BAB I

PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Polymerase Chain Reaction atau yang lebih dikenal dengan istilah
PCR. PCR adalah suatu metode in vitro untuk menghasilkan sejumlah
fragmen DNA spesifik dengan panjang dan jumlah skuens yang telah
ditentukan dari jumlah kecil template kompleks.
PCR merupakan suatu teknik sangat kuat dan sangat sensitif dan
dapat diaplikasikan dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler,
genetika populasi, dan analisis forensik. Teknik DNA rekombinan telah
memberikan perubahan secara signifikan dalam ilmu genetika karena
memungkinkan terjadinya isolasi dan karakteristik gen-gen, mempelajari
secara rinci fungsi dan ekspresi selama proses perkembangan terjadi,
sebagai respon terhadap lingkungan. Mengingat pentingnya peranan
teknik PCR ini terhadap perkembangan ilmu pengetahuan kedepan, maka
dalam makalah ini akan dibahas tentang teknik PCR, prinsip-prinsip PCR,
pertimbangan penggunaan PCR, dan manfaat PCR, serta aplikasi PCR
dari beberapa jenis PCR dalam hal ini AFLP PCR dan Multiplex PCR.
I.2 Tujuan
Tujuan dari pembuatan makalah ini yaitu:
1. Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain
Reaction (PCR)

2. Untuk mengetahui apa saja tahapan-tahapan Polymerase Chain

Reaction (PCR).
3. Untuk mengetahui apakah komponen-komponen yang dibutuhkan
dalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR).
4. Untuk mengetahui aplikasi dari jenis-jenis dari Polymerase Chain
Reaction (PCR).
I.3 Manfaat
Manfaat yang diperoleh dari penulisan makalah ini adalah bagi
penulis dan pembaca dapat memperoleh pengetahuan tentang proses
Polymerase Chain Reaction (PCR) serta aplikasi dari beberapa jenis PCR.

BAB II

PEMBAHASAN
2.1 PCR
Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh
Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk
mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam
beberapa jam. Dengan diketemukannya teknik PCR di samping juga
teknik-teknik lain seperti sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains
dan teknologi khususnya di bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran
forensik dan evolusi molekular.
2.2 Prinsip-Prinsip Umum PCR
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah
templat DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang
mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan
nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer
PCR; magnesium klorida (MgCl2 ) dan enzim polimerase DNA.
Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi
DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada
templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5)
pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan
tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi
jumlah DNA. Tahapan proses PCR dapat dilihat pada gambar 1.

Pada prinsipnya, reaksi PCR ( protokol PCR konvensional )

membutuhkan tiga tahap:
1. Denaturasi (Melting)

Prinsipnya adalah memisahkan DNA untai ganda menjadi komponen

untai tunggal, sehingga memungkinkan terjadinya hibridisasi primer PCR
untai tunggal pada sekuen targetnya ( jika ada)
2. Annealing Primer PCR
Pada tahap ini terjadi hibridisasi primer PCR pada sekuens tergetnya.
Secara

umum

suhu

annealing

PCR

biasanya

berasal

dari

suhu annealing primer hasil kalkulasi matematis dikurangi 5 0 C ( rumus: 4

x ( B+C) + 2 x ( A + T ) ). Diharapkan dalam suhu annealing tersebut
primer dapat berikatan dengan target komplomentarinya dan jika sudah
terhibridisasi tidak mudah mengalami disosiasi. Waktu yang dibutuhkan
untuk tahapan ini biasanya 15-60 detik
3. Elongasi (Ekstensi rantai DNA)
Tahap ini penting untuk mengamplifikasi daerah yang sudah
dihibridisasi oleh primer, dari akhiran -5 ke akhiran -3. Sebagian besar
enzim polimerase membutuhkan suhu elongasi 72 0C. Hal yang perlu
dipertimbangkan dalam menentukan langkah elongasi adalah waktu
inkubasi,yaitu sebaiknya cukup lama bagi polimerase DNA untuk
mengamplifikasi sekuens target secara komplit tetapi cukup sebentar
untuk mencegah amplifikasi produk non-spesifik yang lebih panjang
daripada sekuens target.

PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang

berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target

DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan
dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai
suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal
primers) pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA
digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan adanya
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai. Umumnya
keadaan ini dilakukan antara 20 40 siklus. Target DNA yang diinginkan
(short target product) akan meningkat secara eksponensial setelah siklus
keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier
seperti tampak pada bagan di atas (Newton and Graham, 1994).
Jumlah kopi fragmen DNA target (amplicon) yang dihasilkan pada
akhir siklus PCR dapat dihitung secara teoritis menurut rumus:
Y = (2n 2n)X
Y : jumlah amplicon
n : jumlah siklus
X : jumlah molekul DNA templat semula
Jika X = 1 dan jumlah siklus yang digunakan adalah 30, maka
jumlah amplicon yang diperoleh pada akhir proses PCR adalah 1.074 x
109 . Dari fenomena ini dapat terlihat bahwa dengan menggunakan teknik
PCR dimungkinkan untuk mendapatkan fragmen DNA yang diinginkan
(amplicon) secara eksponensial dalam waktu relatif singkat.
Umumnya jumlah siklus yang digunakan pada proses PCR adalah
30 siklus. Penggunaan jumlah siklus lebih dari 30 siklus tidak akan

meningkatkan jumlah amplicon secara bermakna dan memungkinkan

peningkatan jumlah produk yang non-target.
Perlu diingat bahwa di dalam proses PCR effisiensi amplifikasi tidak
terjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh target templat terlampau banyak,
jumlah polimerase DNA terbatas dan kemungkinan terjadinya reannealing
untai target.
2.3 Pelaksanaan PCR
Untuk melakukan proses PCR diperlukan komponen-komponen
seperti yang telah disebutkan di atas. Pada bagian ini akan dijelaskan
secara rinci kegunaan dari masing-masing komponen tersebut.
1. Templat DNA
Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan
untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat
berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal
di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang
dituju.
Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan
menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi
DNA kromosom atau DNA plasmid dengan menggunakan metode standar
yang ada. Pemilihan metode yang digunakan di dalam penyiapan DNA
templat tergantung dari tujuan eksperimen.
Pembuatan DNA templat dengan menggunakan metode lisis dapat
digunakan secara umum, dan metode ini merupakan cara yang cepat dan

sederhana untuk pendedahan DNA kromosom ataupun DNA plasmid.

Prinsip metode lisis adalah perusakan dinding sel tanpa harus merusak
DNA yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan dinding sel umumnya
dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel menggunakan buffer lisis.
Komposisi buffer lisis yang digunakan tergantung dari jenis sampel.
Beberapa contoh buffer lisis yang biasa digunakan mempunyai komposisi
sebagai berikut: 5 mM Tris-Cl pH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 % Tween20 dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar).
Buffer lisis ini umumnya digunakan untuk jenis sampel yang berasal dari
biakan, sel-sel epitel dan sel akar rambut. Contoh lain dari buffer lisis
adalah buffer lisis K yang mempunyai komposisi sebagai berikut: buffer
PCR (50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl2 ); 0,5 % Tween-20
dan 100 ug/mL Proteinase-K (ditambahkan dalam keadaan segar). Buffer
lisis K ini biasanya digunakan untuk melisis sampel yang berasal dari sel
darah dan virus.
Selain dengan cara lisis, penyiapan DNA templat dapat dilakukan
dengan cara mengisolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid menurut
metode standar yang tergantung dari jenis sampel asal DNA tersebut
diisolasi. Metode isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid memerlukan
tahapan yang lebih kompleks dibandingkan dengan penyiapan DNA
dengan menggunakan metode lisis. Prinsip isolasi DNA kromosom atau
DNA plasmid adalah pemecahan dinding sel, yang diikuti dengan

pemisahan DNA kromosom / DNA plasmid dari komponen-komponen lain.

