Sebenta TCM

TESTE PRTICO 1 MATRIA PRTICA 2014/2015
Quem encontrar erros tem um sushi pala com um dos membros escolha.
TCM - TESTE PRTICO 1

Porque estudar clulas ?
-
Servem como catalisadores que mantm os processos metablicos.
Servem como elementos estruturais dentro e fora da clulas.
Sinalizao
o Receptores
o Molculas Sinal
Expresso gentica Regulao
Manipulao na expresso e transcrio de DNA e RNA.
Processos de avaliao de protenas:

Eletroforese em acetato de celulose:
A eletroforese uma tcnica segundo a qual se aplica um campo eltrico que separa
as protenas de acordo com o seu peso molecular.
A amostra de soro e plasma colocada numa soluo tampo (alcalina) de modo a

garantir que as protenas da amostra adquirem uma carga negativa visto que cedem
protes H+ soluo tampo. Quando submetidas a um campo eltrico estas vo se
dirigir para o polo positivo (nodo), uma vez que esto carregadas negativamente.
Desta forma a amostra ter de ser colocada perto do polo negativo (ctodo). A
velocidade com que se deslocam est diretamente relacionada com o seu tamanho
Gordjon / Maridjane / Pedz

que se reflete no peso molecular assim as protenas com maior peso molecular, no
final da eletroforese, encontrar-se-o mais prximas do ctodo ( polo negativo ) .
O sangue constitudo por Plasma (componente fluda), e constituintes slidos.

Plasma: Formado por albumina, globulinas 1, 2,
Soro: Formado por albumina, globulinas 1, 2,
e e fibrinognio.
e , ou seja no tem factores de
coagulao.
A centrifugao do sangue sem anticoagulante levara a coagulao do centrifugado;
durante este processo, ha o consumo de fibrinognio, assim como todos os factores
envolvidos na coagulao, dessa forma, constitui-se o soro.
Para a obteno do plasma, faz-se a centrifugao do sangue com o anticoagulante.
Observa-se, ento, que o fibrinognio no esta presente no soro, pois este foi
utilizado para a formao de fibrina, ao contrario do plasma, que o possui.
Pode-se dizer que o soro e, basicamente, o plasma sem o fibrinogenio.
A albumina a protena com menor peso molecular migrando com maior velocidade
apresentando-se mais prxima do nodo (polo positivo). A banda da albumina
mais densa pois esta a protena mais abundante tanto do soro como do plasma.
Quanto s globulinas de maior para menor peso molecular temos, , , 2, 1. O
fibrinognio apresenta-se como uma banda entre a -globulina e a -globulina.

Imuno-Histoqumica (IHQ)
um processo de localizar antigenes (ex. Protenas) em tecidos explorando o
principio de ligao especfica de anticorpos a antigenes no tecido biolgico. A
visualizao de uma interao antigene-anticorpo pode ser obtida de vrias formas.
Na situao mais comum o anticorpo conjugado a uma enzima (ex. Peroxidase)
que pode catalisar uma reao que produz colorao. Alternativamente, o anticorpo
pode tambm ser marcado com um flurofro (ex. Fluorescena, rodamina).
Antigene: toda a partcula ou molcula capaz de iniciar uma resposta imune, a qual
comea pelo reconhecimento pelos linfcitos e acumula com a produo de um
anticorpo especfico. Neste caso so protenas.
Western-Blot
Aps a separao das protenas/antignios, estas so eletrotransferidas para uma

membrana de nitrocelulose pelo facto de o gel de eletroforese ser um meio pouco
apropriado para a imuno-deteo ( uma vez que no um bom suporte para as
ligaes antignio anticorpo . A membrana de nitrocelulose tem alta afinidade para
protenas, fazendo com que estas permaneam presas na sua superfcie. Para
transferir o antignio ( protena separada) do gel de eletroforese para a membrana
utiliza-se um campo eltrico.
Primeiramente, a membrana j com as protenas/antignios passa pelo blotting, que
consiste na adio de protenas no especficas cuja funo ocupar a rea da
membrana que no tem os nossos antignios. De seguida adicionado um primeiro
anticorpo que se vai ligar aos nossos antignios. Depois adicionado um segundo
anticorpo j ligado a uma enzima com caractersticas fluorescentes. Quando este
ltimo se liga aos restantes, na membrana, estes emitem cor, que os permite
identificar e analisar.

ELISA
Elisa um teste imunoenzimtico que permite a deteo de anticorpos/antignio
especficos no plasma sanguneo.
Uma enzima, que reage com um substrato incolor de modo a produzir um composto
colorido, covalentemente ligada a um anticorpo especfico que reconhece o
antignio-alvo (este antignio especfico ser aquele cuja presena no soro
queremos confirmar).
O anticorpo ento colocado num suporte slido, com o qual se relaciona atravs
de interaes hidrofbicas.
Esta superfcie imersa em soro, sendo que, se existirem esses antignios
especficos no soror, estes vo se ligar ao anticorpo em soluo e originar,
consequentemente, uma soluo corada.
Se o antignio especfico no estiver presente ento a soluo no ficar corada.
Permite detetar quantidades muito pequenas de antignio (protena).
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H.

Freeman and Company, 2000), p. 162.]
Citometria de Fluxo
uma tcnica utilizada para contar, examinar e classificar partculas microscpicas
suspensas em meio lquido em fluxo.
Mede o tamanho relativo da clula e a sua granulosidade ou complexidade. Estas
propriedades so caracterizadas num fluxo: As clulas em suspenso, num recipiente
prprio, fluem em fila indiana, este fluido iluminado, refletindo a luz

(fluorescncia), emitindo fluorescncia. Essa fluorescncia filtrada e processada,

num computador.
Cromatografia
A cromatografia uma tcnica quantitativa que tem como finalidade a identificao
de substncias e a separao / purificao de misturas. Recorre a propriedades
como solubilidade, tamanho e massa. Acontece pela passagem de uma mistura
atravs de duas fases: estacionria (fixa) e outra mvel.
O lquido usado para dissolver a s biomolculas a soluo tampo, sendo que a
mistura de ambos denominada de amostra. Esta colocada numa coluna que
contm esferas com poros, passando pelos poros (as molculas mais pequenas) ou
pelo seu lado (as maiores).
Cromatografia por excluso de tamanho:

As molculas so separadas em funo das suas dimenses (do seu volume
hidrodinamico), uma vez
que a fase estacionria
(matriz ou resina) tem
esferas
que
possuem
poros que permitem ou

dificultam a entrada das
molculas
separar.
Assim, as molculas de
menor
tamanho
retidas
nos
ficam
poros
percorrem um caminho
maior, sendo as maiores
as primeiras a sair.

Outros tipos de cromatografia:

Troca inica:
-Troca cationica: separa com base nas cargas positivas das protenas (matriz
carregada negativamente).
-Troca anionica: separa com base nas cargas negativas das protenas (matriz
carregada positivamente) .
Interaces hidrofobicas:
-Separa de acordo com a hidrofobicidade das protenas.
Afinidade:
-Separa por caracteristcas de ligao unicas entre a protena de interesse e a matriz
da coluna (que pode conter por ex. um Anticorpo especfico contra a protena).
Aula Prtica Cromatografia:

1. Como a estrutura de uma protena?
Existem quatro arranjos espaciais que as protenas podem assumir, organizados de forma
crescente em complexidade.
A estrutura primria corresponde sequncia de aminocidos, sendo o nvel estrutural mais
simples e mais importante, pois a partir deste que surgem os restantes. Esta estrutura
resulta numa longa cadeia de aminocidos com uma extremidade Amino Terminal e outra
Carboxilo Terminal.
A estrutura secundria corresponde ao arranjo espacial dos aminocidos, resultante do
enrolamento das cadeias de aminocidos. Este tipo de estrutura ocorre devido
possibilidade de rotao das ligaes entre os carbonos dos aminoacidos e os seus grupos
amina e carboxilo. Existem dois tipos de estruturas secundarias : hlices e folhas
pregueadas .
A estrutura terciria corresponde conformao tridimensional das cadeias polipeptdicas,
sendo determinada pela estrutura primria devido s interaces entre as cadeias laterais.
Existem quatro tipos de estrutura terciaria: /, /, / e + .

