Scientia et Technica Ao 2016, Mes 10 Universidad Tecnolgica de Pereira.

ISSN 0122-1701

Anlisis cualitativo y cuantitativo de muestras problema a travs de la

espectrofotometra.
Primera sesin.
Juliana Rincn Lpez Sara Abello Castaeda.

Escuela de Qumica, Universidad Tecnolgica de Pereira, Pereira, Colombia.

Octubre 2016.
Correo-e: realcamaleon@gmail.com

Resumen- Se realiz un estudio espectrofotomtrico en

dos sesiones. En la primera sesin se realiz la
identificacin de los espectrofotmetros de un haz y de
doble haz comparando sus caractersticas funcionales
principales para reconocer ventajas y desventajas,
adems se identific una sustancia problema la cual
resulto ser Naranja de maxilon en medio acuoso, a travs
de la construccin del espectro manual y por ltimo la
identificacin de celdas equivalentes (y tubos de
ensayo) para su posterior uso. En la sesin dos se
procedi de manera similar con una solucin problema
para realizarle un anlisis cualitativo por medio de la
identificacin y uno cuantitativo por medio de la
construccin de una curva de calibracin, la sustancia
problema resulto ser Turqueza de diazol con una
concentracin de 0,0509 g/L que comparada con su
valor real de 0,04g/L present un error de 4%. Se llego
a la conclusin de que la espectofotometra es una
tcnica precisa y exacta a la hora del anlisis, que arroja
resultados adecuados y esperados lo que le confiere una
alta confiabilidad y que por tener un funcionamiento
electrnico evita el error que implica la interpretacin
del resultado por parte del analista.
Palabras clave- longitud de onda, absorbancia,
transmitancia, espectrofotmetro, banda de absorcin,
mximo de absorcin.
I.

INTRODUCCIN.

Desde hace muchos aos se ha usado el color como

ayuda para reconocer las sustancias qumicas; al
reemplazar el ojo humano por otros detectores de
radiacin se puede estudiar la absorcin de sustancias,

no solamente en la zona del espectro visible, sino

tambin en ultravioleta e infrarrojo. Se denomina
espectrofotometra a la medicin de la cantidad de
energa radiante que absorbe un sistema qumico en
funcin de la longitud de onda de la radiacin, y a las
mediciones a una determinada longitud de onda.
El espectrofotmetro es el instrumento encargado de
hacer esta medicin, y estudia el fenmeno de las
interacciones entre los fotones y las partculas
absorbentes de una muestra, estas interacciones de
absorcin de energa generan transiciones electrnicas,
rotacionales y vibracionales, lo cual hace que la
intensidad del haz se vea disminuida al atravesarla. ste
fenmeno se cuantifica por medio de la transmitancia
(porcentaje de radiacin que se transmite) o de la
absorbancia (cantidad de radiacin que se absorbe) y se
relacionan de la siguiente manera
=
Los espectrofotmetros, a menudo estn equipados con
una escala lineal que se extiende de 0 a 100% de
transmitancia. De manera de hacer tal instrumento de
lectura directa se efectan dos ajustes preliminares:
- El ajuste del 0%T mediante el cierre mecnico
del detector.
- El ajuste al 100% T con un blanco no absorbente
como agua o aire.
Al realizar esta medicin en el espectrofotmetro se
tiene que tener en cuenta que el anlisis posterior que se
le va a realizar al analito es mediante la curva de
calibracin, por esto se debe tener un patrn de
comportamiento lineal y para que suceda es
indispensable cumplir la ley de Beer-Lambert

Scientia et Technica Ao 2016, Mes 08 Universidad Tecnolgica de Pereira. ISSN 0122-1701

a. Sesin 1.
=
Donde A es la absorbancia, b la longitud de la celda que
contiene el analito, C la concentracin y la absortividad
molar (capacidad de una sustancia de absorber a
diferentes longitudes de onda).
Para controlar que se cumpla la ley de Beer se deben
tener en cuenta los siguientes parmetros:
- La radiacin debe ser monocromtica o con un
ancho de banda muy angosto.
- Muestra de un solo analito o de una reaccin en
el equilibrio.
- Solvente que no interacte con el analito.
- Temperatura y presin constante.
- La absorbancia no debe salirse del lmite entre
0,5-1,8.
El lmite de 1,8 slo puede ser permitido para una
solucin madre. [1]
Por otra parte las celdas son unas cubetas utilizadas para
contener la sustancia a analizar, existen muchos tipos de
ellas pero lo ms importante para un anlisis es
encontrar celdas equivalentes, que es la bsqueda de
celdas con absorcin y transmitancia similar para evitar
errores a la hora de cuadrar el cero y realizar la
medicin. Aparte de esto, se debe asegurar que el
material del cual se encuentren hechas las celdas, no
interacte con la radiacin, es decir, se debe asegurar
que el material no absorba radiacin. Si se va a trabajar
en el espectro de luz visible es aceptable trabajar con
celdas de vidrio, ya que este material no absorbe
radiacin a estas longitudes de onda, pero si se va a
trabajar en zonas como el ultravioleta, las celdas de
vidrio son obsoletas, pues el vidrio si absorbe a estas
longitudes de onda y esta interaccin del material con la
radiacin puede afectar el estudio que se est
realizando, en el caso del ultravioleta se debe trabajar
con celdas de cuarzo. De manera similar a la mencionada
anteriormente, se debe tener en cuenta la longitud de
onda con la que se va a trabajar para determinar el tipo
de material de celda a usarse.
II.

PROCEDIMIENTO.[2]

Se sigui el procedimiento de la prctica de

Espectrofotometra del libro Anlisis instrumental,
Prcticas de laboratorio del Profesor Federmn Castro
Eusse.

Primero se realiz el espectro de manera manual de

una sustancia problema en el espectrofotmetro
Genesys20 con el fin de compararlo con los del manual
de laboratorio de anlisis instrumental e identificarla
por medio de sus picos de absorcin. Se empez con
un barrido espectral cada 20nm con el fin de
identificar los picos (Ilustracin 1) y luego cada 10 nm
para darle una mayor definicin (Ilustracin 2).
Una vez el mximo encontrado en 0,731 de
absorbancia, se procedi a medir la absorbancia en
cada uno de los espectrofotmetros para la
construccin de la tabla 1 y as deducir cual es la
diferencia y el error generado en cada uno de ellos,
complementario a este trabajo se realiz una tabla
comparativa
entre
las
partes
de
cada
espectrofotmetro en la tabla 2.
De igual manera, con el mximo de absorcin de 0,731
se buscaron cuatro celdas equivalentes en el
Genesys20 para guardarlas y utilizarlas en estudios
posteriores, los datos de absorbancia se ilustran en la
tabla 2.
b. Sesin dos.
Se realiz un anlisis cuantitativo de una muestra
problema coloreado azul, con el fin de identificarla y
encontrar su concentracin por medio del anlisis de
una curva de calibracin construida a partir de los
patrones.
Para encontrar la concentracin aproximada de la
muestra problema, luego de identificarla y determinar
que era Turqueza diazol y as saber la concentracin
de los patrones a preparar se utiliz la siguiente
ecuacin

=

Donde Cp y Ap son la concentracin y la absorbancia

de la solucin madre, Ax y Cx son la concentracin y la
absorbancia de la muestra problema.
III.

Resultados.

a. Sesin 1.
En los espectros de absorcin que se realizaron
manualmente se observan dos picos, el ms alto con
una absorcin de 0,731 a una longitud de onda de 420
nm y el ms bajo con una absorcin de 0,454 a una
longitud de onda de 530 nm.

Scientia et Technica Ao 2016, Mes 08 Universidad Tecnolgica de Pereira. ISSN 0122-1701

Una vez identificada la sustancia cualitativamente, se

calcula el error de cada una de las longitudes de onda
en que se da el pico de absorcin terico con el
prctico obtenido, por medio de la siguiente ecuacin:

Barrido espectral cada 20nm

0,8

420; 0,729

Absrbancia

0,6
540; 0,427

0,4

100% = %

0,2

0
300
-0,2

500

700

900

Longitud de onda en nm

Ilustracin 1. Barrido espectral muestra problema cada 20 nm.

