Aislamiento de ADN

La tecnologa del ADN recombinante ha revolucionado el estudio de la clula, y la molcula de ADN ha

pasado a ser mu simple de estudiar. Desde el ao 1953, cuando Watson y Crick propusieron el modelo de
la doble hlice como estructura del ADN se han obtenido innumerables avances en el campo de la
biologa molecular y se han desarrollado muchas tcnicas genticas sofisticadas. La construccin de
molculas de ADN recombinantes y artificiales se denomina Ingeniera Gentica, a causa de su potencial
para crear nuevas combinaciones genticas por medios bioqumicos. El proceso tambin se denomina
clonacin molecular o clonacin gentica, porque se pueden propagar en una estirpe de organismos
genticamente idnticos, los cuales todos contienen la molcula compuesta y al crecer la amplifican, as
como cualquier producto gnico cuya sntesis sea dirigida por ella. Para clonar (multiplicar) un fragmento
de ADN se requiere de los siguientes pasos (figura 1):
1. Obtener el fragmento de ADN que se pretende clonar. 2. Obtener y purificar el Vector de
Clonado. 3. Digerir y ligar las molculas de ADN (forneo y vector) de tal manera que nos
permita crear la molcula recombinante. Las reacciones de corte y ligacin utilizadas deben
poder ser comprobadas fcilmente por el uso de electroforesis en gel.
2. 4. Introducir la construccin obtenida en el organismo hospedador adecuado (bacterias,
levaduras, clulas de insecto, otros sistemas eucariticos) 5. Crecimiento y seleccin de los
organismos portadores de la molcula recombinante. 6. Obtener y purificar la nueva molcula de
ADN.
3. Enzimas de restriccin
4. En los organismos procariotas existe el mecanismo de restriccin regulado por el husped que
les permite a las bacterias distinguir lo propio de lo ajeno. Este fenmeno que involucra la
modificacin y la restriccin tiene como objetivo controlar la entrada de ADN exgeno, y las
endonucleasas responsables de la degradacin de ese ADN se denominan endonucleasas de
restriccin. La bacteria protege su propio ADN contra los efectos letales de sus endonucleasas y
para ello modifica su ADN metilando ciertas bases de las secuencias de ADN que constituyen las
secuencias de reconocimiento de las enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin (ER)
reconocen una secuencia nucleotdica especfica de doble cadena en la molcula de ADN y la
cortan o digieren dejando extremos romos -extremos de doble cadena- o cohesivos -con
extremos de simple cadena complementarios entre s (figura 2). Existe una gran cantidad de
endonucleasas de restriccin que reconocen y digieren el ADN en secuencias concretas de tetra,
penta, hexa o hepta nucletidos, llamadas secuencias palindrmicas, que se caracterizan por
tener un eje de simetra, de manera que ambas cadenas poseen la misma secuencias 3-5.
5. Plsmidos y clonacin
Los plsmidos son molculas de ADN ciculares cerradas covalentemente (CCC) que poseen los
procariotas y se heredan de manera estable en estado extra cromosmico. Esta definicin implica
homogenizacin gentica, tamao constante de las unidades monomricas y la capacidad de
replicarse independientemente del cromosoma. Los genes existentes en los plsmidos codifican
para distintos caracteres fenotpicos como: resistencia a antibiticos, produccin de antibiticos,
resistencia a metales pesados, degradacin de compuestos aromticos, etc. Estos plsmidos
pueden ser modificados para utilizarse como vectores de clonado (para amplificar un fragmento
de ADN de inters), o como vectores de expresin (donde el fragmento de ADN insertado
codifica para alguna protena de inters). Las caractersticas generales de un vector de clonacin
son: bajo peso molecular, contienen un origen de replicacin, tienen capacidad de conferir
caracteres fenotpicos fcilmente seleccionables en las clulas husped (por ejemplo contienen
un gen de resistencia a algn antibitico) y poseen un sitio poli-linker o MCS (multiple
cloning site), el cul es una pequea regin con alto nmero de secuencias reconocibles por un
diferentes de endonucleasas de restriccin. El proceso de clonacin consiste en insertar el
fragmento de ADN exgeno en un vector y su posterior incorporacin en un organismo receptor
adecuado como se mencion anteriormente. Como la eficiencia de esta incorporacin es muy
baja, es esencial que el plsmido tenga algn fenotipo fcil de identificar. Generalmente este es
un gen de resistencia a un antibitico contenido en el plsmido, de manera que slo crecen las
colonias que efectivamente incorporaron el vector.
Para corroborar que el plsmido incorporado en el organismo hospedador contiene el fragmento
de ADN de inters (y no es un plasmado vaco), existen distintas estrategias. Una de ellas es el
sistema -gal: el vector codifica la enzima -galactosidasa y en el interior de este gen est el
polilinker; de esta manera el inserto de ADN interrumpe la expresin de -galactosidasa y por lo

tanto al crecer la bacterias en una placa con x-gal (el sustrato de dicha enzima que da un
producto azul al hidrolizarse) obtendremos colonias azules (-) sin inserto y colonias blancas (+)
recombinantes.
Extraccin de ADN plasmdico:
Existe una gran variedad de mtodos para el aislamiento de ADN plasmdico, en particular para
aquellos plsmidos encontrados en Escherichia coli y otras enterobacterias. Estos mtodos se
diferencian en la pureza del producto final, en el tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la
posibilidad de aplicarlos en aislamientos a pequea o gran escala; sin embargo todos incluyen
tres etapas comunes: crecimiento de las bacterias y amplificacin del plsmido, cosecha y lisis
de las bacterias y purificacin del ADN plasmdico.
La mayora de los mtodos explota, de una u otra forma, las diferencias existentes entre el ADN
cromosmico y el ADN plasmdico: Los plsmidos tienen un pequeo tamao en relacin con
el cromosoma bacteriano. El ADN cromosmico de las bacterias es circular, pero al ser
extrado la mayor parte se obtiene fragmentado, en molculas lineales. Los plsmidos son
molculas de ADN circular, cerrado en forma covalentes (CCC covalently closed circular). El
procedimiento de desnaturalizacin alcalina, descripto por Birnboim & Doly constituye la base
de varios protocolos de extraccin de ADN plasmdico. Para la extraccin de ADN plasmdico se
lisan las clulas por el agregado de un detergente (por ejemplo SDS) y NaOH. Las condiciones
alcalinas (pH 12-12,5) desnaturalizan por completo las molculas lineales de ADN, pero no las
molculas CCC (las cuales sufren una desnaturalizacin parcial). El ADN cromosmico estar
en mayoritariamente en forma fragmentada (mltiples moleculas lineales) y el plsmido que en
relacin es ms pequeo, se mantendr cerrado. Cuando el extracto celular es neutralizado (por
ejemplo con cido actico) bajo condiciones de alta concentracin salina (acetato de potasio), el
ADN cromosomal precipita; obedeciendo a la reasociacin inespecfica de las largas cadenas de
ADN simple cadena, que ocurre en mltiples sitios formando una masa insoluble. Parte del ARN
precipita, pero siempre quedan cantidades detectables de esta molcula, a menos que se utilicen
RNasas durante el proceso de extraccin. Tambin precipitan algunas protenas debido a que la
reaccin se realiza en presencia de SDS y alta fuerza inica, pero la extraccin mayoritaria de las
protenas se realiza posteriormente con cloroformo. Finalmente, el ADN purificado se suele
concentrar mediante precipitaciones alcohlicas. El cambio de polaridad del medio que genera el
agregado de alcohol, y la disminucin de la temperatura vuelven insoluble al ADN, pudindose
recuperar en un precipitado si es centrifugado a altas velocidades. Este protocolo es comnmente
utilizado para minipreps de ADN plasmdico, es decir extracciones a partir de un pequeo
volumen (1-1,5 ml) de cultivo bacteriano saturado. En lneas generales, cuanto ms chico sea el
plsmido, mejor es el resultado obtenido, ya que a medida que se incrementa el tamao, sus
propiedades se asemejan cada vez ms a las del ADN cromosmico. Con plsmidos mayores a
25 kb el aislamiento se hace dificultoso y el rendimiento es muy bajo. Sin embargo para los
vectores de uso rutinario el rendimiento es muy bueno y el producto obtenido es lo
suficientemente puro como para realizar digestiones con endonucleasas de restriccin sin
necesidad de una purificacin ulterior.

Extraccin de DNA total de E. Coli.

La metodologa siguiente es una de las primeras que se us para la extraccin de
DNA genmico.
Para extraer DNA total es conveniente partir de un cultivo fresco y saturado.
Debido a su gran tamao (4.7 x 10 6 pb), y a su extrema fragilidad su extraccin debe
realizarse con sumo cuidado. No se debe usar el vortex en ningn paso despus de que
la lisis celular tuvo lugar. En cambio debe mezclarse por inversin del tubo eppendorff.
Este mtodo consta de tres etapas principales: un crecimiento celular, un paso de
lisis que se efectua con lisozima y Tritn, y un ltimo paso de precipitacin alcohlica.
Por la gran cantidad de DNA que se logra precipitar es posible verlo como una gran
fibra que se puede extraer fsicamente enrollndola en un tip de micropipeta o en una
varilla de vidrio.

a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)
l)
m)
n)

Crecer un cultivo de 5 ml overnight 37C.

Peletear en eppendorff de 1.5 ml tres veces, 1 min. a 14000 rpm.
Resuspender en 200 ul de TE
Centrifugar 1min a 14000 rpm
Descartar el sobrenadante
Resuspender en 200 ul de buffer TE (5X ) a 4C + 20 % de sacarosa .
Agregar lisozima slida ( punta de esptula). Incubar a 37 C 15 min.
Agregar 0.05 ml EDTA (0.5 M, pH 8.5).
Aadir 0.4 ml de Triton 10%. Mezclar por inversion.
Agregar 0.8 vol de isopropanol
Incubar a 20C 10 min.
Tomar un tips y enrollar en el mismo el ovillo de DNA observable.
Pasar a otro eppendorf y dejar secar .
Redisolver el precipitado en 200 ul de H20

Referencias
Molecular cloning. Vol 1. Maniatis
Experiments in Molecular Biology. Cap 1 Robert J. Slater
Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Biologa molecular de
la clula (1996) Omega. Glick B. And Pasternak. Molecular Biotechnology (1994)
ASM Press.
Lodish H, Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaria P., Darnell J. Molecular
Cell Biology (1995) Scientific American Books.
Old R.W., Primrose S.B. Principios de manipulacin gentica (1987) Editorial Acriba
S.A.
Hardy, K.G. Plasmids, a practical approach (1987) IRL Press.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. Molecular cloning, a laboratory manual
(1982) Cold Spring Harbor Laboratory.