Dengan demikian akan diperoleh kualitas DNA yang lebih baik dan murni.
2. Primer
Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer
yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai
pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus
menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk
proses eksistensi DNA.
Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA
yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan
DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan
DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka
perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari
urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan
kekerabatan yang terdekat.
Dalam melakukan perancangan primer harus dipenuhi kriteriakriteria sebagai berikut:
a. Panjang primer
Di dalam merancang primer perlu diperhatikan panjang primer yang
akan dipilih. Umumnya panjang primer berkisar antara 18 30 basa.
Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas
primer rendah. Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya
mispriming (penempelan primer di tempat lain yang tidak diinginkan)

tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer

tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi
proses PCR. Sedangkan untuk panjang primer lebih dari 30 basa tidak
akan meningkatkan spesifisitas primer secara bermakna dan ini akan
menyebabkan lebih mahal.
b. Komposisi Primer
Dalam merancang suatu primer perlu diperhatikan komposisinya.
Rentetan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan
spesifisitas primer yang dapat memungkinkan terjadinya mispriming di
tempat lain. Kandungan (G+C)) (% jumlah G dan C) sebaiknya sama atau
lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Sebab primer dengan %
(G+C) rendah diperkirakan tidak akan mampu berkompetisi untuk
menempel secara efektif pada tempat yang dituju dengan demikian akan
menurunkan efisiensi proses PCR. Selain itu, urutan nukleotitda pada
ujung 3 sebaiknya G atau C. Nukleotida A atau T lebih toleran terhadap
mismatch dari pada G atau C, dengan demikian akan dapat menurunkan
spesifisitas primer.
c. Melting temperature (Tm)
Melting temperatur (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda
DNA terpisah. Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm
primer akan berpengaruh sekali di dalam pemilihan suhu annealing proses
PCR. Tm berkaitan dengan komposisi primer dan panjang primer. Secara

teoritis Tm primer dapat dihitung dengan menggunakan rumus [2(A+T) +

4(C+G)]. Sebaiknya Tm primer berkisar antara 50 65 oC.

d. Interaksi primer-primer
Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology
harus dihindari. Demikian juga dengan terjadinya mispriming pada daerah
lain yang tidak dikehendaki, ini semua dapat menyebabkan spesifisitas
primer menjadi rendah dan di samping itu konsentrasi primer yang
digunakan

menjadi

berkurang

selama

proses

karena

terjadinya

mispriming. Keadaan ini akan berpengaruh pada efisiensi proses PCR.

3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)
dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP
(deoksiadenosin

trifosfat),

dTTP

(deoksitimidin

trifosfat)

dCTP

(deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). Dalam proses

PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam
proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus OH pada ujung
3 dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai
DNA templat. Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus
ditentukan.
4. Buffer PCR dan MgCl2
Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu.
Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR.
Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium. Selain buffer

PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal
MgCl2 . MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi
aktivitas DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan
interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan
dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2
berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer
PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi
disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya
dapat dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang
diperlukan.
5. Enzim Polimerase DNA
Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi
polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap
ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR
diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini
bersifat termostabil
2.4 Aplikasi PCR (Multiplex PCR)
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran
PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang
spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen
sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang
tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu
untuk melakukan. Temperatur Annealing untuk masing-masing set primer

harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan
ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda
cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan
dengan elektroforesis gel .
Multiplex PCR merupakan adaptasi dari PCR yang memungkinkan
amplifikasi secara stimulan dari berbagai sekuens atau urutan. Teknik ini
digunakan untuk mendiagnosis penyakit yang berbeda dalam sampel
yang sama. Multiplex PCR dapat mendeteksi patogen yang berbeda
dalam dalam satu sampel selain itu juga PCR ini dapat digunakan untuk
mendeteksi urutan exonic dan intronic dalam gen tertentu (Gambar 2)
dan penentuan dosis gen (gambar 2, 3, dan 4).
Hal ini dapat dicapai ketika dalam tabung tunggal mencakup primer
spesifik untuk target yang berbeda. Pada metode PCR ini, desain dari
primer sangat penting karena primer harus ditandai dengan aturan urutan
DNA spesifik pada suhu yang sama.

bkj

Reaksi rantai polymerase dapat dilakukan lebih dari satu daerah

untuk di copy terus menerus dengan menambahkan secara sederhana

lebih dari satu kali reaksi campuran yang complete. Untuk reaksi yang
multiplex bekerja memerlukan pasangan yang cocok. Suhu sangat
mempengaruhi dalam reaksi ini untuk menjaga formasi yang baik dari
DNA. Multiplex PCR lebih banyak tantangan daripada reaksi singleplex
karena memerlukan kondisi yang lebih simultan. Variabel-variabel harus
diperiksa ketika mencoba untuk mendapatkan hasil yang optimal dari
multiplex PCR termasuk reagen-reagen dalam kondisi suhu yang baik.
Rangkaian-rangkaian primer dan konsentrasi magnesium biasanya sangat
menentukan hasil dari multiplex PCR. Perpanjangan waktu selama siklus
suhu biasanya meningkatkan reaksi multiplex PCR dalam memberikan
waktu polymerase untuk mengcopy lengkap seluruh target DNA. PCR
mutiplex memerlukan STR (Short Tandem Repeat) untuk membetulkan
reaksi agar mendapatkan pemisahan ukuran

yang baik antara locus

dengan fluorosencenya. PCR multiplex harus menghasilkan amplifikasi

tetap dengan keseimbangan puncak yang baik sebaik locus yang memiliki
amplifikasi spesifik dengan hasil yang non-spesifik.

2.4.1 Aplikasi Multiplex PCR untuk deteksi dan diferensiasi dari

Entamoeba

histolytica,

Entamoeba

dispar

dan

Entamoeba

moshkovskii
Entamoeba moshkovskii,

Entamoeba dispar

dan Entamoeba

histolytica secara morfologis indentik tetapi secara biokimia dan genetik

berbeda dan pemeriksaan mikroskopik tidak bisa mendeteksi dan

membedakan ketiga spesies Entamoeba ini. Walaupun E. histolytica
terkenal sebagai patogen, kedua spesies lainnya bersifat non-patogen
atau kemampuannya untuk menyebabkan penyakit masih belum jelas.
Pengembangan suatu metode baru untuk diferensiasi amoebaamoeba yang identik secara mikroskop tersebut kini semakin ditekankan.
Multiplex PCR merupakan suatu teknik biologi molekular untuk
amplifikasi dari beberapa target dalam satu eksperimen PCR tunggal.
Multiplex PCR digunakan secara ekstensif untuk identifikasi patogen,
identifikasi genotip Single Nucleotide Polymorphism (SNP), analisis
mutasi, analisis delesi/penghapusan gen, kuantifikasi template/cetakan,
analisis linkage, deteksi RNA, studi-studi forensic.
Dalam prosedur multiplex, lebih dari satu sekuens target bisa
diamplifikasi dengan menggunakan beberapa pasang primer dalam
campuran reaksi. Untuk reaksi PCR cetakan tunggal/single template
digunakan satu cetakan tunggal dengan bebrapa pasang primer-primer
forward dan reverse, sedangkan pada reaksi PCR dengan beberapa
cetakan/tempate dan beberapa set primer dalam satu tabung reaksi.
Ekstraksi DNA sering menjadi tahap awal dan penting dari berbagai
proses diagnosi yang digunakan untuk mendeteksi bakteri, virus dan
parasit-parasit dalam lingkungan dan juga mendiagnosa penyakit dan
kelainan-kelainan genetik.