Barrido espectral cada 10nm

0,8

420; 0,731

Absorbancia

0,6
530; 0,454

0,4

Pico de mxima absorbancia : 2,68%

Pico bajo de absorbancia: 2,51%

Este error se puede deber principalmente a que los

dos espectros fueron tomados en diferentes
espectrofotmetros, y cada uno de ellos tiene un ancho
de banda que define que tan monocromtico es el haz
con el que mide la absorbancia de la muestra, este es
uno de los principales causantes del error a la hora de
trabajar en un equipo que no trabaje con selectores de
longitud de onda que sean monocromadores, prismas
o espejos.
Con el mximo de absorcin a 420 nm se midi la
absorbancia y el porcentaje de transmitancia en los
diferentes instrumentos.

0,2
0
300

350

400

450

500

Longitud de onda en nm

550

600

Tabla 1. Medicin del mximo de absorcin de 0,731 en todos los

espectrofotmetros.
Ilustracin 2. Barrido espectral muestra problema cada 10 nm.

Comparando los espectros obtenidos (ilustraciones 1

y 2), con los espectros de absorcin del manual de
laboratorio se concluye que la sustancia problema es
naranja de maxiln en medio acuoso, aunque los
mximos de absorcin no sean exactamente
parecidos, es la curva con dos picos ms similar que se
encontr dentro de dicho manual.

Ilustracin 3. Espectro de absorcin del naranja de maxilon

extrado del libro de prcticas de laboratorio de anlisis

instrumental de Federman Castro Eusse.

Equipo
Spectronic 20D
Gnesis 20
Shimadzu UV-1700
Visible
spectrophptpmeter

%T
47,2%
18,6%
18,52%

A
0,323
0,731
0,7321

15,5%

0,779

El spectronic 20D es el instrumento ms antiguo del

laboratorio, en l se mide con tubos de ensayo en vez
de celdas, la longitud de onda se cuadra por medio de
una perilla y todo esto adems de la desviacin tan
grande de absorbancia y transmitancia en
comparacin con los otros datos de los dems
instrumentos indican cosas como que el ancho de
banda es muy amplio, o que partes del ya no funcionan
de una manera ptima.
Del resto de los espectrofotmetros usados, se puede
decir que dieron resultados muy similares de
absorbancia y transmitancia lo cual indica que se
pueden hacer mediciones de manera confiada y segura
en cada uno de ellos.
Se procedi a encontrar las celdas equivalentes
midiendo a la longitud de onda de mxima absorcin

Scientia et Technica Ao 2016, Mes 08 Universidad Tecnolgica de Pereira. ISSN 0122-1701

de 420 nm de la misma sustancia problema en

diferentes celdas hasta encontrar cuatro celdas que
arrojaron datos de absorbancia y transmitancia muy
similares.
Tabla 2. Datos obtenidos en la bsqueda de las celdas equivalentes.

# Celda
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Absorbancia
0,729
0,757
0,758
0,732
0,730
0,764
0,746
0,740
0,731

%Transmitancia
18,7
17,5
17,5
18,6
18,6
17,2
18,0
18,4
18,6

10

0,733

18,4

Las filas resaltadas con verde claro fueron las celdas

seleccionadas para seguir trabajando gracias a los
resultados tan similares en la absorbancia y
transmitancia. El hecho de que se presenten diferentes
absorbancias con cambios tan grandes puede ser dado
por que el material de la celda vara un poco entre los
fabricantes, por rayones o impurezas sobre la
superficie lisa de la celda.
Para el spectronic20D que trabaja con tubos de ensayo
en vez de celdas, por esto de igual manera se procede
en l para encontrar los tubos de ensayo equivalentes.

Tabla 3. Tubos equivalentes.

#Tubo
1
2
3

Absorbancia
0,323
0,325
0,321

%Transmitancia
47,2
47,6
47,4

Tabla 4. Comparacin de las partes tcnicas de los espectrofotmetros que se encuentran en el laboratorio.

Espectrofotometro
Marca
Modelo
Tipo de haz
Regiones
Ancho de banda en
nm

UV-Visible
Shimadzu
UV-1700
Doble
UV-visible

Genesys20
Thermo scientific
20
Haz dividido
Visible

Spectronic 20D
Hilton Roy

2nm

20nm

20nm

Rango espectral

190-1100nm

325-1100nm
350-800nm

350-900nm

Haz sencillo

Deuterio
(UV)Tugnsteno o halgeno
Tungsteno
Halgeno(Visble)
Tipo Ebert con red cncava
Monocromador
De rejilla de difraccin
Monocromador de red
hologrfica.
Vidrio
o
Vidrio
o metacrilato(visible)Material y espesor
Vidrio con 1 cm de espesor o
metacrilato(visible)Cuarzo (UV-visible)
de la celda.
cilndricos.
Cuarzo (UV-visible)
1 cm de espesor con
capacidad de 3mL
Detector
Fotodiodos de silicio
Diodos de silicio
Fototubos
Amplificacin
Electrnico
Electrnico
Por intensidad de luz
Instrumento
de
Digital
Digital
Galvanometro o display
lectura.
Fuentes

Scientia et Technica Ao 2016, Mes 08 Universidad Tecnolgica de Pereira. ISSN 0122-1701

Imagen de cada
uno

Por ltimo se hizo la comparacin de las

caractersticas tcnicas de los diferentes modelos de
espectrofotmetros presentes en el laboratorio, el
condensado de ste se muestra en la tabla 4. Por medio
de esta comparacin se concluy que el Shimadzu es
el mejor espectrofotmetro con el que se puede
trabajar adems de ser el ms cmodo gracias a su
estrecho ancho de banda, por ser de doble haz y tener
un display que permite el ahorro de tiempo gracias a
que construye los espectros y realiza los barridos por
s solo.
b. Sesin 2.
Se empez construyendo el espectro manual de la
muestra problema el cual tena un color azul brillante
por medio de un barrido espectral desde 362nm hasta
los 800nm.
Tabla 5.Barrido espectral manual.

Longitud de onda (nm)

365
370
380
390
400
405
410
419
440
450
460
470
480
490
500
510
520
530

Absorbancia
0,48
0,403
0,264
0,203
0,091
0,07
0,06
0,042
0,016
0,006
0,004
0,004
0,006
0,011
0,019
0,038
0,059

540
0,109
550
0,149
560
0,238
570
0,354
580
0,475
590
0,633
600
0,811
610
0,955
620
1,015
630
0,947
640
0,817
650
0,741
660
0,729
670
0,687
680
0,545
690
0,384
700
0,272
710
0,197
720
0,141
730
0,103
740
0,076
750
0,055
760
0,041
770
0,03
780
0,02
790
0,016
800
0,011
Y por medio de la comparacin entre el espectro
experimental obtenido y los espectros presentados en
el

Scientia et Technica Ao 2016, Mes 08 Universidad Tecnolgica de Pereira. ISSN 0122-1701

libro gua se concluy que la sustancia era Turqueza

diazol en medio acuoso.

Curva de calibracin para la solucin de

turquesa de diazol.

en medio acuoso extraido del libro gua de Federman Castro Eusse.

Espectro de absorcin experimental del

1,1
turqueza de diazol.
620; 1,015

1,5
y = 20,62x + 0,0026
R = 0,9959

1
0,5

Absorbancia

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

Absorbancia

Ilustracin 4. Espectro de absorcin terico de truquesa de diazol

0
0

0,02

0,04

0,06

0,08

Concentracin(g/L)
Ilustracin 6. Curva de calibracin para la solucin de turquesa de

diazol.
360

460

560

660

Longitud de onda (nm)

760

860

Ilustracin 5. Espectro de absorcin experimental del turquesa de

diazol.

Una vez se determin la muestra problema, se

procedi a construir la curva de calibracin a partir de
una solucin madre de la respectiva sustancia que
tena una concentracin de 0,08g/L la cual tuvo una
absorbancia de 1,7153 y la muestra problema de
1,0532.
Se prepararon seis patrones que se muestran en la
tabla 5.
Tabla 6. Patrones para la curva de calibracin del turqueza de

diazol.

