Mahadma Bhima Whinata

Tiara Sustriani Putri

KROMATOGRAFI KOLOM

1. Pengertian Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk

memurnikan bahan kimiatunggal dari campurannya. Metode ini sering
digunakan untuk aplikasi preparasi pada skala mikrogram hingga kilogram.
Keuntungan utama kromatografi kolom adalah biaya yang rendah dan
kemudahan membuang fasadiamyang telah digunakan. Kemudahan
pembuangan fasa diam ini mencegah kontaminasi silang dan degradasi fasa
diam akibat pemakaian ulang atau daur ulang.
Kromatografi kolom preparatif klasik berupa tabung kaca dengan
diameter antara 5 mm hingga 50 mm dengan panjang 5 cm hingga 1 m
dengan keran dan pengisi (dengan sumbat kaca atau serat kaca untuk
mencegah hilangnya fasa diam) pada bagian bawah. Dua metode yang
umum digunakan untuk preparasi kolom adalah metode kering dan metode
basah.

Pada metode kering, kolom pertama kali diisi dengan serbuk

kering fasa diam, kemudian kolom dialiri fasa gerak hingga
seluruh kolom terbasahi. Mulai titik ini, fasa diam tidak
diperkenankan mengering.

Pada metode basah, fasa diam dibasahi dengan fasa

gerak hingga menjadi bubur di luar kolom, dan kemudian
dituangkan perlahan-lahan ke dalam kolom. Pencampuran dan
penuangan harus ekstra hati-hati untuk mencegah munculnya
gelembung udara. Larutan bahan organik diletakkan di bagian
atas fasa diam menggunakan pipet. Lapisan ini biasanya ditutup
dengan lapisan kecil pasir atau katun atau wol kaca untuk
melindungi bentuk lapisan organik dari tuangan eluen. Eluen
kemudian dialirkan perlahan melalui kolom sambil membawa
sampel bahan organik. Sering kali, wadah eluen sferisataucorong
pisah bersumbat yang sudah diisi eluen diletakkan di bagian atas
kolom.

Komponen-komponen tunggal tertahan oleh fasa diam secara berbeda

satu sama lain pada saat mereka bergerak bersama eluen dengan laju yang
berbeda melalui kolom. Di akhir kolom, mereka terelusi satu per satu.
Selama keseluruhan proses kromatografi, eluen dikumpulkan sesuai fraksifraksinya. Fraksi-fraksi dapat dikumpulkan secara otomatis oleh pengumpul
fraksi. Produktivitas kromatografi dapat ditingkatkan dengan menjalankan
beberapa kolom sekaligus. Di sini, diperlukan pengumpul multi aliran.
Komposisi aliran eluen dapat dimonitor dan masing-masing fraksi dianalisa
senyawa terlarutnya, misalnya dengan kromatografi, absorpsi
sinar UV atau fluoresensi. Senyawa berwarna (atau senyawa berfluoresensi
di bawah lampu UV) dapat terlihat di dalam kolom sebagai pita-pita
bergerak.

2. Tujuan kromatografi kolom

Untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Metode

pembuatan kolom terbagi menjadi 2 yaitu untuk metode kering, kolom
pertama diisi dengan kering fase diam bubuk, diikuti dengan penambahan
fase mobile. Metode basah, sebuah bubur disiapkan dari eluent dengan fase
diam bubuk dan kemudian dengan hati-hati dituangkan ke dalam kolom.
Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau dengan kapas
atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru
ditambahkan eluent. Eluent perlahan-lahan melewati kolom untuk
memajukan bahan organik.

3. Prinsip pemisahan kromatografi kolom

Didasarkan pada afinitas kepolarananalite dengan fase diam,

sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase
diam. Pada sebagian besar kromatografi kolom menggunakan fase diam
yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-polar dengan begitu waktu
retensi akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak
akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang
kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran
eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau
dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai
dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan
kompresi (misalnya udara,nitrogen, argon) untuk mendorong pelarut melalui
kolom.
Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel
atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam
kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga
sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa)
ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut
berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang
teradsorbsi oleh adsorben (fasastationer). Selama perjalanan turun, zat

terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju

penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada
koefisien partisi masing-masing zat terlarut.