Por fim, a estrutura quaternria corresponde distribuio espacial de duas ou mais cadeias
polipeptdicas. Este o nvel superior de complexidade na estrutura das protenas e surge
apenas nas protenas oligomricas. As cadeias polipeptdicas mantm-se unidas por ligaes
no covalentes. As subunidades da protena podem atuar de forma independente ou
cooperativamente no desempenho da funo bioqumica da protena.
2. Como so formadas as protenas a partir de uma cadeia de DNA?
O processo de produo de protenas a partir de uma cadeia de DNA ocorre por etapas: a
transcrio, a migrao e a traduo.
A transcrio, que ocorre no ncleo, a etapa em que se verifica a cpia da sequncia de
bases de DNA para uma cadeia complementar de mRNA, o qual sofre ainda um
processamento antes de abandonar o ncleo. Durante este processo diversas pores de
RNA inicialmente transcritas so removidas, os intres. Desta forma, obtm-se um RNA
funcional, constitudo apenas por sequncias codificadoras denominadas exes, unidas
entre si numa cadeia simples (que difere da dupla hlice caracterstica do DNA).
Seguidamente ocorre a migrao, em que este RNA funcional recentemente formado passa
para o citoplasma atravs dos poros nucleares.
Por ltimo ocorre a traduo, constituda por trs fases: iniciao, alongamento e
finalizao. Na iniciao o mRNA liga-se ao ribossoma e posteriormente o tRNA transporta o
aminocido metionina at subunidade menor do ribossoma.
De seguida, no alongamento, um novo tRNA vai transportar um novo aminocido at ao
ribossoma, para que este se ligue aos aminocidos anteriores a partir de uma ligao
peptdica. Finalizada a ligao, o ribossoma avana trs bases no mRNA.
Por ltimo, na finalizao, o ribossoma encontra um codo de finalizao, o qual no tem
um anticodo complementar, pelo que termina a sntese proteica. Neste momento, a cadeia
polipeptdica recm formada destaca-se do ribossoma e as subunidades deste separam-se.
3. O que um gene?
Um gene um fragmento de DNA que contm a informao necessria para a sntese de
protenas ou de RNA funcional.
4. Que caractersticas proteicas so normalmente usadas para separa duas
protenas? Nesta aula qual delas vai ser usada?
A separao de protenas pode fazer-se segundo diferentes caractersticas proteicas,
nomeadamente:

Afinidade: separao tem em conta as caractersticas de ligao da protena

de interesse matriz da coluna
Solubilidade: separao de protenas segundo as diferenas de solubilidade
em solues aquosas.
Carga: nesta situao a separao baseia-se na carga da protena. Se esta
tiver carga positiva a matriz ter que possuir uma carga negativa e vice-versa.
Tamanho: a separao d-se conforme o tamanho das protenas, sendo que
as protenas com maior peso molecular so as primeiras a abandonar a coluna
de cromatografia.
Nesta aula a caracterstica proteica a utilizar o tamanho, ou seja, ser efectuada uma
cromatografia por excluso de tamanho
5. .D dois exemplos de cromatografia em coluna.
Dois exemplos de cromatografia em coluna so a cromatografia e a cromatografia liquida de
alta resoluo (HPLC) e a cromatografia por excluso de tamanho.
6. Explique brevemente como funciona o tipo de cromatografia que vamos utilizar.
Para iniciar o processo aplica-se na coluna de cromatografia a mistura de molculas
dissolvidas num liquido, a fase mvel. Na coluna j se encontra o suporte slido, a fase
estacionria, constituda por uma membrana de microesferas porosas. Esta fase tem a
funo de uma malha que filtra as molculas mais pequenas e as retm temporariamente.
As molculas de maior tamanho passam volta da membrana e so excludas da fase
estacionria. Sendo assim, as primeiras pores a serem recolhidas contm as molculas
com maior peso molecular.
7. Se tivermos uma mistura de protenas que vai ser separada por cromatografia de
excluso de tamanho, qual a ordem com que as protenas passam pelo fundo da
coluna? Mistura: hemoglobina (65,000 dalton), mioglobina (17,000 dalton) e
miosina (180,000 dalton).
Na cromatografia de excluso de tamanho a progresso das protenas ao longo da coluna,
at atingirem o seu fundo, tanto mais rpida quanto maior a protena. Ou seja, protenas
de maiores dimenses atingem o fundo da coluna antes das de menores dimenses.
Neste caso, temos hemoglobina (65,000 dalton), mioglobina (17,000 dalton) e miosina
(180,000 dalton). A sua ordem decrescente de dimenso ser, ento, miosina, hemoglobina,

mioglobina, pelo que, esta ser, tambm, a ordem pela qual iro atravessar o fundo da
coluna de cromatografia.
Anlise Resultados / Procedimentos:

1. Porque razo ser a mistura proteica castanho-avermelhada?
Esta mistura constituda por hemoglobina, de cor castanho-avermelhada, e vitamina B12,
com colorao cor de rosa. A sua cor final, no entanto, apenas castanho-avermelhada,
devido ao facto de a hemoglobina ser o componente maioritrio e a vitamina B12 ser um
componente que, por estar presente em menores quantidades, vai ter uma menor
influncia na colorao final da mistura.
2. No passo 7 foi necessrio deixar secar a membrana da coluna. Porqu?
O tampo que se encontrava no interior da coluna de cromatografia tinha a funo de
conservar as micro esferas, sendo necessrio remov-lo antes de adicionar a mistura
proteica. Se no se deixasse secar a membrana da coluna os vestgios de tampo iriam
misturar-se com a mistura proteica adicionada. Esta nova soluo formada teria maior
volume do que a mistura proteica, o que iria interferir na velocidade de movimentao das
partculas ao longo da coluna e, consequentemente, na sua separao.
3. Porque razo no passo 8 foi necessrio adicionar mais tampo de coluna?
A soluo tampo o lquido utilizado para dissolver as biomolculas de modo a obter a fase
mvel. Desta forma, as biomolculas entram na coluna pelo topo e so filtradas pela
membrana ou volta dela, passando no fim por uma abertura no fundo da coluna. No
entanto, para que este processo seja completo e a cromatografia seja eficaz necessrio
voltar a adicionar tampo, permitindo que a descida de toda a amostra e de toda a fase
mvel seja conseguida.
4. Examinando as 10 fraces colectadas, que tubos que acha que contem as

fraces correspondentes ao pico de hemoglobina e de vitamina B12? Qual das
duas molculas sai da coluna primeiro? A maior ou a mais pequena?
A mistura de protenas utilizada contm hemoglobina, de colorao castanha, e vitamina
B12, de colorao rosa. Na cromatografia efectuada identificam-se quatro tubos com
mistura castanha (tubos 3 a 6 ) e outros quatro com mistura rosa (tubos 7 a 10). No entanto,

as cores so mais fortes nos tubos 4 e 9. Deste modo, pode concluir-se que estes tubos
correspondem aos picos de hemoglobina e vitamina B12, respectivamente. Conclui-se,
ento, que a primeira molcula a sair foi a de hemoglobina. A hemoglobina tem um peso
molecular de 65,000dalton enquanto que a vitamina B12 tem um peso de 1,350dalton,
sendo a primeira, de maiores dimenses. Deste modo, por ser encontrada nos primeiros
tubos, a maior molcula a primeira a sair da coluna.
(exemplos
de
resultados
de
uma
experincia)
Organelos Celulares
1. Organelos Membranares
1.1. Membrana plasmtica
Bicamada fosfolipdica que forma o limite da clula assim como o limite de outros
organelos dentro da clula.
1.2. Ncleo
o maior organelo da clula, estando rodeado por uma membrana dupla
denominada de invlucro nuclear. Em determinados locais deste invlucro, este
funde as suas duas membranas, formando um poro nuclear, seletivamente
permevel.
O ncleo contm a informao gentica, o DNA, pelo que controla a atividade
celular.
Este contm diferentes domnios, nomeadamente o nuclulo, regio onde se
encontra a maquinaria necessria sintese de ribossomas.
1.3. RER retculo endoplasmtico rugoso
uma regio do retculo endoplasmtico, contnua com o ncleo, que est associada
a ribossomas. Este o local de sntese de protenas e modificao de protenas
recentemente formadas (ps-traducionais).
10

1.4. REL - retculo endoplasmtico liso

uma regio do retculo endoplasmtico involta em lpidos e esterides (composto
lipossolvel) e que no se encontra associada a ribossomas. Este responsvel pelo
armazenamento de Ca2+, pela sntese de lpidos e colestrol e pela desintoxio
celular, visto que neutralisa as toxinas.
1.5. Aparelho de Golgi
Organelo composto por mltiplas cisternas achatadas responsveis por modificar,
classificar e empacotar protenas e lipidos para serem transportados para o meio
intra ou extracelular. Existem trs zonas de cisternas, as cisternas cis que recebem as
vesculas do RER, a zona trans, responsveis pelo direcionamento das protenas
recebidas nas vesculas (para estas protenas serem secretadas, contribuirem para a
formao do contedo do lisossoma ou para regressarem ao RER), existindo
cisternas entre ambas.
1.6. Endossomas
So organelos com vrias formas, localizados entre o complexo de Golgi e a
membrana plasmtica.Os endossomas so responsveis pelo transporte e digesto
de partculas e macromolculas que so captadas pela clula por processos
conhecidos como endocitose.
1.7. Lisossomas
Pequenos organelos que contm enzimas digestivas, sendo responsvel pela
digesto ijntracelular.As suas derivaes incluem: fagossomas, fagolisossomas,
autofagossomas, autofagolisossomas. Esta destri lipidos, hidrocarbonetos e
protenas, transformando-os em molculas simples; recicla organelos danificados ou
no usados; ataca/digere materiais indesejados.
1.8. Vesculas de transporte
Inclui: vesculas pinocticas, vesculas endocticas, vesculas revestidas.
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Estas vesculas esto envolvidas tanto na exocitose como na endocitose, variam na

forma e no contedo que transportam.
1.9. Mitocndria
Organelo que providencia a energia que a clula necessita pela produo de ATP
(adenosina trifosfato), no processo da fosforilao oxidativa. constituda por uma
membrana externa (permevel, uma vez que contm porinas) e uma membrana
interna (mais rica em protenas, visto que apresenta a cadeia de eletres,
responsvel pela fosforilao oxidativa que vai conduzir sntese de ATP ), que
envolve a matriz mitocondrial. Nesta matriz encontram-se igualmente protenas e
ainda DNA mitocondrial, herdado da parte materna e ribossomas.
1.10.
Perximos
Pequenos organelos envolvidos na produo e degradao de H2O2 e na degradao

de cidos gordos.
2. Organelos no Membranares
2.1. Microtbulos
Com a actina e os filamentos intermdios formam elementos do citoesqueleto.
Microtubulos so continuamente alongados pela adio de dmeros de tubulina e
encurtados pela remoo de dmeros de tubulina, estando associados ao
centrossoma. Estes do origem aos clios, que permitem o movimento celular (os
clios tm uma forma denominada de axonema, apresentado nove pares de
microtubulos concntricos que rodeiam um par central).
2.2. Filamentos
Tambm fazem parte do citoesqueleto. Em geral, os filamentos podem ser
organizados em dois grupos: os filamentos de actina (microfilamentos), que so
cadeias flexveis de molculas globulares de actina responsveis pelo movimento e
contrao celular (estando presentes nas microvilosidades); filamentos intermdios,
que so tipo corda formados com vrias protenas.
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2.3. Centrolos
Curtos, cilndricos e pares e encontram-se no centro do centrossoma. Derivados dos
centrolos do origem ao corpo basal dos clios
2.4. Ribossomas
Estruturas compostas por rDNA (DNA ribossmico) e por protenas no
ribossomicas. Este pode estar associado ao RER, no qual sintetiza essencialmente
protenas para serem excretadas, ou pode estar livre no citoplasma, sintetizando
protenas para a prpria clula.
Introduo Cultura de Clulas