Patrn #
1
2
3
4
5
6
Sln madre
Sln
problema

Concentracin
g/L
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08

%T

0,414
0,631
0,799
1,04
1,278
1,421
1,7153

38,6
24,3
15,9
9
5,3
3,8

Por medio de la ecuacin de la curva de calibracin se

calcul la concentracin de la muestra problema,
utilizando la ecuacin obtenida de la grfica anterior.
= 20,62 + 0,0026
=

0,0026 1,0532 0,0026 0,0509

=
=
20,62
20,62

La concentracin terica obtenida de 0,0509g/L que

comparndola con la concentracin terica de 0,04
g/L se obtiene un error del 4%.
Un error pequeo gracias al espectofotometro
utilizada del genesys20 por su angosto ancho de
banda, por la buena construccin de la curva de
calibracin y la pertinencia de su escala. Adems se
puede considerar que este clculo a travs de la curva
de calibracin construida es de confianza por el
coeficiente de correlacin de 0,9959 que est muy
cercano a uno y que su intercepto es de 0,0026 el cual
es muy cercano a cero y entre ms lo sea mejor ya que
el concepto gua a la idea de que si la concentracin del
analito es cero, luego de correr la lnea base su
absorbancia debera ser cero.

1,0532
IV.
-

CONCLUSIONES.

La espectrofotometra es la tcnica instrumental

del primer ciclo ms adecuada para los anlisis
que requieren alto grado de precisin y
exactitud, ya que gracias al hecho de que la
persona no es la que determina los valores
medibles se evita un error mayor. Adems a
diferencia del ndice de refraccin o de la

Scientia et Technica Ao 2016, Mes 08 Universidad Tecnolgica de Pereira. ISSN 0122-1701

rotacin especfica, el espectro de absorcin es

nico e irrepetible para cada sustancia.
A pesar de ser una buena tcnica instrumental
no es la mejor para caracterizacin de
sustancias. Pues la determinacin de muestras
problemas se debe hacer mediante comparacin
con espectros que se encuentren registrados en
la literatura. Puede ocurrir el caso de que la
muestra problema no se encuentre registrada en
la literatura o de que se encuentren espectros
similares y no se posean de ms parmetros
aparte de la absorbancia y la mxima longitud de
onda para tomar una decisin.
Para realizar un buen estudio espectrofometrico,
se deben tener en cuenta diferentes variables,
como la concentracin de la muestra, el ancho y
el tipo de celda a usar, entre otros para que el
estudio se realice de la mejor manera.
Mediante la espectrometra, tambin se pueden
realizar estudios cuantitativos, como el hallar la
concentracin de soluciones problema mediante
curvas de calibraciones, este tipo de estudios
disminuyen el error asociado al mtodo, como en
el caso de la ilustracin 6, en donde el coeficiente
de correlacin es de 0.9959, muy cercano al uno,
lo que indica que esta parte de la prctica estuvo
realizada de manera ptima.
Existen diversos tipos de espectofotmetros, y
aunque en ultimas, todos estn diseados para el
mismo fin, las caractersticas propias de cada
equipo hacen que dependiendo de la necesidad
particular, unos sean mejores que otros.
V.

REFLEXIONES.

1. Qu factores afectaron las medidas de la

Absorbancia?
Las longitudes de onda de las radiaciones que una
molcula puede absorber y la eficiencia con la que se
absorben dependen de la estructura atmica y de las
condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica,
constante dielctrica), por lo que dicha tcnica
constituye un valioso instrumento para la
determinacin y caracterizacin de biomolculas.
2. Qu factores afectan la medida
absortividad molar o especfica?

de

la

Segn la ley de Beer establece que debe trabajarse con

luz monocromtica. Pero al analizar el funcionamiento
de los filtros y de los monocromadores se observa que la
luz es completamente monocromtica.
3. Cmo puede determinar la confianza en los
resultados analticos obtenidos?
Estadsticamente el lmite de confianza de una medida
viene dado por la expresin:
Donde:

X: promedio
S: desviacin estndar
n: nmero de datos
Un alto nivel de confianza puede darse hacindose una
comparacin con una muestra ya conocida adems de
cerciorarse del buen estado y funcionamiento del
equipo.
4. Cmo puede adaptar la tcnica fotomtrica en
la regin del visible para el control de calidad y
controlar algunos procesos industriales?
En general, cuando se miden espectros UV-visible,
solos es deseable que ocurra absorbancia. Como la luz
es una forma de energa, la absorcin de la luz por la
materia causa que aumente el contenido de energa de
las molculas. La energa potencial total de una
molcula, generalmente se representa como la suma
de sus energas electrnica, vibracional y rotacional:
La cantidad de energa que una molcula posee en
cada forma no es continuo, sino una serie de niveles o
estados discretos. La diferencia de energa entre los
diferentes estados siguen el orden: En algunas
molculas y tomos, los fotones de luz UV y visible
tienen suficiente energa para causar transiciones
entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la
luz absorbida es aquella que tiene la energa requerida
para mover un electrn desde un nivel de energa
inferior a uno superior. Las derivadas de los espectros
pueden utilizarse para resaltar las diferencias entre
espectros, resolver bandas solapadas para el anlisis
cualitativo. Hoy en da, varias compaas fabrican
espectrmetros y con series de produccin cada vez
ms grandes. Otra gran ventaja de estos nuevos
espectrmetros es que han salido del laboratorio, y
pueden utilizarse para el control de calidad en

Scientia et Technica Ao 2016, Mes 08 Universidad Tecnolgica de Pereira. ISSN 0122-1701

instalaciones de campo o en grandes plantas

industriales. Gracias tambin al aumento de la
resolucin, la industria se ha movido rpido y esta
tecnologa se utiliza ya con mucha frecuencia en todo
tipo de instalaciones industriales con el objetivo de
controlar el color o la composicin qumica de un
producto terminado. La determinacin de la
composicin qumica de los materiales, o el color, es
de vital importancia en numerosos proceso
industriales, y esto ahora puede hacerse de forma
eficiente y en tiempo real con espectrmetros.
5. Consultar en qu consisten las sondas
fotomtricas y los sensores fotomtricos y cul
es su utilidad.

Sonda radiomtrica para la medida de la irradiancia con

mdulo SICRAM incluido. Campo espectral UVB
280nm315nm. Pico a 305 nm, difusor para la
correccin del coseno de cuarzo. Rango de medida:
0,12000.
LP471UVC
Sonda radiomtrica para la medida de la irradiancia con
mdulo SICRAM incluido. Campo espectral UVC
220nm280nm. Pico a 260 nm, difusor para la
correccin del coseno de cuarzo Rango de medida: 0,1 y
2000

Sondas Radiomtricas y Fotomtricas

LP471ERY

LP471PHOT

Sonda radiomtrica para la medida de la irradiancia

total eficaz () ponderada segn la curva de accin UV
(CEI EN 603352-27) con mdulo SICRAM incluido.
Campo espectral 250nm400nm. Difusor para la
correccin del coseno de cuarzo. Rango de medida: 0,1 y
2000.

Sonda fotomtrica para la medicin de la iluminancia

con mdulo SICRAM incluido. Respuesta espectral de
acuerdo con la visin fotopila estndar, difusor para la
correccin del coseno. Rango de medida: 0,01lux.200103.
LP471LUM2
Sonda fotomtrica para la medida de la iluminancia con
mdulo SICRAM incluido. Respuesta espectral de
acuerdo con la visin fotopila estndar, Angulo de visin
de 2 Rango de medida: 0,1 2000 103

VI.
REFERENCIAS.
[1]http://materias.fi.uba.ar/6305/download/Espectrofoto
metria.pdf
[2] libro Anlisis instrumental, Prcticas de
laboratorio del Profesor Federmn Castro Eusse.
-REFLEXIONES.

LP471PAR
Sonda cuanto-radio mtrica para la medida del flujo de
fotones en el campo de la clorofila PAR, fotosntesis.
Radiacin activa (400nm700nm) con mdulo SICRAM
incluido Mide en , difusor para la correccin del coseno
Rango de medida: 10 .

http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometr
ia.htm
https://analiticaunexpo.files.wordpress.com/2011/11/d
atos-analiticos.pdf}

LP471UVA
Sonda radiomtrica para la medida de la irradiancia con
mdulo SICRAM incluido. Campo espectral UVA
315nm400nm. Pico a 360nm, difusor para la
correccin del coseno de cuarzo. Rango de medida: 0,1 y
2000.
LP471UVB

http://www.ictsl.net/productos/instrumental/sondasra
diometricasyfotometricas.html
http://www.espectrometria.com/espectro_electromag
ntico