F

GERSON DE FREITAS SILVA VALENTE
REMOO DE COLESTEROL DA GORDURA DO LEITE POR ADSORO

EM SLICA GEL
Tese apresentada Universidade

Federal de Viosa, como parte das
exigncias do Programa de Ps-Graduao
em Cincia e Tecnologia de Alimentos,
para obteno do ttulo de Magister
Scientiae.
VIOSA
MINAS GERAIS BRASIL
2000
Aos meus pais Jos Maria e Suzana.

minha irm Gislene.
Aos meus familiares.
Aos amigos e companheiros.
minha querida esposa Luciana Duarte O. Valente.
A Deus, pela felicidade.
ii
AGRADECIMENTO
Universidade Federal de Viosa, pelo Programa de Ps-graduao.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
(CNPq) e Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior
(CAPES) pelo auxlio financeiro concedido durante o mestrado.
Ao professor orientador Sebastio Csar Cardoso Brando, pelo
acompanhamento.
Aos professores conselheiros June Ferreira Maia Parreiras e Jos
Carlos Gomes, pela ajuda.
Ao professor Jos Antnio, por dispor do seu tempo para discusso do
trabalho.
Ao Departamento de Tecnologia de Alimentos.
Ao Conselho de Ps-graduao.
Aos membros da banca examinadora.
Ao corpo docente e tcnico administrativo do DTA.
Ao colegas da ps-graduao.
Ao tcnico Washington, do Laboratrio de Anlise de Alimentos.
Aos colegas, Carlos Henrique Baltazar e Lus Sampaio, pela
contribuio nas atividades iniciais, no laboratrio.
iii
BIOGRAFIA
GERSON DE FREITAS SILVA VALENTE, filho de Jos Maria e

Suzana, nasceu em 15 de dezembro de 1973, em Viosa-MG.
Em 1993, iniciou o Curso de Engenharia de Alimentos na Universidade
Federal de Viosa, graduando-se em dezembro de 1997.
Em maro de 1998, comeou o Curso de Mestrado em Cincia e
Tecnologia de Alimentos na Universidade Federal de Viosa, sob a orientao
do professor Sebastio Csar Cardoso Brando, submetendo-se defesa de
tese em dezembro de 2000.
iv
CONTEDO
PGINAS
RESUMO...........................................................................................................vii
ABSTRACT .......................................................................................................ix
1. INTRODUO ............................................................................................... 1
2. REVISO DE LITERATURA ......................................................................... 4
2.1. O Colesterol e as gorduras saturadas em alimentos......................... 4
2.2. Distribuio do colesterol na gordura do leite ................................... 8
2.3. Limitao produo de alimentos com colesterol reduzido ........ 10
2.4. Reduo de colesterol em alimentos ................................................ 10
2.5. Tecnologias para reduo do colesterol do leite ............................ 11
2.5.1. Processos biolgicos .................................................................... 13
2.5.2. Processos qumicos ...................................................................... 15
2.5.2.1. Processos de complexao e extrao por solventes .......... 15
2.5.3. Processos fsicos........................................................................... 16
2.5.3.1. Substitutos de gordura............................................................... 16
2.5.3.2. Destilao de vapor vcuo .................................................... 17
2.5.3.3. Destilao molecular de via curta (Short path distillation) ... 18
2.5.3.4. Extrao com fluido supercrtico ............................................ 18
2.5.4. Cromatografia preparativa ............................................................ 21
2.5.4.1. Fatores importantes em separaes por cromatografia

preparativa............................................................................. 21
2.7. Mtodos para anlise quantitativa de colesterol.............................. 22
2.7.1. Cromatografia gasosa ................................................................... 24
2.7.2. Cromatografia lquida de alto desempenho................................. 25
3. MATERIAIS E MTODOS ........................................................................... 26
3.1. Preparao do leo de manteiga ....................................................... 26
3.1.1. Dispositivo experimental................................................................. 26
3.1.1.1. Delineamento experimental ..................................................... 30
3.2. Metodologia da anlise quantitativa de colesterol do leo de
manteiga ............................................................................................... 31
3.2.1. Anlise de colesterol por HPLC.................................................... 31
3.2.2. Anlise dos resultados de adsoro do colesterol em leito
de slica ........................................................................................ 31
3.2.3. Anlise de produtos de oxidao do colesterol por HPLC ........ 32
3.2.4. Condies cromatogrficas e equipamentos para anlise de
colesterol e produtos de sua oxidao ......................................... 32
4. RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................... 34
4.1. Anlise do leo de manteiga por cromatografia .............................. 34
4.1. Curvas de adsoro do colesterol ..................................................... 36
4.2.1. Efeito da Temperatura ................................................................... 36
4.2.2. Efeito da altura do leito.................................................................. 40
4.2.3. Efeito da Granulometria da Slica ................................................. 44
4.3. Influncia das variveis na quantidade mxima de colesterol
adsorvido..................................................................................... .........52
4.4. Efeito dos tratamentos na produo de xidos de colesterol ........ 56
5. RESUMO E CONCLUSES ........................................................................ 59
6. RECOMENDAES.................................................................................... 61
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................ 62
vi
RESUMO
VALENTE, Gerson de Freitas Silva, M.S., Universidade Federal de Viosa,

dezembro de 2000. Remoo de Colesterol da Gordura do Leite por
Adsoro em Slica Gel. Orientador: Sebastio Csar Cardoso Brando.
Conselheiros: June Ferreira Maia Parreiras e Jos Carlos Gomes.
O processo de remoo de colesterol da gordura de leite por adsoro
em slica gel foi avaliado como uma alternativa para a elaborao de produtos
lcteos com baixo teor de colesterol. A remoo do colesterol do leo de
manteiga foi estudada em colunas de dimetro interno de 22 mm, que foram
preparadas in loco usando 10,0 g, 12,5 g e 15,0 g de slica, utilizando as
temperaturas de 70C, 80C e 90C para a slica gel com duas granulometrias,
que foram de 5 m a 40 m e de 45 m a 60 m. Os dados experimentais
mostraram que possvel produzir leo de manteiga com uma reduo de at
95% na concentrao de colesterol nas primeiras fraes da fase mvel.
Adsoro de at 10,1 mg de colesterol injetado por grama de slica foi obtida,
equivalente a 3,1 mL de leo produzido para cada grama do adsorvente para a
slica de menor granulometria. Para a slica de maior granulometria foi
adsorvido at 6,9 mg de colesterol injetado por grama do adsorvente, isto ,
uma relao de at 1,7 mL de leo de manteiga por grama de slica de maior
granulometria. Foi possvel verificar que nos tratamentos testados, a
concentrao de produtos da oxidao do colesterol foram inferiores a 10 g/g
de leo para o xido 25-hidroxicolesterol e
5 g/g de leo para o xido
7--hidroxicolesterol logo aps o processo. Portanto, com base nos resultados,
vii
pode-se afirmar que a tcnica uma alternativa promissora para a remoo de

colesterol da gordura do leite.
viii
ABSTRACT
VALENTE, Gerson de Freitas Silva, M.S., Universidade Federal de Viosa,

december of 2000. Removal of Cholesterol of the Milk Fat by Adsorption
on Slica Gel. Adviser: Sebastio Csar Cardoso Brando. Commitee
members: June Ferreira Maia Parreiras and Jos Carlos Gomes.
The process of cholesterol removal of milk fat by adsorption on slica
gel was evaluated as an alternative for the ''cholesterol-reduced" elaboration of
milk products. Cholesterol removal of butter oil was studied in columns of same
diameter, with variations in the height of the bed, the temperature and the
particles size distribuition of the slica. The columns were prepared in loco with
10,0 g, 12,5 g and 15,0 g of slica, temperatures used were 70C, 80C and
90C and particles size distribuition for the slica was of 5 m to 40 m and
45 m to 60 m. The experimental data showed that it is possible to produce
butter oil with a reduction of up to 95 % in the cholesterol concentration for the
first eluated. Adsorption of up to 10,1 mg of injected cholesterol for each gram
of slica or a relationship of up to 3,1 mL cholesterol reduced butter oil produced
for each gram of the adsorvent was obtained for the slica of smaller particle
size distribution and a relationship of up to 6,9 mg of injected cholesterol for
each gram of adsorvent or a relationship of up to 1,7 mL cholesterol reduced
butter oil produced for each gram of the slica was obtained for the slica of
larger particle size distribution. Analysis by HPLC determined that concentration
of cholesterol oxides were below the detector limite (10 g/g oil for the oxide
25-hidroxicolesterol and 5 g/g oil for the oxide 7--hidroxicolesterol).
ix
1. INTRODUO
O colesterol uma pequena molcula que recebeu grande ateno na

Biologia. Treze Prmios Nobel foram dados a cientistas que dedicaram grande
parte de suas carreiras ao colesterol. Desde que foi isolado de clculos biliares,
em 1784, o colesterol tem exercido uma fascinao quase hipntica em
cientistas das mais diversas reas da cincia e da medicina (DEHAL et al.,
1991).
Apesar de ser visto como um causador em potencial de danos sade,
o colesterol um composto de grande importncia biolgica nos animais, visto
que um precursor da formao de cidos biliares, corticosterides, hormnios
sexuais, da vitamina D e atua na regulao da absoro de lipdeos no trato
gastrointestinal e na atividade do seu transporte atravs da membrana. O
colesterol tambm essencial para o crescimento e a multiplicao de uma
grande variedade de clulas (DEHAL et al., 1991).
A concentrao de colesterol, que pode ser considerada benfica
sade humana, no deve ultrapassar 200 mg/dL de sangue, sendo que o LDL
(lipoprotenas de baixa densidade) deve ser menor que 130 mg/dL (FELDMAN,
1994). Cerca de 33% da populao brasileira possui concentrao de
colesterol no sangue acima desse valor. Nessa condio, as concentraes
plasmticas de lipoprotenas transportadoras de colesterol ou triglicerdeos
excedem o limite considerado normal. As complicaes decorrentes vo desde
o desenvolvimento acelerado de arteriosclerose, podendo levar ao enfarto e
trombose (ROSSI, 1998).
Segundo dados do Ministrio da Sade (BRASIL, 1994), no Brasil, as

doenas cardiovasculares foram responsveis por 300 mil bitos anuais e
representam os maiores custos da Previdncia Social, resultantes de licenas e
aposentadorias. Em 1988, essas doenas causaram 15% das mortes na faixa
etria de 15 a 44 anos, atingindo, assim, pessoas jovens em plena fase
produtiva. Esses dados evidenciam a magnitude do problema das doenas
cardiovasculares no quadro geral das patologias do pas.
Medidas isoladas para reduzir a concentrao de colesterol no sangue,
relacionadas com a dieta, tm sido, freqentemente, insuficientes. Torna-se
necessria a associao destas com drogas hipolipidmicas, capazes de
reduzir a sntese endgena de colesterol ou melhorar a eficincia de sua
remoo do plasma. No entanto, efeitos colaterais indesejveis resultantes do
uso de tais medicamentos, aliados ao seu elevado custo associado ao seu uso,
tm motivado a procura de novas estratgias nutricionais e, ou, farmacolgicas,
para preveno da arteriosclerose (SALVA, 1996).
As principais fontes alimentares de colesterol so de origem animal,
como o ovo, os produtos crneos, e o leite e derivados. Est ocorrendo uma
mudana de hbito de consumo de lipdeos animais por vegetais, de manteiga
por margarina, de carne vermelha por carne branca e de leite integral por
desnatado ou com baixos teores de gordura. Se o colesterol pudesse ser
extrado ou reduzido significativamente nesses alimentos, a ingesto e a
recomendao desse tipo de alimento seria facilitada frente ao seu alto valor
nutricional.
Atualmente, existem vrias tecnologias disponveis para a reduo de
colesterol em alimentos, entre elas, a destilao de vapor a vcuo, a destilao
molecular de via curta, a extrao com fluido supercrtico, a aplicao de
enzimas, alm do uso de complexantes e substitutos de gordura, extrao com
solventes e o processo de adsoro. H algumas barreiras, j que alguns
mtodos impossibilitam a utilizao do produto aps o tratamento da extrao,
por exemplo, o leite pode no ser apropriado para a produo de queijo, por
no mais ser capaz de coagular. Outro problema a possibilidade de oxidao
do colesterol durante a extrao, pois o produto final pode conter substncias
txicas, impossibilitando o consumo.
O objetivo geral desta pesquisa foi estudar o efeito de algumas

variveis de processo, temperatura do leo de manteiga, granulometria e altura
do leito de slica, na remoo do colesterol da gordura do leite por adsoro e
tambm verificar a possvel formao de produtos de oxidao do colesterol.
2. REVISO DE LITERATURA
O primeiro problema associado presena de colesterol em alimentos

que h indivduos para os quais existe uma relao direta entre a quantidade
de colesterol ingerida e a sua concentrao no sangue e, conseqentemente,
com o risco de doenas cardiovasculares. Outro problema diz respeito
toxicidade dos produtos da sua oxidao (SALVA, 1996).
Mais recentemente tm-se encontrado evidncias de que vrios
produtos de autoxidao do colesterol esto tambm relacionados a doenas
coronarianas, alm de serem potencialmente citotxicos, mutagnicos,
carcinognicos (SALVA, 1996). Produtos da autoxidao do colesterol, como,
por exemplo, o 25-hidroxicolesterol, um inibidor da biossntese do colesterol,
foram detectados em ovos desidratados por processo de atomizao
(spray dryer) (SALVA, 1996).
2.1. O Colesterol e as gorduras saturadas em alimentos
O colesterol (Figura 1) um esterol animal extremamente importante,
encontrado em todas as clulas e tecidos animais e humanos. O ser humano
adulto mdio contm cerca de 150 g de colesterol e sintetiza de 700 mg a
1.500 mg de colesterol diariamente, para repor as perdas fecais e outras. O
colesterol tem diversas funes vitais. No intestino, os cidos biliares (entre os
compostos, o colesterol) modulam a absoro de gordura alimentar. Ele um
componente muito importante das membranas celulares e dos nervos. O
colesterol tambm o precursor dos hormnios esteris do crtex da glndula

supra-renal, de hormnios sexuais masculinos e femininos, de vitamina D, e
essencial para o crescimento e desenvolvimento de mamferos jovens (GURR,
1992).
Figura 1 - Estrutura Qumica do Colesterol.
O colesterol encontrado em diversos alimentos, em concentraes

bem variveis (Quadro 1). Concentraes altas de colesterol em ovo e em leite
tem, por exemplo, induzido a reduo do consumo desses alimentos, com as
conseqentes desvantagens nutricionais e a necessidade de adaptaes
tecnolgicas de processos j bem definidos (SALVA, 1996).
O grande interesse no metabolismo de gorduras e leos desenvolveuse nos anos 50, quando ocorreram as primeiras descobertas sobre a influncia
de gordura saturada na dieta e sobre o aumento da taxa de colesterol no
plasma, j que a ingesto de gorduras saturadas pode aumentar em at duas
vezes o teor de colesterol plasmtico, em comparao com as gorduras
poliinsaturados (HAYES, 1996).
Quadro 1 - Concentrao de colesterol em diferentes alimentos

Alimento
% de Gordura
Concentrao de
Colesterol
(mg/100g do produto)
Leite humano
4,0
25
Leite de vaca
3,8
12,3
Leite desnatado
0,1
Brie
27,9
100
Camembert
22,3
62
Cheddar
32,3
100
Roquefort
29,8
88
Frescal
31,5
103
Gouda
29,2
114
Parmeso
25,8
68
Quark
5,1
17
Ovo Integral
14,4
396
Manteiga
83,2
240
Banha
99,7
86
Queijos:
Carne de vaca
Msculo
1,9
60
Carne de porco
Msculo
1,9
65
Fgado
5,7
340
Fonte: SIEBER, 1993.
A gordura saturada e os cidos graxos saturados no so totalmente

deletrios, e uma quantidade segura de gordura saturada ingerida pode ser to
benfica quanto o HDL (High Density Lipoprotein lipoprotena de alta
densidade), que remove o excesso de triglicerdeos do sangue e transporta o
colesterol dos tecidos perifricos de volta ao fgado (HAYES, 1996). Os cidos
graxos trans no so metabolizados como as gorduras monoinsaturadas e
sim como as saturadas, que reduzem o HDL, enquanto aumentam o LDL (Low
Density Lipoprotein lipoprotena de baixa densidade), que faz o transporte do
colesterol do fgado para as artrias (ODONNEL, 1993).
As doenas cardacas coronarianas, principalmente arteriosclerose
(Figura 2), despertam a ateno sobre as gorduras. De modo geral, as pessoas
acreditam que as gorduras saturadas simplesmente aumentam a taxa de
colesterol sangneo e que as polinsaturadas reduzem-no. Isso no constitui
verdade absoluta, pois os cidos graxos trans, obtidos por exemplo na
hidrogenao de leos vegetais, induzem a formao de colesterol endgeno,
elevando a concentrao deste no sangue (HAYES, 1996).
Figura 2 - Representao grfica da Arteriosclerose.
Na verdade, os steres de colesterol vindos da dieta so hidrolisados

no trato intestinal, mas a re-esterificao ocorre em grande escala durante a
absoro. O colesterol incorporado nos quilomcrons formados na mucosa
intestinal e transportado pelo sistema linftico at o fgado. Sua absoro
dependente da absoro de gorduras e estimulada pela presena de cidos
graxos. Assim, o colesterol vai at o fgado ligado nos quilomcrons, que so as
lipoprotenas maiores e de mais baixa densidade. Quando os quilomcrons
passam pelo fgado, grande parte dos steres de colesterila hidrolisada e o
colesterol captado pelo fgado. Uma lipoprotena de muito baixa densidade
(VLDL), formada no fgado e se constitui de partculas ricas em triglicerdeos.
O colesterol transportado do fgado para o plasma atravs da VLDL. No
plasma, o colesterol transportado como lipoprotena, sendo a proporo mais
elevada encontrada nas LDL (lipoprotenas de baixa densidade), formadas a
partir das VLDL. Finalmente, a LDL desdobrada e o colesterol captado pelos
tecidos. Somente o colesterol livre incorporado em membranas. O excesso
de colesterol livre deixa a clula e levado at o fgado ligado a HDL
(lipoprotena de alta densidade) plasmtica. Parece que a HDL desempenha o
papel principal na remoo do excesso de colesterol, evitando seu acmulo
nos vasos sanguneos (ZACOUR, 1988).
2.2. Distribuio do colesterol na gordura do leite
O leite no uma emulso de leo em gua simplesmente, mas muitas
de suas propriedades podem ser explicadas por esse modelo. Quase toda a
gordura do leite est na forma de pequenos glbulos de gordura. A gordura
consiste de vrios componentes que variam de composio entre os prprios
glbulos do leite de uma mesma vaca. Os glbulos de gordura diferem tanto no
tamanho como na sua prpria composio qumica (MULDER e WALSTRA,
1974).
O Quadro 3 exemplifica como a concentrao de colesterol em
produtos lcteos no diretamente proporcional ao contedo de gordura.
Quadro 3 - Concentrao (%) de gordura e colesterol em alguns produtos

lcteos
Produto
Gordura
Fosfolipdeos Colesterol cidos graxos livres
Leite
4,0
0,035
0,014
0,008
Leite desnatado
0,06
0,015
0,002
0,002
40
0,21
0,12
0,06
Creme
Fonte: MULDER e WALSTRA, 1974.

O colesterol representa 95% dos esteris do leite de vaca. Outros
esteris incluem os compostos de vitamina D (o ergocalciferol, o colecalciferol
e seus metablitos 25-hidroxilados) e os hormnios esterides, que ocorrem
em nveis traos (MATILLA e PIIRONEN, 1995).
Os esteris do leite so encontrados esterificados e livres, constituindo
o principal componente da matria insaponificvel da gordura (PINHEIRO e
MOSQUIM, s.d). No leite, a maior parte do colesterol est na forma livre.
Menos de 10% so encontrados como steres de colesterol (KOSIKOWSKI,
1990).
A maior parte do colesterol no leite est na gordura livre e no glbulo
de gordura. Neste ltimo, porm, est distribudo irregularmente entre o
colesterol livre no interior e na superfcie da lipoprotena e, ainda, uma pequena
quantidade na forma de ster (KOSIKOWSKI, 1990).
A camada superficial das lipoprotenas do glbulo de gordura rica em
colesterol. Esta camada contm em mdia 2% a 3% do peso do glbulo de
gordura, mas contm cerca de 10% do colesterol do glbulo (KOSIKOWSKI,
1990).
A concentrao de colesterol no leite e seus derivados bastante
varivel. Por exemplo, um leite que contenha cerca de 4 mg de colesterol por
grama de gordura, usado no processamento de queijo maturado, resulta em
um produto com aproximadamente 3 mg de colesterol por grama de gordura,
enquanto o creme removido do leite poderia ter at 16 mg de colesterol por
grama de gordura. Essa concentrao reflete a distribuio irregular no glbulo
de gordura e o efeito do mtodo usado para o processamento (KOSIKOWSKI,
1990).
2.3. Limitao produo de alimentos com colesterol reduzido

cada vez maior a preocupao de consumidores com o nvel de
colesterol em seus alimentos, mas existem algumas barreiras elaborao de
produtos com baixas concentraes de colesterol. Entre elas, pode-se destacar
as desvantagens dos mtodos atualmente utilizados para a reduo de
colesterol. Alguns mtodos impossibilitam a utilizao do produto aps o
tratamento da extrao, por exemplo, o leite pode no ser apropriado para a
produo de queijo, por no mais ser capaz de coagular. Outro problema a
possibilidade de oxidao do colesterol durante a extrao, pois o produto final
pode conter substncias txicas, impossibilitando o consumo (KOSIKOWSKI,
1990).
2.4. Reduo de colesterol em alimentos
SCHRODER e BAER (1991) concluram em um estudo que 44% dos
americanos tm mudado os hbitos alimentares em funo do colesterol.
Segundo pesquisa realizada em 1990, pelo Food Marketing Institute
nos Estados Unidos, 60% dos entrevistados eliminaram manteiga de sua dieta
e isso implica em uma reduo de aproximadamente 1,5 kg/ano per capta nas
vendas.
De acordo com a National Milk Marketing Board, o consumo por
residncia caiu 13%, no ano de 1989. As estatsticas de consumo do gnero,
em 1990, nos Estados Unidos, foram de 70% para o consumo de margarina e
30% para o consumo de manteiga (SCHRODER e BAER, 1991).
SCHRODER e BAER (1990) associaram a reduo no consumo de
manteiga aos novos hbitos alimentares, que se caracterizam pela busca de
alimentos com ausncia ou com nveis reduzidos de colesterol.
Produto com baixssimas concentraes de colesterol (colesterol-free),
tornou-se um rtulo quase que obrigatrio em muito alimentos industrializados
nos EUA (KOSIKOWSKI, 1990). A venda de alimentos com baixa concentrao
de colesterol e com baixo teor de gordura foram estimadas em 33 bilhes de
dlares, no mesmo pas, em 1991 (SCHRODER e BAER, 1991).
10
2.5. Tecnologias para reduo do colesterol do leite

Vrias tecnologias tm sido desenvolvidas para reduzir a concentrao
ou eliminar o colesterol de alimentos processados ou in natura. Elas incluem o
emprego de substitutos de gordura, modificao gentica, a sua extrao com
solventes, gases, vapores e agentes complexantes e a sua transformao em
produtos no-txicos pela ao de enzimas. Os processos para reduo do
colesterol do leite podem ser classificados em biolgicos, qumicos, e fsicos
(Quadro 4).
11
Quadro 4 - Mtodos para remoo de colesterol de gorduras

Mtodo
Processo
Mecanismo
Rhodococcus
Transformao
Biolgico
Microrganismo*
Nocardia
Enzima*
Colesterol
Transformao
redutase ou
oxidase
Qumico
Complexao**
-ciclodextrina
Complexao
cidos biliares
Adsoro
Slido-lquido**
Slica gel
Adsoro
Slido-lquido**
Carvo ativo
Adsoro
Destilao**
Destilao por
Fracionamento
Fsico
arraste de vapor
Destilao Short
Fracionamento
path
Cristalizao**
Extrao supercrtica**
Cristalizao
Cristalizao
fracionada
fracionada
Extrao com
Fracionamento
dixido de
carbono
Fonte: SIEBER, 1993.
* - mtodo aplicado no leite
** - mtodo aplicado no leo de manteiga
12
2.5.1. Processos biolgicos

Embora os mtodos enzimticos para a reduo da concentrao de
colesterol em alimentos apresentem vantagens, como um baixo investimento
para a aquisio de equipamentos e a transformao do produto sem sua
recuperao posterior, pode-se considerar que os trabalhos nessa rea so
ainda iniciais.
Algumas pesquisas, por exemplo, investigam a melhor fonte de
colesterol redutase, que converte o colesterol em coprostanol (Figura 3), que
tem baixa absoro no trato intestinal (SALVA, 1996)
Diversos pesquisadores isolaram e caracterizaram Eubactrias ssp., a
partir de fezes de ratos, macacos e humanos, capazes de efetuarem essa
converso. Folhas de pepino, soja, milho e feijo contm enzimas similares
(ANDERSON et. al., 1995).
Colesterol
redutase
HO
HO
Colesterol
Coprostanol
Figura 3 - Transformao de colesterol em coprostanol por colesterol redutase.

Colesterol oxidase, por sua vez, transforma o colesterol em
4-colesteno-3-ona (colestenona) (Figura 4), sem toxicidade conhecida. Essas
enzimas so produzidas por microrganismos isolados do solo, de fezes de rato
e de alimentos ricos em gordura como bacon, manteiga e vrios tipos de carne
(SALVA, 1996).
13
O principal problema com essas enzimas parece ser a acessibilidade

dos seus stios ativos para o colesterol, que se encontra nos glbulos de
gordura do leite (ANDERSON et al., 1995).
Colesterol
Oxidase
HO
4-Coleteno-3-ona
Figura 4 - Transformao do colesterol em colestenona por colesterol oxidase.

Uma patente francesa foi credenciada para a remoo de esteris de
filme de gordura por meio da sua incubao com bactrias degradadoras de
esteris, por exemplo, Nocardia. Esse procedimento alcanou uma reduo de
at 89% do contedo de esteris, aps um perodo de 12 horas, a 29oC. A
aplicao de enzimas de degradao do colesterol, em larga escala,
entretanto, exige o conhecimento da segurana e eficincia da enzima, a
transferncia do gene responsvel para microorganismos aceitveis, a
purificao da enzima e o modo de aplicao, em suporte slido ou ainda na
forma solvel, diretamente no sistema alimentar (BOUDREAU e ARUL, 1993).
Por fim, h relatos sobre a habilidade do Lactobacillus acidophilus em
metabolizar o colesterol em produtos lcteos fermentados (ANDERSON et al.,
1995).
De acordo com estudos desenvolvidos com bactrias lcticas nos
ltimos vinte anos, fortes evidncias indicam um efeito dessas bactrias na
reduo do colesterol em produtos fermentados, ou mesmo no colesterol
sangneo em pessoas que usam esses produtos (THARI et al., 1995; RASIC
et al., 1992).
Microorganismos como L. acidophilus e o Bifidobacterium bifidum so
capazes de reduzir o colesterol por mecanismos no totalmente conhecidos
14
(KLAVER e MEER, 1993; GILLILAND e SPECK, 1977; RASIC et al., 1992;

GILLILAND et al., 1985; THARI et al., 1995).
2.5.2. Processos qumicos
2.5.2.1. Processos de complexao e extrao por solventes
O processo qumico de extrao do colesterol com ciclodextrina
consiste na formao de complexos com o colesterol, com posterior separao.
O alto requerimento de ciclodextrina para remover o colesterol e o elevado
custo da mesma podem resultar em um mtodo proibitivo (BOUDREAU e
ARUL, 1993).
Os processos de complexao com ciclodextrina tm, entretanto, o
potencial de serem implementados com equipamentos j disponveis na
indstria de laticnios e com custos operacionais mais baixos. Baixos
rendimentos e alterao na qualidade do produto podem ou no acontecer,
dependendo da seletividade do agente de separao pelo colesterol e da
eficincia do processo utilizado para separar os complexos ou agregados do
produto final. Problemas legais deveriam ser mnimos, se agentes de
separao de grau alimentcio, como a quilaia ou ciclodextrinas, fossem
empregados (SUNDFELD, 1996).
Ciclodextrinas foram utilizadas para remoo de colesterol do leite,
manteiga e gordura do leite. Um complexo do colesterol com a ciclodextrina
formado em soluo aquosa, o qual removido por centrifugao, resultando
em produtos em que at 90% do colesterol originalmente presente foram
removidos
(SUNDFELD,
1996).
Permanecem,
entretanto,
problemas
relacionados elevada quantidade de complexante necessria e dificuldades

na recuperao das ciclodextrinas.
Saponinas de beterraba foram propostas como agentes de remoo de
colesterol. As saponinas purificadas so adicionadas ao leite fluido,
promovendo-se a formao de complexos insolveis com o colesterol livre, os
quais so removidos por filtrao. O produto final tinha sua concentrao de
colesterol reduzida em at 95%. Entretanto, nada se comenta quanto
disponibilidade comercial de saponinas purificadas e sua situao frente
15
legislao de alimentos, eventual presena de saponinas residuais no produto,

suas implicaes legais e sensoriais e a viabilidade de sua recuperao
(SUNDFELD, 1996).
Outras tcnicas tm sido baseadas na adsoro do colesterol pelo uso
de agentes como o brometo de clcio ou de magnsio e sais de carbonato
insolveis, que se ligam seletivamente ao colesterol. Contudo, nenhum desses
agentes foram provados como satisfatrios (BOUDREAU e ARUL, 1993).
Alternativamente, um procedimento de extrao de colesterol pelo uso
de solventes orgnicos foi descrito por CZECH et al. (1993). O mtodo consiste
essencialmente da passagem de uma mistura da gordura do leite, etanol e
propanol em coluna extratora e extrao com uma mistura de etanol, gua e
pequena quantidade de propano em contra-corrente, a 30oC e presso de 10
bar. A mistura de gordura livre de colesterol, propano e etanol, com baixa
concentrao de gua, removida no topo da coluna, enquanto uma soluo
de colesterol e gordura de leite, em uma mistura de etanol, gua e propano,
recolhida na base da coluna, sendo que os compostos flavorizantes extrados
com o colesterol podem ser reciclados.
2.5.3. Processos fsicos
2.5.3.1. Substitutos de gordura
A retirada ou substituio de toda gordura ou de parte dela e do
colesterol em um alimento, com um resultado final no qual as caractersticas
organolpticas so equivalentes ao produto tradicional, um desafio,
especialmente porque o teor de gordura tem influncia significativa nas
caractersticas fsicas e sensoriais.
Dos diferentes sistemas que buscam substituir toda gordura ou parte
dela e do colesterol em alimentos, a microparticulao tem grande destaque. A
microparticulao proporciona a mesma sensao de fluidos gordurosos pelo
fato da nossa lngua ter a capacidade de identificar uma partcula em funo de
seu tamanho (YOKOYAMA, 1996). Normalmente so usados compostos de
carboidratos, pectinas e carragenas ou protenas, como as protenas do soro
de leite (HAUKSSON e HEDETOFT, 1996).
16
Alm da microparticulao, existem os substitutos base de gorduras,

que so gorduras modificadas em sua estrutura (caprenina, olestra, salatrim),
de forma que fornecem pouca ou nenhuma energia, podendo at passar sem
alteraes pelo organismo (SLIKTA, 1996).
Substitutos base de carboidratos so ingredientes que variam desde
amidos e gomas at polidextrose. Funcionam como estabilizantes e
espessantes, simulando vrias funes das gorduras (SLIKTA, 1996).
Com excelente versatilidade em sistemas congelados e refrigerados,
os substitutos, base de protenas, so derivados de protenas lcteas, de
ovos e at de milho. Protenas lcteas concentradas e modificadas so
exemplos de maior sucesso (SLIKTA, 1996).
2.5.3.2. Destilao de vapor vcuo
O colesterol um composto pouco voltil, porm mais voltil que a
maioria dos triglicerdeos do leite. Vapor superaquecido pode ser borbulhado
atravs do leo de manteiga e este pode ser aquecido indiretamente para
fornecer
calor
latente
de
vaporizao
dos
componentes
destilantes
(BOUDREAU e ARUL, 1993).

Destilao do vapor da gua e componente de baixa volatilidade, como
o colesterol, cidos graxos livres e aroma ocorrem quando a soma das
presses de vapor do vapor da gua e destilados igual presso total. A
presso pode ser reduzida pela aplicao de vcuo, ou, alternativamente, a
presso de vapor dgua pode ser diminuda pelo aumento da temperatura,
que, por sua vez, aumenta a presso de vapor dos componentes destilantes. A
temperatura de destilao pode ser diminuda, se necessrio, pelo aumento da
quantidade de vapor (BOUDREAU e ARUL, 1993).
Com essa tcnica, possvel diminuir de 75% a 95% da concentrao
de colesterol da gordura de leite anidra. Embora essa remoo no afete as
propriedades funcionais e sensoriais dos produtos lcteos, h a possibilidade
de formao de produtos de oxidao do colesterol que so txicos,
principalmente o 7-hidroxicolesterol e o 25-hidroxicolesterol e o colestanetriol.
O investimento inicial e o custo operacional desse processo so muito
17
elevados, considerando-se o sistema de vcuo necessrio para realizar a

destilao temperatura mais reduzida (BOUDREAU e ARUL, 1993).
2.5.3.3. Destilao molecular de via curta (Short path distillation)
Este processo de destilao consiste na evaporao de molculas em
um espao substancialmente livre de gs (vcuo). A separao mais simples
alcanada pelo processo a destilao de uma substncia de baixo peso
molecular, desejada ou no, de uma mistura de componentes de maior peso
molecular (LANZANI et al., 1994).
O emprego da destilao short path reduz o colesterol de 70% a 90%
em gordura de leite anidra e constitui um dos melhores mtodos de extrao,
uma vez que no ocasiona mudana na gordura original do leite (LANZANI et
al., 1994).
As condies apropriadas para extrao envolvem temperatura
elevada e tempo longo, numa razo inversamente proporcional entre esses
fatores. Somente aps quatro destilaes do leo de manteiga, obtm-se uma
separao satisfatria do colesterol, podendo ainda ocasionar alteraes da
composio de lipdeos do produto. O investimento industrial e o custo
operacional da destilao molecular so extremamente elevados. No houve
avaliao das perdas de compostos aromticos e de caractersticas sensoriais
(LANZANI et al., 1994).
2.5.3.4. Extrao com fluido supercrtico
Os fluidos supercrticos so definidos como qualquer substncia
mantida acima da sua temperatura e presso crtica. A temperatura crtica a
temperatura mais alta, na qual o gs pode ser convertido em lquido pelo
aumento da presso. A presso crtica a presso mais elevada, na qual o
lquido pode ser convertido em gs pelo aumento da temperatura. Acima da
presso crtica, as propriedades do lquido e do gs tornam-se idnticas, e este
gs, altamente denso, denominado fluido supercrtico (ARAJO, 1995).
A tcnica de extrao com fluido supercrtico funciona de forma
semelhante extrao com solvente. Neste caso, o CO2 utilizado como
18
solvente de extrao temperatura e presso prximas e acima do ponto

crtico, em substituio aos lquidos normalmente utilizados como cloreto de
metileno, hexano, metanol entre outros, sem causar danos s propriedades
funcionais de protenas e de outros constituintes do alimento. A amostra a ser
extrada exposta ao CO2 supercrtico, que dissolve e remove alguns
componentes da amostra original (ARAJO, 1995).
Alm do uso em laboratrios, a tcnica com CO2 supercrtico utilizada
em escala industrial na descafeinao e extrao de lpulo, na extrao e
recuperao de aromas e remoo de colesterol e lipdios em carnes, ovos e
produtos de laticnios (ARAJO, 1995).
O dixido de carbono destaca-se dos demais fluidos de utilizao por
ter uma temperatura crtica ligeiramente acima da ambiente (31,1C), evitando
a destruio de substncias termossensveis, tem uma presso crtica fcil de
ser obtida, no inflamvel, inodoro, quimicamente inerte, est disponvel
em alta pureza e baixo custo, no representando risco ambiental (ARAJO,
1995).
A extrao de colesterol da gordura de leite anidra por dixido de
carbono supercrtico tem sido investigada por diversos autores. Em um estudo
realizado por KAUFMANN et al. (1982), utilizando CO2 para extrao de
colesterol, foram obtidas duas fraes do leite (20% lquido e 80% slido) em
uma presso de 200 bar e temperatura de 80oC, sendo registradas
concentraes de 5,5 mg de colesterol por grama de gordura na frao lquida
e 2,3 mg/g na frao slida.
A extrao do colesterol em uma fase mvel determinada pelo
balano de interaes tripartidas, triglicerdeos com CO2, triglicerdeos com
colesterol e colesterol com CO2. Sendo um constituinte menor na gordura do
leite, o colesterol provavelmente est associado com triglicerdeos, com os
quais ele mantm maior afinidade, principalmente os triglicerdeos de cadeia
curta e mdia e, em alguma extenso, triglicerdeos insaturados de cadeia
longa (BOUDREAU e ARUL, 1993).
A afinidade do CO2 baixa para o colesterol na presso de 200 bar e
80oC (baixa concentrao de gs), por isso existe menor competio entre os
triglicerdeos e o CO2 para o colesterol. As molculas de colesterol associadas
com triglicerdeos de cadeia mdia e curta so eludas na fase gasosa,
19
enquanto molculas de colesterol associadas com triglicerdeos de cadeia

longa no so eludas, por causa do seu tamanho, como tambm ocorre para
os steres de colesteril (BOUDREAU e ARUL, 1993).
CHAO et al. (1991) estudaram os efeitos das condies que afetam a
extrao de lipdeos e colesterol em carne usando presses numa faixa de
103 bar a 310 bar e uma faixa de temperatura de 30C a 50C. Eles
encontraram que a extrao de colesterol com CO2 supercrtico mais efetiva
a baixa presses e propem o uso desta tcnica como fonte de colesterol para
uso na industria farmacutica.
A reduo de colesterol junto com o fracionamento de triglicerdeos em
leo de manteiga foi obtido usando um processo combinado de extrao com
CO2 supercrtico com adsoro em alumina num equipamento que permitia o
controle independente da presso e temperatura. A concentrao de colesterol
no leo de manteiga foi reduzida de 2,5 mg/g para 0,1 mg/g. O leo de
manteiga tambm foi fracionado em triglicerdeos de baixo, mdio e alto peso
molecular, o que permite a formulao de uma gordura com propriedades
especficas (MOHAMED, 1998).
BHASKAR et al. (1993) usaram um sistema contnuo de extrao com
CO2 supercrtico, em escala piloto, para remoo de colesterol do leo de
manteiga. A gordura foi separada em cinco fraes, usando uma faixa de
presso de 3,4 MPa a 24,1 MPa numa faixa de temperatura de 40C a 75C,
conseguindo uma separao de at 400 g/h de gordura do leite.
Embora a remoo do colesterol seja apenas modesta na extrao
com CO2 supercrtico com etapa nica, nveis superiores podem ser
alcanados por processos de estgios mltiplos ou pelo uso de adsorventes
em linha (BOUDREAU e ARUL, 1993).
Segundo HUBER et al. (1996), o uso de CO2 supercrtico para remoo
direta do colesterol da gordura de leite anidra, ou mesmo com separadores em
srie no so mtodos prticos, pois a seletividade do colesterol em relao
gordura relativamente baixa para diversas condies de operao. A
solubilidade da gordura anidra pequena e ainda h perdas de componentes
flavorizantes, que so separados junto com o colesterol, devendo destacar
ainda o alto custo dos equipamentos e de sua manuteno.
20
2.5.4. Cromatografia preparativa

A cromatografia preparativa o mtodo mais usado para isolar e
purificar misturas. Essa tcnica requer colunas maiores devido carga elevada
de material em separao presente no processo. Da mesma forma que em
cromatografia analtica, pode-se conseguir a separao desejada de uma s
vez, mas em alguns casos se faz necessrio extraes sucessivas. Essas
duas circunstncias podem requerer procedimentos operacionais diferentes,
mas em ambos os casos aconselhvel aperfeioar a separao e maximizar
a carga de amostra em uma coluna pequena. De posse dessas informaes,
pode-se calcular o tamanho necessrio da coluna preparativa para a obteno
da separao desejada, como tambm a quantidade de material que pode ser
injetada nesta para se obter pureza ideal e recuperao (WATERS, 1998).
Aps a separao do colesterol, a gordura do leite pode ser
reincorporada ao leite desnatado para produzir os mais diversos produtos,
incluindo creme (ELLING e DUNCAN, 1996), manteiga (SHUKLA et al., 1993),
entre muitos outros.
2.5.4.1. Fatores importantes em separaes por cromatografia preparativa
Os fatores determinantes em uma separao preparativa so muito
semelhantes aos fatores que influenciam uma separao analtica. Nmero de
pratos tericos (N), o fator de capacidade (k'), e a seletividade (), todos iro
afetar a resoluo. O tamanho da partcula do material de empacotamento e o
tamanho da coluna podem afetar a eficincia da coluna e a velocidade da
separao. Alterar qualquer um desses parmetros pode ocasionar efeitos
mltiplos na separao. Portanto de extrema importncia o conhecimento
sobre como esses fatores podem influenciar o processo de separao
(WATERS, 1998).
21
2.6. FDA (Food and Drug Administration) e o colesterol

O rgo americano responsvel pelo controle e inspeo de alimentos
e medicamentos nos Estados Unidos da Amrica props o estabelecimento de
valores para a determinao e diferenciao de alimentos com nveis
baixssimos de colesterol (sem colesterol), alimentos com baixos nveis de
colesterol (baixo colesterol) e alimentos com nveis mdios de colesterol (mdio
colesterol) e alimentos com altos nveis de colesterol (alto colesterol) (FDA,
1986).
Baseado nessa publicao o alimento considerado sem colesterol
quando possui ndices inferiores a 2 mg de colesterol por poro, enquanto o
alimento com baixo-colesterol deve estar entre 2 mg e 20 mg de colesterol
por poro e, finalmente, o mdio colesterol deve estar na faixa
compreendida entre 20 mg e 25 mg de colesterol por poro. Acima de 25 mg
por poro, o produto considerado alto colesterol. O termo poro definido
para cada produto baseado na ingesto diria recomendada. No Quadro 5, so
apresentados os efeitos da remoo de 90% do colesterol do leo de manteiga
por mtodos, tais como o CO2 supercrtico e o de destilao, usado na
produo de alguns alimentos. Os clculos nesse Quadro consideram o
colesterol presente no leite desnatado.
2.7. Mtodos para anlise quantitativa de colesterol
Diversos mtodos so citados na literatura para se determinar
quantitativamente o colesterol e seus xidos em alimentos. Ultimamente, a
reduo de custos e a alta qualidade tornaram-se fundamentais na maioria das
anlises laboratoriais, da mesma forma que a automao dos procedimentos
analticos essencial para o desenvolvimento de mtodos aplicados
rotineiramente. Durante as trs ltimas dcadas, a cromatografia teve um
desenvolvimento rpido e significativo, sendo hoje umas das tcnicas mais
freqentemente usadas para separao, anlise qualitativa e quantitativa
(COLLINS et al., 1997). Os principais mtodos so cromatografia gasosa
(NIELSEN et al., 1995; STEWART et al., 1992 e HUBER et al., 1995) e
22
cromatografia lquida de alto desempenho (HPLC, do ingls High Performance

Liquid Chromatography) (MANZI et al., 1996).
Quadro 2 - Efeito da remoo de 90% do colesterol do leo de manteiga, no
nvel de colesterol e na classificao(a)do produto final
.
Nvel de Colesterol e Classificao do
Alimento(a)
Padro do Produto
Produto com leo
com Avaliao
de Manteiga
Comercial
Colesterol Reduzido
(b)
Produto
Leite fresco
Semi-desnatado
Integral
Sorvete
Creme light
Creme integral
Manteiga
Fermentado
Iogurte (fruta)
Iogurte natural
Creme
Queijo fresco
Cotage
Ricota
Mussarela
Creme
Nvel de
Nvel de
% Gordura colesterol por Classificao colesterol Classificao
poro
por poro
(d)
2,0
3,3
10,8
19,3
37,0
81,1
19 mg/244 g
33 mg/244 g
59,9 mg/100 g
10 mg/30 g
21 mg/245 g
11 mg/15 g
Baixo
(f)
Alto
Alto
Baixo
(e)
Mdio
Baixo
5,7 mg/244 g
6,4 mg/244 g
5,5 mg/100 g
4,1 mg/30 g
4,8 mg/245 g
1,5 mg/15 g
1,2
1,6
12,0
5,0 mg/224 g
7,0 mg/224 g
6,0 mg/15 g
Baixo
Baixo
Baixo
2,5 mg/224 g Baixo

2,6 mg/224 g Baixo
0,8 mg/15 g Livre
1,9
7,9
15,9
34,9
9,0 mg/113 g
38,0 mg/124 g
16,0 mg/28 g
31,0 mg/28 g
Baixo
Alto
Baixo
Alto
0,7 mg/113 g
4,1 mg/124 g
1,5 mg/28 g
2,8 mg/28 g
Baixo
Baixo
Baixo
Baixo
Baixo
(c)
Livre
Livre
Baixo
Livre
Baixo
Fonte: FDA, 1990.
(a) De acordo com Classificao citada pela FDA, 1986;

(b) Nvel calculado supondo 90% de remoo do colesterol do leo de manteiga;
(c) Valor menor que 2 mg por poro, segundo FDA, 1986.
(d) 2 mg a 20 mg por poro, segundo FDA, 1986;
(e) Valor entre 20 mg e 25 mg por poro, segundo FDA, 1986;
(f) Valor de 25 mg ou maior por poro, segundo FDA, 1986;
23
2.7.1. Cromatografia gasosa

Gases ou substncias volatilizveis podem ser separadas, utilizando-se
a tcnica de cromatografia gasosa. A separao baseia-se na diferente
distribuio das substncias da amostra entre uma fase estacionria (slida ou
lquida) e uma fase mvel (gasosa). A amostra injetada em uma coluna
contendo a fase estacionria e a temperatura neste local e na coluna deve
possibilitar a sua vaporizao. De acordo com as propriedades da amostra e da
fase estacionria, as substncias so retidas por tempos determinados,
chegando sada da coluna em tempos diferentes. O uso de detector
adequado na sada da coluna torna possvel a deteco e quantificao dessas
substncias (COLLINS et al., 1997).
Essa tcnica pode ser empregada na anlise de substncias volteis e
estveis termicamente, caso contrrio, h necessidade de se realizar a
derivatizao da amostra, o que nem sempre vivel. A derivatizao
necessria, por exemplo, em acares, aminocidos e em algumas anlises de
cidos graxos. Os derivativos so substncias volteis e termicamente estveis
nas condies de separao utilizadas, permitindo uma melhor separao e
resoluo dos componentes (ARAJO, 1995).
A anlise cromatogrfica isoladamente rpida, no entanto, na maioria
das vezes, h necessidade de etapas de preparao da amostra, antes que ela
possa ser analisada, para que no haja interferncias e contaminao da
coluna cromatogrfica. s vezes, essa etapa de preparao longa e
complexa, aumentando muito o tempo e o custo da anlise.
A cromatografia gs-lquido utilizada na anlise de colesterol tem como
fase estacionria um lquido pouco voltil recobrindo um suporte slido ou as
paredes de colunas capilares. A separao baseia-se em mecanismos de
partio das substncias entre a fase lquida e a fase gasosa. A fase
estacionria deve ser termicamente estvel e quimicamente inerte s
substncias na temperatura de uso (COLLINS et al., 1997).
24
2.7.2. Cromatografia lquida de alto desempenho

Diversos mtodos desenvolvidos para a determinao de colesterol em
manteiga utilizam a tcnica de Cromatografia Lquida de Alto Desempenho
(HPLC, do ingls High Performance Liquid Chromatography).
HPLC o mais novo e mais importante membro de uma famlia inteira
de tcnicas de separao, que utiliza instrumentos que podem ser totalmente
automatizados, empregando pequenas colunas preenchidas com materiais
especialmente preparados e uma fase mvel que bombeada atravs da fase
estacionria sob altas presses. A HPLC tem a capacidade de realizar
separaes e anlises quantitativas de uma grande quantidade de compostos
presentes em vrios tipos de amostras, em curto tempo, com alta resoluo,
eficincia e sensibilidade. O desenvolvimento de instrumentos controlados por
microcomputadores tambm tem contribudo para melhorar a eficincia dos
equipamentos (COLLINS et al., 1997).
Compostos diferenciados em tipo qumico ou nmero de grupos
funcionais so facilmente separados por cromatografia lquido-slido, incluindo
cidos
graxos, lcoois, alcalides, aminas, antioxidantes, barbitricos,
corantes, esterides, fenis, lipdeos e vitaminas (COLLINS et al., 1997).

A anlise de colesterol por HPLC apresenta a grande vantagem de ser
rpida, pois a separao cromatogrfica feita em cerca de seis minutos.
Podemos destacar ainda a alta preciso e o desvio padro para a sua
reprodutibilidade que inferior a 2% (CASIRAGHI et al., 1994).
25
3. MATERIAIS E MTODOS
Este trabalho foi realizado nos laboratrios de Anlise de Alimentos e

de Cromatografia do Departamento de Tecnologia de Alimentos da
Universidade Federal de Viosa.
3.1. Preparao do leo de manteiga
O leo de manteiga foi preparado pelo aquecimento de manteiga a
60C e posterior centrifugao (INTERNATIONAL CENTRIFUGE TACHO
METER, IEC ), numa acelerao equivalente a 800 g por 10 minutos. A fase

superior, que o leo de manteiga, foi analisada por cromatografia lquida de
alto desempenho, para determinar a concentrao inicial de colesterol. Para
cada repetio foi preparado um leo de manteiga para evitar possvel
formao dos xidos de colesterol durante o armazenamento.
3.1.1. Dispositivo experimental
Na Figura 5 mostrado o esquema usado para estudar o processo de
remoo de colesterol em slica gel. Neste esquema, pode-se observar que a
coluna foi preenchida com slica gel (MERCK) e leo de manteiga foi injetado
em quantidade suficiente para saturar o adsorvente. O nitrognio foi utilizado
para controle do fluxo e a estufa (FANEM) para controle de temperatura.
26
Suporte
leo de
manteiga
Nitrognio
Slica gel
Estufa
Figura 5 - Esquema da montagem da coluna para estudo do processo de

remoo de colesterol em slica gel.
O fluxograma (Figura 6) representa a metodologia que foi usada para

quantificar os efeitos de algumas variveis de processo na remoo do
colesterol da gordura do leite e anlise do colesterol e dos produtos da sua
oxidao.
A extrao de colesterol do leo de manteiga foi estudada numa coluna
de ao inoxidvel com dimetro interno de 22 mm, preenchida manualmente
com slica gel. Uma massa de slica gel, de acordo com cada tratamento
estabelecido, foi colocada na coluna. Fez-se a vibrao, colocando o vibrador
em contato com as paredes da coluna por 15 minutos para que o
preenchimento se tornasse padronizado. A fase mvel foi o leo de manteiga
puro.
O leo de manteiga foi injetado continuamente na coluna de slica gel e
gs nitrognio foi usado para controlar o fluxo atravs do leito. Para a slica de
menor granulometria, o fluxo foi de 0,37 mL/min + 0,1 mL/min, sendo
necessria uma presso de 3 kgf/cm2. Para a slica de maior granulometria, um
27
fluxo de 1,50 mL/min + 0,3 mL/min, sendo que a presso foi menor que
0,5 kgf/cm2. Fraes da fase mvel na sada do leito foram coletadas em
funo do volume e submetidas anlise quantitativa para a determinao da
concentrao de colesterol por cromatografia lquida de alto desempenho.
28
leo de manteiga
Coluna Cromatogrfica Preparativa
Variveis (Temperatura, Granulometria e Quantidade de Slica)
Coleta de Fraes
Pesagem
Saponificao
Diluio
Extrao
Eluio em Sep-pak C18
Remoo do Solvente
Remoo do Solvente
Diluio na Fase Mvel
Diluio na Fase Mvel
Anlise de Colesterol
(HPLC)
Anlise de xidos
(HPLC)
Equao de Regresso
da Adsoro
Figura 6 - Fluxograma da metodologia para remoo e anlise do colesterol e
de produtos da oxidao do colesterol.
29
3.1.1.1. Delineamento experimental

Os tratamentos (3 nveis de temperatura, 3 nveis de quantidade de
slica e 2 granulometrias da slica) foram aplicados segundo um esquema
fatorial com 3 repeties, num delineamento inteiramente ao acaso (Quadro 6).
Quadro 6 - Esquema do delineamento experimental empregado
Tratamento
Temperatura
(C)
Altura
aproximada
do leito (mm)
Massa de
Granulometria
slica (g)
da slica
70
42
10,0
5 m a 40 m
80
42
10,0
5 m a 40 m
90
42
10,0
5 m a 40 m
70
54
12,5
5 m a 40 m
80
54
12,5
5 m a 40 m
90
54
12,5
5 m a 40 m
70
67
15,0
5 m a 40 m
80
67
15,0
5 m a 40 m
90
67
15,0
5 m a 40 m
10
70
36
10,0
45 m a 60 m
11
80
36
10,0
45 m a 60 m
12
90
36
10,0
45 m a 60 m
13
70
50
12,5
45 m a 60 m
14
80
50
12,5
45 m a 60 m
15
90
50
12,5
45 m a 60 m
16
70
63
15,0
45 m a 60 m
17
80
63
15,0
45 m a 60 m
18
90
63
15,0
45 m a 60 m
30
3.2. Metodologia da anlise quantitativa de colesterol do leo de manteiga

3.2.1. Anlise de colesterol por HPLC
As amostras de leo de manteiga original e das fraes da fase mvel
na sada do leito foram analisadas por HPLC, para se determinar a
concentrao de colesterol. Para saponificar o leo de manteiga, foram
pesados aproximadamente 200 mg da amostra, que foi dissolvida em 10 mL de
etanol (frao de volume de 96%). A essa soluo foram acrescentados
2 mL de soluo de KOH de concentrao 0,50 g/mL. A temperatura foi
mantida a 70C por 8 minutos, sob constante agitao, para promover a
saponificao. A amostra j saponificada foi resfriada temperatura ambiente.
A extrao foi efetuada com 50 mL de hexano (VETEC) dissolvido em ter
dietlico (CHEMCO) (50% em volume) e 30 mL de gua sob agitao
vigorosa, num funil de separao. Aps a separao completa das fases,
25 mL da fase orgnica foram evaporados com o uso de rotavapor a 350C e
reconstitudos em seguida com 10 mL da fase mvel usada na anlise
quantitativa (CASIRAGHI et al., 1994).
3.2.2. Anlise dos resultados de adsoro do colesterol em leito de slica
Os resultados da concentrao de colesterol na fase mvel na sada do
leito foram usados para ajustar uma equao polinomial que descreve o
processo de saturao da slica com colesterol para os tratamentos. As curvas
que descrevem o processo de saturao da slica em funo do volume so
conhecidas como curvas de ruptura (breakthrough). A partir dessas curvas, foi
possvel determinar a carga mxima de colesterol para atingir uma determinada
reduo na concentrao de colesterol do leo de manteiga.
Baseado na reviso de literatura, uma reduo de 90% na
concentrao de colesterol considerada excelente e, portanto, determinou-se
a carga mxima para atingir esse nvel. Esses dados foram usados para
determinar uma equao de regresso que descreve a carga mxima para
cada tipo de slica em funo das variveis temperatura e quantidade de slica.
31
O ajuste dos modelos polinomiais e anlise estatstica dos dados foram

feitos atravs do programa computacional para anlise estatstica SAS,
usando um nvel de 5% de probabilidade (SAS, 1995).
3.2.3. Anlise de produtos de oxidao do colesterol por HPLC
Amostras da fase mvel na sada do leito at o incio do processo de
saturao do adsorvente (leo de manteiga com baixa concentrao de
colesterol) foram analisadas por HPLC para determinao da concentrao de
produtos de sua oxidao. Foram pesados aproximadamente 1,0 g da amostra.
Esta foi dissolvida em 1 mL de acetato de etila (MERCK) dissolvido em
metanol (CHEMCO) (50% em volume), para reduzir a viscosidade e ento
aplicado coluna Sep-Pak C18 . A coluna Sep-Pak C18 foi ativada com 10 mL
de gua destilada, seguido por 10 mL de metanol antes da aplicao da
amostra. A maior parte do colesterol e dos triglicerdeos foram eludos da
coluna com 1 mL de acetato de etila dissolvido em metanol (50% em volume).
Os produtos da oxidao do colesterol e as impurezas residuais foram eludos
com 10 mL de metanol e 6 mL de acetato de etila dissolvidos em metanol (50%
em volume). O solvente foi removido em rotavapor a 40C e o resduo
dissolvido em 1 mL da fase mvel constituda de isopropanol em hexano
(12% em volume). Os xidos usados como padres foram 25-hidroxicolesterol
e 7--hidroxicolesterol (MERCK). As anlises foram feitas em triplicata (CHEN
et al., 1994).
3.2.4. Condies cromatogrficas e equipamentos para anlise de
colesterol e produtos de sua oxidao
As anlises por HPLC foram realizadas usando um Cromatgrafo
Lquido (Modelo CG480C) equipado com vlvula de injeo e loop de
100 L, um Detector UV50 (VARIAN ) e uma coluna de slica gel (Micropak,
VARIAN ) com granulometria mdia de 5 m, dimetro interno de 4 mm e

30 cm de comprimento. A fase mvel foi a mistura de 2-propanol (VETEC) em
hexano (VETEC), 5% em volume para anlise de colesterol e 12% em volume
32
para anlise dos produtos da oxidao do colesterol. O fluxo foi de 1,0 mL/min
e a deteco foi realizada no comprimento de onda de 208 nm com a
quantificao das reas feita em um Registrador-Integrador CG200. As
injees, em um injetor Rhodyne 7125, foram de 60 L das amostras
preparadas, utilizando-se seringa HAMILTON de 100 L (CASIRAGHI et al.,

1994; PARK e ADDIS, 1985).
33
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1. Anlise do leo de manteiga por cromatografia

Na Figura 7 so apresentados os cromatogramas do leo de manteiga
original, cuja concentrao inicial de colesterol foi de 246 mg + 15 mg em 100 g
de leo, e do leo de manteiga na sada do leito at ocorrer a saturao. O
tempo de reteno do colesterol nas condies usadas para anlise por
cromatografia lquida de alto desempenho foi de 4,4 minutos.
Analisando-se esses cromatogramas, pode-se verificar que houve uma
reduo na rea do pico referente ao colesterol no incio do processo e que
outros picos foram alterados. Isso indica que a slica adsorve outros compostos
da frao insaponificvel do leo de manteiga. Ainda, um mesmo pico
apresenta uma rea maior no incio do processo e depois a sua rea vai
diminuindo e aumentando; ao final, podendo estar relacionado a possveis
compostos que possuem tempo de reteno muito prximos nas condies de
anlise, mas tempos de reteno diferentes para a cromatografia preparativa.
Isso observvel na seqncia de cromatogramas (a), (b), (c), (d), (e) e (f),
indicando uma provvel alterao na composio qumica da frao
insaponificvel do leo de manteiga com teor de colesterol reduzido.
34
(b)
(a)
(c)
(d)
rea
colesterol
4,4
(e)
4,4
4,4
(f)
4,4
(g)
rea
4,4
4,4
Tempo de Reteno (minutos)
4,4
Figura 7 - Cromatogramas representando o pico do colesterol durante o

processo de saturao da slica gel: a) leo de manteiga nas
primeiras fraes da fase mvel; b, c, d, e e) leo de manteiga na
fase mvel durante a saturao; f) leo de manteiga na fase mvel
com a slica saturada; e g) leo de manteiga.
35
4.2 . Curvas de adsoro do colesterol

Em leito fixo, a curva representando a concentrao do soluto na fase
fluida em funo do tempo na sada do leito denominada curva de ruptura.
Essa curva tem a forma de S (McCABE et al., 1993). Neste trabalho, foi
construda a curva relacionando a razo entre concentrao do colesterol no
leo na sada do leito (C) e a concentrao inicial (Co) e a quantidade de
colesterol injetado (mg) por grama de slica.
A taxa de transferncia de massa para adsoro em leito fixo obtida
pela equao:
c/t + (1 - ) W/t = - uo c/L
O termo a frao do volume do leito no-ocupado pela slica; c/t

a variao da concentrao do colesterol na fase fluida, em funo do tempo;
a densidade do adsorvente; W/t a variao entre a massa de colesterol
adsorvido por unidade de massa do adsorvente em funo do tempo; uo a
velocidade superficial da fase fluida; e c/L a variao da concentrao do
colesterol na fase fluida em funo da altura do leito. O mecanismo de
transferncia inclui a difuso em torno da partcula e a difuso atravs dos
poros do adsorvente (McCABE et al., 1993).
4.2.1. Efeito da Temperatura
Nas Figuras 8 a 10 so apresentadas as curvas de ruptura para a slica
de menor granulometria (5 m a 40 m), representando o efeito da temperatura
para as colunas com 10 g, 12,5 g e 15 g, respectivamente.
36
1,0 0
C/Co
0,8 0
70 C
80 C
90 C
0,6 0
0,4 0
0,2 0
0,0 0
4
10
12
14
16
Co les te ro l inje tad o (mg ) p o r g r ama de s lic a
Figura 8 - Curva de ruptura para a coluna com 10 g de slica gel (granulometria

de 5 m a 40 m).
1,00
70 C
C/Co
0,80
80 C
0,60
90 C
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Coles terol injetado (mg) por grama de s lic a
Figura 9 - Curva de ruptura para a coluna com 12,5 g de slica gel

(granulometria de 5 m a 40 m).
37
1,00
C/Co
0,80
70 C
0,60
80 C
0,40
90 C
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Figura 10 - Curva de ruptura para a coluna com 15 g de slica gel

Pode-se observar nas Figuras 8 a 10 que o aumento da temperatura

provocou uma reduo na quantidade de colesterol adsorvido por grama de
slica gel. Essa reduo era esperada, pois o aumento da temperatura provoca
um aumento na vibrao das molculas que reduz a capacidade do adsorvente
reter o colesterol, visto que o processo de adsoro um fenmeno de
superfcie.
Nas Figuras 11 a 13 so apresentadas as curvas de ruptura para a
slica de maior granulometria (45 m a 60 m), podendo-se observar nestas
figuras que o efeito da temperatura no aconteceu, tal como o observado para
a slica de menor granulometria. O aumento da temperatura no provocou uma
reduo na capacidade da slica. Uma possvel explicao o maior fluxo para
essas colunas, quando comparado com as colunas de slica de menor
granulometria, j que no se conhece a relao de equilbrio do processo de
adsoro (isoterma de adsoro), nem sua porosidade, tamanho dos poros e
rea para adsoro.
38
1,00
70 C
0,80
C/Co
80 C
0,60
90 C
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16

1,00
C/Co
0,80
70 C
0,60
80 C
0,40
90 C
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Figura 12 - Curva de ruptura para a coluna com 12,5 g de slica gel

39
1,00
70 C
C/Co
0,80
80 C
0,60
90 C
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16

4.2.2. Efeito da altura do leito

Nas Figuras 14 a 16 encontram-se as curvas de ruptura para a slica de
menor granulometria (5 m a 40 m), para as temperaturas de 70C, 80C e
90C, respectivamente. Nessas figuras, faz-se a comparao do efeito da
altura do leito para cada temperatura.
Observa-se que a altura do leito para a slica de menor granulometria
no apresentou efeito adicional no processo de adsoro do colesterol para as
temperaturas utilizadas, ou seja, a diferena, entre as alturas dos leitos em
estudo, no provocou nenhuma alterao no processo de adsoro, dado o
efeito da disperso axial do leo de manteiga.
40
1,00
10,0 g
C/Co
0,80
12,5 g
0,60
15,0 g
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Figura 14 - Curva de ruptura a 70C (slica com granulometria de 5 m a

40 m).
1,00
C/Co
0,80
10,0 g
12,5 g
0,60
15,0 g
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16

40 m).
41
1,00
C/Co
0,80
10,0 g
12,5 g
0,60
15,0 g
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16

40 m).
Nas Figuras 17 a 19, encontram-se as curvas de ruptura para a slica

de granulometria de 45 m a 60 m, para as temperaturas de 70C, 80C e
90C. Nessas Figuras, faz-se a comparao do efeito da altura do leito para
cada temperatura. Observa-se, nessas figuras (17,18 e 19), que a altura da
coluna para a slica de maior granulometria no apresentou efeito adicional na
quantidade de colesterol adsorvido pela slica para as temperaturas utilizadas.
Pode-se observar que, em algumas colunas, o leito no est sendo usado da
mesma forma. Isso observvel temperatura de 70 e 80C. J temperatura
de 90C essa diferena reduzida, podendo ser decorrente de uma menor
viscosidade do leo, o que facilita o seu escoamento atravs do leito. Essa
diferena na utilizao do leito pode ser proveniente do maior fluxo nessas
colunas de slica de maior granulometria e, principalmente, a dificuldade de se
obter um preenchimento manual totalmente uniforme das colunas, apesar de
se ter adotado uma padronizao para essa etapa. Isso pode ter levado a uma
disperso axial da fase mvel durante o escoamento atravs do leito.
42
1,00
0,80
C/Co
10,0 g
0,60
12,5 g
0,40
15,0 g
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Colesterol injetado (mg) por grama de s lica

60 m).
1,00
C/Co
0,80
10,0 g
0,60
12,5 g
15,0 g
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16

60 m).
43
1,00
C/Co
0,80
10,0 g
0,60
12,5 g
0,40
15,0 g
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Colesterol injetado (mg) por grama de slica

60 m).
4.2.3. Efeito da Granulometria da Slica

O efeito da granulometria da slica foi representado nas Figuras 20 a
28, nas quais TS1 a slica com granulometria de 5 m a 40 m e TS2 a
slica com granulometria de 45 m a 60 m.
Nas Figuras de 20 a 22, so representadas as curvas de ruptura para a
coluna preenchida com 10 g de slica, e adsoro s temperaturas de 70C,
80C e 90C, sendo que o objetivo dessas curvas comparar o efeito da
granulometria da slica no processo de adsoro.
Para a coluna com 10 g de slica, observa-se nas Figuras 20 a 22 que
o aumento da temperatura aproxima a quantidade de colesterol adsorvido por
grama de slica, para as duas granulometrias utilizadas.
44
1,00
C/Co
0,80
TS1
0,60
TS2
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Coles terol (mg) injetado por grama de s lic a
Figura 20 - Curva de ruptura a 70C para as colunas com 10 g de slica.
C/Co
1,00
0,80
TS1
0,60
TS2
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
45
1,00
C/Co
0,80
TS1
TS2
0,60
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Nas Figuras 23, 24 e 25 so mostradas as curvas de ruptura para as

colunas preenchidas com 12,5 g de slica, e temperaturas de adsoro de
70C, 80C e 90C.
Observa-se nas Figuras 23 a 25 que os resultados apresentados para
as colunas preenchidas com 10 g de slica foram confirmados, ou seja,
medida que se aumenta a temperatura de trabalho, os dois tipos de slica
tendem a ter as curvas de ruptura muito prximas.
Nas Figuras 26, 27 e 28 so mostradas as curvas de ruptura para as
colunas preenchidas com 15 g de slica s temperaturas de 70C, 80C e 90C.
46
1,00
C/Co
0,80
TS1
0,60
TS2
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Figura 23 - Curva de ruptura a 70C para as colunas com 12,5 g de slica.
1,00
C/Co
0,80
TS1
0,60
TS2
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Figura 24 - Curva de ruptura a 80 C para as colunas com 12,5 g de slica.
47
1,00
0,80
C/Co
TS1
0,60
TS2
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Figura 25 - Curva de ruptura a 90C para as colunas com 12,5 g de slica.
1,00
C/Co
0,80
TS1
TS2
0,60
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
48
1,00
C/Co
0,80
TS1
TS2
0,60
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
1,00
0,80
C/Co
TS1
0,60
TS2
0,40
0,20
0,00
4
10
12
14
16
Figura 28 - Curva do ruptura a 90C para coluna com 15 g de slica.
49
Os dados representados nas Figuras 20 a 28 confirmam que o aumento de

temperatura para as colunas utilizadas tornam as curvas de ruptura para as
diferentes slicas mais prximas. Isso pode estar relacionado com o aumento da
vibrao molecular, ou seja, para slica com granulometria de 45 m a 60 m cujo
fluxo foi de 1,50 mL/min + 0,3 mL/min, maior do que o fluxo para a slica com
granulometria de 5 m a 40 m (0,37 mL/min + 0,1 mL/min), compensado pelo
aumento de temperatura que provoca o aumento das vibraes moleculares. Mas
ainda vale ressaltar que no se conhece a rea superficial das slicas, nem a sua
porosidade. O Quadro 7 mostra as equaes obtidas por regresso para os
tratamentos aplicados e representados graficamente nas figuras anteriores.
O modelo polinomial ajustado aos dados das curvas de ruptura so
apresentados no Quadro 7. O termo C/Co a razo entre as concentraes de
colesterol na fase mvel na sada do leito e no leo de manteiga original, X o
colesterol injetado no leito (mg) por grama de slica. Cada tratamento est definido
no Quadro 5.
50
Quadro 7 - Modelo polinomial ajustado aos dados das curvas de ruptura
Tratamento
Equaes
R2
C/Co = - 0,0129X3 + 0,4356X2 - 4,6236X + 15,7877
0,9957
C/Co = - 0,0427X3 + 1,2252X2 - 11,3002X + 33,8989
0,9986
C/Co = - 0,0295X3 + 0,7260X2 - 5,5892X + 13,8404
0,9986
C/Co = - 0,0645X3 + 1,9199X2 - 18,5840X + 58,9091
0,9992
C/Co = - 0,0296X3 + 0,7989X2 - 6,8471X + 18,9565
0,9982
C/Co = - 0,0800X3 + 1,8585X2 - 13,8130X + 33,2838
0,9769
C/Co = - 0,0357X3 + 1,1500X2 - 11,9599X + 40,4848
0,9991
C/Co = - 0,1090X3 + 2,9305X2 - 25,7242X + 74,1686
0,9999
9
10
0,9981
0,9948
C/Co = - 0,0424X + 1,0743X - 8,6698X + 22,6141

C/Co = - 0,0061X + 0,1563X - 1,1403X + 2,6134
11
C/Co = - 0,0046X + 0,1257X - 0,9385X + 2,1080
0,9913
12
C/Co = - 0,0088X3 + 0,2191X2 - 1,6007X + 3,6896
1,0000
13
C/Co = - 0,0260X3 + 0,6393X2 - 5,3930X + 13,9385
1,0000
14
C/Co = - 0,0041X3 + 0,1160X2 - 0,9262X + 2,2884
0,9900
15
C/Co = - 0,0180X3 + 0,4355X2 - 3,2096X + 7,5259
0,9991
16
C/Co = - 0,1253X3 + 2,9323X2 - 22,2247X + 54,9131
0,9993
17
C/Co = - 0,0362X3 + 0,8488X2 - 6,2694X + 14,8762
0,9997
18
C/Co = - 0,0394X3 + 0,8972X2 - 6,4526X + 14,9612
0,9986
51
4.3.
Influncia das variveis na quantidade mxima de colesterol

adsorvido
A influncia das variveis temperatura (70C, 80C e 90C) e massa de
slica (10,0 g, 12,5 g e 15,0 g) para cada granulometria de slica utilizada na

quantidade mxima de colesterol adsorvido esto representadas nas curvas do
ruptura para a remoo de 90% (C/Co = 0,1) de colesterol do leo (Quadro 8 ).
Quadro 8 - Equaes relacionando a quantidade mxima de colesterol

adsorvido e as variveis em estudo para reduo de 90% da
concentrao de colesterol do leo de manteiga
Granulometria
Equao
da Slica
R2
5 m a 40 m
Z = 38,2400 0,1158 X 3,4553 Y + 0,1411 Y2 0,9479
45 m a 60 m
Z = 6,9479
--------
Pelas equaes obtidas no Quadro 6, nas quais X a temperatura (C),

Y a quantidade de slica (g) e Z o colesterol injetado (mg) por grama de
slica, pode-se verificar que temperaturas mais baixas para a slica de menor
granulometria (5 m a 40 m) permite injetar maior massa de colesterol para se
obter 90% de reduo na concentrao de colesterol. Entretanto, a temperatura
ideal para a separao cromatogrfica precisa ainda ser determinada,
dependendo de diversas variveis, incluindo o nvel de reduo na
concentrao de colesterol no leo, o custo operacional, a limpeza da slica,
entre outros.
Em relao altura do leito (quantidade de slica), observa-se uma
reduo na carga mxima para a coluna com 12,5 gramas, enquanto para as
outras colunas mantm valores muito prximos para cada temperatura (Figura
29). Esse comportamento no-esperado pode ser em virtude do preenchimento
da coluna, que a etapa considerada crtica para este processo.
Para a slica de maior granulometria (45 m a 60 m), a temperatura e
a altura do leito (quantidade de slica) no apresentaram nenhum efeito
52
estatisticamente significativo, a 5% de probabilidade, no processo. Isso permite

concluir que, para as condies de trabalho utilizadas, a relao entre o
dimetro da coluna e altura, tem um efeito mnimo sobre a quantidade mxima
de colesterol adsorvido. A coluna preenchida com a slica de maior
granulometria tem a vantagem de provocar menor queda de presso no leito.
Nas Figuras 29 e 30, so representadas graficamente as equaes do
Quadro 6. Pode-se observar que, para a slica com menor granulometria, o
aumento de temperatura provocou uma reduo na quantidade de colesterol
adsorvido por grama de slica e a altura do leito apresentou um ponto de
mnimo que no era esperado. Esse comportamento no-esperado provocado
pela altura do leito pode estar relacionado com a dificuldade do preenchimento
manual. Para a slica de maior granulometria, tanto a temperatura quanto a
altura do leito no apresentaram efeitos na quantidade de colesterol adsorvido
pela slica.
Z = 38,2400 0,1158 X 3,4553 Y + 0,1411 Y2
R2 = 0,9479
mg colesterol injetado
por grama de slica
10,5
9,5
8,5
7,5
15
6,5
70
12,5
T e mp e
6,5-7,5
80
r a tu r a
7,5-8,5
10
( C )
Slic a (g)
90
8,5-9,5
9,5-10,5
Figura 29 - Efeito da temperatura e da massa de slica na quantidade mxima

de colesterol injetado para reduo de 90% da concentrao para
a slica gel de menor granulometria.
53
Z = 6,9479
m g colesterol injetado
por gram a de slic a
11
10
9
8
15
7
70
12,5
80
Te m p e
ra
6,5-7,5
10
tu ra ( C
)
7,5-8,5
90
8,5-9,5
S lic a (g)
9,5-10,5
Figura 30 - Efeito da temperatura e da massa de slica na quantidade mxima

de colesterol injetado para reduo de 90% na concentrao para a
slica gel de maior granulometria.
No Quadro 7, apresenta-se um resumo da quantidade
mxima de
colesterol injetado por grama de slica para cada um dos tratamentos, e a

quantidade mxima de leo produzido com 90% de reduo na concentrao
de colesterol. Neste mesmo Quadro, TS1 a slica de menor granulometria e
TS2 a slica de maior granulometria.
Considerando os resultados obtidos neste trabalho e a quantidade de
leo produzido com concentrao de colesterol reduzido por grama de slica,
podemos observar que uma maior altura do leito proporcionou uma maior
produo de leo com concentrao de colesterol reduzido, j que houve uma
reduo no volume intersticial por grama de slica, portanto uma maior
produo de leo a partir de uma mesma relao de leo e massa de
adsorvente. Isto observvel no Quadro 9 na produo do leo com 90% de
reduo na concentrao de colesterol para a slica de maior granulometria.
54
Apesar da carga mxima admitida ser a mesma, o volume de leo produzido foi
maior para a coluna com maior altura (15 g de slica).
Quadro 9 - Quantidade mxima de leo produzido por grama de slica, com

90% de reduo na concentrao de colesterol, a partir de um
leo com uma concentrao de 246 mg por 100g
T (C)
Slica (g)
70
70
70
80
80
80
90
90
90
10,00
12,50
15,00
10,00
12,50
15,00
10,00
12,50
15,00
Colesterol injetado (mg) leo produzido (mL) por

por grama de slica
grama de slica
TS1
TS2
TS1
TS2
9,7
6,9
2,7
1,6
9,0
6,9
2,5
1,6
10,1
6,9
3,1
1,7
8,5
6,9
2,2
1,6
7,8
6,9
1,9
1,6
8,9
6,9
2,5
1,7
7,4
6,9
1,6
1,6
6,7
6,9
1,3
1,6
7,7
6,9
2,0
1,7
Segundo KEEN (1991), os principais adsorventes para o processo de

remoo de colesterol e seus xidos da gordura do leite so preferencialmente
selecionados de um grupo que consiste de carvo, carvo ativado, carvo
impregnado com sais metlicos, silicatos, aluminas e compostos de magnsio.
Destaca-se, ainda, a necessidade do uso de grande quantidade de
adsorventes para se conseguir uma boa separao. Para um processo
contnuo, uma reduo de 90% na concentrao de colesterol foi atingida
quando foi utilizada uma relao de 0,8 mL a 0,3 mL de leo por grama de
adsorvente, que variou de acordo com o tipo de adsorvente utilizado. Neste
trabalho, foi possvel obter at 3,1 mL de leo por grama de slica (5 m a
40 m). Para a slica de maior granulometria, foi possvel obter at 1,7 mL de
leo por grama de slica.
Ainda, vale ressaltar que no trabalho realizado por KEEN (1991),
quando carbono era impregnado com sais metlicos, a capacidade para a
adsoro do colesterol era aumentada muito significativamente, uma possvel
alternativa para melhorar a capacidade da slica.
55
Considerando os resultados obtidos, esse processo surge como uma

alternativa para a elaborao de produtos com baixa concentrao de
colesterol.
A dieta um dos muitos fatores que levam ao aumento do colesterol e
uma dieta balanceada pode ajudar na reduo do colesterol sangneo,
portanto a produo de alimentos com baixa concentrao de colesterol uma
alternativa competio dos produtos de origem animal com os de origem
vegetal.
4.4. Efeito dos tratamentos na produo de xidos de colesterol
A anlise de xidos de colesterol teve como objetivo verificar se o
processo de remoo de colesterol, nas condies do experimento, poderia
provocar a formao desses compostos.
Os
resultados
mostraram
que
as
concentraes
dos
xidos
25-hidroxicolesterol e o 7--hidroxicolesterol estavam abaixo do limite de

deteco do mtodo utilizado neste trabalho (Figuras 31 e 32).
Para
as
25-hidroxicolesterol
condies
no
leo
de
foi
anlise,
menor
que
concentrao
10
g/g
do
xido
xido
7--hidroxicolesterol foi menor que 5 g/g. Esses resultados esto de acordo

com os obtidos por CSIKY (1982) que encontrou 2,6
g do xido
25-hidroxicolesterol por grama de leo em manteiga. NIELSEN et al (1996)

encontraram 0,26 g do xido 7--hidroxicolesterol por grama de leo.
KEEN (1991) conclui que colunas empacotadas com adsorventes
podem ser usadas para reduo do colesterol e seus xidos em gordura de
leite anidra. Em seu trabalho, usando carvo como adsorvente, os xidos
analisados foram completamente removidos nas primeiras fraes da fase
mvel e. entre estes, o 5,6--epoxicolesterol. Portanto, considerando os
resultados obtidos por KEEN (1991) e que o xido 25-hidrocolesterol um dos
mais txicos, o processo de adsoro um processo que pode ser usado tanto
para reduzir o colesterol quanto seus xidos.
56
Figura 31 - leo de manteiga adicionado de 4 g do xido 25-hidroxicolesterol

e 0,8 g do xido 7--hidroxicolesterol. Condies de anlise (fase
mvel de 12% de isopropanol em hexano com fluxo de 1 mL/min,
com detector a 208 nm).
57
Figura 32 - leo de manteiga. Condies de anlise (fase mvel de 12% de

isopropanol em hexano com fluxo de 1 mL/min, com detector a
208 nm).leo de manteiga original (xidos abaixo do limite de
deteco).
58
5. RESUMO E CONCLUSES
Avaliou-se o processo de remoo de colesterol da gordura de leite por

adsoro em coluna cromatogrfica com slica gel em funo da temperatura,
altura do leito (quantidade de slica) e granulometria.
Usando leo de manteiga com uma concentrao inicial mdia de
246 mg por 100 g, obteve-se uma reduo de at 95% na concentrao para
as primeiras fraes da fase mvel.
Para a slica de menor granulometria, foi possvel injetar uma
quantidade mxima de 10,1 mg de colesterol por grama de slica para atingir a
reduo de 90% na concentrao de colesterol no leo. A reduo de
temperatura resultou num aumento da quantidade mxima de colesterol
adsorvido pelo adsorvente. A altura do leito no alterou a quantidade mxima
de colesterol adsorvido, mas provocou uma reduo no volume intersticial por
unidade de massa do adsorvente, portanto um aumento na quantidade de leo
produzido quando se utiliza uma mesma relao de leo e adsorvente. Foi
possvel produzir at 3,1 mL de leo com uma reduo de 90% na
concentrao de colesterol por grama de adsorvente.
Para a slica de maior granulometria, a temperatura no apresentou
efeito significativo, e a altura do leito somente reduziu o volume intersticial do
leito por unidade de massa de slica, da mesma forma que a slica de menor
granulometria. A quantidade mxima de colesterol admitida foi de 6,9 mg, com
uma produo de at 1,7 mL de leo por grama de slica.
59
Apesar da slica de menor granulometria ter apresentado uma carga

mxima maior por unidade de massa do adsorvente, os resultados mostraram
que o efeito de um fluxo menor pode ter alterado os resultados, j que no se
conhece a porosidade, nem a rea superficial. Em temperaturas mais altas, a
quantidade mxima de colesterol adsorvido apresentou uma diferena menor
entre as duas slicas.
Foi verificado que os tratamentos no provocaram aumento, alm da
capacidade de deteco, na concentrao dos xidos, imediatamente aps o
processo, ou, pelo menos, estavam em concentraes inferiores a 10 g/g de
leo para o xido 25-hidroxicolesterol, e 5 g/g de leo para o xido
7--hidroxicolesterol.
60
6. RECOMENDAES
Existem diversas propriedades fsicas e variveis operacionais que

influenciam o processo de adsoro em leito fixo. Especificamente, para o
colesterol, sero estabelecidas algumas sugestes de pesquisas que visem
contribuir com os dados j existentes, como se segue abaixo:
Fazer estudo da relao de equilbrio (isoterma de adsoro).
Verificar o efeito da porosidade e rea superficial na quantidade mxima de

colesterol adsorvido.
necessrio fazer um estudo sobre a cintica de adsoro do colesterol na

slica gel, com o objetivo de verificar como o fluxo atravs do leito pode
alterar o valor da quantidade mxima de colesterol adsorvido.
Verificar o comportamento do processo em temperaturas menores, entre

40C e 70C.
Determinar a possibilidade de recuperao do adsorvente com o uso de

solventes.
Verificar a estabilidade quanto aos aspectos fsico-qumicos e sensoriais

dos produtos elaborados com o leo de manteiga contendo baixa
concentrao de colesterol.
61
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Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais.
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GERSON DE FREITAS SILVA VALENTE

REMOO DE COLESTEROL DA GORDURA DO LEITE POR ADSORO

Tese apresentada Universidade

Aos meus pais Jos Maria e Suzana.

Universidade Federal de Viosa, pelo Programa de Ps-graduao.

GERSON DE FREITAS SILVA VALENTE, filho de Jos Maria e

2.5.4.1. Fatores importantes em separaes por cromatografia

VALENTE, Gerson de Freitas Silva, M.S., Universidade Federal de Viosa,

5 g/g de leo para o xido

7--hidroxicolesterol logo aps o processo. Portanto, com base nos resultados,

pode-se afirmar que a tcnica uma alternativa promissora para a remoo de

VALENTE, Gerson de Freitas Silva, M.S., Universidade Federal de Viosa,

O colesterol uma pequena molcula que recebeu grande ateno na

Segundo dados do Ministrio da Sade (BRASIL, 1994), no Brasil, as

O objetivo geral desta pesquisa foi estudar o efeito de algumas

O primeiro problema associado presena de colesterol em alimentos

colesterol tambm o precursor dos hormnios esteris do crtex da glndula

Figura 1 - Estrutura Qumica do Colesterol.

O colesterol encontrado em diversos alimentos, em concentraes

Quadro 1 - Concentrao de colesterol em diferentes alimentos

Fonte: SIEBER, 1993.

A gordura saturada e os cidos graxos saturados no so totalmente

Figura 2 - Representao grfica da Arteriosclerose.

Na verdade, os steres de colesterol vindos da dieta so hidrolisados

Quadro 3 - Concentrao (%) de gordura e colesterol em alguns produtos

Fosfolipdeos Colesterol cidos graxos livres

Fonte: MULDER e WALSTRA, 1974.

2.3. Limitao produo de alimentos com colesterol reduzido

2.5. Tecnologias para reduo do colesterol do leite

Quadro 4 - Mtodos para remoo de colesterol de gorduras

2.5.1. Processos biolgicos

Figura 3 - Transformao de colesterol em coprostanol por colesterol redutase.

O principal problema com essas enzimas parece ser a acessibilidade

Figura 4 - Transformao do colesterol em colestenona por colesterol oxidase.

(KLAVER e MEER, 1993; GILLILAND e SPECK, 1977; RASIC et al., 1992;

relacionados elevada quantidade de complexante necessria e dificuldades

legislao de alimentos, eventual presena de saponinas residuais no produto,

Alm da microparticulao, existem os substitutos base de gorduras,

(BOUDREAU e ARUL, 1993).

elevados, considerando-se o sistema de vcuo necessrio para realizar a

solvente de extrao temperatura e presso prximas e acima do ponto

enquanto molculas de colesterol associadas com triglicerdeos de cadeia

2.5.4. Cromatografia preparativa

2.6. FDA (Food and Drug Administration) e o colesterol

cromatografia lquida de alto desempenho (HPLC, do ingls High Performance

2,5 mg/224 g Baixo

Fonte: FDA, 1990.

(a) De acordo com Classificao citada pela FDA, 1986;

2.7.1. Cromatografia gasosa

2.7.2. Cromatografia lquida de alto desempenho

graxos, lcoois, alcalides, aminas, antioxidantes, barbitricos,

corantes, esterides, fenis, lipdeos e vitaminas (COLLINS et al., 1997).

Este trabalho foi realizado nos laboratrios de Anlise de Alimentos e

METER, IEC ), numa acelerao equivalente a 800 g por 10 minutos. A fase

Figura 5 - Esquema da montagem da coluna para estudo do processo de

O fluxograma (Figura 6) representa a metodologia que foi usada para

Eluio em Sep-pak C18

Diluio na Fase Mvel

Diluio na Fase Mvel

3.1.1.1. Delineamento experimental

3.2. Metodologia da anlise quantitativa de colesterol do leo de manteiga

O ajuste dos modelos polinomiais e anlise estatstica dos dados foram

100 L, um Detector UV50 (VARIAN ) e uma coluna de slica gel (Micropak,