-Conjunto de tcnicas que permitem cultivar ou manter clulas isoladas de um dado
organismo;
- Podem-se cultivar clulas a partir de tecidos humanos, animais ou vegetais.
Estudo de processos biolgicos: (Expresso gentica, Trafego atravs da membrana, Fluxo e
transferencia de metabolitos, Transduo de sinal, Adeso, interaes recetor-ligando,
Interao clula-clula, Exocitose )
Estratgia essencial no tratamento de diversas doenas: Clulas estaminais na terapia
celular, Vacinas de clulas, Terapia gentica, Reposio tecidual .
Vantagens
- Controlo das condies ambientais
- Analise independente de parametros
- Elevado numero de testes num curto espao de tempo - Reduo dos ensaios com
animais
- Menos dispendiosas que a experimentao animal
Desvantagens
- Perda de caractersticas fenotpicas celulares - Sistema biolgico fora do ambiente
natural
- Ausencia de sinais importantes
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Tipos de Culturas:
Primrias:
- Obtidas diretamente dos tecidos.

- Culturas heterogneas.
- Mantem-se pouco tempo em cultura .
Secundrias: -Obtidas a partir de culturas primarias.

-Clulas imortalizadas (alterao gentica).
-Crescimento rapido e contnuo.
-Proliferao ilimitada ou limitada a um elevado numero de passagens
Condies necessrias ( Aps o isolamento das clulas do tecido)
Superfcie de plastico para as clulas se fixarem e crescerem (como num tecido) /
Meio de crescimento adequado (nutrientes, fatores de crescimento, antibioticos) /
Temperatura fisiologica /pH fisiologico / 5% CO2 manuteno do pH / Humidade
/Condies de esterilidade
Clulas aderentes VS Clulas No Aderentes

-Clulas derivadas de um tecido so normalmente aderentes - So crescem aderidas a
uma superfcie, numa unica camada.
-Clulas do sangue ou linhas celulares derivadas da linhagem hematopoitica
(leucemias,...) crescem em suspenso, logo so nao aderentes.
Cultura Confluente VS Cultura No Confluente
Confluente: Uma cultura em que as clulas se dividem, ocupando, depois, toda a
superfcie da placa em que so cultivadas numa s camada.
No Confluente: Oposto da Confluente, em que existem espaos entre as clulas,
que no ocupam toda a superfcie da placa.
Quando a cultura se encontra em estado confluente ser necessrio cultivar ou fazer
uma passagem. Com cerca de 80% / 90% de confluncia o substrato disponvel e o
espao comeam a escassear, o crescimento celular torna-se lento e as clulas
comeam a entrar me apoptose. Ser necessrio remover as clulas da superfcies
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onde esto aderidas (tripsina, colagenase ou EDTA para quebrar as ligaes entre as
clulas e entre as clulas e a superfcie de suporte) e assim procede-se ao scalling up e
subcultivo.
Cultura de Clulas ( aula prtica )

Procedimentos e Anlise
Realizado , supostamente, em cmara de fluxo laminar que garante condies de
assepsia (conjunto de medidas que permitem manter um ser vivo ou um meio inerte
isento de bactrias. )
Lavar as clulas com PBS
PBS uma soluo isotnica (tampo) que permite a regulao do pH do meio da
cultura de clulas. A concentrao salina deste aproxima-se dos valores do corpo
humano.
Adio de tripsina
A adio de tripsina tem como fim a separao das clulas da superfcie onde se
encontram aderidas.
Incubadora
O tempo de permanncia na incubadora permitiu uma maior eficcia na dissociao
das clulas, culminando com um maior nmero de clulas solto da placa.
Up&Down
Permite remover completamente as clulas da placa, de modo a que fiquem em
suspenso. Aps o up&down a maioria das clulas encontram-se suspensas no
lquido de forma a que se possam colocar nos tubos para realizar a centrifugao.
Centrifugao
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Permite separar as clulas do liquido sobrenadante permitindo que estas se

concentrem numa zona especifica do eppendor sendo mais fcil retirar o liquido
sobrenadante com o mnimo de clulas.
Azul Tripano
O azul de tripano um corante de excluso que apenas entra em clulas
permeabilizadas (inviaveis/mortas). Apos a entrada na clula atravessa o involucro
nuclear e acaba por se localizar nos nucleos, que ficam corados de azul.
16

Continhas:
O volume de um quadrado (A,B,C,D) 0.1 l
( 0.1 * 10^-3 ml).
Para calcular o numero de clulas:
1. Contar
todas as clulas viveis
observadas nos quadrados (A,B,C,D).

2. Fazer a mdia (A+B+C+D)/4 cujo
resultado ser utilizado no clculo da

concentrao celular.
Clculo da concentrao celular:

Nmero de Clulas
( 1 104 )
Factor de Diluio
Calculado na aliena
2, anteriormente.
Nr.de Clulas Contadas________0,1 l (Volume de cada quadrado (A,B,C,D))

X ____________________1000 l ( 1ml visto que a concentrao expressa em clulas/ml)
Nr. Clulas Contadas *
1000
0,1 ul
= Nr. Clulas Contadas * 1
104
( + )
( )
17
Nota: Se o volume das clulas em suspenso e do corante (azul tripano no caso)

Clculo das percentagens
%vivas/mortas =
. /
.
Clculo 2 (Se pretendesse plaquear as clulas numa placa de dimetro de 60 mm,

volume final = 5ml, e uma concentrao de 2 105 clulas/ml, que volume das
SUAS clulas precisa de utilizar)
-
Pelo enunciado temos 2 105 em 1ml, ento queremos saber

quantas clulas que existem em 5ml.
1ml ________ 2 105

5ml ________ x (A) A= 5 2 105
-
Necessitamos de ir buscar as clulas e para isso necessrio conhecer o

volume. Para calcular o volume utilizamos a concentrao celular e o nmero
de clulas em 5ml (A) , calculados anteriormente.

5 2 10
=

18

1. Case Study
Estrutura da membrana
O modelo vigente para a ultraestrutura da membrana citoplasmtica o Modelo do
Mosaico Fluido (fig. 1), que admite que a membrana uma dupla camada contnua de
fosfolpidos, com uma espessura aproximada de cinco nanmetros, que apresenta
protenas, lpidos e glcidos associados que constituem o glicoclice. Esta bicamada
apresenta permeabilidade selectiva e caracterizada pela sua fluidez (condicionada pela sua
composio e pela temperatura) e pela sua dinmica.
Fig. 1) Modelo do Mosaico

Fluido
Os lpidos que constituem a membrana encontram-se distribudos de forma irregular.
Assim, os fosfolpidos, os mais abundantes, dispem-se na membrana com as extremidades
hidroflicas voltadas para as faces interna e externa da membrana e com as extremidades
hidrofbicas voltadas para o seu interior. Os fosfolpidos apresentam alguma mobilidade na
membrana, descrevendo movimentos de flip-flop (com uma frequncia mdia de uma vez
por ms para cada molcula), laterais, de flexo e de rotao, mais rpidos e frequentes (fig.
2). As molculas de colesterol (fig.3), mais frequentes nas clulas eucariticas, ocupam as
imediaes das pores polares dos fosfolpidos. Os glicolpidos apresentam uma
distribuio assimtrica na superfcie externa da bicamada.
Associadas aos lpidos membranares podem surgir protenas em quantidades variveis,
responsveis pela maioria das atividades da membrana (fig. 4). Assim, as protenas
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perifricas estabelecem ligaes covalentes com os lpidos da superfcie externa da

membrana. As protenas integradas so molculas anfipticas que se dispem na membrana
com a sua poro hidroflica em contacto com um solvente, e a sua poro hidrofbica
alojada no interior da membrana. tambm possvel encontrar na membrana
glicoprotenas, ou seja, protenas integradas associadas a glcidos.
Fig. 2) Movimentos de fosfolpidos
Fig. 3) Molcula de colesterol
Fig. 4) Protenas membranares
Funes da membrana plasmtica

