UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Per, DECANA DE AMRICA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

Escuela Acadmico Profesional de Microbiologa y Parasitologa

CARACTERIZACIN MOLECULAR DE PLSMIDOS

DE Acidithiobacillus sp. AISLADOS DE ZONAS
MINERAS DEL PER

Tesis para optar al Ttulo Profesional de Bilogo Microbilogo

Parasitlogo
Bach. Anika Guadalupe Eca Avila
Lima - Per
2016

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

Universidad del Per, DECANA DE AMRICA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

Escuela Acadmico Profesional de Microbiologa y Parasitologa

CARACTERIZACIN MOLECULAR DE PLSMIDOS

DE Acidithiobacillus sp. AISLADOS DE ZONAS
MINERAS DEL PER

Tesis para optar al Ttulo Profesional de Bilogo Microbilogo

Parasitlogo
Bach. Anika Guadalupe Eca Avila
Asesor: Dr. Pablo Ramrez Roca
Lima - Per
2016
2

AGRADECIMIENTOS
Al Fondo para la Innovacin, Ciencia y Tecnologa (FINCyT), por el financiamiento de esta
tesis con el contrato N 188-IB-FINCyT-2013, y al Estudio de Investigacin CON/CON
2015 N 151001241 del Vicerrectorado de Investigacin de la UNMSM.
Al PhD. Pablo Ramirez Roca, mi asesor, por su apoyo tanto en mi formacin acadmica
como en la realizacin de mi tesis, por sus consejos y sobretodo su paciencia y su
motivacin.
A la MSc. Ruth Garca de la Guarda por ser la primera gua que tuve en el camino de la
ciencia, siempre apoyndome y depositando su confianza en m.
A mis estimados amigos Abraham Espinoza y Fernando De La Cruz por ensearme con
mucha dedicacin y desinters a trabajar en un laboratorio y valorar la importancia de la
investigacin en el desarrollo de la ciencia.
Al PhD. Michel Abanto por su apoyo en la parte tcnica del anlisis bioinformtico.
A Robert Corahua, Gregory Guerra y Jordan Bernaldo, mis compaeros en el proyecto,
por darme su apoyo, sus consejos y por crear un excelente ambiente de trabajo y
compaerismo durante la tesis.
A Vanessa Gonzales, mi compaera en todo camino y mejor amiga, por darme nimos
para seguir en todo momento.
Y el agradeciemiento ms importante, a mi madre, padre y hermanos, por ser mi impulso
en la vida, el motivo por el que doy cada paso en ella y por creer en m y amarme como lo
hacen.
3

NDICE
Pg.
NDICE DE FIGURAS

NDICE DE TABLAS

II

RESUMEN

III

ABSTRACT

1. INTRODUCCIN

2. MARCO TERICO

2.1 Generalidades

2.2 Fisiologa de At. ferrooxidans.

2.3 Plsmidos de Acidithiobacillus sp.

3. HIPTESIS

4. OBJETIVOS

5. MATERIALES Y MTODOS

5.1 Obtencin de las muestras

5.2 Aislamiento de Acidithiobacillus sp.

5.3 Extraccin de DNA genmico

10

5.4 Amplificacin y secuenciacin del gen rRNA 16S

11

5.5 Electroforesis de DNA en geles de agarosa

11

5.6 Aislamiento de plsmidos de Acidithiobacillus sp.

12

5.7 Preparacin de DNA plasmdico para secuenciamiento

13

5.8 Ensamblamiento y anotacin de los plsmidos

pAF-PQ32 y pAF-PQ31 de At. ferrivorans

13

6. RESULTADOS

15

7. DISCUSIN DE RESULTADOS

28

8. CONCLUSIONES

36

9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

37

10. ANEXOS

43
4

NDICE DE FIGURAS
Pg.
Figura 1: Coloracin Gram de la muestras

15

Figura 2: Colonias tpicas del gnero Acidithiobacillus

16

Figura 3: Plsmidos de cepas aisladas de Puno

18

Figura 4: Plsmidos de cepas aisladas de Huancavelica

19

Figura 5: Plsmidos de cepas aisladas de Cerro de Pasco

20

Figura 6. Plsmido pAF-PQ31.

22

Figura 7. Plsmido pAF-PQ32.

23

Figura 8. Alineamiento del plsmido pAF-PQ31 y el origen

de replicacin putativo del plsmido pTF91 de
At. ferrooxidans.

26

Figura 9. Diagrama de GCskew muestra el posible

origen de replicacin del plsmido pAF-PQ32

27

NDICE DE TABLAS
Pg
.
Tabla 1: Plsmidos de cepas aisladas de Puno

17

Tabla 2: Plsmidos de cepas aisladas de Huancavelica

19

Tabla 3: Plsmidos de cepas aisladas de Cerro de Pasco

Tabla 4. Caractersticas generales de los plsmidos de At. ferrivorans
6

20
21

Tabla 5. ORFs identificados en el plsmido pAfPQ33-2 de At. ferrivorans

24

Tabla 6. ORFs identificados en el plsmido pAfPQ33-1 de At. ferrivorans

25

Tabla 7. ORFs identificados en el plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2 de At.

ferrivorans

44

Tabla 8. ORFs identificados en el plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-1 de At.

ferrivorans

45

RESUMEN
Los plsmidos en cepas de Acidithiobacillus sp. aislados de aguas cidas de mina son
recursos genticos que an no han sido reportado en nuestro pas, que podran usarse en
la construccin de vectores y el mejoramiento de cepas bacterianas para su aplicacin en
biorremediacin y biolixiviacin. Por ello, el objetivo de esta tesis fue determinar la
presencia de plsmidos de Acidithiobacillus aislados de aguas cidas de zonas mineras, y
7

analizar in slico genes putativos identificados a partir del secuenciamiento y anotacin de

dos plsmidos de la cepa At. ferrivorans PQ33.
Para la extraccin de plsmidos se utiliz el protocolo de PureLink Quick Plasmid
Miniprep Kit (Invitrogen ). Los plsmidos de At. ferrivorans PQ33 fueron secuenciados
por sntesis qumica en sistema HiSeq 200 de Illumina. El software Velveth, versin 1.1,
fue empleado para el ensamblamiento de novo de las secuencias. Los plsmidos
circularizados fueron anotados usando las herramientas Prokka y ORFfinder, las
bsquedas de similaridad se realizaron empleando BlastX contra la base de datos del
GenBank. Blastn y el software Artemis fueron usados para identificar los orgenes de
replicacin. De 24 cepas de Acidithiobacillus (10 de Puno, 6 de Huancavelica y 8 de Cerro
de Pasco), 17 (70.83%) presentaron plsmidos. El anlisis in silico revel la presencia de
genes implicados en la conjugacin (TraD, MobA, protenas de exclusin de entrada y
XerD), sistemas toxina-anti toxina (HicA y HicB), protenas de replicacin (RepA y
protenas de union a DNA), reguladores de transcripcin y post traduccin (CopG y la
chaperona DnaJ), as como la destacable presencia de una protena de virulencia (VapD),
adems de dos protenas (Porina fosfato selectiva O y diguanilato ciclasa), implicadas en
la resistencia a la falta de nutrientes y produccin de biofilm, respectivamente.
Es la primera vez que se reporta plsmidos caracterizados de un cepa psicrotolerante de
Acidithiobacillus ferrivorans, con capacidad de transferencia horizontal y sistemas de
regulacin implicados tanto en el mantenimiento del plsmido como en la adherencia a
sustratos, caracterstica importante de esta especie para su aplicacin en biominera.
Palabras Claves: Acidithiobacillus ferrooxidans. Acidithiobacillus ferrivorans, bacterias
psicrotolerantes, Puno, Huancavelica, Cerro de Pasco, plsmidos, anotacin.

ABSTRACT
Plasmids of bioleaching psychrotolerant bacteria Acidithiobacillus ferrivorans have not
been reported although their presence may be involved in the adaptation of this bacterium
to cold environments. Moreover, this plasmids have potential applications in the
construction of vectors and genetic improvement of strains for bioremediation bioleaching
processes. The aim of this thesis was to characterize plasmids of Acidithiobacillus
ferrivorans by sequencing and gene annotation.

For plasmid isolation the protocol PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen )
was used. Two plasmids (12 kb and 10 kb) from At. ferrivorans strain (LN650696) was
isolated by standard miniprep protocol. The genomes were sequenced by Illumina HiSeq
system. In the de novo assembly, Velveth 1.1 package was used. Plasmids were
annotated using Prokka and ORFfinder and similarity analysis were performed using
BlastX against the GenBank database. The origins of replication was identify by Artemis
software and BlastN. It was isolated 24 Acidithiobacillus strains (10 from Puno, 6 from
Huancavelica and 8 from Cerro de Pasco). 17 (70.83%) of them had plasmids. For
analysis, T10, RA1 and PQ33 strains plasmids were selected, which ones were from
Puno, Huancavelica and Cerro de Pasco, respectively. In silico analysis predicted the
presence of CDS for proteins involved in conjugation (TraD, MobA, excluding entry and
XerD), toxin-anti-toxin systems (HicA and HicB), replication proteins (RepA and DNA
binding protein), transcription regulator (CopG), a DnaJ chaperone, a gene of protein
virulence (vapD) and seven hypothetical proteins. Furthermore, a phosphate selective
porin O and P involved in phosphate starvation adaptation, and a diguanylate cyclasefosfodiesterase protein, related to biofilm production signaling was found. This is the first
report of plasmid genomes of a psychrotolerant At. ferrivorans strain genes encoding
horizontal transfer, regulation systems of plasmid maintenance and adhesion to
substrates, an important feature of this species in its adaptation to the environment during
biomining process.
Keywords: Acidithiobacillus ferrivorans, Acidithiobacillus ferrooxidans, psychrotolerant
bacteria, Puno, Huancavelica, Cerro de Pasco, plasmid, annotation.

10

1. INTRODUCCIN
La biolixiviacin de minerales se usa en faenas mineras. En Chile y Estados Unidos
aproximadamente el 18% del cobre total se recupera mediante este proceso, dado que los
microorganismos biolixiviantes como Acidithiobacillus sp., presentan elevados niveles de
resistencia a metales como mercurio, arsnico, uranio, entre otros (Mao et al., 1980).
Existe un nmero limitado de estudios enfocados en plsmidos de Acidithiobacillus sp.
(Rawlings at al., 1984; Chisholm et al., 1998; Holmes y Yates, 1990) debido a que muchos
11

de stos suelen ser de naturaleza crptica, por ello, es importante caracterizar

molecularmente estos elementos gnicos pues poseen un valor prctico en biotecnologa.
Hallberg et al., 2010 report a la especie At. ferrivorans con capacidad de crecimiento a
bajas temperatura, que comparte caractersticas fisiolgicas con At. ferrooxidans, por lo
que el inters en esta nueva especie ha crecido en los ltimos cinco aos. Sin embargo,
no se han reportado en el mundo investigaciones que involucren el estudio de plsmidos
presentes en esta especie a pesar de su importancia tanto en el mejoramiento de cepas
con potencial uso en biominera y su implicancia en la adaptacin de esta especie a
ambientes fros, que la convierte en una cepa idnea en procesos de lixiviacin. De este
modo, los plsmidos encontrados naturalmente en cepas de Acidithiobacillus sp. en
fuentes como aguas cidas de mina son un posible recurso gentico que an no ha sido
reportado ni explorado en nuestro pas, teniendo en cuenta que la industria minera se ha
convertido rpidamente en una de las ms importantes fuentes de ingreso para el Per.

2.

MARCO TERICO
2.1 Generalidades
Un considerable inters se ha mostrado en Acidithiobacillus sp. debido a su uso en el
procesamiento de minerales industriales y su fisiologa inusual. La principal contribucin
de estas bacterias en la extraccin de metales es su capacidad para atacar minerales
azufrados y convertir los sulfuros insolubles en iones tales como cobre, plomo, zinc,

12

nquel y sulfatos. Los tres metales recuperados en mayores cantidades mediante reaccin
bacteriana directa o indirecta son cobre, uranio y oro.
Los procesos de biolixiviacin industrial no se llevan a cabo en condiciones de esterilidad,
y como resultado Acidithiobacillus sp. rara vez o nunca crece como un cultivo puro. La
mayora de las operaciones comerciales de biolixiviacin se llevan a cabo con un
consorcio de bacterias acidfilas, quimiolitotrficas que pueden incluir At. ferrooxidans,
Acidithiobacillus thiooxidans, Leptospirillum ferrooxidans y bacterias hetertrofas acidfilas
que pertenecen al gnero Acidiphilium. Aunque At. ferrooxidans se considera el miembro
ms importante del consorcio, los cultivos mixtos de bacterias son a menudo ms
eficientes en la descomposicin de mineral que At. ferrooxidans sola. Las bacterias
mencionadas son mesfilas, y como resultado, cuando el control es posible la
biooxidacin industrial de los minerales se lleva a cabo a temperaturas por debajo de
45C. Sin embargo, para una aplicacin efectiva de estas tecnologas en minas de
ambientes fros, el cual es el ambiente de la minera de gran altitud en el Per, son
necesarias cepas adaptadas al fro para este tipo de procesos, con la finalidad de
optimizar las tasas de lixiviacin y mejorar la viabilidad de las operaciones de lixiviacin a
baja temperatura. Hallberg et al., 2010 reporta una nueva especie de este gnero como
Acidithiobacillus ferrivorans, que comparte caractersticas con At. ferrooxidans, pero tiene
la cualidad de crecer a bajas temperaturas (4 oC). Durante los ltimos aos su genoma ha
sido estudiado, pese a ello, todava existe una necesidad de caracterizar mejor las cepas
de esta especie y sus mecanismos de adaptacin a ambientes fros, ya que son los
mediadores de la oxidacin biolgica del hierro y la lixiviacin de metales
ambientes mineros de bajas temperaturas.
2.2 Fisiologa de Acidithiobacillus sp.

13

en los

At. ferrooxidans es un bacilo Gram negativo, que tiene una fisiologa bien adaptada al
crecimiento en un ambiente minero inorgnico y fija dixido de carbono atmosfrico por lo
que es auttrofa (Kelly y Harrison, 1989).
La energa la obtiene por la oxidacin del ion ferroso a ion frrico o compuestos de azufre
reducido generando cido sulfrico. La bacteria es acidfila con un pH ptimo dentro del
rango 1.5 a 2.5. Crece mejor en un ambiente aerbico con oxgeno como aceptor de
electrones (Corbet y Ingledew, 1987)
At. ferrooxidans es ubcuo en el medio ambiente, puede ser fcilmente aislado a partir de
muestras de suelo recogidas de yacimientos de minerales de pirta o de los sitios de
drenaje cido de minas, que estn frecuentemente asociados con los residuos de carbn
o de vertederos de minas. Adems de su fisiologa nica, At. ferrooxidans tiene otras
caractersticas que lo hacen adecuado para su uso en operaciones de biominera. Una de
ellas es su resistencia inherente a altas concentraciones de iones metlicos y otros. Se ha
reportado que la bacteria es capaz de crecer en medios que contienen Zn +2 (120 g/L), Ni+2
(72 g/L), Co+2 (30 g /L), Cu+2 (55 g /L), U308 (12 g/L) y Fe+2 (160 g /L) (Torma, 1977).

2.3 Plsmidos de Acidithiobacillus sp.

Se han hecho una serie de estudios sobre la existencia de plsmidos naturales en las
cepas de Acidithiobacillus aisladas en diferentes partes del mundo. Martin et al. (1981)
informaron que 11 de 15 cepas originarias en su mayora de Estados Unidos y Bulgaria
albergaban desde cuatro a nueve plsmidos por cepa, que tenan un tamao de 7.4 a 75
Kb. Shiratori et al. (1991) en un estudio de ms de 100 cepas obtenidas de seis minas
14

japonesas reportaron que el 73% llevaban uno o ms plsmidos que variaban en tamao
desde 2.0 a 30 Kb. Los plsmidos tambin se han reportado en cepas de Sudfrica, Italia,
Mxico, Chile y Canad. Plsmidos de 18,6 a 65 Kb fueron detectados en nueve cepas de
At. ferrooxidans aisladas a partir de una mina de uranio, al norte de Ontario, y se intent
correlacionar la presencia de un plsmido de un tamao particular, con el aumento de la
resistencia a uranio, mostrando que todas las cepas con ms alta resistencia al xido de
uranio (UO2) contenan un plsmido particular de 20 Kb. En una cepa la desaparicin del
plsmido de 20 Kb era compatible con una reduccin en la resistencia de uranio. Sin
embargo, esta evidencia fue insuficiente para demostrar una relacin causal (Martin et al.,
1983).
Se han hecho otros intentos para correlacionar la presencia de plsmidos de origen
natural con la resistencia a metales (Chisholm et al., 1998), pero stos no han tenido
xito. Parte del problema es que sin un marcador seleccionable, curar cepas de sus
plsmidos es muy difcil y ningn procedimiento ha resultado exitoso.
Varios plsmidos At. ferrooxidans se han clonado en Escherichia coli (Shiratori et al.,
1989; Chisholm et al., 1998; Rawling et al., 1984). Estos incluyen dos plsmidos de
resistencia a uranio pertenecientes a la cepa ATCC 33020 de At. ferrooxidans; una cepa
resistente a arsnico con un plsmido de 20 Kb que se ha encontrado en cepas de At.
ferrooxidans aisladas de diferentes partes del Italia, Cerdea y Bulgaria, y cuatro
plsmidos de cepas de At. ferrooxidans aislados en Japn.
Rawling et al. (1984) trabajaron con cuatro plsmidos recombinantes de At. ferrooxidans
los cuales fueron transformados en E. coli. Se determin la resistencia de los
transformantes a Ag+, As+3, Cd+2, Co+2, Cr+6, Cu+2, Hg+, Li+, Mo+6, Ni+2, Sb+3, Te+4, U+6, Zn+2, y
ocho antibiticos. Los plsmidos recombinantes no afectaron la tolerancia de los
15

transformantes a los iones metlicos ni conferan resistencia a cualquiera de los

antibiticos utilizados.
Algunas funciones de los plsmidos At. ferrooxidans se han expresado en E. coli.
Rawlings et al. (1984) inform que un plsmido aislado de At. ferrooxidans era capaz de
replicarse en E. coli y que tres de los cuatro plsmidos recombinantes se movilizaron
entre las cepas de E. coli.
2.3.1 Plsmido PTF1
Holmes et al., (1984) trabajaron con el plsmido movilizable PTF1 de 6.7 kb de At.
ferrooxidans, ste fue clonado en pBR322 y localizaron una regin de 2.8 Kb que es
requerido para la movilizacin. sta regin fue secuenciada por Drolet et al., (1992), los
cuales determinaron que las protenas MobL de 42.6 kDa y 11.4 kDa eran esenciales para
la movilizacin y adicionalmente, se identific la posicin exacta del sitio de corte dentro
de la regin oriT.
2.3.2 Plsmido PTF- FC2
Rawlings y Dorrington (1993) reportaron el aislamiento en Sudfrica de una cepa de At.
ferrooxidans con la presencia del plsmido PTF- FC2 de 12.2 kb, ste es altamente
movilizable y adems presentaba resistencia a arsnico. Esta cepa era dominante en un
cultivo bacteriano mixto que se utiliza industrialmente en la biooxidacin de un
arsenopirita. El plsmido PTF- FC2 completo fue secuenciado y se compone de tres
regiones: una regin de replicacin, una de movilizacin, y un elemento de transposicin.
El replicn consta de cinco o seis genes y una regin oriV que se encuentra en cis, la cual
est claramente relacionada con el oriV de los plsmidos IncQ de amplia gama de
huspedes. Rawlings (2005) compar las regiones de ambos plsmidos y encontraron

16

una homologa de DNA de 60%, adems un 75% de homologa entre los 115 pb de DNA
inmediatamente adyacente a las secuencias repetidas de PTF-FC2 y los plsmidos IncQ.
La regin de la movilizacin de PTF-FC2 se encuentra en un fragmento de DNA de 3.5 kb
y se compone de un oriT y cinco genes mob dispuestos en dos operones a ambos lados
de la oriT. Los dos operones divergentes se transcriben a partir de dos promotores
situados dentro de la regin oriT, mobA y mobB en una direccin, y mobC, mobD, y mobE
en la otra. Tres de las protenas Mob (MobA, MobC y MobD) son esenciales para la
movilizacin. Un hallazgo inesperado fue que la regin de movilizacin de PTF- FC2 era
claramente homlogas a la regin traI de los plsmidos conjugativos IncP RP4 y R751.
Cuatro de las protenas tenan una significativa homologa en la secuencia de sus
aminocidos (26 a 33% de identidad; 44 a 51% similitud) con cuatro de las protenas de la
regin traI de los plsmidos IncP.
La tercera regin del plsmido PTF-FC2 es un elemento de transposicin. Esta regin
est flanqueada por dos secuencias idnticas invertidas y un transposn de resistencia a
mercurio, dentro de este se encontraron varios ORFs, uno con similitud a la protena
reguladora MerR del opern de la mercurio reductasa y otro con similitud al gen cmlA
(resistencia a cloranfenicol). Ninguna secuencia equivalente al gen merA que codifica la
mercurio reductasa se encontr en la secuencia del DNA, ni tampoco la presencia del
elemento transponible era capaz de aumentar la resistencia a cloranfenicol en E. coli.

17

3. HIPTESIS
Existen plsmidos en cepas de Acidithiobacillus ferrivorans aisladas de aguas cidas de
zonas mineras del Per.
4.

OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL

Caracterizar molecularmente los plsmidos de Acidithiobacillus ferrivorans

aislados de aguas cidas de zonas mineras del Per.
18

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

5.

Identificacin molecular de cepas de Acidithiobacillus sp.

Anotar los genes de los plsmidos pAF-PQ32de At. ferrivorans.

MATERIALES Y MTODOS.
5.1 Obtencin de las muestras:
Las muestras fueron colectadas en Puno: Relave de minas Sillustani y El Cofre, aguas
cidas del ro Parata, lagunas La Gringa y Choquene, y puntos alrededor de las minas;
asimismo, las muestras colectadas en la regin Huancavelica, provinieron de las minas
Acchilla, Palea y Recuperada, ubicadas en el distrito de Ccochaccasa. Finalmente las
cepas restantes se obtuvieron del muestreo en Cerro de Pasco, aislados de relaves
mineros de la mina Volcn, aguas cidas de la mina Huarn y de la laguna Yanamate.
Todos los lugares de muestreo estuvieron sobre los 3500 m.s.n.m. de altitud.
19

5.2 Aislamiento de Acidithiobacillus sp.

De las muestras obtenidas se tomaron alcuotas de 10 mL y se trasfirieron a un matraz de
250 mL conteniendo 90 mL de medio liquido 9K modificado (Orrantia, 1997) que contiene
(g/L): FeSO4x7H2O, 33.3; MgSO4x7H2O, 0.4; (NH4)2SO4, 0.1; y KH2PO4x3H2O, 0.04. El
medio fue ajustado a un pH 1,6 e incubado a 25C en agitacin constante de 200 rpm. A
partir de este pre-enriquecimiento se realiz un enriquecimiento ms, en el mismo medio y
las mismas condiciones, con el objetivo de eliminar el material de donde fue obtenida la
muestra.
Para la obtencin de colonias, las muestras se sembraron en medio FeO modificado
(Abanto, 2008) y la identificacin presuntiva de Acidithiobacillus sp, se realiz tomando en
consideracin la morfologa celular, oxidacin de ion ferroso y la morfologa de las
colonias, que en el caso de este gnero son rugosas y de color rojizo, adems se tom en
cuenta la presencia de un halo blanco de precipitacin alrededor de algunas colonias,
tpico de la especie At. ferrivorans.
Las colonias aisladas fueron inoculadas en 5 mL de medio 9K y una vez observado el
crecimiento, se inocul todo el contenido en 100 mL de medio 9K para el mantenimiento
de la cepa aislada. Las cepas que evidenciaban la presencia de hongos y/o levaduras
fueron inoculadas en medio Base (g/L): MgSO4x7H2O, 0.4; (NH4)2SO4, 0.1; y
KH2PO4x3H2O, 0.04; pH 2,5 suplementado con CuS al 0,5%.
5.3 Extraccin de DNA genmico
Para la extraccin del DNA genmico de las cepas de Acidithiobacillus sp, stas se
cultivaron en 100 mL de medio 9K y se utiliz el kit Miniprep de Wizard Genomic
Purification (Promega), siguiendo las indicaciones del fabricante.

20

Previamente, se hicieron 3 lavados de las clulas bacterianas con agua cida, para
eliminar restos de medio de cultivo, centrifugando a 13000 rpm por 8 minutos y
descartando el sobrenadante. Al pellet bacteriano se adicion 600 L de la solucin de
lisis nuclear y se incub a 80C por 5 minutos, luego se dej a temperatura ambiente por
5 minutos para adicionar 3 L de RNasa (4mg/ml) y se incub a 37C por 1 hora. Se
agregaron 200 L de solucin de precipitacin de protenas al lisado tratado con RNasa,
se homogeneiz vigorosamente por 20 segundos y se incub por 5 minutos en hielo. Se
centrifug a 13000 rpm por 3 minutos colocando el sobrenadante a un tubo de
microcentrifuga de 1.5 mL.
Al tubo de microcentrifuga con el sobrenadante, se adicion 600 L de isopropanol
absoluto mezclando suavemente por inversin, hasta formar una masa visible de DNA,
para luego centrifugar a 13000 rpm por 2 minutos, eliminando el sobrenadante
cuidadosamente y escurriendo el tubo en papel absorbente limpio. Al tubo que contena el
sedimento de DNA se adicionaron 600 L de etanol al 70%, invirtiendo suavemente el
tubo varias veces para lavar el sedimento, luego se centrifug a 13000 rpm por 2 minutos
eliminando el sobrenadante cuidadosamente y dejando secar el tubo de 10 a 15 minutos.
El DNA fue rehidratado con 100 L de solucin de rehidratacin de DNA por incubacin a
65C por 1 hora, peridicamente se golpeaba el tubo suavemente para mezclar la
solucin. Finalmente se guard a -20C hasta su uso.
5.4 Amplificacin y secuenciacin del gen rRNA 16S
El DNA aislado fue amplificado con los iniciadores procariticos universales para el gen
rRNA 16S: 27F y 536R (Edwards et al., 1989; Karavaiko et al., 2003). Las reacciones de
PCR se realizaron segn las instrucciones provistas para la Taq polimerasa comercial y el
nmero de ciclos, la temperatura de incubacin de cada paso se ajustaron segn los
21

pares de iniciadores utilizados y el tamao esperado del fragmento a amplificar. El

programa de PCR consisti en un ciclo de desnaturalizacin del DNA a 94C durante 3
min, re-asociacin del cebador a 50C durante 3 min y sntesis de DNA a 72C durante 3
min, cinco ciclos de 94C durante 30 s, 50C durante 2 minutos y 72C durante 30 s, 30
ciclos de 94C durante 30 s, 40C durante 30 s y 72C durante 30 s, y una incubacin final
a 72C durante 7 minutos (Karavaiko et al., 2003).
5.5 Electroforesis de DNA en geles de agarosa
Para visualizar el DNA extrado y el producto de PCR se utilizaron geles de agarosa. Los
geles se prepararon en amortiguador TAE 0.5X con 1% de agarosa ultra pura. Las
muestras de DNA se mezclaron con solucin de carga y como marcador de tamao
molecular se utiliz 1 kb DNA Ladder (Promega). Luego de la electroforesis los geles se
tieron con bromuro de etidio (0.5 g/mL), por 45 segundos, para visualizarlos con un
fotodocumentador. Los amplificados que visualizaron en las condiciones requeridas se
prepararon para el secuenciamiento, realizado por la Empresa Macrogen Korea.
5.6 Aislamiento de plsmidos de Acidithiobacillus sp.
Para el aislamiento de los plsmidos se sembr 10 mL de cada una de las cepas con 3
semanas de crecimiento en 50 mL de medio 9K a pH 1.65, para la obtencin de clulas
jvenes. Luego se inocul 20 mL del cultivo obtenido en 250 mL de 9K para la obtencin
de suficiente biomasa para la extraccin (Chisholm et al., 1998).
El cultivo fue centrifugado a 7000 rpm por 10 min y a una temperatura de 10 oC. La
extraccin de plsmidos se llev a cabo utilizando el PureLink Quick Plasmid Miniprep
Kit de Invitrogen y siguiendo las indicaciones del fabricante: Se lavaron tres veces las
clulas bacterianas con agua cida, para eliminar restos de hierro, centrifugando a 13000
rpm por 8 minutos y descartando el sobrenadante.
22

Al sedimento bacteriano se adicion 250 L de la solucin de resuspencin la cual

contiene RNAsa, se realiz un pipeteo suave hasta obtener la resuspencin total del
pellet. Luego se adicion 250L de solucin de Lisis, la cual contiene adems una
solucin de precipitacin de protenas, inmediatamente el tubo se agit cuidadosamente
por inversin de tres a cuatro veces hasta que se observe una mezcla homognea y se
incub a temperatura ambiente por 5 minutos, sin exceder este tiempo. Luego de la
incubacin se aadi 350 L de solucin de neutralizacin e inmediatamente se agit el
tubo vigorosamente hasta que el contenido se observe homogneo. Luego se centrifug a
13000 rpm por 8 minutos colocando el sobrenadante en la columna de slica,
centrifugando a 13000 rpm por 1 minuto, inmediatamente se adicion 500 L de solucin
de lavado, la cual contiene etanol, y permite eliminar contaminantes del DNA plsmdico
inmerso en la columna, se centrifug 13000 rpm por 1 minuto, este paso se repiti dos
veces descartando siempre la solucin de lavado que pasa a travs de la columna. Luego
se realiz una centrifugacin adicional a 13000 rpm por 30 segundos para eliminar por
completo la solucin de lavado.
La columna se coloc en el tubo de recuperacin y se adicion 75 L de buffer TE, este
paso se realiz con mucho cuidado de modo que el buffer se colocara en el centro de la
columna y sin daarla. Finalmente se incub por 4 minutos a temperatura ambiente y se
centrifug a 13000 rpm por 2 minutos. El buffer que pasa a travs de la columna y se
queda en el tubo de recuperacin que contiene el plsmido e inmediatamente se
almacenaron a 20C para su uso posterior.
5.7 Preparacin de DNA plasmdico para secuenciamiento
La cepa seleccionada para el secuenciamiento total de plsmidos fue la PQ-33. Se
prepar un cultivo joven de 800 ml y se extrajo DNA plasmdico. El DNA fue cuantificado y
23

verificada su pureza usando un Nanodrop de ThermoScientific, para ello, se alicuot 5 L

de DNA en tubos eppendorf y tambin 5 L de buffer TE, el que se utiliz como blanco.
Finalmente se cuantific por duplicado una misma muestra, cargando 2 L sobre el lector
del Nanodrop por cada una de las repeticiones. La muestra de DNA que cumpli con los
requerimientos especificados (Concentracin: >1 g/L; pureza: >1,7) se envi a la
Empresa Macrogen Korea para su secuenciamiento.
5.8 Ensamblamiento y anotacin de los plsmidos pAF-PQ32aislados de At.
ferrivorans
Los plsmidos de At. ferrivorans PQ33 fueron secuenciados por sntesis qumica en
HiSeq 2000 de Illumina. El paquete Velveth versin 1.1 (Zerbino, 2010) fue empleado
para el ensamblamiento de novo de los reads obtenidos, utilizando un valor de K-mer de
63 y los parmetros de cut-off y cobertura sugeridos por el programa. Los contings
resultantes se ensamblaron con el software CAP2 (Huang, 1996) para la obtencin final
de los plsmidos ensamblados, cuyos tamaos se compararon con los observados
previamente en el gel de electroforesis.
Los plsmidos fueron circularizados alinendolos con contings provenientes del
ensamblamiento del cromosoma de At. ferrivorans PQ33, obtenido con el mismo mtodo.
Una vez circularizados fueron anotados usando el software Prokka (Seemann, 2014) y el
ORFfinder (Rombel et al., 2002), las bsquedas de similitud se realizaron empleando
BlastX contra la base de datos del GenBank, tomando en cuenta los ORFs que
presentaban un porcentaje de identidad mayor al 30% y un E-value menor a e-05.
Para encontrar posibles secuencias pertenecientes al origen de replicacin del plsmido
se utiliz el BlastN contra la base de datos del GenBank. En caso de no hallar
coincidencias se predijo un posible origen analizando el software Artemis (Rutherford et
24

al., 2000) para la obtencin de los patrones de CGskew tomando el valor mnimo en la
grfica como el origen de replicacin plasmdico. El mapa circular de los plsmidos pAFPQ32pAfPQ33-2 y pAF-PQ31pAfPQ33-1 fue creado usando la herramienta CGview
(Stothard y Wishart, 2005).

6. RESULTADOS
6.1 Aislamiento de Acidithiobacillus sp. de Cerro de Pasco.
Se obtuvo cultivos jvenes de tres muestras provenientes de Cerro de Pasco (PQ1, Psb1
y PH1), todas crecieron en un periodo de 5 a 6 das a 10 oC en medio lquido. Se observ
motilidad de las clulas en el microscopio y la coloracin Gram evidenci la presencia de
bacilos Gram negativos pequeos (Figura 1). Luego de 8 a 12 das de la siembra en
placas, se evidenci un cambio en el color del medio a naranja oscuro, tpico para el

25

crecimiento de Acidithiobacillus sp. Luego de una semana se observaron las primeras

colonias aisladas tpicas del gnero Acidithiobacillus (Figura 2).

Figura 1. Coloracin Gram de las muestras.

Figura 2. Colonias tpicas del gnero Acidithiobacillus.

6.2 Secuenciamiento del rRNA 16S e identificacin de Acidithiobacillus sp.

Las cepas PQ510 y PQ33, aisladas de Cerro de Pasco, fueron identificadas como
Acidithiobacillus ferrivorans, las dems cepas provenientes tambin de esta regin fueron
identificadas como Acidithiobacillus ferrooxidans. Todas las secuencias fueron enviadas a
26

la

base

de

datos

del

EMBL

(The

European

Bioinformatics

Institute)

(http://www.ebi.ac.uk/ena).
6.3 Aislamiento de plsmidos de Acidithiobacillus ferroxidans
Slo las cepas T9 y BB3 provenientes de Puno no presentaron plsmidos, las ocho cepas
restantes albergaron un plsmido como mximo, los cuales mostraban un tamao
aproximado de 12 Kb (Tabla 1). Todos los plsmidos aislados de Puno se observaron en
sus tres conformaciones en la lectura del gel de agarosa (Figura 3). Las cepas RA1 y RA2
provenientes de Huancavelica fueron las nicas en presentar un solo plsmido de 8 Kb
(Tabla 2) de tamao molecular y mostraron un sola banda compacta en el gel (Figura 4).
Por otro lado, de un total de ocho cepas provenientes de Cerro de Pasco, siete mostraban
al menos un plsmido y como mximo tres (Figura 5), cuyos tamaos oscilaron entre 3,5
Kb y ~12 kbp. Solo la cepa PQ36 no present plsmidos (Tabla 3).
Tabla 1. Plsmidos de cepas aisladas de Puno. De 10
cepas se obtuvo 8 plsmidos.

27

Aislado
T7
At.
ferrooxidans
T8
At.
ferrooxidans
T9
At.
ferrooxidans
T10
At.
ferrooxidans
T11
At.
ferrooxidans
T12
At.
ferrooxidans
T13
At.
ferrooxidans
T9B5
At.
ferrooxidans
T9D2
At.
ferrooxidans
BB3
At.
ferrooxidans

No de
plsmidos

(~)Tamao (Kb)

12

12

12

12

12

12

12

12

28

10 kp

Figura 3: Plsmidos de cepas aisladas de Puno. Se

muestra

la

presencia

de

plsmidos

de

aproximadamente 12 Kb y vistos en sus tres

conformaciones. M: Marcador 1 kb DNA Ladder
(Promega). Gel de agarosa 0.7%.

29

Tabla 2. Plsmidos de cepas aisladas de Huancavelica.

De 6 cepas se obtuvo 2 plsmidos.

Aislado
RA1
At. ferrooxidans
IP1
At. ferrooxidans
RA2
At. ferrooxidans
AC11
At. ferrooxidans
AC22
At. ferrooxidans
IP2
At. ferrooxidans

RA1

IP1 RA2

No de
plsmidos

(~)Tamao (Kb)

AC11 AC22

IP2

T13

BB3

10 kp

Figura 4. Plsmidos de cepas aisladas de Huancavelica.

Se observa una sola banda bien definida. M: Marcador 1
kb DNA Ladder (Promega). Gel de agarosa 0.7%.

30

Tabla 3. Plsmidos de cepas aisladas de Cerro de Pasco.

De 8 cepass se obtuvo 12 plsmidos
Aislado
PQ506
At.
ferrooxidans
PQ509
At.
ferrooxidans
PQ510
At. ferrivorans
PQ516
At.
ferrooxidans
PQ33
At. ferrivorans
PQ36
At.
ferrooxidans
PsbA
At.
ferrooxidans
PQ16
PQ
PQ
M
506
509
At.
ferrooxidans

No de
plsmidos

(~)Tamao (Kb)

12

12, 5

12, 9.5, 3.5

12

12, 9.5

12, 10

PQ
510

PQ
516

PQ
33

PQ
36

12

pSB
A

PQ
16

10 kp

Figura 5. Plsmidos de cepas aisladas de Cerro de Pasco. M:

Marcador 1 kb DNA Ladder (Promega). Gel de agarosa 0.7%.
31

6.4 Anotacin de los plsmidos pAF-PQ32pAfPQ33-2 y pAF-PQ31pAfPQ33-1 de At.

ferrivorans.
A partir del ensamblamiento de los contings se obtuvieron los plsmidos pAFPQ31pAfPQ33-1 (Figura 6) y pAF-PQ32pAfPQ33-2 (Figura 7), con un tamao de 10 218
pb y 12 094 pb, respectivamente (Anexo 3 y Anexo 4). Las caractersticas generales de
ambos plsmidos se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Caractersticas generales de los plsmidos de At.
ferrivorans.
pAfF-PQ33-12
Tamao
Contenido de G-C
Genes codificantes de protenas
Protenas con funcin asignada
Protenas hipotticas conservadas
pAfF-PQ33-21
Tamao
Contenido de G-C
Genes codificantes de protenas
Protenas con funcin asignada
Protenas hipotticas conservadas
Protenas hipotticas

10 218 pb
60.3%
10
8
2
12 094 pb
57%
12
8
2
2

En pAF-PQ32pAfPQ33-2, usando los predictores PROKKA y ORFfinder, de un total de 12

ORFs identificados como codificantes para protenas putativas, 96% tuvieron funcin
asignada, 24% eran protenas hipotticas conservadas, 24% protenas hipotticas. Por
otro lado, en el plsmido pAF-PQ31pAfPQ33-1, 11 ORFs fueron identificados 10, de los
cuales el 80% tuvieron una funcin asignada mientras que 20% fueron protenas
hipotticas conservadas (Tabla 5 y Tabla 6). Slo se tomaron en consideracin los ORFs

32

con un porcentaje de identidad mayor a 35 % y un E-value menor a e -05 (Anexo 1 y Anexo

2).

pAFPQ31pAfP

Figura 6. Plsmido pAF-PQ31pAfPQ33-1. Los genes putativos (ORF) se

indican con flechas azules. El sombreado negro indica el contenido de GC.
El contenido de GC skew se indica de verde y violeta. El sombreado verde
indica un contenido de GC ms alto que el promedio de la secuencia
plasmdica, mientras que el sombreado prpura indica un contenido ms
bajo del promedio.

33

pAF-

Figura 7. Plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2. Los genes putativos (ORF) se

representan con flechas azules. El sombreado negro indica el contenido de
GC. El contenido de GC skew se indica de verde y violeta. El sombreado
verde indica un contenido de GC ms alto que el promedio de la secuencia
34

plasmdica, mientras que el sombreado prpura indica un contenido ms

bajo del promedio.

Tabla 5. ORFs identificados en el plsmido pAfF-PQ33-22 de At. ferrivorans

Designacin del
ORF

Ubicacin

TraD
367-777
Porina O/P
Protena
hipottica
Exclusin de
entrada
Protena
hipottica
Protena
hipottica
Protena
hipottica
HicB

(44715724)c
(781-1008)

3272-3706
5779-6456
3750-4022
(10851327)c
(65426901)c

(75807918)c
(6904HicA
7131)c
(8026DnaJ
9213)c
(9415MobA
11913)c
(c)
: Cadena complementaria
VapD

Descripcin del
Producto
Protena de
transferencia en
conjugacin TraD
Protena fosfato
selectiva O y P de
membrana externa

Organismo ms
cercano
Burkholderia cepacia
Acidithiobacillus
ferrivorans

Acidithiobacillus
ferrivorans
Protena de exclusin de Providencia
entrada
rustigianii
Acidithiobacillus
Protena hipottica
thiooxidans
Ferrovium
Protena hipottica
myxofaciens
Protena hipottica

Protena hipottica

Thioalkalivibrio

Protena de la familia
HicB con dominio
nucleasa de la RNAsa H

Desulfovibrio
fructosivorans

Endonucleasa VapD
asociada a virulencia
Protena de la familia
HicA

Pseudomonas sp.
Geobacter sp

Alicycliphilus
denitrificans
Protena de movilizacin Acidithiobacillus
A
thiooxidans
Chaperona DnaJ

35

Tabla 6. ORFs identificados en el plsmido pAfF-PQ33-11 de At. ferrivorans

Designacin
del ORF

Ubicacin

TraD

8582-8989

Dgc-cmz

3785-6429

CopG

3345-3599

Hipottica
RepA

(8928-9491)c

324-1211

Descripcin del Producto Organismo ms cercano

Protena de transferencia
en conjugacin TraD
Diguanilato CiclasaFosfodiesterasa con
dominio quimiorrecetor
de unin a zinc
Regulador
transcripcional de la
familia CopG.
Protena hipottica con
regin N-terminal de
unin al DNA en la
replicacin plasmdica
Protena de replicacin
plasmdica A

Hipottica

(1527-1805)c Protena hipottica

Exclusin de
entrada

(1824-2228)c

MobA

(6560-8401)c

Hipottica

(1226-1549)c Protena hipottica

XerD

(2281-3171)c

Protena de exclusin de
entrada
Protena de movilizacin
A
Tirosina recombinasa
XerD.

(c)

: Cadena complementaria

36

Acidithiobacillus
ferrivorans
Acidithiobacillus
ferrivorans
Fischerella muscicola

Acidithiobacillus caldus
Acidithiobacillus
thioxidans
Acidithiobacillus
thioxidans
Providencia rustigianii
Acidithiobacillus caldus
Acidithiobacillus
thioxidans
Acidithiobacillus caldus

6.6 Origen de Replicacin.

Al realizar un BlastN contra la base de datos del GenBank con la secuencia del plsmido
pAF-PQ31pAfPQ33-1, se encontr una identidad del 85% con una regin rica en GC
perteneciente al origen de replicacin putativo del plsmido pTF91 de Acidithiobacillus
ferrooxidans (Figura 8). En el plsmido pAF-PQ31pAfPQ33-1 esta regin comprende de
175 pb y se encuentra antes de la regin codificante para la protena RepA.

Figura 8. Alineamiento del plsmido pAF-PQ31pAfPQ33-1 y el origen de replicacin

putativo del plsmido pTF91 de At. ferrooxidans.
No se encontr un origen de replicacin para el plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2
utilizando la base de datos del GenBank. Sin embargo, al analizar el contenido de
GCskew utilizando el software ARTEMIS, se obtuvo un valor mnimo el cual
posiblemente pertenece al origen de replicacin del plsmido (Figura 9) segn
37

estudios realizados en bacterias extremfilas y arqueas (Lopez et al., 1999). El

posible origen de replicacin se encuentra aproximadamente a 100 pb de la regin
codificante de la protena MobA.

Figura 9. Diagrama de GCskew muestra el posible origen de replicacin del plsmido

pAF-PQ32pAfPQ33-2 de At. ferrivorans ubicado entre los valores mnimos de (G-C)/
(G+C) como se indica entre barras.

7.

DISCUSIN DE RESULTADOS
Se logr aislar siete cepas de Aciddithiobacillus sp. provenientes de Cerro de Pasco,
entre ellas, dos cepas pertenecan a la especie, Acidithiobacillus ferrooxidans, PQ16 y
PQ19. Las cepas PQ16, PQ18 y PsbA fueron las primeras colonias formadas en placa
Petri, la morfologa de las colonias result ser tpica para las dos primeras, es decir,
colonias rojizas, rugosas y pequeas. Sin embargo la cepa PsbA mostr un tanto diferente
38

ya que mostraba un precipitado blanquecino alrededor de la colonia y se observ un

punto de color rojo vino justo en medio de la colonia roja.
Diecisiete de un total de 24 aislados de Acidithiobacillus sp albergaron un plsmido, lo que
equivale a un 70,8%. Martin et. al. (1981) obtuvo 11 de 15 cepas de Acidithiobacillus
ferrooxidans que albergaban plsmidos (73,2%). Shiratori et al. (1991), reportaron 95
cepas portadoras de plsmidos de un total de 131 aislados analizados (72,5%). Ambas
cifras de referencia concuerdan con los resultados obtenidos en este estudio. Ocho de los
plsmidos reportados provenan de cepas aisladas en Puno y fueron identificadas como
At. ferrooxidans. Al presentar un peso molecular similar, se puede sostener que
posiblemente albergan el mismo tipo de plsmido y que estos adems podran ser
transferibles entre cepas de At. ferrooxidans debido a su elevada frecuencia de aparicin.
Adicionalmente el tamao de estos plsmidos (12 Kb) fue similar al obtenido por Rawling
et al. (1984) para el plsmido pTF-FC2. Asimismo, las cepas aisladas de Huancavelica
fueron identificas como At. ferrooxidans, en este caso se aislaron plsmidos de
aproximadamente

8 kb, ms pequeos que los encontrados en Puno, pero cuya

frecuencia es baja, lo que podra significar la presencia de plsmidos naturales de At.

ferrooxidans.
Siete de un total de ocho cepas aisladas de Cerro de Pasco presentaron al menos un
plsmido. Cinco de estas cepas fueron previamente identificadas como At. ferrooxidans, y
dos de ellas como At. ferrivorans (PQ33 y PQ510). Los plsmidos aislados de las cepas
provenientes de Cerro de Pasco presentaron una mayor variedad de tamaos
moleculares y un mayor nmero de plsmidos presentes por aislado, a diferencia de las
otras dos zonas estudiadas, esto se observ en ambas cepas de At. ferrivorans. La
diversidad encontrada de plsmidos se debi a que todas las cepas evaluadas provenan
de aislados obtenidos a 4 oC y el aislamiento de las mismas se realiz en el momento en
39

que llegaron las muestras a Lima, de modo que la diversidad bacteriana no se vio
disminuida. Los plsmidos aislados de At. ferrivorans, fueron seis en total, dos de ellos
presentaron un tamao similar (~12 Kb) a pesar de provenir de cepas diferentes.
La cepa PQ33 present algunas dificultades durante la extraccin de plsmidos ya que
las clulas mostraban una gran capacidad de adherencia al hierro, lo que se evidenciaba
en el color rojizo de las clulas luego de varios lavados con agua cida. Por ello, las
soluciones de lisis y precipitacin de protenas no actuaban eficientemente durante la
extraccin, ya que entre otras cosas como la aparicin de protenas en la muestra, el
hierro presente en el precipitado celular inhiba la accin del EDTA, impidiendo que acte
correctamente sobre las DNAsa presentes. Es as que la cantidad de lavados se aument
a ocho y adicionalmente la cepa se hizo crecer en medio 9K a pH de 1,6, para disminuir la
rpida formacin de jarosita y la disminucin notable de la biomasa que la acompaaba.
El DNA plasmdico probablemente sufri algn dao durante la extraccin debido a la
cantidad de lavados necesarios para la eliminacin del hierro, lo que podra explicar la
aparicin continua de las tres conformaciones plasmdicas en el gel de electroforesis
El objetivo principal de los proyectos de secuenciacin de DNA es adquirir conocimientos
acerca de los procesos acontecidos en un organismo. La comprensin de cmo se
desarrolla un organismo, sobrevive y se adapta a diferentes condiciones ambientales nos
ayudan a comprender las vas de regulacin existentes. Un paso importante en la
obtencin de esta informacin valiosa es la anotacin, que principalmente consiste en la
identificacin de los genes, la prediccin de su funcin y lo ms importante sus relaciones
funcionales. Por esta razn, las herramientas utilizadas para este proceso, deben ser en
conjunto, lo suficientemente robustas, ya que los genes anotados de manera inadecuada,
podran ser utilizados errneamente como referencia para el reconocimiento de nuevos
genes. As, la anotacin de los plsmidos pAF-PQ32pAfPQ33-1 y pAF-PQ31pAfPQ33-2
40

se realiz utilizando el software PROKKA que utiliza una base de datos curada, y
adicionalmente se realiz una anotacin manual usando ORFfinder contra la base de
datos del GenBank.
Protenas Conjugativas
Entre los genes que codifican protenas participantes en el proceso de conjugacin
tenemos a traD, adems presente en ambos plsmidos con una identidad mayor al 40%
frente a la protena del organismo ms cercano, At ferrooxidans. La protena codificada
por traD pertenece al sistema de secrecin tipo IV en la membrana interna de las
bacterias Gram-negativas y est directamente involucrada en la transferencia del DNA en
bacterias portadoras de bacterias plasmidos F+ (Panicker y Minkley, 1992); adicionalmente
encontramos al gen de la protena de exclusin de entrada, esencial en la maquinaria
conjugativa ya que acta como una barrera en la transferencia de DNA entre bacterias
que comparten el mismo o cercanamente relacionado factor F+ (Garcilln y De La Cruz,
2008); el gen mobA, presente tambin en ambos plsmidos con una porcentaje de
identidad mayor a 40%, cuya protena est posiblemente implicada en la funcin relaxasa
de movilizacin del plsmido desde la clula donadora hacia el complejo del pili para su
trasporte a la clula receptora. sta ltima protena ha sido reportada en plsmidos
movilizables -no conjugativosbles de At. ferrooxidans, como parte de su maquinaria de
movilizacin (Rohrer y Rowling, 1992).
Adicionalmente se encontr el gen de la protena tirosina recombinasa XerD presente slo
en el plsmido pAF-PQ31pAfPQ33-1 con un porcentaje de identidad mayor al 70%, esta
protena tiene la funcin cuyo rol principal es lade separarcin de dmeros cromosmicos
luego de la replicacin bacteriana, pero que tambin acta resolviendo formas

41

multimricas originadas de la recombinacin homloga en una variedad de plsmidos

multicopia (Hallet et al., 1999).
Dado el tamao de estos dos plsmidos 10 Kb y 12 Kb, es probable que sean plsmidos
movilizables, debido a que no se ha identificado la maquinaria completa de genes de
transferencia, presentes en un plsmido conjugativo, sin embargo, ya que no se han
hecho ensayos de conjugacin con cepas de At. ferrivorans que no presenten dichos
plsmidos, no podemos descartar su capacidad de conjugacin.
Sistema Toxina-Antitoxina
Los sistemas toxina-antitoxina (TAS) son abundantes, diversos y estn presentes en una
variedad de elementos de transferencia horizontal que presenten genes implicados en
mecanismos de resistencia al estrs en bacterias ambientales. ElL sistema toxinaantitoxina HicAB fue descrito por primera vez en un plsmido, est codificado en un
opern conformando por dos genes dentro qude un opern, ambos genes codifican
protenas relativamente pequeas. La protena HicB, a menudo contiene un dominio helixturn-helix de unin a DNA y una derivado RNAsa H, ambas tpicas en el sistema toxinaantitoxinacaractersticas comnmente encontradas en antitoxinas. Por otro lado, la
protena HicA, perteneciente a la familia YcfA, acta funciona como un mRNA de
interferencia, tpico en las toxinas (Makarova et al., 2009). En algunos casos la protena
HicB se encuentra sola, mientras que HicA se encuentra siempre que, al menos un gen
hicB est presente. Generalmente el gen hicA se encuentra adyacente al gen hicB en la
misma cadena codificante, pero algunas veces est posicionada en la regin upstream de
hicB en la cadena no codificante (Makarova et al., 2006).
En el plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2 se identific el gen que codifica la protena HicB
(antitoxina), mientras que en la cadena complementaria, se encontr un gen que codifica
42

a una protena de la familia YcfA, por el contexto genmico, se podra asumir que se trata
de un homlogo de la protena HicA (toxina).

Replicacin y Regulacin de la Replicacin

El gen de la protena RepA helicasa encontrada en el plsmido pAF-PQ31pAfPQ33-1
tiene un alto porcentaje de identidad con la helicasa de replicacin del plsmido de
Acidithiobacillus thiooxidans (98%).
Por otro lado, cabe resaltar que si bien no se encontraron genes de replicacin en el
plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2, se reporta un protena chaperona putativa DnaJ, que no
solo se ha reportado asociada a la funcin de re-plegamiento de protenas bajo
condiciones de shock trmico o estrs (Xiao, 2007), sino tambin se ha demostrado su
asociacin con la protena RepA de inicio de la replicacin en plsmidos, de modo que
forman un complejo dimrico que permite la unin de RepA al origen de replicacin
(Wickner et al., 1991).
Origen de Replicacin
El BlastN realizado contra la base de datos del GenBank usando la secuencia de pAFPQ31pAfPQ33-1, nos permiti identificar un posible origen putativo de replicacin similar
al plsmido de Acidithiobacillus thiooxidans, con una identidad de (86%), desde 1 al 456
pb.
No se encontr un posible origen de replicacin para el plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2
usando el BlastN, sin embargo, al analizar los valores de GC skew, obtenidos con el
43

programa Artemis, se observ un patrn de cada de estos valores que segn anlisis
realizados en bacterias extremfilas y arqueobacterias corresponde al origen de
replicacin.

PROTENAS DE ADAPTACIN AL AMBIENTE

Putativa Endorribonucleasa VapD Putativa.
La protena VapD ha sido estudiada comon un factor de virulencia asociado con el gnero
Pseudomonas, esta es un endorribonucleasa de la familia CAS2 que juega un rol
importante como protena de proteccin en a la invasin de elementos genticos
extracelulares. Ya que muchas de las protenas de la familia CAS2 han sido relacionadas
a la degradacin de mRNA de interferencia, se sugiere que VapD podra representar un
nuevo grupo de endorribonucleasa especfica de mRNA (Beloglazova et al., 2008).
El plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2 present un gen que posiblemente codifiqueca una
protena putativa VapD, cuyo porcentaje de identidad con la endonucleasa reportada para
Pseudomonas sp. es alto elevado (65%), y probablemente que tenga una funcin
importante en At. ferrivorans dentro de la bacteria por lo que su capacidad de
transferencia horizontal se ha convertido en una ventaja para esta especie.
44

Putativa Porina Fosfato-Selectiva O y P Putativa

Durante los procesos de biolixiviacin diversas condiciones pueden afectar a las bacterias
involucradas, entre ellas est la falta de nutrientes como el fosfato inorgnico que es
esencial para el metabolismo de estos microorganismos. As, la privacin de fosfato
genera la activacin de genes que codifican protenas que permiten la recuperacin de
fosfato ambiental (Bobadilla y Parada, 2009), una de ellas es la Porina fosfato-selectiva O
y P, la cual tiene un sitio de unin especfico al fosfato/ ortofosfato y se encuentra sobreexpresada en condiciones de inanicin (Poole et al., 1986).
El plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2, presenta el gen putativo de la porina fosfato selectiva
con un porcentaje de identidad de 73% con la porina presente en el cromosoma de At.
ferrivorans y una longitud de 417 aminocidos, que coincide con otras porinas fosfato
encontradas en bacterias del gnero Acidithiobacillus. La presencia de un gen de una
protena implicada en la adaptacin a condiciones de estrs ambiental en un plsmido se,
explicara por la rpida adaptacin de esta especie al fro y su condicin de
psicrotolerante, evidenciadandose poren su capacidad de crecimiento in vitro en
comparacin con cepas de la especie At. ferrooxidans.
Diguanilato Ciclasa-Fofodiesterasa (C-di-GMP) con Dominio Quimiorreceptor de
Unin a Zinc
El C-di-GMP ha sido identificado como un importante segundo mensajero involucrado en
la regulacin de varios procesos fisiolgicos y juega un papel esencial en el ataque a
superficies mediante la formacin de biofilms, controlado por la produccin de
exopolisacridos (EPS). El C-di-GMP es sintetizado por la diguanilato ciclasa (DGC), la
cual presenta el dominio GGDEF, y es degradado por la enzima fosfodiesterasa (PDE),
que presenta el dominio EAL (Ruiz et al., 2011).
45

Recientemente se est estudiando la va del C-di-GMP en bacterias del gnero

Acidithiobacillus, involucradas en procesos de biominera, debido a que la adherencia a
las superficies sulfuradas es una caracterstica esencial para mejorar la eficiencia en la
biolixiviacin. En At. caldus y At. ferrooxidans se ha reportado la expresin de la enzima
DGC; para la primera especie se encontr alrededor de dieciocho ORFs funcionales y se
demostr que las cepas mutantes del gen que codifica esta protena perdan su capacidad
de adherencia a superficies de azufre (Castro et al., 2015).
El draft del genoma draft de At. ferrivorans reporta aproximadamente 16 genes putativos
para la codificacin de la enzima DGC, muchas de ellas presentan los dominios GGDEF y
EAL presentes, as como una serie de dominios sensores, entre ellos el dominio
quimiorreceptor de unin al zinc (CZB). Estudios realizados en E. coli demostraron que la
formacin de biofilm era dependiente de la actividad DGC-CZB o comnmente
denominada DgcZ, que estuvo modulada por la disponibilidad de zinc, ya que la mutacin
en los aminocidos que coordinan este ion generaba una disminucin en la formacin de
exopolisacridos en las cepas estudiadas (Zahringer et al., 2013).
El plsmido pAF-PQ31pAfPQ33-1 presenta un ORF que codifica la protena DGC con la
presencia de los dominios GGDEF, EAL y CZB. Los dos primeros dominios presentan un
porcentaje de identidad de 78% con los dominios GGDEF/ EAL de At. ferrivorans SS3,
mientras que el dominio CZB es similar (63%) al presente en At. cCaldus. La expresin
del gen de la diDiguanilato ciclasa representara una vez ms un claro ejemplo de la
capacidad adaptativa de esta especie, ya que la eficiencia de oxidacin de diversos
sustratos metlicos aumenta con el incremento de su capacidad de adherencia, hecho
que se evidencia en su cintica de crecimiento y adems en la adherencia a hierro y
cobre observada en los lavados celulares durante la extraccin de DNA plasmdico.

46

8. CONCLUSIONES
Diecisiete de un total de 24 aislados de Acidithiobacillus sp. albergaron al menos
un plsmido. Once de estas cepas fueron identificadas como Acidithiobacillus
ferrooxidans y dos de ellas: PQ33 y PQ510 como Acidithiobacillus ferrivorans.
Se reporta por primera vez plsmidos caracterizados molecularmente de un cepa
nativa psicrotolerante de Acidithiobacillus ferrivorans, con posible capacidad de
transferencia horizontal y sistemas de regulacin implicados en el mantenimiento
del plsmido.
El plsmido pAfF-PQ33-22 de At. ferrivorans presenta el gen putativo de la porina
fosfato selectiva, hasta ahora reportado slo en el cromosoma, cuya funcin es la
recuperacin de fosfato y posiblemente est involucrada en la adaptacin de esta
especie durante condiciones de estrs ambiental.

47

 El gen de la protena diguanilato ciclasa, reportado en el plsmido pAfF-PQ33-1,

presenta un dominio regulador dependiente de zinc y dos dominios involucrados
en la sntesis y degradacin de C-di-GMP, mensajero que media la formacin de
biopelculas, importante para la adherencia de At. ferrivorans a sustratos
sulfurados y su aplicacin en biominera.

9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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53

ANEXOS

54

55

Anexo 1.
Table 7. ORFs identificados en el plsmido pAF-PQ32pAfPQ33-2 de At. ferrivorans
Localizacin

Tamao
del
producto

%
Covertura

E-Value

%
Identidad

367-777

135

53

1e-10

51

Protena de transferencia
en conjugacin TraD

Porina
O/P

(4471-5724)c

423

99

6e-152

68

Protena fosfato selectiva O

y P de membrana externa

Acidithiobacillus
ferrivorans

(781-1008)c

76

98

7e-42

92

Protena hipottica

Acidithiobacillus
ferrivorans

Eep

3272-3706

143

96

9e-14

31

Protena de exclusin de
entrada

5779-6456

228

91

2e-09

25

Protena hipottica

Acidithiobacillus
thiooxidans

3750-4022

91

70

5e-33

94

Protena hipottica

Ferrovium myxofaciens

(1085-1327)c

82

95

3e-05

41

Protena hipottica

Thioalkalivibrio

HicB

(6542-6901)c

120

95

3e-32

50

VapD

(7580-7918)c

113

83

1e-36

65

HicA

(6904-7131)c

76

94

4e-10

42

Protena de la familia YcfA

DnaJ

(8026-9213)c

401

86

7e-35

34

Chaperona DnaJ

MobA

(9415-11913)c

845

47

8e-64

44

Protena de movilizacin A

ORF's
TraD

56

Description del ORF

Protena de la familia HicB

con dominio nucleasa de la
RNAsa H
Endonucleasa VapD
asociada a virulencia

Organismo Relacionado
Burkholderia cepacia

Providencia rustigianii

Desulfovibrio
fructosivorans
Pseudomonas sp.
Geobacter sp
Alicycliphilus
denitrificans
Acidithiobacillus
thiooxidans

(c)

: Cadena complementaria

Anexo 2.
Table 8. ORFs identificados en el plsmido pAF-PQ31pAfPQ33-1 de At. ferrivorans

Localizacin

Tamao del
producto

%
Covertura

E-Value

%
Identidad

TraD

8582-8989

137

53

2e-05

41

Dgc

3785-6429

837

99

0.0

78

CopG

3345-3599

85

80

8e-17

54

(8928-9491)c

191

90

9e-13

47

324-1211

299

94

0.0

98

(1527-1805)c

93

98

2e-56

96

Eep

(1824-2228)c

136

99

4e-78

88

MobA
H

(6560-8401)c
(1226-1549)c

623
108

80
88

2e-56
1e-54

47
89

ORF's

H
RepA

57

Description del ORF

Organismo Relacionado

Protena de transferencia en
conjugacin TraD
Diguanilato CiclasaFosfodiesterasa con dominio
quimiorrecetor de unin a zinc
Regulador transcripcional de la
familia CopG.
Protena Hipottica con regin
N-terminal de unin al DNA en
la replicacin plasmdica
Protena de replicacin
plasmdica A

Acidithiobacillus
ferrivorans

Protena hipottica
Protena de exclusin de
entrada
Protena de movilizacin A
Protena hipottica

Acidithiobacillus caldus
Fischerella muscicola
Acidithiobacillus caldus
Acidithiobacillus
thioxidans
Acidithiobacillus
thioxidans
Providencia rustigianii
Acidithiobacillus caldus
Acidithiobacillus

thioxidans
c

XerD
(2281-3171)
(c)
: Cadena complementaria

300

70

-91

1e

71

58

Tirosina recombinasa XerD.

Acidithiobacillus caldus

Anexo 3.
SECUENCIA DEL PLSMIDO pAfPQ33-1
ORIGIN

1 cggcgaggcg
tctttgcgcc
61 cggcgccgaa
tatccaccgc
121 cggaggcgtt
ggtttctgga
181 ggccttatgg
aattggtgtg
241 ggtaaaggta
tatccacagg
301 ctggcgtaga
cattcgcgct
361 ggtttcttta
tttttggtag
421 aaggtgacta
ctcattagaa
481 tctgacaacc
gccactcttc
541 tcatgcaggg
tttcctagct
601 atctcatata
atccagagtt
661 agcacgtggc
ctctaccgct
721 gtcattcggt
gccaaatcct
781 gcacgctcac
gcttaatcta
841 cgcaacgcgt
cgttgtaacg
901 agaaaatcat
tcgattgaca
961 gcctccataa
tgttgcacag
1021 ccatatggcc
acgaacccgc
1081 ctgtctccgg
gtctttcggt
1141 gccgcatcca
tgggcgtagg
1201 tggctaccca
agattctcca
1261 tgtattgacg
gacttgaacc
1321 atgtgatgac
tgatctagaa
1381 cttttgcttc
tcgatgtcat

aagccgagga cagggggacc agcagggtcc ccgccagaga

ggcggcaagt gggcgctcct tctttcttcc gctgtggggt
aaaagctttt cttaaagtta aaaacgcgcg cgcgcgttac
atattggcct gcgggtatgt ccgtgtgggt aaaggtacgt
cgtgtctatc cacagaaacg cgtgtgtgaa agtacgtgcc
ttatccaccg ctgtcatgct tgtttcgtag ccttcttctt
gcatgtcccg gatctgcgcc attgagccgg ctctgccgtt
catctgcgtc atgatcaaac acgacttgat agccaggcaa
ctttaatgag cctccgaaac tctcgcaaag tagccgaact
tggcagtggt cgcccgccat cgtggctgga tgccgcaatg
tacgcctgtc taacggcttg cgtagtcgaa agtaatcccg
gggccttaac cgatctaaac aaccaatctg ggagcgtgac
tgtcttttcc cctctcgaca accttccagg catcaattag
gttttccatc tgtttctatg ttggtctcaa tacgtgtccc
cagccatccg atcataacca actccagcaa ctggacgatt
aggcgacaaa tctgaccgtt cgacttatat catctctgcc
gttgacttat gcagtaaatc caaacgtctt tatcatgaat
caggctgtat ctcaacctta taattcccac gttcgtaagt
cacgtaaagc aaaaagagga tgctccatgc ttgccgtatc
aaatgtcagc aatgaaaaag tctcgctgga tatgcctgtc
tatcgatgac agcgcctacc tactctgtcc atgcttctcc
cagaacctgg ttcatcaaga cttggtagcg cccaccgcgg
gtcttgatcg actcttatgg ttatcggttt tttagcgccc
tttccagaaa tcggcactca gctcgggcac atcactataa