Pada penelitian ini kami menyelidiki keberadaan dari E. histolytica,

E. dispar dan E. moshkovskii dengan menggunakan prosedur PCR
tunggal dan multiplex/ganda (single-round and multiplex PCR) dengan
menggunakan enam metode ekstraksi DNA yang berbeda beda.
Bahan Bahan dan Metode
Sampel Entamoeba
Dilakukan analisa dua puluh tujuh DNA cetakan/template dari 20
sampel Entamoeba histolytica dan 7 sampel Entamoeba dispar. 20 DNA
E. histolytica diekstraksi sebelumnya di Jepang dari pasien - pasien
Jepang. DNA dari 7 E. dispar juga diekstraksi sebelumnya dari isolate
-isolate Iran.
DNA dari E. histolytica HM-1: IMSS, E. dispar SAW760, dan sel
-sel Laredo E. moshkovskii digunakan sebagai kontrol positif yang
dipertahankan dalam keadaan hidup dalam wadah berisi nitrogen cair di
Department of Medical Parasitology and Mycology, Shahid Beheshti
University of Medical Sciences, yang selanjutnya dipuligkan kembali
(recovered) dalam medium TYI-S-33 dan DNA nya diekstraksi untuk diteliti
dengan menggunakan prosedur PCR tunggal dan multiplex.

Preparasi DNA
Trophozoite yang sedang bertumbuh dipanen dengan menggunakan
sentrifugasi dengan kecepatan 800 g selama 5 menit. Sekitar 200 L dari
trophozoite terkultur dibilas dengan phosphate-buffered saline (pH=7.2).

DNA genomik dari trophozoite terkultur diekstraksi dan dibandingkan

dengan menggunakan lima kit ekstraksi DNA: DNG TM plus dan DNPTM kit
(CinnaGen Inc., Tehran, Iran), Chelex (Bio Rad), QIAamp DNA mini kit dan
QIAamp DNA stool mini kit (QIAGEN, Jerman), digunakan berdasarkan
arahan produsen dan juga metode fenol-kloroform tradisional.
Prosedur dari DNGTM -plus dan DNPTM membutuhkan waktu sekitar
60 menit dan tidak membutuhkan ekstraksi fenol atau pencernaan dengan
proteinase untuk DNGTM plus. Pada kit ekstraksi QIAamp DNA stool mini
kit dan QIAamp DNA mini kit untuk ekstraksi jaringan, untuk purifikasi DNA
tidak dibutuhkan ekstraksi fenol-kloroform atau presipitasi alkohol, dan
DNA dielusi dalam buffer rendah garam dan bebas dari protein, nuclease,
dan ketidakmurnian dan inhibitor-inhibitor lainnya. Chelex merupakan
suatu bahan pengkhelat dari Bio-Rad. bahan tersebut cepat, murah dan
efektif untuk metode ekstraksi DNA. Chelex melindungi sampel dari
DNAse yang mungkin masih aktif setelah pendidihan dan berakibat
mampu menghancurkan DNA. konsentrasi dan kemurnian dari DNA yang
terekstraksi dinilai dengan menggunakan alat Spectrophotometer WPA
untuk membaca absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm.
Konsentrasi DNA dan nilai A260 yang sesuai, untuk enam metode isolasi
DNA dari tiga kontrol positif diperlihatkan di Tabel 1.
Tabel 1. Konsentrasi DNA dari tiga strain spesies Entamoeba, dan nilainilai A260-nya, untuk enam metode ekstraksi DNA.