Tendo em conta a sua estrutura e os seus constituintes, pode inferir-se o papel fundamental
da membrana plasmtica no metabolismo celular, que passa essencialmente por assegurar
os contactos com o meio exterior, funcionando como barreira de permeabilidade que
permite clula manter um meio qumico apropriado para os seus processos.
Em primeiro lugar, de referir o papel da membrana na manuteno da integridade celular.
Ao delimitar a fronteira entre o citoplasma, com todos os organelos que o ocupam, e o meio
extracelular, a membrana essencial na individualizao da clula. As foras que unem os
fosfolpidos lado a lado na bicamada fosfolipdica conferem membrana alguma resistncia
traco, suficiente para assegurar a integridade fsica da clula, em condies normais, e a
sua individualidade. Estruturas internas como o citoesqueleto complementam a membrana
plasmtica nesta funo.
Para alm disso, a membrana essencial nos movimentos de transporte transmembranares
(fig.5) que ocorrem entre o meio exterior e o interior da clula. De facto, atravessam a
membrana ies, molculas pequenas, macromolculas e mesmo partculas, atravs de
mecanismos diversos de transporte membranar, que garantem a selectividade do processo
e o fluxo concordante com as necessidades da clula. A endocitose e a exocitose so
20

tambm processos importantes em que a membrana est envolvida. Importa ainda referir
que estes mecanismos permitem regular o volume citoplasmtico.
A membrana plasmtica est envolvida ainda em processos de recepo de informao (fig.
5), essenciais adequao do funcionamento da clula s condies envolventes. Assim,
compete membrana plasmtica assegurar a recepo da informao pertinente, presente
nomeadamente em hormonas, atravs de receptores proteicos incorporados na membrana.
Algumas clulas estabelecem entre si mecanismos de transmisso de informao, instalados
ao nvel da membrana. No caso concreto das clulas nervosas, a transmisso de informao
constitui a funo primordial para a qual se orienta todo o processo de especializao. A
membrana assume, neste processo, funes determinantes, quer constituindo estruturas
isoladoras, como a mielina, quer assegurando a propagao de um sinal elctrico.
Para alm disso, o reconhecimento celular (fig.5) uma funo que particularmente
importante nas clulas que se organizam em organismos pluricelulares, nos quais se
estabelece um processo de diferenciao. A garantia de que as clulas pertencem ao mesmo
organismo implica, no s a existncia de sinais exteriores identitrios, como a capacidade
de os reconhecer. Implica ainda que certas clulas diferenciadas disponham de mecanismos
especficos de eliminao de eventuais intrusos. Desta forma, a membrana intervm de
diversas formas no reconhecimento celular.
Fig. 5) Algumas funes da membrana

celular
ainda de referir a importncia da membrana na orientao vectorial de reaces (fig 6).
Vrios processos qumicos dos sistemas biolgicos implicam sequncias de reaces
21

coordenadas. Por exemplo, a substncia A convertida em B, a B em C, e assim

sucessivamente at ao produto final, sendo cada reaco catalisada por uma enzima. Se as
diversas enzimas envolvidas se dispuserem sequencialmente superfcie da membrana, o
produto de uma reaco passa a estar fisicamente disponvel para intervir na reaco
seguinte. A sequncia de reaces processar-se- com maior eficcia.
Permeabilidade da membrana
A membrana plasmtica, (tal como j foi falado), tem inmeras funes, sendo a principal a
limitao e individualizao do meio intra e extracelular. A permeabilidade da membrana
uma caracterstica fundamental no s para o funcionamento da clula como tambm para
a manuteno das condies fisiolgicas intracelulares em condies satisfatrias. Esta
permite a passagem de algumas substncias e impedem a passagem de outras do meio
extracelular para o meio intracelular e vice-versa.
Existem vrias molculas de interesse biolgico que atravessam as membranas biolgicas
por difuso, tais como:
Molculas pequenas no polares hidrofbicas - (gases como o azoto, o
oxignio, o dixido de carbono ou anidros carbnicos)
Solventes orgnicos (lcool, ter, clorofrmio, benzeno, etc.)
Substncias lipossolveis
Pequenas molculas polares no carregadas (gua, glicerol, ureia, etc.)
Existem por outro lado substncia de interesse celular que precisam da interveno de
outros agentes para passar a membrana, as tais protenas transmembranares que esto a
fazer greve, da a revindicao dos fosfolpidos da membrana (fala dos PHOSPHOLIPIDS:
Deixamos algumas coisas passar, mas outras no podemos deixar! E comeam a cantar:
Algumas coisas podem passar! Outras no podem!...)
Essas substncias que no so capazes de atravessar directamente a bicamada fosfolipdica,
como a glicose, aminocidos, nucletidos, e ies precisam da interveno de protenas
transportadoras para que se efectuem os processos de difuso facilitada ou transporte
ativo.
22

Difuso Simples
A difuso simples o mecanismo de transporte transmembranar mais simples, em que
molculas mais pequenas, no polares e lipossolveis se difundem livremente atravs da
membrana plasmtica de uma clula. Alguns gases indispensveis tambm podem
atravessar a membrana da clula, como o caso do oxignio molecular, metano e azoto.
Isto possvel devido a conformao fluda que a membrana apresenta, garantida pelos
movimentos dos fosfolpidos que a constituem.
Como foi anteriormente referido, as clulas no polares (hidrofbicas) tm uma maior
facilidade em atravessar a membrana citoplasmtica atravs da difuso simples. No entanto,
tambm possvel para as molculas de gua atravessar a membrana por difuso, apesar de
a via mais eficaz ser atravs de difuso facilitada por aquaporinas
A difuso simples negada a molculas de dimenses muito elevadas (glicose e
aminocidos), no lipossolveis e com carga (ies). Desta forma, a membrana atua como um
filtro (permeabilidade seletiva).
A difuso simples um tipo de transporte passivo, ou seja, que no implica gasto de energia
para o seu funcionamento. Assim sendo, as substncias que atravessam a membrana por
este meio esto a favor do gradiente de concentrao. Ou seja, estando um determinado
soluto em concentraes desiguais no meio extra e intracelular, este passa pela membrana
do meio mais concentrado (hipertnico) para o menos concentrado (hipotnico), at se
atinginr igual concentrao do referido soluto nos dois meios (meios isotnicos).
Difuso Facilitada
Transporte passivo (sem gasto de energia)
A favor do gradiente de concentrao (hipertnico
Interveno de protenas transportadoras da membrana
Canais proteicos formam uma passagem hidrofilica que atravessa a membrana.
Transportam gua ou tipos especficos de ies e de molculas pequenas
hipotnico)
hidrofbicas
Alguns canais inicos ficam abertos a maior parte do tempo; esses so denominados
canais no controlados.
23

A maioria dos canais inicos abre somente em resposta a sinais qumicos ou

eltricos especficos: so os canais controlados
Atravs da difuso facilitada, as molculas maiores, as molculas polares e os ies utilizam

estes canais proteicos para passarem do meio hipertnico para o meio hipotnico.
O transporte de outras substncias, tais como a
glicose e os aminocidos, necessitam de uma
protena carregadora (ou transportadora), mais
concretamente de uma protena uniportadora,
qual se vo ligar, e consequentemente provocar
uma alterao conformacional nesta, libertando
assim as substancias no lado oposto.
Velocidade na difuso facilitada maior do que a permitida pela difuso simples.
Isto ocorre, por exemplo, com a glicose, com alguns aminocidos e certas vitaminas.
Contudo, esta no proporcional concentrao da substncia. Aumentando-se a
concentrao, atinge-se um ponto de saturao. Quando todas as protenas
transportadoras esto a ser utilizadas, a velocidade no pode aumentar. Como
alguns solutos diferentes podem competir pela mesma permease, a presena de um
dificulta a passagem do outro.
Transporte Activo
O transporte ativo consiste na transferncia de substncias atravs de protenas que
atravessam a membrana plasmtica (transmembranares) contra o seu gradiente de
concentrao, com gasto de energia na forma de ATP.
Este tipo de transporte pode ser primrio ou secundrio. No caso de ser primrio, os
transportadores ativos primrios utilizam o ATP diretamente como fonte de energia para
impulsionar o transporte de ies e molculas, enquanto que se for secundrio, a energia
derivada, secundariamente, de gradientes inicos que foram criados, primariamente, por
transporte ativo primrio. Este transporte pode ainda ser feito de 2 maneiras diferentes, cotransporte (simporte) ao transportar simultneamente duas mulculas diferentes de soluto
na mesma direo ou contratransporte (antiporte) se transportar simultneamente duas
24

mulculas diferentes de soluto em direes opostas. Em

ambos os transportes, uma das molculas passa a favor do
gradiente de concentrao, fornecendo energia para que a
outra molcula seja transportada contra o gradiente de
concentrao
Bomba sdio-potssio: Para bombear Na+ contra o gradiente de concentrao (de baixas
concentraes de Na+ para altas concentraes de Na+) necessrio o gasto de energia.O
transporte ativo de Na+ para fora da clula e K+ para o interior da clula requer o uso de
ATPases que so as protenas enzimticas que decompem uma molcula de ATP num ADP
e o io fosfato(hidrlise).O gradiente de ies Na+ permite que as clulas musculares sejam
excitadas eletricamente e contraiam.
Entrada de Glicose por transporte ativo secundrio (simporte): A bomba sdio-potssio gera
um gradiente de ies sdio (estabelecido pelo transporte ativo primrio) que direciona o
transporte ativo secundrio da glicose nas clulas epiteliais do intestino. A glicose
transportada juntamente com o Na+ atravs da membrana plasmtica para dentro da clula
epitelial.
Transporte da gua
Potencial hdrico ( )
A gua no estado lquido um fluido cujas molculas esto em constante movimento. A
capacidade das molculas para se moverem num sistema particular depende da sua energia
livre, que quantificada atravs do potencial hdrico.
O movimento da gua ocorre de maneira espontnea ao longo de gradientes de energia
livre, desde regies onde a gua mais abundante , tendo assim maior energia livre (mais
), para zonas onde a energia livre da gua baixa (menos ).
A gua pura tem uma energia livre muito alta uma vez que todas as molculas podem
mover-se livremente!
25

Este o estado de referncia do potencial hdrico, a gua pura, sem interaces com os
outros corpos, a presso normal com um
igual a 0.
Quando a energia livre da gua maxima, o seu potencial nulo! medida que vo sendo
adicionados solutos soluo a energia livre diminui e o potencial hdrico toma valores cada
vez mais negativos , uma vez que as molculas de gua tm menos liberdade de movimento
devido presena de outras substncias.
Osmose e o Movimento da gua atravs de uma Membrana Seletivamente Permevel
O movimento de molculas de gua atravs de tal membrana conhecido como osmose. A
osmose envolve um fluxo de gua de uma soluo que tem maior potencial hdrico para
uma soluo com menor potencial (Figura 4-5). Na ausncia de outros fatores que
influenciam o seu potencial (como a presso), o movimento da gua por osmose, de uma
regio com menor concentrao de soluto (e assim maior concentrao de gua) para uma
regio com maior concentrao de soluto ( com menor concentrao de gua).
A presena de soluto diminui o potencial hdrico, criando um gradiente de potencial atravs
do qual se movimenta a gua. O potencial no afetado pela espcie especfica que est
em soluo, mas sim, pela quantidade e desta, ou seja , afetado apenas pela concentrao
do soluto.
Aquaporinas
As aquaporinas so protenas de canal de gua que aumentam a permeabilidade da
bicamada lipdica da membrana celular gua (facilta a osmose).
26

Estas protenas contm poros, seletivos para a gua, que permitem a passagem rpida
(molcula a molcula), mais rpida do que por difuso pela bicamada, desta molcula pela
membrana, por difuso facilitada (ligao por pontes de hidrognio). Normalmente esto
dispostas em arranjos tetramricos.
Apesar do movimento da gua atravs da membrana celular poder ocorrer diretamente
atravs da bicamada lipdica, em certas clulas a maior parte da passagem de gua pela
membrana facilitada por estas protenas integradas transmembranares, as aquaporinas.
As aquaporinas desempenham um importante papel e esto presentes nas membranas
onde necessria uma passagem rpida, por, por exemplo, desequilbrios osmticos, das
molculas de gua de modo a que essas clulas possam desempenhar corretamente as suas
funes.
Para alm de transportarem gua, algumas destas protenas podem transportar glicerol,
contribuindo, por exemplo, para o metabolismo dos lpidos nos mamferos. No entanto,
existe uma constrio central que impede a passagem de molculas maiores que a molcula
de H2O, alm de cadeias laterais de alguns aminocidos constituintes destas protenas que
so carregados positivamente e, por isso, repelem caties.
2. Case Study Tabaco- Ciclo Celular

1.Ciclo Celular
Nos organismos pluricelulares, os processos de crescimento e renovao

celular revestem-se de grande importncia, pelo que necessrio assegurar a
eficcia dos mecanismos de diviso celular. De facto, todas as clulas provm de
clulas pr-existentes, constituindo o processo mittico a forma de uma clula se
dividir em duas clulas-filhas geneticamente iguais entre si e clula que as
originou, a clula-me. Contudo, para que uma clula se possa dividir necessria
no s a replicao do seu DNA, mas tambm a reproduo de todos os outros
constituintes da clula. Assim, aps uma diviso, para que uma clula recmformada esteja pronta a dividir-se novamente, necessrio um perodo de
27

preparao. a esta alternncia de perodos de diviso e perodos de no diviso

que se chama ciclo celular.
Pode considerar-se que um ciclo celular consiste no conjunto de processos

que ocorrem numa clula viva entre duas mitoses. Tem como objectivos o
crescimento celular, a replicao do DNA, a distribuio dos cromossomas
duplicados pelas clulas-filhas e a diviso celular. A sua durao muito varivel
conforme o tipo de clula.
O ciclo celular compreende duas fases principais: a fase mittica, que inclui a
mitose e a citocinese, e a interfase, o perodo que decorre entre duas mitoses.
1.1 Interfase
A interfase corresponde ao perodo que decorre entre duas fases mitticas. um

perodo longo, podendo demorar horas, semanas, anos, ou mesmo perpetuar-se at
morte da clula. Caracteriza-se por uma intensa actividade biossinttica, que
conduz ao crescimento e maturao da clula. Desta forma, a interfase permite que
a clula se prepare para uma nova diviso celular. A interfase compreende trs
perodos: G1, S e G2.
G1
Inicia-se aps uma diviso celular.

a fase mais longa da interfase, apesar de ter uma durao muito varivel,
dependendo do tipo de clula.
Intensa actividade de sntese: so produzidas molculas de RNA, protenas e enzimas
e verifica-se a formao de organitos celulares.
Crescimento celular, condicionado pela actividade biossinttica.
H uma monitorizao por parte da clula das condies internas e externas e do
tamanho.
Forma-se o complexo pr-replicao, que se liga s origens de replicao do DNA.
A clula possui apenas um centrossoma.
Aps o perodo G1, algumas clulas prosseguem para a fase S, enquanto outras
entram numa fase de G0, permanecendo num estado denominado resting state.
28

G0
Algumas clulas saem do ciclo devido a condies intra ou extracelulares. Assim,

interrompida a diviso celular, por represso activa dos genes necessrios para a
mitose. Estas clulas permanecer no chamado resting state.
No estado G0, as clulas, apesar de no terem capacidade de diviso, possuem um
metabolismo activo, ocorrendo, por exemplo, sntese proteica.
Pode ser temporrio - estado quiescente -, sendo possvel atravs de estmulos
externos fazer com que a clula retome o ciclo, ou permanente, em clulas altamente
diferenciadas.
O perodo S caracterizado pela replicao semiconservativa, bidireccional, de 5 para

3, do DNA, em que cada molcula de DNA origina duas molculas filhas idnticas.
D-se a sntese de histonas que se associam s molculas de DNA, formando-se
cromossomas constitudos por dois cromatdeos ligados pelo centrmero.
Os filamentos de cromatina adquirem uma estrutura dupla, com baixo nvel de
condensao.
Inicia-se a replicao dos centrolos.
G2
O perodo G2 tem lugar aps a replicao do DNA e ocorrem processos de verificao

da qualidade do DNA formado.
Verifica-se a sntese de protenas e a produo de estruturas membranares, a partir
das molculas sintetizadas em G1.
D-se ainda a sntese de molculas necessrias para a diviso celular como os
centrolos.
Nesta fase j h o dobro da quantidade de DNA presente na clula original, sendo os
cromossomas bem visveis em microscopia ptica.
1.2.
Fase Mittica
No final do perodo G2, inicia-se a mitose, o processo que permite que um

ncleo se divida, originando dois ncleos-filhos, cada um contendo uma cpia de
todos os cromossomas do ncleo original. Esta diviso nuclear seguida de uma
diviso do citoplasma, a citocinese, que, em conjunto com a mitose, garante a
diviso celular.
Na mitose distinguem-se cinco fases: profase, prometafase, metafase, anafase e
telofase.
29

Profase: d-se a condensao do DNA, apresentando-se sob a forma de

cromossomas. Ocorre tambm o incio da formao do fuso acromtico
por parte dos microtbulos, a partir dos centrossomas.
Prometafase: ocorre a desintegrao do invlucro nuclear. Os
microtbulos iniciam a ligao aos cromossomas, atravs dos
cinetocoros, pelo que os cromossomas se comeam a alinhar na linha
equatorial da clula.
Metafase: caracteriza-se pelo alinhamento dos cromossomas a nvel do
plano equatorial da clula, equidistantes dos plos do fuso acromtico.
Anafase: ocorre a separao dos cromatdeos, processo que implica a
activao do complexo promotor da anafase (APC), que sinaliza a
destruio de ciclinas e da securina, o que leva activao da separasse,
enzima responsvel pela degradao das coesinas. Esta degradao leva
separao dos cromatdeos irmos e a sua migrao para plos opostos
da clula, devido aco dos microtbulos. Podem distinguir-se duas
etapas: a Anafase A, em que se verifica a separao dos cromatdeos
irmos e o incio do seu movimento e a anafase B, em que se verifica a
segregao destes cromatdeos para cada plo da clula.
Telofase: caracteriza-se pela regenerao do invlucro nuclear,
desintegrao do fuso acromtico e desagregao dos cromossomas.
A citocinese o processo, que permite a diviso do citoplasma atravs de um anel
contrctil constitudo por filamentos de actina e miosina. Inicia-se aquando da
anafase e termina com o final da telofase, pelo que ocorre paralelamente mitose.
30

2. Controlo do Ciclo Celular
Na dcada de oitenta assistiu-se a um progresso notvel no conhecimento da

biologia celular, com a identificao de protenas-chave responsveis pela regulao
do ciclo celular. O sistema de controlo do ciclo celular atua de forma eficaz, rigorosa
e metdica numa sequncia de processos bioqumicos, sendo capaz de contornar
condies do meio adversas, de se adaptar s necessidades especficas de cada
clula e de responder de forma eficaz a sinais provenientes dos meios intra e
extracelulares.
Na maioria das clulas eucariticas o sistema de controlo celular assenta em
trs transies regulamentares, os checkpoints:
1. O primeiro checkpoint (Start Checkpoint) ocorre no final da fase G1/S,
quando a clula se prepara para iniciar a replicao do DNA. Este o ponto
mais importante da regulao do ciclo celular, uma vez que decidido se a
clula inicia um novo ciclo celular ou se fica bloqueada no estdio G0.
2. O segundo checkpoint o G2/M, tendo lugar entre as fases G2 e M, quando a
clula inicia a mitose, encarregando-se de confirmar se o meio favorvel ao
prosseguimento do ciclo e se todo o material gentico se encontra duplicado.
3. O terceiro checkpoint ocorre na transio da metfase para a anafase,
responsabilizando-se por verificar se os cromossomas se encontram
devidamente alinhados na placa equatorial e presos ao fuso acromtico.
Se for detetada alguma anomalia ou irregularidade justificvel no interior ou no

exterior da clula em cada um dos checkpoints, o ciclo celular imediatamente
bloqueado, sendo apenas retomado aquando do restabelecimento de condies
favorveis.
CDKS - CINASES DEPENDENTES DE CICLINAS

As principais protenas que controlam o ciclo celular so as ciclinas (estas s se tornam
activas quando ligadas a cinases protenas que fosforilam outras protenas e activam-nas
e a sua concentrao varia de forma cclica no ciclo celular), as protenas cinases
dependentes de ciclinas (CDKs protenas cinases do ciclo celular, sempre presentes mas
31

podem no estar sempre activas) e as protenas inibidoras (CKI) que actuam sobre as
protenas-cinases dependentes das ciclinas.
Assim sendo, as protenas cinases podem formar complexos moleculares CDK - ciclinas,
quando associados a ciclinas. Na verdade, as ciclinas activam e controlam a capacidade das
CDK para fosforilar determinadas protenas alvo. Desta forma, podemos referir a existncia
de cinases heterodimricas (2 subunidades distintas mas dependentes), sendo estas
constitudas por ciclinas (subunidade reguladora) e cinases dependentes de ciclinas (CDKs subunidade cataltica). Como consequncia, se as protenas cinases dependentes de ciclinas
no estiverem associadas a ciclinas, no tm qualquer funo no ciclo celular.
Por outro lado, como j foi referido, a concentrao das ciclinas varia ao longo do ciclo,
variando a sua aco sobre as CDKs e, consequentemente, sobre o ciclo celular. Desta
forma, podemos destacar a interveno deste complexo em trs momentos do ciclo celular
das clulas eucariticas:
1. G1/S As ciclinas activam as CDKs no final da fase G1, conduzindo a clula

entrada no ciclo celular. A sua concentrao acaba por decrescer na fase S.
2. S As ciclinas libertam-se das CDKs e ajudam na duplicao dos
cromossomas. A sua concentrao permanecer elevada at fase mittica,
e estas tambm so fundamentais para alguns fenmenos que conduziro a
clula mitose.
3. M As ciclinas activam as CDKs, o que estimula a entrada da clula na fase
mittica no checkpoint G2/M. De seguida, estas acabaro por ser destrudas
mais tarde.
Na maioria das clulas, existe um terceiro grupo de ciclinas que actua na fase G1,
ajudando a controlar a actividade das ciclinas no momento G1/s.
Desta forma, podemos distinguir quatro diferentes complexos molculas de ciclinasCDK: G1-CDK; G1/S-CDK; S-CDK; M-CDK.
Para alm disso, importante referir que as protenas ciclinas no activam
simplesmente todas as protenas dependentes de ciclinas, pensa-se que estas
actuam em CDKs especficas. Consequentemente, cada complexo molecular CDKciclina ir fosforilar um substrato distinto, podendo estes complexos induzir
32

diferentes efeitos em diferentes momentos do ciclo. Finalmente, a completa

ativao destes complexos moleculares ocorre atravs da interveno da protena
CAK (CDK-activating kinase), que fosforila a CDK, causando-lhe uma pequena
alterao conformacional e aumentando ainda mais a actividade da CDK,
permitindo-lhe fosforilar a sua protena alvo.
INIBIO DAS CDKs

O aumento e a diminuio da concentrao de ciclinas o primeiro factor
determinante para a actividade das CDKs. Contudo, existem tambm outros
mecanismos que inibem a aco das CDKS:
CKI - protenas inibidoras que actuam nas protenas cinases dependentes de
ciclinas, impedindo-as de realizar a sua funo.
Fosforilao - a fosforilao de um aminocido pode inibir a a actividade das CDKs.
A protena responsvel por esta fosforilao designa-se Wee1. Para reverter este
fenmeno, a CDK sofre uma desfosforilao por parte da protena Cdc25.
Concluindo, estes complexos moleculares tm um papel fundamental nos diferentes
checkpoints.
CHECKPOINTS
Fase G1
A progresso em G1 regulada por dois checkpoints:
- Ponto de Restrio;
- Checkpoint de danos no DNA em G1.
Ambos os checkpoints esto ausentes em vrias clulas tumorais, sendo que estas
continuam a proliferar-se na ausncia de sinais ambientais favorveis ou com danos no DNA.
33

Fase S
medida que as protenas replicam o DNA, elas vo sendo inactivadas de modo a prevenir
que o DNA possa ser replicado mias do que uma vez por cada ciclo celular.
Fase G2
Existem um checkpoint de danos no DNA, prevenindo a entrada em mitose na presena de
DNA no replicado ou danificado (defeitos neste mecanismo de controlo pode levar ao
aparecimento de cancro).
Checkpoint de danos no DNA em G1:
Impede a progresso no ciclo celular na
presena de erros no DNA;
A protena supressora de tumores p53
gene regulatrio essencial neste
checkpoint (encontra-se mutada em cerca
de 50% dos cancros humanos);
Os nveis de p53 so regulados pela
protena
Mdm2,
que
promove
degradao da p53 quando os seus nveis

so elevados;
Em situaes normais, a Mdm2 liga-se
p53, levando sua degradao no
proteossoma;
Na presena de danos no DNA, a p53 fosforilada pela cnase ATM, estabilizandose. Isto impede que Mdm2 se ligue p53 e que esta seja degradada. A p53 um
factor de transcrio que, quando estabilizado, promove a transcrio da protena
p21. Esta inibe os complexos ciclina-CDK em G1, essenciais para que a clula possa
entrar na fase S. Desta forma, nveis elevados de p53 impedem a clula de entrar na
fase S, permitindo-a corrigir os danos presentes no seu DNA.
34

Checkpoint de danos no DNA em G2:

Impede a entrada em mitose de clulas com DNA danificado em G2 ou em caso de
replicao incompleta;
Este atraso possibilita a clula a correco dos erros no DNA antes de entrar em
mitose;
Caso os danos no sejam possveis de reparar, a clula desencadeia um mecanismo
de morte celular entra em apoptose;
O checkpoint de danos no DNA da fase G2 envolve trs componentes: sensores
(Rad1, Rad 9), transmissores (cnases como ATM) e efectores (Chk1);
Quando existem danos no DNA ou no caso de a replicao ter sido incompleta, as
protenas de checkpoint ATM e Rad 1/9 fosforilam a protena Chk1, activando-a.
Esta, por sua vez, fosforila a Cdc25, inactivando-a. Como Cdc-25 activa tem um
importante papel na entrada da clula em mitose, a sua inactivao leva a que a
clula fique mais tempo em G2 para que tente corrigir os danos verificados a nvel
do seu DNA.
Fosfatases: desfosforilam
Cinases: fosforilam
Transio G2 Metafase-Anafase:
Nesta atua o compelxo APCCdc20, cujo mecanismo de regulao se baseiam no
alinhamento correto, ou no, dos cromossomas na linha equatorial. Como
checkpoint haver ento sensores que reconheam este tipo de erros, inibindo,
35

ento, o complexo acima mencionado, que quando est ativo promove a segregao
dos cromossomas.
CKI: resulta da expresso

do gene p27.
Genes
Os genes que podero dar origem a cancro podem ser classificados em dois grupos:
genes que sofreram o ganho de funo (isto , aps a sua expresso) e genes que
perderam a sua funo, sendo que esse ganho ou perda contribuiu para a
desrugulao do ciclo celular e no foi possvel o seu controlo.
Como mutaes que resultam do ganho de funes temos o caso dos oncogenes.
36

Proto-oncogenes
Proto-oncogenes so genes que podem ter diferentes funes na clula. Alguns
deles tm como funo emitir sinais que levam diviso celular, regular a apoptose,
ou at sinalizao de enzimas.
As enzimas sinalizadas no interior da clula, ativam protenas especiais chamadas
fatores de transcrio, no interior do ncleo. Estes fatores, ativam os genes
necessrios para o crescimento celular e a sua proliferao.
A exposio a radiaes e a certas substncias, como alguns qumicos, pode
contribuir para a ocorrncia de mutaes nos genes.
Oncogenes
Os proto-oncogenes, como foi anteriormente referidos, so genes que participam no
controlo da diviso celular, e na sntese de protenas fundamentais para o
funcionamento celular. Estes genes so assim classificados uma vez que, quando
mutados, exibem um alto risco de ocorrncia de tumor. Quando estes genes sofrem
certos tipos de mutao podem converter-se em oncogenes. Sabe-se que a ativao
de um nico oncogene, na maior parte dos casos, insuficiente para dar origem a
uma neoplasia.
(Joo: Mas antes as clulas normais tm que se tornar pr-cancergenas.)
(Maria: Sabes qual a diferena entre as clulas normais e as cancergenas, ou entre
as clulas normais, cancergenas e pr-cancergenas?)
O ciclo celular assegurado atravs da funo de vrios genes, que codificam
protenas com grande importncia para o correto funcionamento de todo o
processo. Quando estes genes sofrem mutaes podem originar protenas com
funes diferentes das normais, possuindo caractersticas oncognicas.
De forma geral, os proto-oncogenes esto fortemente relacionados com a ativao
de etapas do ciclo celular, atuando no momento certo, de forma a assegurar o
sucesso da diviso celular. Quando estes genes sofrem mutaes, pode surgir um
37

oncogene, que codifica a mesma protena em quantidades exageradas, ou outra que

induz o ciclo celular mesmo nos momentos onde isso no suposto. Desta forma, o
risco que as clulas tm de entrar num crescimento descontrolado mais elevado,
podendo provocar tumores.
De entre as alteraes que os proto-oncogenes podem sofrer que levam a
converterem-se em oncogenes, destacam-se: - Amplificao gentica (1)
- Rearranjo dos cromossomas (2)
- Mutao reguladora (3)
-Mutao Pontual na sequncia nucleotdica de DNA (4)
1- A protena normal sintetizada em quantidades exageradas devido a erros
no momento da transcrio, em que so feitas demasiadas cpias dos genes
em causa.
2- A alterao da regio do gene que codifica uma determinada protena,
resultante da quebra e reajuste da molcula de DNA, pode provocar a sntese
de uma protena de fuso com funes diferentes da normal.
3- Quando h mutao na sequencia do DNA reguladora desse gene, a protena
pode ser produzida exageradamente.
4- Quando ocorre uma mutao numa sequencia codificadora de protenas, h
a produo de uma protena com caractersticas oncognicas.
Genes supressores de tumores

As mutaes do tipo de perda de funo ocorre geralmente em genes supressores
de tumores. Estes so genes que codificam protenas que vo ter um papel
fundamental na regulao do ciclo celular, controlando a proliferao da clula.
Torna-se mais fcil de explicar a partir de um exemplo, neste caso vamos falar do
modelo retinoblastoma.
38

3. Case Study- Vias De sinalizao
Sinalizao Intracelular
INTRODUO
A clula responde a sinais extracelulares produzidos por outras clulas ou por elas
mesmas. Este mecanismo, sinalizao celular, permite comunicao clula a clula,
sendo necessrio para a regulao funcional e para a integrao de organismos
multicelulares.
A comunicao entre as clulas mediada principalmente por molculas
sinalizadoras. Estas diferenciam-se entre si pelos seus mecanismos de aco, pelas
suas diferentes clulas alvo e pelos seus tipos de
receptores, podendo estes ser membranares ou
citoplasmticos.
Quando uma molcula sinalizadora se liga ao seu
recetor, d-se a activao do seu recetor que por sua
vez ativa uma cascata de sinalizao intracelular
mediada por uma sria de protenas sinalizadoras. Por
ultimo estas protenas sinalizadoras alteram a
actividade da protena efectora, o que resulta numa
alterao do comportamento da clula.
Devido ao seu papel no controlo do crescimento normal e diferenciao da clula,
as molculas sinalizadoras tm uma importncia acrescida no que toca
investigao do cancro.
39

FASES DA SINALIZAO INTRACELULAR

Na sinalizao intracelular distinguem-se trs fases principais:
Receo: Ativao de um recetor pelo seu ligando (cada recetor tem
afinidade expecfica para um s ligando, ou para um grupo restrito de
ligandos);
Transduo: O rector altera a sua forma e consequentemente, h alterao
conformacional e/ou estrutural de outras protenas celulares (o sinal
extracelular convertido numa resposta intracelular);
Resposta: Modificao do metabolismo, da funo ou do desenvolvimento
celular acionada pelo complexo sinal-receptor.
MOLCULAS SINALIZADORAS OU LIGANDOS
So responsveis pelo controlo do metabolismo, crescimento e diferenciao dos

tecidos, sntese e secreo de protenas e composio dos fluidos extra e
intracelulares.
H uma grande variedade de molculas sinalizadoras que se ligam aos receptores,
podendo ser:
Pptidos: hormonas peptdicas (insulina, glucagon e hormonas secretadas
pela hipfise), neuropeptidos (secretados pelos neurnios, como por
exemplo endorfinas) e factores de crescimento (que controlam o
crescimento celular e diferenciao)
Neurotransmisores: este tipo de molculas so libertados pelos neurnios e
atuam ao nvel dos receptores celulares presentes nos neurnios ou outro
tipo de clulas alvo, como por exemplo clulas musculares. A libertao de
neurotransmissores por parte dos neurnios leva a um potencial de aco.
Gases: como o caso do xido ntrico e do dixido de carbono.
Eicosanides e Leucotrienos: estes so lpidos que contem molculas de
sinalizao celular.
40

A ligao das molculas sinalizadoras pode ocorrer por difuso (quando se

trata de ligao a receptores intracelulares, acontece com molculas
hidrofbicas), transporte por protenas transmembranares (para o interior da
clula, acontece com molculas sinalizadoras hidroflicas), ou por ligao a
recetoreas da superfcie celular (maior parte das molculas sinalizadoras)
TIPOS DE SINALIZAO
So considerados 4 grandes grupos de sinalizao clula a clula, tais como:
Endocrina: A molcula de sinalizao uma hormona que sintetizada e
secretada por clulas endcrinas e posteriormente transportadas pelos
sistema circulatrio e atuando em clulas-alvo distantes do seu local de
sntese.
Parcrina: mediado por uma molcula de sinalizao que atua localmente
regulando
comportamento
de
uma
clula
prxima.
Exemplo:
nurotransmisores na transmio de sinal clula nervosa-clula nervosa.

Autcrina: As clulas respondem a molculas de sinalizao produzidas por
elas mesmas.
Por protenas integrais da membrana: neste caso, as molculas sinalizadoras
so protena integrais da membrana localizadas na superfcie da clula. As
protenas membranares de uma clula ligam-se a receptores ligados na
superfcie da clula alvo adjacente desencadeando uma cascata de
acontecimentos.
41

RECETORES
Os receptores so responsveis por reconhecer a molcula sinalizadora, mesmo
quando esta se encontra em baixas concentraes (isto devido sua grande
afinidade a estas). Estes podem ser:
Receptores intracelulares: activados por ligandos hidrofbicos (apolares),
capazes de atravessar a membrana plasmtica. Uma vez no interior eles
regulam directamente actividade de protenas intracelulares especificas.
Exemplos de ligandos hidrofbicos so o xido ntrico e as hormonas e
esterides.
Recetores superficiais: activados por ligandos hidrofilicos (polares), existem

na superfcie celular. As molculas sinalizadoras ligam-se a especficos
receptores proteicos ao nvel da membrana das clulas alvo, influenciano-as
sem penetrar no citoplasma ou no ncleo.
Canais inicos ou ianotrpicos: Esto envolvidos na rpida sinalizao

sinptica entre clulas nervosas e outras electricamente excitveis (clulas
alvo), tais como clulas musculares ou nervosas. So formados por protenas,
que abrem ou fecham como resposta a estmulos de neurotransmissores
alterando assim a permeabilidade inica da membrana plasmtica.
Receptores associados s protenas G: Quando uma molcula sinalizadora

como a epinefrina se liga a uma protena receptora da superfcie celular, esta
ativa a protena G associada recetora no interior da clula. A protena G
estimula a Adenil ciclase a produzir grandes quantidades de cAMP a partir de
ATP no interior da clula. O cAMP liga-se posteriormente a protena alvo (kinase) que fosforiliza protenas especificas na clula. O efeito desta
fosforilao depende da identidade da clula e das protenas que so
fosforiladas.
42

Receptores enzimticos ou catalticos: funcionam directamente como

enzimas ou associam-se directamente com as enzimas que ativam. So
protenas transmembranares onde o seu local de ligao ao ligando se
encontra no exterior da clula, no entanto, o seu local de ligao
enzima/cataltico econtra-se no interior da clula.
Molculas Sinalizadoras
A mensagem recebida pelo recetor composta por vrias molculas
intracelulares sinalizadoras. Estas podem ser segundos mensageiros (Camp ou ca2+)
ou protenas sinalizadoras intracelulares. A cadeia resultante de eventos
sinalizadores intracelulares provoca uma alterao nas protenas efetoras
responsveis por modificar o comportamento da clula.
Via do xido ntrico

As vias de sinalizao esto dependentes de molculas sinal. Embora a maioria dos
sinais extracelulares sejam molculas hidroflicas que se ligam a receptores na
superfcie da clula-alvo, algumas destas molculas so suficientemente hidrofbicas
e/ou pequenas para atravessar a membrana plasmtica da clula-alvo. Neste caso,
as molculas-sinal, uma vez no interior da clula, ligam-se a receptores
intracelulares. Um exemplo deste tipo de molcula-sinal o gs xido ntrico (NO).
Desta forma, ao ligar-se a receptores intracelulares, o NO sinaliza pela regulao
directa da actividade de protenas especficas dentro da clula-alvo. O NO um
ligante parcrino, porque actua na proximidade da clula que o produziu ou
difundiu.
Muitos tipos de clulas nervosas utilizam o NO para enviar sinais s clulas vizinhas.
O NO libertado pelos nervos autnomos do pnis, neste caso, tem como funo o
relaxamento da musculatura lisa, nomeadamente nas paredes dos vasos sanguneos,
43

causando a vasodilatao local, responsvel pela ereco. Vamos ento explicar esta
via de sinalizao.
Via de Sinalizao do xido Ntrico
1.O NO funciona como a molcula-sinal ou ligando. produzido maioritariamente

nas clulas endoteliais, que revestem o interior dos vasos sanguneos, especialmente
dos capilares sanguneos. As clulas endoteliais contm um G0 protein-coupled
receptor, que fixa a acetilcolina e activa a fosfolipase C, levando a um aumento da
concentrao de Ca2+ citoslico. A activao do complexo Ca2+/calmodulina (a
calmodulina uma protena citoplasmtica que, quando ligada ao Ca2+, forma um
complexo que interage com vrias enzimas e outras protenas, modulando a sua
actividade) estimula a actividade da NO sintase, uma enzima que catalisa a formao
do NO a partir de O2 e do aa arguinina. Uma vez que o NO tem um pequeno tempo
de meia-vida, ele apenas pode difundir para clulas musculares vizinhas, onde
desencadeia o relaxamento muscular.
44

2.
Como o NO dissolvido atravessa a membrana plasmtica, difunde-se para
fora da clula onde foi sintetizado e para o interior das clulas vizinhas. Actua
apenas localmente, uma vez que pode ser rapidamente convertido, na matriz
extracelular, em nitratos e nitritos, pelo O2 e H2O.
3.
Como molcula-sinal, o NO vai ligar-se a um receptor nas clulas-alvo. Nas
clulas musculares lisas, o receptor a enzima Guanilil-ciclase (GC). Atravs da

ligao do NO ao ferro no centro activo desta enzima Guanilil-ciclase, forma-se o
complexo activo NO-Guanilil-ciclase.
4.
A Guanilil-ciclase, quando activada, catalisa a reaco que transforma o GTP
(guanosina trifosfato) em cGMP (GMP cclico ou Guanosina monofosfato cclica),

uma pequena molcula sinalizadora intracelular. Assim, o NO pode aumentar o
cGMP no citosol em segundos. Contudo, esta produo de cGMP pela Guanililciclase equilibrada pela aco de uma fosfodiesterase PDE5 que degrada o
cGMP assim que a molcula sinal j no se encontra presente.
5.
O cGMP, por sua vez, actua como segundo mensageiro, activando a protena
PKG (Protena cinase dependente de cGMP). A PKG, como protena cinase, fosforila
outras protenas. A fosforilao das mesmas ter consequncias a nvel da
concentrao celular.
As setas que ligam a PKG a uma protena indicam que a fosforilao dessa protena
mediada pela PKG estimula a sua actividade biolgica. Uma barra inibitria indica
que a fosforilao de determinada protena mediada por PKG inibe ou impede a
aco biolgica dessa protena.
45

a.
PKG fosforila uma protena inibidora da actividade dos receptores de IP3,
inibindo a libertao de clcio dos compartimentos intracelulares, como o retculo

endoplasmtico. Assim, a aco da PKG promove a sequestro de clcio, levando
diminuio da sua concentrao no citoplasma.
b.
PKG fosforila a protena fosfo-lamban (P-lamban), diminuindo a sua aco
inibitria sobre a ATPase de clcio do retculo sarcoplasmtico, o retculo

endoplasmtico das clulas musculares, levando a um sequestro de clcio neste
retculo.
c.
Promove a abertura dos
canais K+, permitindo a sada

deste para o meu extracelular, o
que provoca a hiperpolarizao
da
membrana.
Esta
hiperpolarizao vai-se refletir a

nvel
dos
canais
de
Ca2+,
impedindo o seu influxo, entrada

para a clula.
d.
Por fim, este inclusive,
promove a dessensibilizao de recetores responsveis pela produo e mobilizao

do Ca2+, havendo uma conseuqente dessensibilizao da molcula.
Os Ca2+ regulam a contraco das clulas musculares lisas. Ligam-se a uma enzima,
chamada cinase da cadeia leve da miosina (MLCK). Esta tem a capacidade de
fosforilar a cadeia leve da miosina, utilizando ATP, e levando contraco muscular.
Na ausncia de Ca2+, a enzima fosfatase da cadeia leve de miosina, remove o grupo
fosfato e a miosina torna-se inactiva, levando ao relaxamento muscular.
Assim, a resposta final da via de sinalizao o relaxamento das clulas musculares
lisas, associado vasodilatao, que permite manter o pnis erecto.
46

Nota: Ca2+ tambm considerado um segundo mensageiro nesta via de sinalizao

Assim, podemos resumir o papel do NO da seguinte forma: A acetilcolina, libertada
pelos terminais nervosos na parede do vaso sanguneo, activa as enzimas NOS das
clulas endoteliais que revestem o vaso, induzindo a produo de NO a partir de
arginina. O NO funciona como molcula-sinal ou primeiro mensageiro. Difunde-se
para fora das clulas endoteliais e para dentro das clulas musculares lisas, onde se
liga GC, o receptor, activando-a, com consequente produo, a partir de GTP, de
cGMP, um segundo mensageiro. Este activa a protena PKG, que por sua vez,
fosforila as protenas da via de sinalizao, utilizando ATP. Estas tornam-se
fosfoprotenas e vo desencadear uma resposta: a diminuio dos nveis de Ca 2+ no
sangue, que se traduz pelo aumento do fluxo sanguneo, pelo relaxamento das
clulas musculares lisas e pela vasodilatao.
As setas do diagrama vo aumentado de espessura porque ocorre uma amplificao
do sinal.
Nota: Nitroglicerina um agente farmacolgico usado no tratamento de doenas
cardacas que convertido em NO.
Concluso: O mau funcionamento de uma etapa da cadeia de sinalizao suficiente
para comprometer todo o mecanismo prvio ereco.
O bloqueio da cadeia pode ocorrer antes desta ter inicio, isto , se ocorrer ao nvel
das clulas nervosas do Endotlio, ou ja na propria cascata celular podendo estar
ligada actuao da PDE5, do receptor GC, ou da PKG.
Ginseng
Ginseng uma substncia encontrada no ch que afecta o xido ntrico que entra na
clula. O Ginseng consegue aumentar a quantidade de xido ntrico (NO) secretado,
o que levaria a um aumento na produo de cGMP.Os efeitos da cGMP so
mediados por uma protena kinase cGMP-dependente, a protena kinase G (PKG).
Nas clulas musculares lisas, a protena kinase G activa uma via sinalizadora que
47

resulta na inibio do complexo actina-miosina, relaxamento da clula e,

consequentemente, vasodilatao, levando a ereco.
Viagra
O relaxamento muscular permite a ocorrncia de erees. Este relaxamento

est diretamente ligado presena de GMPc, guanosina monofosfato cclica, uma
pequena molcula sinalizadora intracelular. A concentrao de GMPc equilibrada
pela atividade de Guanil-ciclase e PDE5 um inibidor da GMPc.
Num caso de disfuno ertil, o medicamento tem que ser capaz de
aumentar a quantidade de NO ou eliminar o PDE5 do pnis para que os nveis de
cGMP aumentem normalmente e se d o relaxamento muscular.
O Citrato de Sildenafina, vendido com o nome de Viagra, inibe a
fosfodiesterase no pnis (PDE5) aumentando o tempo de permanncia de GMPc em
nveis elevados na musculatura lisa peniana. Poder se afirmar que o Viagra um
inibidor do inibidor. O viagra tem uma estrutra molecular semelhante do cGMP,
por essa razo liga-se ao centro ativo da PDE5, tal como a cGMP, inibindo a ligao
da PDE5 com o cGMP por inibio competitiva1. Assim, sem existncia de inibidores
de GMPc ativos, este composto atua nas PKG, protena cinase dependente de GMPc,
que por sua vez permitem a diminuio de concentrao de Ca2+ por processos
variados que foram abordados anteriormente. O decrscimo na concentrao deste
io promove o relaxamento muscular, a vasodilatao e, consequentemente, o
aumento do fluxo sanguneo, causando a ereo.
48

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Servem como catalisadores que mantm os processos metablicos.

Servem como elementos estruturais dentro e fora da clulas.

Expresso gentica Regulao

Manipulao na expresso e transcrio de DNA e RNA.

Processos de avaliao de protenas:

A amostra de soro e plasma colocada numa soluo tampo (alcalina) de modo a

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O sangue constitudo por Plasma (componente fluda), e constituintes slidos.

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Cultura de Clulas ( aula prtica )

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Permite separar as clulas do liquido sobrenadante permitindo que estas se

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todas as clulas viveis

observadas nos quadrados (A,B,C,D).

resultado ser utilizado no clculo da

Clculo da concentrao celular:

Nr.de Clulas Contadas________0,1 l (Volume de cada quadrado (A,B,C,D))

Nr. Clulas Contadas *

= Nr. Clulas Contadas * 1

TESTE PRTICO 1 MATRIA PRTICA 2014/2015

Clculo das percentagens