59

1441 catcacccaa
ttatcaaccc
1501 ctacagcacg
agatcgagtc
1561 tcccggctgt
cctgttggtg
1621 tacacaacga
ggattcacca
1681 tattctcgcc
tgacgcatcc
1741 acaaaatcaa
ccattcaaaa
1801 atcatatgta
ttgcgccact
1861 ccaaagccat
ctcacgaagc
1921 caagccactt
ttcagactgc
1981 aacgcgctaa
gtcccatact
2041 gtgtcctttg
ctctgaagtg
2101 tcaataacct
atttatgtac
2161 ttttcgtaaa
tatgttgacc
2221 ttagccatgt
caaatcgcca
2281 tcaccgccac
ccgtatgctg
2341 gatgttccgg
ggtcggccag
2401 cgcgaagccg
gccccgccag
2461 cgccccatag
tcccccgtgc
2521 actcaaaaac
tcctgcgcca
2581 ctgccgcagc
tctcctccgt
2641 ccgcagcggc
taatcctgct
2701 ctccaggtcc
gtccgtggcg
2761 gaacatcagg
ctttcgtggc
2821 caccagcagg
ccgaggccgc
2881 ccggcgcttt
cggacggcga
2941 ctctgcggac
cgggtggcaa
3001 atcaggggac
tcactgtgac
3061 cgcttccgct
gaaccacggt

cgcgtccaga cgattccagt ccgtttggga tattgcctga

cgtaatcact gcaggcttat tcatttgttg cgttttcata
tagccttccg caatgagatg atccggacga ggtttgcgct
ccatcaccct tccctctatg cgaccagtcc caacatagcg
tggcatcctc tgccacaatc atgatcccat cccacatttt
ccccgtgttt ttcaaggttg ataaggcgct ttgcttcatc
caataataca tacttaccat ggccaccacc aatgctttcc
ccttctggtg agttagcagt gctgtggttt tgccgacctg
cctgttcctt ggccctaaga tattcacgca gcacttcgtt
ttacactgtc tttatggccg cttttatcat gtccttgact
tgttgtcgcc acaaaccaaa tccccgaaga cccttatcag
ttcgcccttc acggtctgtt tctactgtta tagcaccagt
gatgcgatcg gctctttccg accagccttg cagcttctga
acgcacctgt actttagtgt tgtcgtcagt gttatagctc
agtttctcga agcgcgccgg gttggtggcc gtgtagcgca
tgtcccagat agtcctgaat gagccgggtg tccgcgccct
caggcatgcc ggagcatgtg gggatggggc ggcagggaca
cggcgcagca gcgcccagaa ggttttgcgc gacagcgccg
agcgcctggc gatccagggc cgccccggtg cctccttctt
cagcgctccc gctcggccat ccagcctttc agcaggcgga
tgggtggtgg acagcccgcc cttgagccgc tggacctgga
acctggtcca tccgcatggc acaggcctcc gtcacccgca
aggatcaggc agcggtcgcg cagaccggtc cggggattgt
cgatccacct ccagtgtggt gagatgcttt ctttcgccct
tggggggtgg ctaccgctgc ggataacaga tcctgtcctg
ggcgactctg cggacggcgg ccctgcaggc gaccgcgctg
gatacggcag gcccggacgc gaccggagcg ggtgcatctg
ggcatccccc cgaacaattc cccctgaccg ggcacgaccg
60

3121 ctccgcctcg
tcgccaaaaa
3181 tctccgccgt
ggtagcagca
3241 gaatcagtac
gcataaggtc
3301 ttgatggtca
gcgttgaccg
3361 ttcgactacc
cgcaaagtaa
3421 gcgtcagcag
gatgcagaaa
3481 ccagattcca
cttgagctgc
3541 tgggcaaggc
acggaatgat
3601 gaaaaacccc
tttcggacag
3661 gggctgaggt
ttgtctcacc
3721 cccctgaaat
cggtcccgga
3781 acggatgaaa
gggacccgga
3841 ctttcagatc
ccctggctcg
3901 gactttctac
gggactttga
3961 ccctcagcgc
agcttcttgc
4021 tagccacctg
tacaccatcg
4081 tctgggtatc
gtcattggca
4141 gaagatactc
acgccttgtt
4201 ccgcctactg
cctccagaga
4261 gaccgatgcc
ccgttccccg
4321 cgacgagtcc
tgccgcgcaa
4381 gagctccagt
atttgcttac
4441 gctggaatgc
atgccggaga
4501 tccctgctgg
aagacccgcg
4561 cgcgccggaa
tttttccctt
4621 cggggcgcag
gctacttcca
4681 ccgggtcgga
tattgctgct
4741 gcgcaaccaa
tctttcggga

atccccctct tccgtttccg cccggtttcc ccgtccacca

gatcgtaatg tcccatgata gccccttatg gagcttgccc
attaagactt cgccggccgc aggccacgag acagaatggc
taccccaacc ctcacgccgc caggagatgg caccatgagc
ggatgacaaa catcgccgcc tgaaggagct ttccaggcag
gcttatcgac gagatgacca ccctcatgct ggcggatttc
gttaagggca agtcgcgggc aagggaaggc gtctcgcggg
ggtagatggt gtacacgaca gccagatgtt ccggggcgga
gtccgaatct atcgccccgt ccagaaggca ctttgcctac
gggtgtccga aagggaccgg ttttggacag ttagtagctg
ttgcaaggaa gcggaagcca tgaaaaacat cgaatcagca
ccactacagg ggagttacct cccggatttt ttgggcctac
atcgatcggt accgggccat tctcgatgcg gaagcaccgg
gactacctgc tttcctaccc ggccaccgcc gccgtctttc
ctggatgccc tgatcgagaa acagaccgat catgcccgcc
gacacgtcct ggcgggagtc catgcgcaaa gtcggcgcgt
gcgccttcct gggtcgccgg agcctatgtc ctctactggc
caggagcagg tccccgcgag cgaccagaag gtgttgcggg
atcggcgacc tgatgaccca gctcgacggc tacgcccgcg
gaaaggctgg ccttgttcga cgtgttgctg aatgtgcttg
ccgcgcccgg aggcgttgct ccagcaaatc tgcgaagcct
gttcgcctgg ccggttatgt cgtgactggc ggcatggggg
atagccgggc ttcctctgcc agacctgcag ataccgaagc
gaagccctgg aaagcggaca ggcggtcatt cagtccgtgg
tggatcaaag ccttgcggaa ccgcgttgag gaactcggga
gatctgcgcg gtgtagtctt gattggagtg cgcgaaaagg
tcagcgtact tcgacgcctt tgcgcatctg ggcgaattgg
tccttgcgcg accccctgac cggtctaccc aatcgcgccc
61

4801 tcgcctggaa
gggtggcgtt
4861 cctggacctg
tcggagacca
4921 attactgcaa
acaccctcgc
4981 ccgcatgggg
tggacaattt
5041 cgaggggatc
tctatggcga
5101 atccgtcagt
acagcgatgc
5161 cgacacgctg
ccggccggga
5221 ccagtttcat
cgtccatgcg
5281 cacgctactg
agcccatcgt
5341 ctccagtgcc
atccggagca
5401 gggactgctt
tcgcgcgtcc
5461 catcggccgc
aaagggaggg
5521 attgccgttg
cccgttttct
5581 ggaagacctg
aggtagagat
5641 cgagatcacc
tcttgcactc
5701 ctgccgccgc
acgcttccct
5761 gacctacctc
tcgtgcgcaa
5821 catgatcaat
ccagccgcat
5881 gctgggcctg
ccttgctggt
5941 caagatgggc
cggccgagga
6001 catccccggc
ccttgccccc
6061 ccccatggac
cgacgttctc
6121 cgcgccctgc
tgccgaggag
6181 tattgccata
gcagtcaccg
6241 ggtttctctc
cgcggccaag
6301 cgtctcctgg
gctggaagaa
6361 gaaaaccgct
gacagtacac
6421 acaccgtaac
cccgccgagg

ctcgcgataa aacagaccct gcggaccgat cgcttgctgg

gacggattca aggcagtaaa cgaccgacta ggccatggcg
actctgggcc aacggctgca ggcgcagttg cgaccggggg
ggtgatgagt ttggcctgat acttccgaat ctggagagcg
ggcgagcgac tgctggccac catccgcacc ccgatggaaa
gtctccggca gcctgggggt gaccctctat cctctggacg
atacggcacg ccgacatggc gctctatgcc gccaaggatg
ctgcataccc tggccctgga cgatgccgta cagaccacag
gaacaggcac tgaacgacca ccgcctgctt ctgcactatc
ggttcggtct cgagcgtgga agccctcatc cgcctgcagc
gcgcctgcgg cctttttctc cgccctggat catcctcgcc
ttcgtcctgg aaacggcctt gcgccaaggg gagatctggc
cgcctgtcgg tgaacatcag cacgcgtcat ctgctcgatg
cgggaagcgc tggccaggca tccgggcttg cccccggaac
gagtcggccc ccttgctcga cctccaaggc gcgcaggaaa
ctgggggtac gcgtggccct cgacgacttc ggcaccggca
cagcaactcc ccgcccatta catcaaaatc gatcagagct
gatccaaagg ctctcgccat cgtcgcagcg gtgatcaccg
gacgtgattg ccgagggggt ggaaacggca gatcacgccg
tgcagtcatc tgcaagggta tctcttctcc aagccgctcc
tggctcgccc gttttcgccc ggctccccgg ctgggggatg
atcctgccgc caatcctgga agcgcacatc ctgcgtgtgc
gccaagaaaa tccattcccc gcccacgtcc tggaagagga
tggggcggtg gctgcggggg gaagccgcgc tcctatttgg
gcctcctgac ccgtcatgaa cggctgcatc aactcgcccg
acgcaggaga taaggagggt gccttggctc agggagcgct
tgctgttgga acaagtgcaa gccatgacga cggagcggcg
gccccgcata tatccaccaa acgaccgttt gatggacacg
62

6481 cctgcgcggc
gccccagagt
6541 tgagttgttg
ttgctgcggg
6601 ccgtgccttt
cggttcgcgg
6661 cctgccgctc
tcggagacgc
6721 tgaaccccgc
gtcccctcga
6781 tcattaactc
atatcgttta
6841 tcccccgtgg
ctgccctgat
6901 tatccctgac
ttctgctcaa
6961 cggcccgctc
cgccacgcct
7021 gccacggcgt
ggtgcccacg
7081 gttccgtggt
cgccgctcct
7141 gcagcgcggc
tagacccaga
7201 tccggcgacc
tgttcatatc
7261 ctgcttggcg
tgctcggcca
7321 atgccaataa
cgctctcgct
7381 ccagccgcag
tcccggagac
7441 gggtttcccg
gcttcaatga
7501 cggcctggcg
cgctccggtg
7561 cattctctga
ggacggtcga
7621 gggcgtcagc
tccaccgtgg
7681 cggacatatc
atccgggcat
7741 cgatgcccgc
cgcacacggt
7801 cggtccaggt
ggtatcggca
7861 ggcgctcgcg
aacagcgtct
7921 cggcatcacg
acgtgccgat
7981 gctcggggtg
accccgccat
8041 ccaccgtggc
tcttgggaca
8101 attcttcggg
cgctcgtggg

cagtgtttcc gcagtgccga ttggcgtttc tggacaaaac

gacacatcat catccaggtc cccagtcgtc accgggaccc
ggtcggctgc ttctttcgta aaagttcctg ctgacgctgc
cgcctcgatc tgttgcctag cacttttctc aagcacttta
ttgtaacgcg gctgacgccg ccgccaaccg aaaaccgtcc
cgtccagccc ttggctttcg ccaactccag catcaacgga
attctccgct ttcacaatgg cgcccgtatc gatgatctcc
attcagtcca cccaggtcag gacgcatccg aatataccaa
tgcggttgcc atcccatagc gctctgccag cgttttttcc
ttttttctcc ccccgcaccg ctacagcgtc cgctaccatg
acgccaggag cgctgtgcgg catcgacgtc attcgcctcc
tttgaccgcc gcctgcgctt ccggcagatc attcggcggg
gtactctcct ccctgaccat cggggacgcg gcgctcgacc
gtaggcctga cccacatcca agtcggtttg ggtccgcaac
ccccctctgg cgggccttcc tggcggcatc ggcggcctga
atcccgcgcc gcctgtatcc gcaaaagacg cgcacgggcc
ccgggcaatc tccgccgctt cccgctccgc tgcccgccgg
ctcggccttg gccgcctcga aatccaccac catctccgcc
cccggcatgg gtcagcaccc gccctttctt cggctccggg
tttatccgcg aactgccgcg cccagatcgg atcttcttcc
cagatatgct tcgcgttgcg cttccagcgt gcgatggtcg
ctgctccagc gcttcgttgg ccagcccctc ccagagagga
ggatgcgggc accacctggt catcaacgtc tttgtggccg
ggtctttcgc gctccgggca ccttggcatt gggctgcttg
ctccacgcca tccatgatgc ggtcggatag caggatatga
ggcggcgtcc tgctggtgga tcgccagcgt gtacggcgtg
gacttcctga gcaaaaaccc gcgccagcgc tatttgctgc
aagggctgcc tcgacctctc gataggtgca gccgttcgcc
63

8161 cgtcgctggc
aaattgccgg
8221 attcggcatg
gtgaccccat
8281 cctgcacctg
cgcgcctttc
8341 caccagcgcc
taaatcgcca
8401 tacgctctcc
ggacatgatt
8461 aagcgcgcct
atcatatcgt
8521 ctagcatggg
tcgaggaaca
8581 catggcccgc
ccgccgatgc
8641 gcaattacgc
cccgcaagga
8701 gcgcaacaag
tcctgtccct
8761 ggaccgggga
aggggaaccc
8821 cgagaaaacg
gggaaacaga
8881 gaaggccaaa
gtccggctcc
8941 gctgggcgct
cgcctccagc
9001 gcctgccgct
cgcctctttg
9061 gcccgtgctt
cgccatttca
9121 gccagatcgg
cgtcgagaac
9181 tgcgccaaca
ccagaccgcc
9241 tggaaggccc
ctccggcatc
9301 gccggcgcgc
cgccaggctc
9361 ccccgtccga
gccgagggcc
9421 tcgaccgccg
cggtacgatg
9481 gcctcgtcca
ttatatgtaa
9541 attacagata
gacatccaga
9601 ggggtcggcg
acgctaggac
9661 tgctggtgga
gttcggaatg
9721 aataaccgcc
ggaaagcccc
9781 gccaaggccc
gggttcccta

gtcccagaaa cgggcggggt ccgctacggc ccaggcgggc

aacgagctcg gcgcgcttgt cgatgacgat ctcccgtacc
ctcccggacc ttcgtgtatg acccttcccg cagcaaataa
tttgccgctg ctcttgctgc cactgctgac gtgcaggtga
ggggtgcagg ggcgcagccc ttgccgtgct catgtccgta
gctttgcagg atacggcatg gcggctcctt gtataggcat
gcaacaggga atcgcgtgga tgatcgtatg acaaaggctg
ctggctgcac agaaagaggc ggctctggaa aaggccaagg
aaactccggg cggaacagga ccgcctggcg cgaatctccg
gcgctgattc aggcgggcct cctggtggag atgacgagcc
accctcctgg gcgggttgct ggccctggtc aggagcgccg
gcactatgga aacaggcggg cgacgcggag atcacccggc
aaaaagacag aaccgaagga acccgcgctg gacggattca
gcccctccga cgacaacatc ccgcgcaatc gcgccatgac
ctcccgccat gaccgcccgt tcctgaacca gggcttcttc
ccgccgcctg cgcacgggct tccgtgcaat ccacctgctc
agagcgccgt ctccagaccc tcggccaggg tccggctctc
gcgcggcgtg tctccgctcg gccatcgccc aggccgccga
ctgtcaggtc gctgggcatg gcgggggcac tctccaggtc
tctcggcgtc ccggatggcc tgcaggtgct tctgaatggt
tccgggcgcg aatcgccgcc gcgttggtgc ggttcgggcc
accggacgtc atcggcggtg atgggaccgg cgggaaccgg
tgattgtctc ctctaccatg taatttacta tgtaaacgta
gaagtaaaat atttttacac agtgcccgcc gaccttggcg
gcgttgagga cggagcgccc cttcccttgc agaggcccag
gatcgggaga cggcaggggc tcgcaatgcg tgtcgaacac
aaaccgccct ggtgacacgg gtacacccgc cagccgctca
caaatctgcc ctacagcgca cacaatgggc attggtggta
64

9841 ccccaagcgc
cgacggcgcc
9901 gcacagaccc
tgccacgcct
9961 tcggcgtgcc
tactccgtag
10021 caggcattcc
caaatcgccc
10081 gccactcctc
tcaaaaaaag
10141 cctgattcac
gggacggcgt
10201 ccccaaaggg
//

cggaaaggcg atttacgcgc ccgcaatgcc cattcaatcg

cgaaggagtg cccgcttgcc acgccttcgg agtgcccgtt
gggcacggat tgctttccgg ccatgcaaac cctcgcgtag
gccctctggg cggttgcggt agcgtcgaac gatttgcaag
gctgttcttt gcgcctgcgg cgctagagca aaagctcttt
tgctaaaccg aaagggggga gccgatgccg gaggcattgg
ggtcgatc

Anexo 4.
SECUENCIA DEL PLSMIDO pAfPQ33-2
ORIGIN
1 taaagcactt cgctggatcg attgatccgc acccgctcaa tcactgcgcc
gttcacctgc
65

61 tctacggtct
cccgcctgcg
121 ccttttccgg
cattcgggcg
181 cctccttctt
gcgcgtttct
241 cgaagagaaa
actcgattgc
301 tgtgcaacta
ggctcaggag
361 gggatcatgg
caaagcccgc
421 gccgatgcgg
gaaggccaaa
481 aaagaggccc
gatgatcctc
541 gcggatctcg
cctgctcggg
601 ggattgatgg
ctttcaggag
661 tggaaaagcg
atcaccaccg
721 gccaaaaacc
tacgtaagca
781 tcacactatc
cggcgtgatc
841 ctgatgcgca
cgggggcatc
901 ctcctccgca
gcgccttctt
961 gcgctgcgct
cgggtcctct
1021 ctgtaagcgt
gctttttgtg
1081 agactcacac
cagcgggcca
1141 ggctatccaa
gtggcctcat
1201 ccatgccgag
gcgggctgga
1261 gggtgatttt
tcggtgatgc
1321 gctgcatgaa
ccccgttccc
1381 gtcctgcatc
acggcccatt
1441 ccacgcagtc
atgataaaac
1501 tcaacagcca
aaaaccgtcc
1561 atgaaatggc
ctcccggaac
1621 tgaaccgaag
ggcaacaccg
1681 tgaatctctg
aattcaaaga

tttgtgcata ggcgccttca cgcagaatat accgcacatg

caccgcgact gtgggtcttt gcgtgtaggt ggtattccgc
tcttcttgcc gtctgcaaga ctggccgccc cgcagtggcc
cattaaagcg cgcctgcctt acctgacggt gcgtctggaa
tagagtccgt gtatggtcca aagttccacg cgtgccgcat
tttccaaggc agaacgacta cagcaacagt acgagatcaa
ctaaagccgc cctggctgag ttacgccgca tccagaatca
gcaagaaacg gaatcatgcg ctgtttgaat ccgccggatt
tcgtgtcgga atccggtctg cccgctgtgg accggggcgc
cggtggctaa aacgctggaa cacggaccgg aatcgacccg
ccggagatgc cctgctggcc gaacgcgaag ccgcccggca
ccgcgacggc accagaccag acacccagcg aatccttcat
catccataac gccgcccgaa ggcttcccag gcccgctgtg
cttttaccag caccccgcat cagtgccagc agcgcccggt
ccgatggcct cgatagtggc ccgcttgtcg cgttgatact
gcggtcatcg gatgatcgtg gataggcttc ctgggcatgg
gatactcaca atatagcata aagtgagtat cacataaacc
cacccgcaac tcggccaccc cgcagccctg cgccttcagc
actcgcccag gtgcggactt cggtgcgggc cgacttgata
cttgagcacc acggcccagc gctctttgcc gttccagggt
acggacggac ccggcattga cgaggatgcg gaaggtttct
cggactcact ttttgaagcg acgaaaaggc caaagtgtag
acccgctgcc tgcgtaaata acccccgaaa acttcacata
ccatttgcca gcgccgtgcc gcttccctaa aatttccgac
agatcgagac cgtgttctgc aatgcctaca ggatggtccg
ccttctgttg cgtcttagtc agccccgtat cagctcactc
aggtcttatc cacgcgcccc ggtgtaaggt gggacccaga
ggatctaccc attccgcagg aaacccccgc atgaaagcca
66

1741 cgccacagtc
ccgtcaccgt
1801 gacggaagtg
ccgatgggaa
1861 ccccggtaaa
aacaggttta
1921 tccccaaaat
cgggatatgg
1981 aaagcagcac
gctcgtgcag
2041 gccacacccg
ggttgcggta
2101 gcgtcgggcg
cgctacgcgg
2161 tcctgagcaa
atttttcttc
2221 ttcgttcaac
tccctaatcc
2281 acccggactg
atcgatctac
2341 tgcgggtcca
ggcggcgtgt
2401 actcggaatc
ctgtccgtat
2461 cgcctttgag
gaataaacgc
2521 cctaggctgt
cagtttccat
2581 acggcgggat
ggggcttctt
2641 gggacgcttg
gcgcgagaca
2701 ggccgggacg
aggcgcggca
2761 aacgtgccag
gccacttgcc
2821 acccccgcaa
gggggatggg
2881 ggggctgcag
cgctacactg
2941 tgcatgtttc
tggggaggcg
3001 tgttgtcacg
acctgccagg
3061 cggcggcagg
cgtccggagc
3121 caacatctca
aaggaaacct
3181 gctgtagtcg
cacgttatcg
3241 ttcacaatga
tattgagcat
3301 tacagaagct
acaacaagtc
3361 tggggctctg
tgtctgagat

ggcgccaccc tctggatcaa ggatcacggg gaatggaaag

cgtaaaggcg gcaaaggaca caaggttgct tggaccgatg
agcgcgctgg acaccatgta cgcgcaaccc aaagactgaa
ctgtggggca ccctgtgggc aatgtggaca aaaccctgac
ggcggaaaaa gcggcgccct ctccccagac ccctcaccca
ccgcactccg tagcaggcac tccgcgtcgc catgctcctt
atccgcaagc gaatcacccg ccactcctcg ctcttctttc
aagctcttta tcggccttcg gcctgtatcg acttcccttt
cagcccggag ggagtaaggg agggagccag ggcgaaagtc
cccttttcag acagcggggt ggattaggac tttcgccctg
gcccgtcggt cggtcggtcg gtcggccact caaggtggcg
agcacacaca acacggctca agagattcct ctcccgctgc
ggcctatcca acggtaagcc tgcacgcagg cccttgcggt
ctctaggccc cggatatgag cagttcccat cctctccggg
cgggcctcat cccccagcgc agcaagtaag attcacaccg
caccgcatgg gcaaaacatc tctgaaaacc ctacggcgga
atggcaaagc cgcccgcgaa gggcgcagaa aggccctgca
tggtgtagat atagcggaaa gggagaaaga gaggctagag
cgtggctcat acagggcgct cgatgcgctc ggcctacgtc
ttgcagccag gtagaaagat tttgcttgct ggtaaaaagt
ttgccctgtt tgagagggtt aagggaccac ggcaacagcc
gcgtatgggt ttatcctagc gccatttgta aaaaattcct
atgccagggg cctcgatccg aaaggatcgg ggcctttgtg
ccaaagccac aacattcgcc ttaaccaacc ttatctgtgc
tcaaatctgg ttgagaattt ggcgtgtgct tcaccatgaa
acactacaac acgttcacag aatggggcgg acagtggcta
gcgcgactct ttgggaagag ccgaacaaca ctatacaaat
agctttgttc caggggacga tggcaagcct gccgttgata
67

3421 gcttagagta
atgaacaagg
3481 caacacgtcc
ccgcattgca
3541 ggaggttgtc
aaaaatggtt
3601 gcaggagcgg
aaccgccgga
3661 gcagcctgaa
caaaagggcg
3721 gcgcctttta
tacgggccta
3781 ccgcaatgga
cgaggacgcg
3841 tggatcaaat
ctggaacaag
3901 ctatgaatct
aggcagcaga
3961 tcacgttgga
gaactatcct
4021 gacaggacgt
caccggcacc
4081 cagagaaccc
caagacagaa
4141 tgatgcattc
gagcgcccac
4201 tacaaatccc
aatacgaacc
4261 tagttacttc
gtacttggct
4321 tttggctttt
tgttgtatac
4381 tttccacagg
gccgttattc
4441 ctgagactga
actagccgtc
4501 gcggcggctt
cgctgatacc
4561 ggtccggttg
gacatctacc
4621 aatggttcat
ccgcttaggc
4681 ttcaagggcg
ggataacgct
4741 gctatccgca
tggtaacgca
4801 tccatccttg
tgaagtcggc
4861 aagttcaagc
tgtattacgc
4921 agcatggccc
tggcaaatac
4981 gtattgaacg
cgactccacc
5041 tcactggatt
gatcccattt

tttggcagcg ttcacggtgg taccgttcat aatagccaaa

aaattagaca atgaacacgg cctgttagca gaaaaagttg
aggcgacagg acgagttact gagaaaggca gatgaccgag
ctagaacgat ctcaacaaca gatacaagca ctgatccatc
gcacttcaaa aaagaaaaaa gtggtggccg tggtgacaga
gtaatccatt aaaccgccta tgcttggcag aacagactca
aaacatcgaa aacctagttt tggaacactt gcgccatatc
cgctgaggat atgggcgacc tgaaacaccg catgtctggc
ggtgaaacgt gagatcaacc tgagtgagga aaccgatgcc
caagctggcc gagcgcatcg gacgcattga gcgccgtctc
aaaatgggcg gcctcatcgt tttgtctcaa aacagccagt
agcaaaatca ggccatccgc ccgtcctgtc cgagcaccca
tgtctaatcg ctaagcgtgt gacgccgtgc tgatctttcg
acacccctcc ttgcatctcc acctgtgctg gcttagatta
atgactgggc tcctcccgcc atgagccaag tacctcaacg
ttacacccca cacctcaagt ttcttgcatt ttcctgacac
gataggcaaa aagtatacgc caaaggacca tctggccagc
tttgaggagg agtacctaat atgaagaaga atctcgtagc
ttgttgttcc tggcgttgct tttgccacaa caagtagcaa
tttacggcta tgcgcaaatc actggcgccc agcagtttgg
ctcaaggcag cagcggtttg gtatttggtg cgaaccgtat
aggctgttcc cggtgtgacc tataatatga tggctggctg
gcggctatgg caacctgttg aacaacggtc ttggtaacaa
atgcatggtt aaactacgcg cccctaccct ttgctcagct
ttcccgttgg taacgacgcg aaaggcaatg agttgccctt
agtccctact tccagggcgc tctgcaggtg ccatggttca
gtcggactgg taccgctcta ggttatgcag ctggcattgc
cctacaacgc ttatagcgcc ttcacgtccg gaaatggaac
68

5101 ggtgctggac
tgcccggtta
5161 cactatgacc
tatgaagctg
5221 cattctcttc
catccacggc
5281 aaaatcatgg
tcgcagcttt
5341 ggaaccccta
gtatgctcaa
5401 gctgggctca
agcagttcgt
5461 ttcgactcgt
taacaccaca
5521 ctcggactga
tcagctgaac
5581 tacatcattc
tggcttcaat
5641 ggtggcgcat
tactctgatg
5701 ttgcagttcc
atcgaaagat
5761 ggcggccttt
tgaccagctc
5821 cgattggcgg
aatcgccaag
5881 gccttgcagt
aaacagaatg
5941 tctttagaaa
gcacatttct
6001 ccaaaaattg
tcttcctctc
6061 gtaattaacc
tgacactatc
6121 ccggtcggat
cttatgcaaa
6181 ccacaaaata
ctggggaaag
6241 ctattaccac
agatcaaaac
6301 accaccccag
aaatcatagc
6361 tctctggaat
ggatatcgac
6421 agcgctcgcc
gacactttca
6481 gggctgaaaa
tccggtaaac
6541 ctcattccac
accatcgcat
6601 tgagcgatac
gattttggta
6661 ctctggcaat
accggcatcc
6721 cctgctcctg
tgtaacgctt

agagcgcctc cctcaacggc agcggcacct atttggtttt

tcatggggcc tacactgaaa gctgaaatta gtggctcaga
cttatgcacc tgcagcatcc gtctatacat ggaacgcgcg
gcattctcta tgcagcggcg tatacccagt taaagagtgg
acggttataa tggttctaat gggatgtctg ccacagattg
atctctatca ggcgggctta acgccgctgg atatcgaacc
ataccatcaa cgatcataac ggtactgatg cgaagatcga
actacttcgt caaccctaac aacccttatg cggcagaggt
cttctgcgcg tcaaggaaag ttcggttacc agccgaatgg
ttggagcgaa tcaggctcca atcgatggtg tcgcgtataa
aggccggctt ctaattagct gataatggag aaaggccgct
tgcatttaat ggcatacacc aagcaaagta ttcacgatga
caaaatcgct cattgtacta cgcaatgaaa aattggcagg
ttgacccagg cggtatatct ggctggctgg gcggaacccc
aaaaggaatt tttttccacc tatctaggat tggaatacgc
ttcaccgctg gtcaacaaat gcggaagacg ttagaaccct
atgaaatgct tcatcgtata cgcatcagtc aggtttcttc
gcatttacca ttcagccata ggtaatacaa tacttattgc
aagcatttcc tatgccaatc gtcaccccaa aagatagtgg
ctatagatgt ggccaagagt acttggaatt catggtggac
aagaaatcgc cgcatacctt tccatttctc aaaaaacgac
cgtgggcatt attggttgcg gagttgatcc aacgcggcgc
aatgcctaga aaccaaggtt ttgtgacact ccggtttttg
tggcctcgaa agtgtccatc aacccgtcta ccttttagcg
ccgcgttccc tgacccagcc ccttggcgat gagcgtcaaa
tccctccatt ctggcccgcg cagcaagttg ggcatggatg
gaatttgccg gaagccacgc ccccaccatt cggtgccggt
caaagcctct ataacagcat tcaaggcttc ccggccattc
69

6781 cttccagcgt
atcagaaatc
6841 caccaccttc
aaggcataca
6901 tggtcattct
tgatcggtcg
6961 atgggcgggc
gactgccgcc
7021 atcgtgtcgc
caatctgcca
7081 ccccatgggg
tcaacgaatg
7141 atactacttg
cgtttttgag
7201 aggctctcaa
ctcaaaatca
7261 gctcttgaaa
ttgtcactgt
7321 gaccagcgct
gtggtctcca
7381 cggcggtcat
tcacgctcct
7441 gatcagcggc
tgcggcctga
7501 gcaaatcctc
gttcagccct
7561 gtctgctaaa
ctttttttta
7621 gatcgctgcc
cgcagcatcc
7681 gaatgtcacg
tgaacggcca
7741 gaacgcagga
tgttgccagt
7801 tgaatccgta
ccgtaagact
7861 cattgtgata
gcgtacatgg
7921 caactctcca
aacaccaaaa
7981 cccgcttcac
agtcctcatc
8041 cacgccccag
tctcccggcg
8101 ttgcatctgc
tctcctgctg
8161 gatcccggcc
ggataaagcc
8221 ctttgctgag
gctgctgaat
8281 atcctgaacg
tataggtttt
8341 gaggtgatcc
gatcctgctg
8401 cagagcgagt
gttgcatcag

ttcgccatcc gcaatgcatt ctgtgaaatc cggataggaa

tgaaggcttc agcggacgca tctcgaacgg gtaatcttcc
cctgccacca ggcgcaaaaa ctttttgatg tagaccggct
actggcagcg tccgtccatc gggccggata aatacgcaat
caggtgattc cgtgctgacg ggcaaccacc tgaagatcat
tggtttttca tagcctcacg cagtttgatc gctttattca
taacatcgtt tagcatcata gacgacctct caaaaccgac
cgtctgtcac agtgacacgc tgaatcagtc ccttaccgtt
tgtgtttctt gattcggccc tgaatgaacg ggttttgaga
gcccatctct tacctgggca tccccagatg gatcagaatg
atccgccagc aaggcattgc accatgcctg tgcttcagcc
catcgccgtg tagccgtcat ccagggcggt atcgagcaca
actcaatgaa ttggttcatg tgccgcctgc caatggttcg
cgtctctgtt caggccgcct ttaggtcggc gctgtggagt
ccgttccacg gcgggcatca gatcgttgtt atcctcgatc
caccgaagaa gcaaaccagt cgaaccgtgc ggtgatgtcc
cacggcatcc acggtatccc caccaaaata gacgctgccc
gtcctctacc agaatacgac gaatatccga gtaggcgtta
ggcatccttc agggtttgcg tatccagatc aaaggtgatg
aagattcggc gttttcatta gtataggggt gaatccagcc
ccgcgccttc ttcgccgtcc ccggtctttg cggtttcagt
aacatttccg tatcccgatc catctgctgc tgccttcgta
agccaggctt taagtgtcgt cggctcctgg agggccacca
gtggcccgtc gcatttcccg gagcgtatcc tcaaaatccc
cgtggggcaa aaaacggccc ccccatgccg gcagcagcgc
cgcgccttga ggcgtgccag atgttccttg agcgcctgat
accgccaaag cgctgagcgc ttccggatct atctgtccga
agttgcagca ggtctttccc ggcataggcc tggttggcac
70

8461 tgcggttttc
ccatactgac
8521 cagttgccgg
cggcctgttg
8581 ggtatcccgt
cgaccggctc
8641 cgcagccgcg
gtgccgccaa
8701 ccggtctttt
tggctgtctc
8761 ctcgacttct
gagattcaat
8821 gtccatgact
tatcgtccgg
8881 atactccata
tctctcgggc
8941 gacattgccc
actggatgcg
9001 caacgccaga
gttgggtatc
9061 ggccattgcc
gctggctcag
9121 gcggttgaag
gggcaatagt
9181 cagggcaagg
gtaatttata
9241 ggcgagacca
ggtggctagt
9301 aaaagtggat
ccatcaccct
9361 ctctgatacc
cacatcaccg
9421 cttcatccct
gaccgccctg
9481 cacagatttg
gcaccagttc
9541 cacaaattcc
tctcagcccg
9601 acggcccagc
actgcgcttc
9661 ccgctcctgc
tgcccttgag
9721 cgacgggtcg
ctttacgctg
9781 ttccgggctc
gcttttgaat
9841 atccgcctcc
cccgcactcc
9901 cggcagatca
aacccgcttc
9961 cagaaagtgt
ccagcgcatc
10021 gagtttcttg
gctgggccgc
10081 cttctgctcc
catgggtgtt

tgttcccgcc gttctggatc ggtttctcgg tcgggatgca

taaatcgtgc gcaaggcctg ccggatattt tcagcctgcg
gctttttgcg cgcccgtacg cgggcgttct ggcgcttcat
ccgcgcgctt cccgccgttc ccgccgcaag gtttccatct
atcagccgct ccatgaagtc cgtgaaagac tccggacccg
tccgcagcat cgccggagcg gaaatcaaaa aagtccgcca
tcagccccgc catggcgctg gtgaatctcc cgaagggtgg
atcagttctg cggcgagctg cacgatgacc tgtgacaggg
agtttgatcg cctgactgct accatccagc tgctgcagca
tattgctgct gtgccgggag aagatcggtg ataacccgtt
cgctcccagt cctgtaagtc ccgttccgtg ttggcaatct
gttctttgcg gtgcggacag gggggctttg ggcgcggcgg
gggcggcact ttggatcaga catgcgtgca ggtaacctct
gaaaaaacac actggccacc gtgtggattc agacatccat
gcatgctgaa aagtaagtcg gtcaccccaa aaagacaagg
atcaacctca tcaccgtacg caccaaaaca gagcacccac
tgactgttcg aaagcacctt ttcctgacgg tatgcctcac
gacagcgcct tttcattcac gcccaatcca accccacgct
cgctgtatct cggtttgctt cccggcgtta ctgcccactt
ttatgggcgg cagcccgaag gactttgcga tcctgttcca
ctggcccgac ccatcccctg tttgtaagcc gtgttcgcca
tcctggatct cctgcgcgag acgctggtgt tccgggtccg
cattgtccgc tttccagtcg ataacccacg ctttccgccc
gtgtccttcc gctgggcagc ggccagcgcg tcccaggccg
gggtctggat aggcatagaa cccatcttta tcctccacaa
ttccctgagt tcccagagcc atgacgctcc agatgcaaga
acccgatccg cacgaatccg cgctgcctct tcccgtttcc
aggtccagtg tgtaccagaa ctgctgctgc ccgtccggct
71

10141 cagacgctcc
agggcagcgc
10201 atccagcggc
tcgtgatact
10261 cacatcacca
gccgacgctc
10321 acgcaaagcc
atatggtcca
10381 cgcgatgccc
cgccctgcgc
10441 ccaggcgttt
acgggtcggg
10501 atctttggag
tccaggcctc
10561 tgcggcttcc
ccggacacaa
10621 cagcgggatc
gcgcccgcat
10681 ccattccgcc
cggtgtccct
10741 ctcctgctgg
atcccgccgc
10801 cagcgccgcc
tcagggcttt
10861 ccagcctttc
tcccgcccgg
10921 gctggatgcc
ccatcacttt
10981 attgtggata
cccgttcgac
11041 ccgcacccag
tcagtacccg
11101 ctcccgatac
ccgcagcccg
11161 gaacccgttg
cccgcgcctg
11221 ctgccgtttc
gcagcccctg
11281 gcgcgcccgc
ggtcccgatc
11341 cgccaccgct
ccctggccgc
11401 ttcaaaatcc
cgtgggtcag
11461 tacccgccct
gggcgtgctg
11521 caaggccgct
cctgctccat
11581 ccgccgcgct
gggccagcgc
11641 gtcgttcgcc
cctggccgat
11701 ccgcgcctgc
tcgctgcccg
11761 ccgaaaccac
agagcatcag

cgcgcctgat cgagcgcgtt ccggtccccg gctttctcca

accgactgcc gcagcaagtg ttccagcacc aaaacctttt
ccaaatgtca ccgtcacacc gcgatccacc ccggcccgtt
cccgcataac gctcgaccga ctcccgcgtt accgccccgg
ggaccttccg gcgcatcctt tcctactttc aacgtcagac
aatgccgctt cccgtccagc ggccgccgcc tgtgctttta
agcgcctgcc gttctgccgt ttctccgtag cggcccacgg
cacaaagccg gacgctgcag aaccgaccga tccagtcctg
tggccgcccg ccagacgttg tgcctgtgcc tgtttcggat
aagactgggg ccgcttccag atctttgacc cgctgtgctt
gccgcaatcc ggacggccag atttccatcg gtcagtgtga
gctcccgccc gcatctgaaa gtcctccgtc cctgtcaccg
gcgcccgcga tcttcagcat ggcttcgatc tcctgggcct
gcctgcaagg ccaccagccg gtcgccataa tcggtgatgt
tgcaggctgg gcgccctgcc aagggtccgg ctgcccagat
cggcccaggg cctgaccgac gtccgctccg taggcctccg
accgcccagg cagggcgctc cggattgccg ggcaccgccg
cgcgtctccg ccagcgtctc ggcgtccagg acccgatcca
cgccagcgct cacgaatgcg catcttgtcg aaagggtcac
gccgccgaca acaccgcttg cgcctgctcc accgcctgcc
tccgccaaac gccggacttc caccgcctgc gcccgcgcgg
accaccatcg ccgcccgccc cggcgccttc tccggccccg
ttcttcggct ccgggggacg atctaacgct tctgcgcttc
atttcgtgat gatcacacat cgcctgcgcg gccaaggctt
tccaggctcc ggtgatcgat ccgcgcgtct acttccgcat
agtcgcgccc agagggggcg caccacgtcc cccagccact
gtcttcggtg cgcctccccg tgccgggtct ttccccggat
aacgccacat cgcgttcgat gccatcattc actttgtcgg
72

11821 atgacagtgc
tgtacggcgt
11881 cgtccaaccc
caaaagaacg
11941 tgccagttcg
cgatctcccg
12001 atagaccgtg
ctgcgggagt
12061 ctgcgcccag
//

agcaacatcg gttttttttc gctgcgatgt attgccagcg

atgccgggtg ctaaccccgg cacggcggca agttcctctg
atgttctcgt tgtcggataa ctccttcggc agcgcaaatt
ccgttcgccc gctcgtactg atctgcagca tcccagtagt
acgggcagat ggccggattc cgca

73