Polymerase Chain Reaction

Amplifikasi PCR tunggal (single-round) dan juga multiplex PCR digunakan
dalam penelitian ini. Sekuens dari primer forward yang digunakan (EntaF,
5- ATGCACGA GAGCGAAAGCAT-3) terlindung dengan baik pada ketiga
strain spesies Entamoeba tersebut., sedangkan primer reverse spesifik
yang

digunakan

adalah

EhR

(5-GATCTAGAAACAATGCTTCTCT-3

X64142), EdR (5-CACCACTTACTATCCCT-ACC-3 Z49256), dan EmR

(5-TGACCGGAGCCAGAGACAT-3 AF149906), masing-maising primer
reverse spesifik untuk E. histolytica, E. dispar, dan E. moshkovskii.
PCR dilakukan dengan menggunakan Amplicon (Taq DNA
Polymerase Master Mix Red, Denmark) sebagai larutan siap pakai.
Campuran reaksi terdiri dari 5 L air terdestilasi, 7.5 L amplikon, 20 pmol
primer-primer forward dan reverse, dan sekitar 5-10 ng dari DNA cetakan
dengan denaturasi awal pada suhu 94C selama 5 menit, dilanjutkan
dengan 30 siklus dengan suhu 94C selama 1 menit, 55C selama 1
menit, dan 72C selama 1 menit dengan ekstensi akhir pada suhu 72C
selama 7 menit.
Produk-produk hasil amplifikasi divisualisasi setelah elektroforesis
dengan menggunakan gel agarosa 1.5% dengan pewarnaan ETBr.

Hasil
Produk-produk PCR spesifik-spesies
Primer forward dikombinasi dengan primer reverse yang sesuai
mengamplifikasi suatu produk PCR yang berukuran 166 bp pada E.
histolytica, 752-bp PCR pada E. dispar, dan 580-bp pada E. moshkovskii
dengan menggunakan DNA dari spesies-spesies Entamoeba.
Dengan menggunakan DNA cetakan Entamoeba spp yang
terpisah-pisah, terlihat bahwa primer-primer spesifik spesies E. histolytica
(EntaF/EhR) mampu mengamplifikasi DNA dari strain HM-1:IMSS dengan
menggunakan semua metode dari enam metode ekstraksi DNA, tapi tidak
ada pita yang terlihat saat digunakan DNA dari E. dispar strain SAW760
atau E.moshkovskii Laredo.
Primer spesifik E.dispar (EntaF/EdR) dan primer spesifik E.
moshkovskii

(EntaF/EmR) juga memperlihatkan spesifitas/selektivitas

yang diperkirakan dalam single-round PCR. Hasil yang serupa juga

terlihat saat primer primer forward dan reverse untuk E. histolytica, E.
dispar, dan E. moshkovskii dicampurkan dalam suatu reaksi DNA cetakan
tunggal. Pita-pita PCR yang teramplifikasi dari hasil ekstraksi dengan
menggunakan enam metode ekstraksi DNA menggunakan tiga isolate
Entamoeba yang divisualisasikan pada gel agarosa 1.5% diperlihatkan di
Gambar 1.

Gambar 1. Prosedur Single PCR dengan primer EntaF, dikombinasikan dengan primerprimer her, EdR dan EmR dalam suatu reaksi single PCR dengan menggunakan 6
metode ekstraksi dari A) E. histolytica (strain HM1:IMSS), (B) E. dispar (strain SAW760) ,
(C) E. moshkovskii strain Laredo.
Baris M, penanda dengan bobot 100 bp; baris N, kontrol negatif; DNA diekstraksi dengan
menggunakan: 1. Fenol- Kloroform; 2. DNG TM-plus kit, 3. DNP TM kit, 4. QIAamp DNA mini
kit, 5. QIAamp DNA stool mini kit, 6. Chelex kit.
Baris M, penanda dengan bobot 100 bp, ; baris N, kontrol negatif; baris 1-6, DNA yang
diekstraksi dengan 6 metode ekstraksi DNA: 1. Fenol- Kloroform; 2. DNG TM-plus kit, 3.
DNPTM kit, 4. QIAamp DNA mini kit, 5. QIAamp DNA stool mini kit, 6. Chelex kit.

Saat DNA dari E. histolytica (HM1:IMSS), E. dispar (SAW760), dan E.

moshkovskii

strain Laredo dicampur bersama dalam suatu prosedur

multiplex PCR dengan seluruh primer-primer forward dan reverse, terlihat

pada saat observasi fragmen-fragmen yang sama dari hasil PCR. Tetapi,
intensitas dari pita-pita PCR dari beberapa metode ekstraksi DNA untuk E.
histolytica dan E. dispar tampak lemah (Gambar 2).

Gambar 2. Fragmen fragmen Multiplex PCR yang diamplifikasi dengan menggunakan

primer EntaF yang dikombinasikan dengan primer-primer reverse EhR, EdR, dan EmR
dalam suatu reaksi tunggal dengan DNA-DNA campuran dari E. histolytica (HM1:IMSS),
E.dispar (SAW 760) dan E. moshkovskii Laredo yang diekstraksi dari kultur trophozoite.

Gambar 3. Prosedur single PCR dari DNA E. hystolytica dengan primer-primer EntaF
dan EhR (baris 1-10), DNA E. moshkovskii degan primer-primer EntaF dan EmR (baris
11), dan DNA E. dispar dengan primer-primer EntaF dan EdR (baris 13-18), dalam sautu
reaksi tunggal dengan menggunakan sampel-sampel DNA dari isolate-isolate E.
histolytica dan E.dispar. Baris M, penanda bobot molekular (100 bp); baris Ch+, kontrol
positif dari E. histolytica; dan baris Cd+, kontrol positif dari E.dispar, DNA diekstraksi
dengan menggunakan metode QIAamp DNA stool mini kit.

Evaluasi dari Prosedur PCR dengan sampel-sampel DNA

Secara keseluruhan, 17 (62.96%) sampel dari 27 isolat berhasil
diidentifikasi, termasuk 10 E. histolytica dan 7 E. dispar dan juga DNA
yang diekstraksi dari sel-sel E. histolytica HM-1:IMSS, E. dispar SAW 760,
dan E. moshkovskii Laredo sebagai kontrol positif dengan menggunakan
reaksi satu putaran PCR (Gambar 3).
Suatu campuran DNA dari beberapa isolate positif E. histolytica, E. dispar,
dan E. Moshkovskii strain Laredo, juga diperlihatkan di Gambar 4.
Fragmen-fragmen Multiple PCR dari E. histolytica (HM-1:IMSS), E. dispar

(SAW760 dan E. moshkovskii strain Laredo diamplifikasi dengan suatu

reaksi tunggal dengan menggunakan primer forward yang dikombinasikan
dengan tiga primer reverse seperti yang diperlihatkan di Gambar 5.

Gambar 4. Multiplex PCR dengan primer EntaF dikombinasikan dengan primer-primer

EhR, EdR, dan EmR dalam suatu campuran reaksi tunggal dengan menggunakan
beberapa DNA dari strain Laredo E. histolytica, E.dispar, dan E. moshkovskii.
Baris M, penanda bobot molekular (100 bp); baris N, kontrol negatif; A) baris 1, E.
moshkovskii (580bp) dan E. dispar (752 bp) dan baris 2-4, E. histolytica (166bp), E.
moshkovskii (580bp) dan E. dispar (752 bp) , B) baris 1-2, E. moshkovskii (580) dan
baris 3 E. histolytica (166bp).

Gambar 5. Fragmen-fragmen multiplex PCR yang diamplifikasi dengan menggunakan

primer EntaF yang dikombinasikan dengan primer-primer reverse EhR, EdR, dan EmR
dalam suatu reaksi tunggal dengan menggunakan sampel-sampel DNA yang diekstraksi
dari 1) E. histolytica (HM1:IMSS), 2) E. dispar (SAW760) dan 3) E. moshkovskii strain
Laredo. Baris M, penanda bobot molekular (tangga 100 bp); baris N, kontrol negatif.

Diskusi
Pendekatan berbasis satu putaran PCR untuk diagnosis differensial dari
tiga spesies Entamoeba, E. moshkovskii, E. histolytica, dan E. dispar,
yang

memiliki

morfologi

identik

sebagai

kista

dan

trophozoite

dideskripsikan dalam penelitian ini. Teknik PCR diagnostik sederhana

tidak membutuhkan tahapan-tahapan tambahan, seperti pada nested
PCR, PCR restricted fragment length polymorphism, dan PCR dengan
hibridisasi reverse line blot (PCR with reverse line blot hybridization).
Enam metode sederhana termasuk fenol-kloroform, DNGTM -plus,
DNPTM, QIAamp DNA mini kit for tissue, QIAamp DNA stool mini kit dan
chelex kit untuk ekstraksi DNA dari spesies Entamoeba juga dibandingkan
dan dievaluasi.
Pada semua 6 metode tersebut, DNA diekstraksi dari kultur
trophozoit dari tiga Entamoeba yang disimpan secara cryopreservation
(proses dimana bahan-bahan biologis yang mudah rusak akibat kinetika
kimiawi yang tidak beraturan disimpan dengan cara didinginkan dengan
suhu yang sangat rendah, biasanya -80 oC dengan menggunakan CO2
padat atau -196oC dengan menggunkan nitrogen cair).
Pada metode ekstraksi DNA manual menggunakan fenol-kloroform
yang cukup memakan waktu, dua pita terlihat di atas pita yang telah
diperkirakan pada trophozoite terkultur dari E. histolytica (Gambar 1, A).
Semua dari 6 metode tersebut memberikan hasil yang bisa diterima dari

DNA-DNA yang diekstraksi. Semua kit komersial yang digunakan juga

bekerja dengan baik dalam amplifikasi PCR.
Penelitian ini mengindikasikan bahwa multiplex-PCR yang terdiri
dari beberapa set primer dalam satu cetakan tunggal memiliki hasil yang
lebih baik dibandingkan dengan beberapa primer ditambah dengan
beberapa cetakan/template reaksi PCR.
Peralatan molekular digunakan secara ekstensif untuk penelitianpenelitian epidemiologis, khususnya dalam diferensiasi dari organismeorganisme patogenik dari spesies non patogenik dari spesies Entamoeba.
Studi ini dan beberapa laporan sebelumnya oleh para peneliti
menunjukkan bahwa prosedur single dan multiplex PCR pada suatu
sampel tunggal mampu mendeteksi dan membedakan anatara E.
histolytica, E. dispar dan E. moshkovskii. Beberapa waktu terakhir ini telah
diperlihatkan kegunaan metode nested multiplex PCR untuk diferensiasi
dari E. histoytica dari E. dispar pada 31 sampel feses yang dilaporkan
oleh Fallah et al. Walaupun suatu hasil yang baik didapatkan untuk
diferensiasi dari tiga spesies Entamoeba yang identik secara mikroskopik
dengan menggunakan satu putaran dan multiplex PCR dalam studi ini,
tetapi dibutuhkan studi mendalam pada lebih banyak sampel feses positif
Entamoeba dan juga pada subjek-subjek normal dan isolat-isolat nonEntamoeba di Iran untuk mengevaluasi sensitivitas dan spesifitas dari
primer-primer dalam suatu multiplex PCR.
Kesimpulan

Berdasarkan penelitian tersebut Kami merekomendasikan aplikasi dari

prosedur multiplex PCR sebagai suatu alat alternatif dalam diagnosis rutin
dan studi epidemiologis dari amoebiasis. Diperkirakan bahwa alternatif ini
bisa memberikan data epidemiologis dari infeksi dengan tiga amoeba ini
pada manusia.
2.4.2 Aplikasi