Aplikasi Multiplex PCR untuk deteksi dan diferensiasi dari Entamoeba histolytica,

Entamoeba dispar dan Entamoeba moshkovskii

Abstrak
Latar belakang: Entamoeba moshkovskii dan E. dispar mustahil untuk dibedakan secara
mikroskopik dari spesies patogenik E. histolytica. Multiplex polymerase chain reaction
(Multiplex PCR) merupakan suatu teknik biologi molekular yang telah digunakan secara
meluas untuk amplifikasi dari beberapa target dalam suatu eksperimen PCR tunggal.
Metode metode: Untuk deteksi dan diferensiasi dari tiga spesies Entamoeba pada manusia
yang tak bisa dibedakan secara mikroskopik, ditelitilah prosedur PCR menggunakan metode
ekstraksi DNA yang berbeda. Suatu primer forward terlindung yang berasal dari bagian
tengah gen small-subunit rRNA, dan primer primer reverse didesain dari sekuens
penanda/signature dari tiap spesies ketiga Entamoeba.
Hasil hasil: Dalam satu kali putaran reaksi multiplex PCR dihasilkanlah suatu produk PCR
berukuran 166 bp dengan DNA E. histolytica, produk berukuran 580 bp dengan DNA E.
moshkovskii dan produk berukuran 752 bp dengan DNA E. dispar.
Kesimpulan: Kami merekomendasikan prosedur PCR ini sebagai suatu metode diagnositik
yang akurat, cepat, dan efektif untuk deteksi dan diskriminasi dari ketiga spesies Entamoeba
ini dalam diagnosis rutin dari amoebiasis dan penelitian penelitian epidemiologik.
Pengenalan
Entamoeba moshkovskii, Entamoeba dispar dan Entamoeba histolytica secara morfologis
indentik tetapi secara biokimia dan genetik berbeda dan pemeriksaan mikroskopik tidak bisa
mendeteksi dan membedakan ketiga spesies Entamoeba ini. Walaupun E. histolytica terkenal
sebagai patogen, kedua spesies lainnya bersifat non-patogen atau kemampuannya untuk
menyebabkan penyakit masih belum jelas (1, 2). Sebelum redeskripsi dari E. histolytica dan
E. dispar pada tahun 1997 (3, 4), beberapa studi epidemiologis di Iran telah menunjukkan
tingkat infeksi spesies Entamoeba berkisar sekitar 2.2 hingga 30 % (5 7). Pada dekade
terakhir, ketiga spesies Entamoeba tersebut telah berhasil diderensiasi dan dilaporkan dengan
menggunakan metode metode molekular di beberapa area di Iran (2, 8 17).
Pengembangan suatu metode baru untuk diferensiasi amoeba amoeba yang identik secara
mikroskop tersebut kini semakin ditekankan. Multiplex PCR merupakan suatu teknik biologi
molekular untuk amplifikasi dari beberapa target dalam satu eksperimen PCR tunggal.
Multiplex PCR digunakan secara ekstensif untuk identifikasi patogen, identifikasi genotip
Single Nucleotide Polymorphism (SNP), analisis mutasi, analisis delesi/penghapusan gen,
kuantifikasi template/cetakan, analisis linkage, deteksi RNA, studi studi forensic dan
analisis diet (18, 19). Dalam prosedur multiplex, lebih dari satu sekuens target bisa
diamplifikasi dengan menggunakan beberapa pasang primer dalam campuran reaksi (18).
Untuk reaksi PCR cetakan tunggal/single template digunakan satu cetakan tunggal dengan
bebrapa pasang primer primer forward dan reverse, sedangkan pada reaksi PCR dengan
beberapa cetakan/tempate dan beberapa set primer dalam satu tabung reaksi (18, 19).
Ekstraksi DNA sering menjadi tahap awal dan penting dari berbagai proses diagnosi yang
digunakan untuk mendeteksi bakteri, virus dan parasit parasit dalam lingkungan dan juga
mendiagnosa penyakit dan kelainan kelainan genetik (20).
Pada penelitian ini kami menyelidiki keberadaan dari E. histolytica, E. dispar dan E.
moshkovskii dengan menggunakan prosedur PCR tunggal dan multiplex/ganda (single-round
and multiplex PCR) dengan menggunakan enam metode ekstraksi DNA yang berbeda beda.
Bahan bahan dan Metode
Sampel Entamoeba

Dilakukan analisa dua puluh tujuh DNA cetakan/template dari 20 sampel Entamoeba
histolytica dan 7 sampel Entamoeba dispar. Semua dari 20 DNA E. histolytica diekstraksi
sebelumnya di Jepang dari pasien pasien Jepang (21). DNA dari 7 E. dispar juga diekstraksi
sebelumnya dari isolate isolate Iran (22). DNA dari E. histolytica HM-1: IMSS, E. dispar
SAW760, dan sel sel Laredo E. moshkovskii digunakan sebagai kontrol positif yang
dipertahankan dalam keadaan hidup dalam tanki/wadah berisi nitrogen cair di Department of
Medical Parasitology and Mycology, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, yang
selanjutnya dipuligkan kembali (recovered) dalam medium TYI-S-33 dan DNA DNA-nya
diekstraksi untuk meneliti prosedur PCR tunggal dan multiplex.
Preparasi DNA
Trophozoite yang sedang bertumbuh dipanen dengan menggunakan sentrifugasi dengan
kecepatan 800 g selama 5 menit. Sekitar 200 L dari trophozoite terkultur dibilas dengan
phosphate-buffered saline (pH=7.2). DNA genomik dari trophozoite terkultur diekstraksi dan
dibandingkan dengan menggunakan lima kit ekstraksi DNA: DNGTM plus dan DNPTM kit
(CinnaGen Inc., Tehran, Iran), Chelex (Bio Rad), QIAamp DNA mini kit dan QIAamp DNA
stool mini kit (QIAGEN, Jerman), digunakan berdasarkan arahan produsen dan juga metode
fenol-kloroform tradisional (23). Prosedur dari DNGTM -plus dan DNPTM membutuhkan
waktu sekitar 60 menit dan tidak membutuhkan ekstraksi fenol atau pencernaan dengan
proteinase untuk DNGTM plus. Pada kit ekstraksi QIAamp DNA stool mini kit dan QIAamp
DNA mini kit untuk ekstraksi jaringan, untuk purifikasi DNA tidak dibutuhkan ekstraksi
fenol-kloroform atau presipitasi alkohol, dan DNA dielusi dalam buffer rendah garam dan
bebas dari protein, nuclease, dan ketidakmurnian dan inhibitor inhibitor lainnya. Chelex
merupakan suatu bahan pengkhelat dari Bio-Rad. bahan tersebut cepat, murah dan efektif
untuk metode ekstraksi DNA. Chelex melindungi sampel dari DNAse yang mungkin masih
aktif setelah pendidihan dan berakibat mampu menghancurkan DNA. konsentrasi dan
kemurnian dari DNA yang terekstraksi dinilai dengan menggunakan alat Spectrophotometer
WPA (Biowave II, Eng) untuk membaca absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm.
Konsentrasi DNA dan nilai A260 yang sesuai, untuk enam metode isolasi DNA dari tiga
kontrol positif diperlihatkan di Tabel 1.
Tabel 1. Konsentrasi DN dari tiga strain spesies Entamoeba, dan nilai nilai A260-nya, untuk
enam metode ekstraksi DNA.

Polymerase chain reaction

Amplifikasi PCR tunggal (single-round) dan juga multiplex PCR digunakan dalam penelitian
ini. Sekuens dari primer forward yang digunakan (EntaF, 5- ATGCACGA
GAGCGAAAGCAT-3) terlindung dengan baik pada ketiga strain spesies Entamoeba
tersebut., sedangkan primer primer reverse spesifik yang digunakan adalah EhR (5GATCTAGAAACAATGCTTCTCT-3 X64142), EdR (5-CACCACTTACTATCCCT-ACC3 Z49256), dan EmR (5-TGACCGGAGCCAGAGACAT-3 AF149906), masing masing
primer reverse spesifik untuk E. histolytica, E. dispar, dan E. moshkovskii (24).
PCR dilakukan dengan menggunakan Amplicon (Taq DNA Polymerase Master Mix Red,
Denmark) sebagai larutan siap-pakai. Campuran reaksi terdiri dari 5 L air terdestilasi, 7.5

L amplikon, 20 pmol primer primer forward dan reverse, dan sekitar 5 10 ng dari DNA
cetakan dengan denaturasi awal pada suhu 94C selama 5 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus
dengan suhu 94C selama 1 menit, 55C selama 1 menit, dan 72C selama 1 menit dengan
ekstensi akhir pada suhu 72C selama 7 menit. Produk produk hasil amplifikasi
divisualisasi setelah elektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 1.5% dengan pewarnaan
ETBr.
Hasil
Produk produk PCR spesifik-spesies
Primer forward dikombinasi dengan primer reverse yang sesuai mengamplifikasi suatu
produk PCR yang berukuran 166 bp pada E. histolytica, 752-bp PCR pada E. dispar, dan 580bp pada E. moshkovskii dengan menggunakan DNA DNA dari spesies - spesies Entamoeba
tersebut. Dengan menggunakan DNA cetakan Entamoeba spp yang terpisah pisah, terlihat
bahwa primer primer spesifik spesies E. histolytica (EntaF/EhR) mampu mengamplifikasi
DNA dari strain HM-1:IMSS dengan menggunakan semua metode dari enam metode
ekstraksi DNA, tapi tidak ada pita yang terlihat saat digunakan DNA dari E. dispar strain
SAW760 atau E.moshkovskii Laredo. Primer primer spesifik E.dispar (EntaF/EdR) dan
primer primer spesifik E. moshkovskii (EntaF/EmR) juga memperlihatkan
spesifitas/selektivitas yang diperkirakan dalam single-round PCR. Hasil yang serupa juga
terlihat saat primer primer forward dan reverse untuk E. histolytica, E. dispar, dan E.
moshkovskii dicampurkan dalam suatu reaksi DNA cetakan tunggal. Pita pita PCR yang
teramplifikasi dari hasil ekstraksi dengan menggunakan enam metode ekstraksi DNA
menggunakan tiga isolate Entamoeba yang divisualisasikan pada gel agarosa 1.5%
diperlihatkan di Gambar 1.

Gambar 1. Prosedur Single PCR dengan primer EntaF, dikombinasikan dengan primer
primer her, EdR dan EmR dalam suatu reaksi single PCR dengan menggunakan 6 metode
ekstraksi dari A) E. histolytica (strain HM1:IMSS), (B) E. dispar (strain SAW760) , (C) E.
moshkovskii strain Laredo.
Baris M, penanda dengan bobot 100 bp; baris N, kontrol negatif; DNA diekstraksi dengan
menggunakan: 1. Fenol- Kloroform; 2. DNGTM-plus kit, 3. DNPTM kit, 4. QIAamp DNA mini
kit, 5. QIAamp DNA stool mini kit, 6. Chelex kit.
Baris M, penanda dengan bobot 100 bp, ; baris N, kontrol negatif; baris 1 6, DNA yang
diekstraksi dengan 6 metode ekstraksi DNA: 1. Fenol- Kloroform; 2. DNGTM-plus kit, 3.
DNPTM kit, 4. QIAamp DNA mini kit, 5. QIAamp DNA stool mini kit, 6. Chelex kit.
Saat DNA dari E. histolytica (HM1:IMSS), E. dispar (SAW760), dan E. moshkovskii strain
Laredo dicampur bersama dalam suatu prosedur multiplex PCR dengan seluruh primer
primer forward dan reverse, terlihat pada saat observasi fragmen fragmen yang sama dari
hasil PCR.
Tetapi, intensitas dari pita pita PCR dari beberapa metode ekstraksi DNA untuk E.
histolytica dan E. dispar tampak lemah (Gambar 2).

Gambar 2. Fragmen fragmen Multiplex PCR yang diamplifikasi dengan menggunakan

primer EntaF yang dikombinasikan dengan primer primer reverse EhR, EdR, dan EmR
dalam suatu reaksi tunggal dengan DNA DNA campuran dari E. histolytica (HM1:IMSS),
E.dispar (SAW 760) dan E. moshkovskii Laredo yang diekstraksi dari kultur trophozoite.

Gambar 3. Prosedur single PCR dari DNA E. hystolytica dengan primer primer EntaF dan
EhR (baris 1-10), DNA E. moshkovskii degan primer primer EntaF dan EmR (baris 11),
dan DNA E. dispar dengan primer primer EntaF dan EdR (baris 13 18), dalam sautu
reaksi tunggal dengan menggunakan sampel sampel DNA dari isolate isolate E.
histolytica dan E.dispar. Baris M, penanda bobot molekular (100 bp); baris Ch+, kontrol
positif dari E. histolytica; dan baris Cd+ , kontrol positif dari E.dispar, DNA diekstraksi
dengan menggunakan metode QIAamp DNA stool mini kit.
Evaluasi dari prosedur PCR dengan sampel sampel DNA
Secara keseluruhan, 17 (62.96%) sampel dari 27 isolat berhasil diidentifikasi, termasuk 10 E.
histolytica dan 7 E. dispar dan juga DNA yang diekstraksi dari sel sel E. histolytica HM1:IMSS, E. dispar SAW 760, dan E. moshkovskii Laredo sebagai kontrol positif dengan
menggunakan reaksi satu putaran PCR (Gambar 3). Suatu campuran DNA dari beberapa
isolate positif E. histolytica, E. dispar, dan E. moshkovskii strain Laredo, juga diperlihatkan
di Gambar 4. Fragmen fragmen Multiple PCR dari E. histolytica (HM-1:IMSS), E. dispar
(SAW760 dan E. moshkovskii strain Laredo diamplifikasi dengan suatu reaksi tunggal
dengan menggunakan primer forward yang dikombinasikan dengan tiga primer reverse
seperti yang diperlihatkan di Gambar 5.

Gambar 4. Multiplex PCR dengan primer EntaF dikombinasikan dengan primer primer
EhR, EdR, dan EmR dalam suatu campuran reaksi tunggal dengan menggunakan beberapa
DNA dari strain Laredo E. histolytica, E.dispar, dan E. moshkovskii.
Baris M, penanda bobot molekular (100 bp); baris N, kontrol negatif; A) baris 1, E.
moshkovskii (580bp) dan E. dispar (752 bp) dan baris 2 4, E. histolytica (166bp), E.
moshkovskii (580bp) dan E. dispar (752 bp) , B) baris 1 2, E. moshkovskii (580) dan baris
3 E. histolytica (166bp).

Gambar 5. Fragmen fragmen multiplex PCR yang diamplifikasi dengan menggunakan

primer EntaF yang dikombinasikan dengan primer primer reverse EhR, EdR, dan EmR
dalam suatu reaksi tunggal dengan menggunakan sampel sampel DNA yang diekstraksi dari
1) E. histolytica (HM1:IMSS), 2) E. dispar (SAW760) dan 3) E. moshkovskii strain Laredo.
Baris M, penanda bobot molekular (tangga 100 bp); baris N, kontrol negatif.
Diskusi
Pendekatan berbasis satu-putaran PCR untuk diagnosis differensial dari tiga spesies
Entamoeba, E. moshkovskii, E. histolytica, dan E. dispar, yang memiliki morfologi identik
sebagai kista dan trophozoite dideskripsikan dalam penelitian ini. Teknik PCR diagnostik
sederhana tidak membutuhkan tahapan tahapan tambahan, seperti pada nested PCR (25),
PCR restricted fragment length polymorphism (26), dan PCR dengan hibridisasi reverse line
blot (PCR with reverse line blot hybridization) (27).
Enam metode sederhana termasuk fenol-kloroform, DNGTM -plus, DNPTM, QIAamp DNA
mini kit for tissue, QIAamp DNA stool mini kit dan chelex kit untuk ekstraksi DNA dari
spesies Entamoeba juga dibandingkan dan dievaluasi. Pada semua 6 metode tersebut, DNA
diekstraksi dari kultur trophozoit dari tiga Entamoeba yang disimpan secara cryopreservation
(proses dimana bahan bahan biologis yang mudah rusak akibat kinetika kimiawi yang
takberaturan disimpan dengan cara didinginkan dengan suhu yang sangat rendah, biasanya

-80oC dengan menggunakan CO2 padat atau -196oC dengan menggunkan nitrogen cair). Pada
metode ekstraksi DNA manual menggunakan fenol-kloroform yang cukup memakan waktu,
dua pita terlihat di atas pita yang telah diperkirakan pada trophozoite terkultur dari E.
histolytica (Gambar 1, A). Semua dari 6 metode tersebut memberikan hasil yang bisa
diterima dari DNA DNA yang diekstraksi. Semua kit komersial yang digunakan juga
bekerja dengan baik dalam amplifikasi PCR.
Penelitian ini mengindikasikan bahwa multiplex-PCR yang terdiri dari beberapa set primer
dalam satu cetakan tunggal memiliki hasil yang lebih baik dibandingkan dengan beberapa
primer ditambah dengan beberapa cetakan/template reaksi PCR.
Peralatan molekular digunakan secara ekstensif untuk penelitian penelitian epidemiologis,
khususnya dalam diferensiasi dari organisme organisme patogenik dari spesies non
patogenik dari spesies Entamoeba. Studi ini dan beberapa laporan sebelumnya oleh para
penelitimenunjukkan bahwa prosedur single dan multiplex PCR pada suatu sampel tunggal
mampu mendeteksi dan membedakan anatara E. histolytica, E. dispar dan E. moshkovskii
(28-30). Beberapa waktu terakhir ini telah diperlihatkan kegunaan metode nested multiplex
PCR untuk diferensiasi dari E. histoytica dari E. dispar pada 31 sampel feses yang
dilaporkan oleh Fallah et al. (31). Walaupun suatu hasil yang baik didapatkan untuk
diferensiasi dari tiga spesies Entamoeba yang identik secara mikroskopik dengan
menggunakan satu putaran dan multiplex PCR dalam studi ini, tetapi dibutuhkan studi
mendalam pada lebih banyak sampel feses positif Entamoeba dan juga pada subjek subjek
normal dan isolate isolate non-Entamoeba di Iran untuk mengevaluasi sensitivitas dan
spesifitas dari primer primer dalam suatu multiplex PCR.
Kesimpulan
Kami merekomendasikan aplikasi dari prosedur multiplex PCR sebagai suatu alat alternatif
dalam diagnosis rutin dan studi epidemiologis dari amoebiasis. Diperkirakan bahwa alternatif
ini bisa memberikan data epidemiologis yang lebih baik dan pengertian yang lebih luas dari
infeksi dengan tiga amoeba ini pada manusia.