analyte. Calculate the
selectivity factor (for the first system only).Suggest a better method to control
the rate of flow of mobile phase through the column.How can this system be
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