4. Fasa Diam

Fasa diam atau adsorben (penjerap) dalam kromatografi kolom adalah

zat padat. Fasa diam yang paling umum untuk kromatografi kolom
adalah silika gel, diikuti dengan alumina. Serbuk selulosa pernah banyak
digunakan. Kromatografi kolom memungkinkan melakukan
teknikkromatografi pertukaran ion, kromatografi fasa terbalik, kromatografi
afinitas, ataupenjerapanbed ekspansi (bahasa Inggris:expanded bed
adsorption, EBA). Fasa diambiasanya serbuk halus atau gel dan/atau
mikropori untuk peningkatan permukaan, meskipun dalam EBA digunakan
bedberfulida. Ada rasio penting antara berat fasa diam dan berat kering
campuran analit yang dapat diaplikasikan ke dalam kolom. Untuk kolom
silika, rasio berada antara 20:1 hingga 100:1, bergantung pada kedekatan
jarak elusi antar komponen analit.

5. Fasa Gerak (eluen)

Fasa gerak atau eluen dapat berupa pelarutmurni atau campuran

pelarut. Pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilaifaktor
retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk
meminimalkan waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama

kromatografi. Eluen dapat pula dipilih berdasarkan daya pisahnya sehingga

senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif. Optimasi eluen
dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya
menggunakan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa gerak yang sama.
Ada laju aliran optimum untuk masing-masing pemisahan. Semakin
cepat laju aliran eluen akan meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk
melalui kolom sehingga meminimalkan difusi, menghasilkan pemisahan yang
lebih baik. Namun, laju aliran maksimum perlu dibatasi karena analit
memerlukan waktu tertentu untuk berada pada kesetimbangan antara fasa
diam-fasa gerak, lihat persamaan Van Deemter. Kolom laboratorium
sederhana bekerja dengan prinsip aliran gravitasi. Laju aliran kolom
semacam ini dapat dinaikkan dengan menambah eluen baru di bagian atas
fasa diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di bagian bawah. Laju
aliran yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan pompa atau
gas bertekanan (misalnya: udara,nitrogen, atau argon) untuk menekan
pelarut melalui kolom (kromatografi kolom kilat).
Ukuran partikel fasa diam pada kromatografi kolom kilat biasanya lebih halus
daripada kromatografi kolom gravitasi. Misalnya, silika gel untuk
kromatografi kilat berukuran antara 230 400 mesh (40 63 m),
sementara untuk kromatografi gravitasi antara 70 230 mesh (63 200 m).

6. Manfaat Kromatografi Kolom

Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang
sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif,
senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek
molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam
bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-

molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan

molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan
menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan
dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk
menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol
kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.
Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama
dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang
pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien
tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok
berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari
sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan
lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan
suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat
penting terutama bagi pasien kidneystones (batu ginjal). Banyak metode
analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi
semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk
mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.
7. Keuntungan Dan Kelebihan Kromatografi Kolom
Kelebihan kromatografi kolom :
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran
Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
Kekurangan kromatografi kolom :
Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan
manual
Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (timeconsuming)

8. Jenis Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan :
Kromatografi Fase Normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal bersifat polar,

misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.

Kromatografi Fase Terbalik
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya
bersifat polar; kebalikan dari fase normal.

9. Cara Kerja Kromatografi Kolom

1. Komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adorben karena telah terikat.
2. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen
sesuai dengan kesesuaian kepolaran.
3.

Masing-masing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda

dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi.

4. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk

mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT.
5. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi
dapat diamati lebih lanjut menggunakan spektroskopi.

Seluruh proses kromatografi kolom dapat dilihat pada gambar berikut: