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NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
Departamento de Formacin Bsica
Disciplinaria
Academia de Bioqumica Mdica I
MANUAL DE LABORATORIO
DE
BIOQUMICA MDICA I
SEMESTRE: AGOSTO-DICIEMBRE
M X I C O ,
D . F.
2 0 1 6
NOMBRE DEL ALUMNO(A):
No. BOLETA:
SEMESTRE:
GRUPO:
EQUIPO:
PROFESORES
LABORATORIO:
LABORATORIO:
LABORATORIO:
No. PRCTICA
FECHA
Vo. Bo.
PROFESOR (A)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
PROFESORES DE LA ACADEMIA
Alfredo Montiel Mrquez
MISIN
La Escuela Superior de Medicina del Instituto Politcnico Nacional es una institucin de educacin mdica,
pblica, laica y gratuita, con un legado histrico identificado con las necesidades de salud de la poblacin
ms desprotegida; cuenta con una planta de destacados profesores, instalaciones fsicas y campos clnicos,
que garantizan una slida formacin mdica. Forma mdicos generales de alta calidad, creativos y eficientes;
con compromiso social, humanitario, de equidad, tico, ecolgico y crtico, tanto en el sector pblico como
en el privado, contribuyendo a mejorar las condiciones de salud y de desarrollo social de la poblacin.
Realiza investigacin cientfica, genera y difunde el conocimiento y fomenta la educacin mdica continua y
el posgrado. Apoya al Sistema Nacional de Salud y participa en el desarrollo cientfico, tecnolgico y social
del pas.
VISIN
La Escuela Superior de Medicina del Instituto Politcnico Nacional, mantendr su carcter de institucin
pblica de educacin mdica con slidas bases en el conocimiento cientfico y tecnolgico, en constante
actualizacin e innovacin, en un marco de calidad, equidad y servicio. Incrementar desarrollo de la
investigacin cientfica, el posgrado y la educacin mdica continua, manteniendo una vinculacin con los
procesos formativos de los profesionales de la salud de alto nivel, para destacar dentro de las Escuelas y
Facultades de Medicina del pas por la formacin de mdicos generales de alta calidad que conforme al
panorama epidemiolgico sean competentes para atender los problemas de salud y la emergencia de nuevas
patologas, bsicamente en el primer nivel de atencin, contribuyendo as a mejorar la salud y el desarrollo
social de la poblacin en constante interaccin con todos los sectores de la sociedad. Continuar participando
en la rectora de la educacin mdica en el pas, en el desarrollo cientfico y reafirmando su compromiso con
la poblacin ms desprotegida, guiada siempre por un desarrollo basado en la calidad humana, la tica y la
excelencia acadmica.
CALENDARIO DE ACTIVIDADES
CURSO DE BIOQUMICA MDICA I
PRIMER SEMESTRE 2016-2017 (17-1)
AGOSTO-DICIEMBRE 2016
FECHA DE INICIO:
FECHA DE TERMINACIN:
DAS DE SUSPENSIN:
VACACIONES
EXMENES
Primer Examen Parcial:
Temas de teora:
Prcticas de laboratorio:
Prcticas de Laboratorio:
Prcticas de Laboratorio:
Examen Extraordinario:
Temas:
3. Material de vidrio.
o Debe examinar todo el material de vidrio antes de utilizarlo,
para detectar la existencia de grietas o roturas. En el caso de
que encuentre material defectuoso, reprtelo de inmediato al
encargado del laboratorio para que se lo cambie.
o No use el material de vidrio con orillas cortantes, con
cuarteadoras, o en general en mal estado.
o Debe transportar, mover o manipular slo la cantidad de
material de vidrio que pueda manejar con seguridad.
o Use pinzas, franela o guantes de asbesto para transportar o
mover recipientes de vidrio calientes.
o Nunca deje material roto para ser lavado, reprtelo y trelo a la basura.
o No deje vidrios rotos sobre la mesa o en cualquier otro lugar
en donde pueda causar accidentes.
o Al calentar recipientes de vidrio, use llama suave al principio
del calentamiento.
o Limpie inmediatamente los materiales que goteen o se
derramen, mediante uso de la franela u otros materiales para
embeber el lquido y evitar que se disperse.
o En caso de lquidos txicos derramados, protjase
adecuadamente y ventile el rea.
4. Equipo elctrico e instalaciones de gas.
o No use equipo elctrico defectuoso.
SIMBOLOS DE SEGURIDAD
FLAMABLE
INFLAMABLE
OXIDANTE
VENENO
EXPLOSIVO
RADIOACTIVO
EXPLOSIVO
CORROSIVO
CORROSIVO
VENENO
IRRITANTE
DAO AMBIENTAL
NDICE
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Pginas
INTRODUCCIN...
SOLUCIONES.
ELECTRLITOS y pH......
SOLUCIONES REGULADORAS.........
PROTENAS
CINTICA QUMICA Y CATLISIS.
CINTICA ENZIMTICA
GLCIDOS..
OXIDACIONES BIOLGICAS
LPIDOS...
CIDOS NUCLEICOS...
1
8
14
17
21
30
39
46
53
59
64
PRCTICA No. 1
INTRODUCCIN AL LABORATORIO
Se revisarn conceptos y procedimientos de importancia para el trabajo en el laboratorio. El alumno deber
previamente haber ledo y sujetarse al Reglamento de la Academia de Bioqumica I.
Las actividades de laboratorio constituyen una parte importante del aprendizaje de la materia de
Bioqumica Mdica I, complementando las actividades de la materia impartidas en el aula.
Es obligacin del alumno la asistencia puntual, as como participar de forma activa, obtener resultados de
los experimentos y entregar el reporte del mismo.
Es obligacin del alumno registrar los resultados de cada experimento que obtiene durante el desarrollo
de cada prctica y de la seccin de Evidencias de aprendizaje, siendo este ltimo apoyo
complementario de los resultados.
Ser de suma importancia cumplir de forma obligatoria con las medidas de seguridad, comportamiento,
uniforme y accesorios como: guantes, anteojos de proteccin o caretas transparentes, cubre bocas y bata larga.
1 Ilustrar la mesa de trabajo sealando la posicin de las tomas de corriente, desages y vlvulas de flujo.
2 Ilustrar la distribucin del laboratorio e indique las zonas de seguridad, posicin del equipo de seguridad y
la ruta de evacuacin desde la mesa.
3 En el esquema anterior, marcar la posicin de las vlvulas de apertura.
Mortero
Tubo de ensayo
Vlvula de Bunsen
Matraz aforado
Vaso de precipitados
Cristalizador
Tubos Falcn
b Conectar el tubo de ltex del mechero a la llave de gas, la que debe estar completamente cerrada, con la manija
en posicin transversal respecto de la salida del gas. No olvidar que la tubera de gas es de color amarillo.
c Verificar que el tornillo de control de flujo de gas est abierto ms o menos a la mitad de su capacidad
total. El flujo de gas se puede disminuir girando el tornillo en el sentido de las manecillas del reloj y
aumentar en sentido contrario.
d Encender el mechero aproximando la flama de un cerillo o encendedor al borde de la parte superior del
mechero e inmediatamente abrir la llave de gas, lo cual debe hacerse lentamente, avanzndola hasta que
est aproximadamente a 45 grados con el tubo del gas. Tener cuidado de no acercar su rostro, pelo u
objetos inflamables al mechero al momento de encender, ni cuando est encendido. Al usar el mechero no
deber portar guantes clnicos hechos de ltex o polietileno, tener cuidado, ya que son inflamables.
e Ajustar la cantidad de aire que entra, usando el arillo de control de flujo de aire, hasta que la flama tenga
una zona central de color azul claro rodeada de otra de color azul oscuro o violeta. La parte ms caliente
se encuentra en la punta de la zona interna. Cuando la combustin es incompleta, por falta de oxgeno, la
flama presenta color amarillo.
Evidencias de aprendizaje
1 En el esquema siguiente, indicar el tipo de mechero, as como las partes que se indican.
a
2
c
b
4
c Armar la bureta colocando la llave del lado derecho de la escala, la cual debe quedar correctamente
orientada (escala de 0 arriba y escala de 25 abajo).
d Sujetar la bureta con las pinzas teniendo cuidado que este bien sujeta, con la escala hacia el observador y a
la altura adecuada por arriba del matraz Erlenmeyer.
e Emplear siempre un vaso de precipitados de 100 mL para llenar la bureta, teniendo cuidado que la llave se
encuentre cerrada. Como precaucin, colocar un vaso de precipitados debajo de la bureta.
f Para purgar la bureta abrir completamente la llave para que el lquido salga rpidamente y pueda
arrastrar las burbujas de aire. Posteriormente, aforar al volumen total y colocar el matraz Erlenmeyer.
g Abrir la llave lentamente y dejar salir el lquido (agua) de la bureta en cantidades fijas de: 1 mL, 5 mL,
6 mL, 10 mL hasta 25 mL, agitando constantemente el matraz Erlenmeyer. Aprender a leer con precisin
la escala de la bureta. Manejar con soltura y seguridad la llave de la bureta y el matraz.
Evidencias de aprendizaje
1 Ilustrar el dispositivo de titulacin.
2 Identificar el tipo de aforo de la bureta utilizada.
3 Describir la forma correcta de leer el volumen en la bureta.
f Cerrar inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate o contamine. Asegurarse que la
mesa y la balanza queden limpias.
Evidencias de aprendizaje
1 Ilustrar la balanza, sealando la posicin del botn de encendido-apagado y del botn de tara.
2 Pesar las muestras que le solicit su profesor.
PRCTICA No. 2
SOLUCIONES
Una solucin es un sistema homogneo, formado por dos o ms sustancias qumicas. Est formada
por un solvente en el cual se dispersan uno ms solutos. Cuando ambos son lquidos miscibles, se
acostumbra nombrar solvente al que se encuentra en mayor cantidad. En las soluciones acuosas siempre se
considera el agua como solvente.
La relacin que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una solucin se llama
concentracin.
Existen varias formas de expresar la concentracin de una solucin. Las de uso ms frecuente son:
MOLARIDAD (M). Nmero de moles de soluto en un litro de solucin. Un mol se define como el
peso molecular en gramos de una sustancia, o sea la masa de una sustancia que contiene el mismo
nmero de tomos o molculas que hay en 12 g de 12C. (6.022 x 1023 o Nmero de Avogadro).
MOLALIDAD (m). Nmero de moles de soluto en 1000 g de solvente.
DILISIS
Ejemplos de membranas dialticas son el celofn y el colodin. La base del tratamiento de pacientes
renales descompensados es la dilisis, la cual es til tambin para eliminar sustancias nitrogenadas,
medicamentos en exceso o exceso de acidez en sangre. Mdicamente se refieren diversos tipos de dilisis de
los cuales mencionaremos la hemodilisis y la dilisis peritoneal.
SMOSIS Y PRESIN OSMTICA
Si dos soluciones de diferente concentracin estn separadas por una membrana semipermeable, el
solvente de la solucin menos concentrada difunde a la de mayor concentracin. Esto se explica
termodinmicamente porque la solucin diluida tiene una tendencia de escape o presin de vapor muy
grande. Esta tendencia de escape o presin de vapor es muy baja cuando la solucin est concentrada. Este
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=
=
fenmeno es conocido como smosis y ejerce una presin osmtica, propiedad coligativa de gran
importancia fisiolgica ya que interviene en la regulacin del volumen de sangre circulante, as como en la
formacin o eliminacin de edemas tisulares, y es la razn por la cual el paciente diabtico elimina
frecuentemente grandes cantidades de orina (poliuria). Esta ltima est ocasionada por la alta concentracin
de glucosa en sangre y forma parte de la triada sintomtica clsica del diabtico: polifagia, polidipsia y
poliuria.
La medicin de la presin osmtica se lleva a cabo mediante el dispositivo llamado OSMMETRO.
Este requiere de una membrana semipermeable y aunque las que ms se acercan a la perfeccin son las de
ferrocianuro de cobre y las de pergamino, por ser ms fcil de conseguir, se utilizar una membrana dialtica
de colodin (celulosa) que proporciona una medida aproximada de la presin osmtica.
La columna de sacarosa ejercer finalmente una presin que se opone al paso del agua (Presin
Hidrosttica). Calculando sta, se puede conocer la presin osmtica ya que ambas son iguales.
Esto se hace mediante la frmula: = hg donde,
= presin osmtica
h = altura a la que asciende la solucin de sacarosa (en metros)
= densidad de la solucin de sacarosa (1.088 g/mL), (convertirla a kg/m3)
g = aceleracin debida a la gravedad (9.81 m/s2)
Efectuando esta operacin encontramos la presin osmtica en Pascales. Para obtener atmsferas
usamos la siguiente equivalencia: una atmosfera igual a 1.013 x 105 Pascales
EXPERIMENTO 1. PREPARACIN DE SOLUCIONES PORCENTUALES.
Utilice la cantidad de NaCl que pes en la prctica anterior para preparar una solucin de
NaCl al 2% considerando que la pureza del reactivo es de 100%. Conserve esta solucin ya que se utiliza en
el experimento de dilisis.
Evidencia de aprendizaje:
1) Describa detalladamente los clculos que hizo para conocer la cantidad de agua destilada que es
necesario aadir al NaCl del sobre para que la solucin sea al 2%.
2) Al considerar que la solucin de NaCl es al 2%, calcule las concentraciones siguientes y detalle los
clculos correspondientes. Molaridad, Normalidad, mEq/mL, mg/mL, moles%, Osmolaridad.
EXPERIMENTO 2. DILISIS
a) Humedecer por inmersin en agua destilada durante 10 minutos el tubo de colodin o celofn de
aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm de dimetro.
b) En el tiempo de 5 minutos, preparar una solucin de NaCl (cloruro de sodio) al 5% que le indique su
profesor, considerar la pureza del reactivo al 100%.
c) Preparar dos tubos de ensayo limpios. Aadir en uno de ellos 2 mL de NaCl al 5% y 5 gotas de
AgNO3 (nitrato de plata). Al otro tubo agregar 2 mL de solucin de almidn al 1% y 2 gotas de
solucin de lugol. Agitar y observar la reaccin que ocurre en cada tubo. Etiquetar como testigo de
cloruros y testigo de almidn respectivamente.
d) Pasado los 10 minutos, cerrar un extremo del tubo de colodin con un hilo de algodn para obtener un
saco. Desechar el agua destilada utilizada, enjuagar el vaso y llenar con agua destilada nueva a un
tercio de su volumen.
e) Llenar el saco con una mezcla de 1 mL de solucin de NaCl al 5% y 10 mL de solucin de almidn al
1%.
f) Cerrar cuidadosamente el otro extremo del saco, enjuagar con agua destilada y sumergir en un vaso de
precipitados con agua destilada, cuidando de no tocar las paredes.
g) Determinar la presencia de almidn y de cloruros en el lquido que rodea al saco del vaso de
precipitados, a tiempo 0 (inmediatamente despus de sumergir el saco), 15, 30, 45 y 60 minutos.
Evidencias de aprendizaje:
1 Describir detalladamente los clculos que hizo para conocer la cantidad de agua destilada que es necesario
aadir al NaCl del sobre para que la solucin sea al 5%.
2 Calcular las concentraciones siguientes y detalle los clculos correspondientes del NaCl al 5%: Molaridad,
Normalidad, mEq/mL, mg/mL, moles%, Osmolaridad.
3 Ilustrar el montaje del experimento.
4 Explicar los resultados de la dilisis.
EXPERIMENTO 3. MEDIDA DE LA PRESIN OSMTICA POR EL MTODO DIRECTO.
El osmmetro consiste en un recipiente que contiene una solucin de sacarosa 1 M teida con rojo
neutro conectado a un capilar de polietileno por el cual asciende el nivel del lquido (ver esquema de la
tabla). El recipiente es el cuerpo de una jeringa hipodrmica de 5 mL que presenta dos bandas de hule; la del
extremo inferior permite la fijacin de una membrana de celofn humedecido previamente durante 5 minutos
en agua destilada. La banda superior sirve para sellar el orificio de llenado de la cmara. Por la parte
correspondiente al pivote, se le agrega el trocar metlico de un catter el cual se introduce en el extremo de
un capilar de polietileno. El extremo inferior de la jeringa se sumerge en un vaso de precipitados con agua
destilada. El dispositivo lo instala el personal tcnico del laboratorio. Nota: cualquier error en el montaje del
osmmetro se manifestar por salida de solucin coloreada del dispositivo.
a) Cuando el Profesor le indique, en el osmmetro marcar el nivel de la solucin de sacarosa contenido en el
tubo capilar, el cual ser el tiempo cero.
b) Medir cada 15 minutos el nivel ascendido hasta los 90 minutos.
c) Registrar sus resultados en la tabla siguiente:
Tiempo
min.
Altura
mm
0
15
10
Atm
30
45
60
75
90
Evidencias de aprendizaje:
1. Graficar el tiempo en las abscisas (eje x) y la altura en milmetros en las ordenadas (eje y).
2. Calcular la presin osmtica en atmosferas y complete la tabla.
3. Cundo deber detenerse el proceso osmtico?
4. Depende slo de la altura la presin osmtica? Explique.
5. Influye el radio del capilar en la presin osmtica? Explique.
6. La sacarosa y el colorante dializan? Explique.
7. Identificar en el esquema de la tabla de resultados todas las partes del osmmetro.
EXPERIMENTO 4. PREPARACION DE SOLUCIONES.
Prepare 50 mL de solucin 0.5 M de CH 3-COOH tomando como base los siguientes datos: El cido
actico tiene un peso molecular de 60, la pureza del reactivo es de 99.7% y la densidad a 20C es de 1.06
g/mL. Una vez preparada consrvela para utilizarla en el experimento siguiente.
Evidencia de aprendizaje:
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=
=
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1) Describa detalladamente los clculos que hizo para conocer el volumen de cido
actico concentrado que utiliz para preparar los 50 mL de dicha solucin.
R = _________ mL
de CH3-COOH.
2) Considerando que la solucin es 0.5M calcule las concentraciones siguientes
detallando los clculos:
% (p/v)
Normalidad
mmoles/L
gramos/L
mEq %
Osmolaridad
=
=
=
=
=
=
12
13
PRCTICA No. 3
ELECTRLITOS y pH
Las sustancias que permiten el paso de la corriente se conocen como electrlitos y a los que no
manifiestan esta propiedad como no electrlitos. A esta capacidad de dar paso a la electricidad se le conoce
como conductancia, propiedad que se debe a la movilidad de los iones.
Los electrlitos de clasifican en fuertes y dbiles segn la facilidad con que conducen la corriente
elctrica.
Los electrlitos fuertes se disocian completamente como las sales minerales, los hidrxidos de
metales alcalinos, y los cidos fuertes. En los lquidos del organismo encontramos ejemplos de
electrolitos fuertes: NaCl, KCl y CaCl2, entre otros.
Son electrlitos dbiles la mayor parte de los compuestos orgnicos como los cidos lctico, pirvico,
urea y otros compuestos nitrogenados.
Disueltos en el agua corporal hay ejemplos de compuestos no electrlitos como glucosa y glicerol.
CONDUCTIVIDAD
La conductividad de las soluciones electrolticas depende exclusivamente de las molculas disociadas,
y por lo tanto depende del grado de disociacin y de la concentracin de los electrlitos presentes. Entre
mayor sea la concentracin, mayor ser la conductividad, hasta un lmite determinado en el cual se hace
constante y luego disminuye, explicndose esto porque cuando la concentracin de cationes y aniones es
grande, interfieren entre s y en tal caso los cationes tienen una menor libertad para desplazarse debido a la
interaccin con los aniones cercanos en la solucin y viceversa.
Esta explicacin se puede aprovechar para explicar la fuerza inica de una solucin, ya que al no
desplazarse libremente las molculas en la solucin, la concentracin activa o actividad de las soluciones
es menor que la concentracin real, por lo tanto:
I = () Cz2
La fuerza inica (I) es la semisuma de los productos de la concentracin (C) de los iones presentes
por sus respectivas valencias (z) al cuadrado.
Se sabe que las fuerzas de atraccin entre iones de carga con signos contrarios disminuyen
rpidamente al crecer las distancias. En las soluciones concentradas, en las que los iones se encuentran ms
cercanos, se hacen mayores y por lo tanto la actividad se hace menor, en las soluciones muy diluidas la
actividad y la concentracin efectiva son equivalentes entre s.
EXPERIMENTO 1. ELECTRLISIS DEL AGUA.
Coloque un cristalizador sobre un fondo blanco y agregue 50 mL de solucin de NaCl al 2%.
Introduzca en la solucin electrodos de carbn conectados a una fuente de energa como el puente de
Wheatstone o una pila de 6 9 V.
Observe la formacin de gas en los electrodos, agregue entre ambos 5 gotas de azul de bromofenol
como indicador.
Observe los cambios de coloracin en la solucin cercana a los electrodos.
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=
=
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Evidencias de aprendizaje:
a) Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos, incluida la del
indicador.
b) Ilustre el proceso de la electrlisis del agua.
EXPERIMENTO 2. CONDUCCIN DE CORRIENTE EN ELECTRLITOS FUERTES Y DBILES.
Coloque la solucin de HCl 0.5M en un vaso de precipitados de 100 mL en cantidad suficiente para
que tenga contacto con los electrodos en una tercera parte de su longitud.
Introduzca los electrodos conectados a una fuente de energa y observe el paso de la corriente
elctrica manifestado por la intensidad de la luz emitida por el foco, como se indique en el siguiente
esquema:
Lmpara
Fuente
Observe tambin la intensidad luminosa con relacin a la distancia entre los electrodos, sin ponerlos
en contacto.
Repita el experimento usando CH3COOH 0.5M.
Evidencias de aprendizaje:
1) Anote sus resultados valorando por medio de cruces la intensidad luminosa y la variacin
observada.
Solucin
HCl
0.5M
CH3COOH
0.5M
Intensidad luminosa
Con base en los clculos previamente hechos prepare 100 mL del par de soluciones que le indique su
profesor, consrvelas para el siguiente experimento.
De cido clorhdrico a partir de HCl al 37% de pureza y densidad de 1.18 g/mL.
De pH = 1.4, 1.7 y 2.0
De cido actico a partir de CH3-COOH al 99.7% de pureza, densidad de 1.06 g/mL y pKa = 4.74.
De pH = 3.07, 3.22 y 3.37
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=
=
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Determine con papel indicador el pH de cada una de las soluciones que prepar en el experimento
anterior. A continuacin determine el pH potenciomtrico de cada una de ellas.
Titule 20 mL de cada una de las soluciones preparadas con NaOH 0.1N, utilizando 2 gotas de
fenolftalena como indicador.
Evidencia de aprendizaje:
1) Con los datos obtenidos llene la tabla
Solucin
TITULACIN
Gasto de NaOH
Concentracin
0.1N mL
pH
N terica
Terico
ColorimtricoPotenciomtricoTerico Experimental
HCl
HCl 1:10
CH3COOH
CH3COOH 1:10
16
N real
PRCTICA No. 4
SOLUCIONES REGULADORAS
A las soluciones reguladoras se les pueden aadir cantidades relativamente grandes de
cidos o lcalis sin alterar de manera significativa su pH. Esta accin amortiguadora se debe a la
presencia en la solucin de un sistema formado por un cido o una base dbil y su sal
correspondiente.
Si se toma como ejemplo una solucin que contenga un cido dbil, al que representaremos por HA y
su sal, representada por BA los hidrogeniones existentes en ella procedern nicamente de las molculas
cidas, que se disocian como sigue:
Donde Ka es la constante de disociacin del cido. De esta ecuacin se deduce que la concentracin
de hidrogeniones es:
La relacin entre estas dos constantes es, sin embargo, tan sensiblemente constante en condiciones
ordinarias que podemos afirmar que la concentracin de A- es igual a la concentracin de la SAL.
Sustituyendo una expresin por otra en la ecuacin anterior tenemos:
Ahora bien, si -log [H+] es igual a pH, por analoga podemos decir que log de K a es igual a pKa por
lo que:
Por otra parte por las leyes de los logaritmos, las expresiones log de ([cido]/[Sal]) y + log de ([Sal]/
[cido]) son iguales y la segunda puede reemplazar a la primera, de tal modo que hechas todas las
modificaciones la ecuacin queda finalmente como sigue:
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=
=
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Esta ecuacin se conoce con el nombre de Ecuacin de HendersonHasselbalch y nos indica que el
pH de una solucin que contenga un cido dbil y su sal est determinado por el valor de pK a (constante para
cada cido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentracin de la sal entre la
concentracin del cido.
Por ejemplo, el valor de la constante de disociacin K a del cido actico es de 1.8 x10-5. El valor de
su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solucin reguladora que posea iguales cantidades de
CH3COOH y CH3COONa en concentracin 0.1N, el pH de esa solucin sera de:
Adems de servir para la preparacin de soluciones de pH conocido, las soluciones reguladoras tienen
dentro del organismo un papel de importancia capital que es el de evitar que aumente o disminuya de manera
importante la concentracin de iones hidrgeno, ya que la vida humana es posible en lmites muy estrechos
de pH, es decir, para la sangre arterial un pH de 7.40 y para sangre venosa y lquidos intersticiales 7.35.
Este ltimo es menor por tener mas CO2 y por lo tanto mas H2CO3 producido metablicamente. Se
sabe que los lmites mximos de pH en los que por algunos minutos puede permanecer el organismo sin
sufrir muchas alteraciones son de 7.0 a 7.8. En los lquidos donde existen y actan al mismo tiempo varios
sistemas amortiguadores, como sucede en la sangre, el cido o la base que entra es amortiguado por todos los
sistemas presentes de manera proporcional a la eficacia de cada uno de ellos.
La regulacin fisicoqumica tiene lugar en todos los medios que contienen reguladores, constituidos
principalmente por cidos o bases dbiles y sus sales. Por ejemplo el de fosfatos H 2PO4-/HPO4= con un pKa2
de 7.2 (o de 6.8 a la temperatura corporal), es el principal amortiguador intracelular.
El principal amortiguador extracelular en la sangre y lquidos intersticiales es el sistema bicarbonato
H2CO3/HCO3- con un pKa de 6.1.
En el interior del eritrocito, adems del bicarbonato, el amortiguador de mayor importancia es el de
hemoglobina reducida / oxihemoglobinato (HHb/HbO2). Otros sistemas son los de protenas y aminocidos.
Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existen excesos de lcali cido ya que
un cambio del pH afecta la estructura y la actividad de las protenas, la distribucin de otros iones entre las
clulas y el lquido extracelular, la actividad de hormonas y frmacos, etc.
Comportamiento cido-base de la glicina. Existen sustancias de mucha importancia en bioqumica
como son los aminocidos y las protenas los cuales tienen grupos cidos y bsicos, por lo que actan como
anfolitos. En sta prctica se determinarn las curvas de titulacin de la glicina con HCl y con NaOH.
La glicina es un aminocido que tiene un carboxilo cuyo pka se denomina pka1 y un grupo amino cuyo
pka se denomina pka2. Una propiedad conocida de los aminocidos es el punto isoelctrico (pI) que es el pH
en que el aminocido tiene carga neta 0 en solucin, y en ste caso se calcula con la siguiente frmula:
18
Describir detalladamente los clculos que realiz para cada uno de los pH solicitados.
Con los datos obtenidos y las de todo el grupo llenar la tabla siguiente:
pH
3
4
pH
Concentracin
terico
Colorimtrico
Potenciomtrico
7.2
0.01
7.2
0.1
7.4
0.01
7.4
0.1
8.0
0.01
8.0
0.1
Explicar la coincidencia o no, entre sus resultados y el clculo terico.
Gasto de
Gasto de
HCl 0.1 N
NaOH 0.1 N
19
Aadir 30 mL de solucin de glicina 0.1 N en otro vaso de precipitados de 150 mL, con la ayuda de su
Profesor agregar una barra magntica y colocar sobre el agitador, medir el pH y sin retirar el electrodo
titular con HCl 0.1 N, como se encuentra indicado en la tabla y registrar sus resultados.
Titulacin con
HCl 0.1N
mL
Acumulativo
0
0
2
2
3
5
4
9
5
14
5
19
5
24
1
25
1
26
1
27
1
28
0.5
28.5
0.5
29
Glicina 0.1 N
pH
Titulacin con
NaOH 0.1 N
mL
Acumulativo
0
0
2
2
3
5
4
9
5
14
5
19
5
24
1
25
1
26
1
27
1
28
0.5
28.5
0.5
29
Glicina 0.1 N
pH
Evidencias de aprendizaje:
1
Graficar los valores acumulativos de HCl signo negativo y a los de NaOH signo
20
PRCTICA No. 5
PROTENAS
Su nombre deriva del griego proteios que significa primordial o fundamental; contienen en su molcula C,
H, O, N y en ocasiones P y S. El nitrgeno constituye en promedio el 16%. Por hidrlisis dan aminocidos,
los cuales varan en nmero, cantidad y posicin en cada protena. La actividad de una protena depende de
su conformacin espacial, por lo que agentes fsicos y qumicos que alteran los diferentes enlaces son
capaces de anularla. Algunos de los agentes desnaturalizantes ms comunes son cidos o bases, detergentes,
metales pesados, solventes orgnicos, alcaloides, calor, radiaciones ultravioleta, rayos x, ondas ultrasnicas,
sales inorgnicas, sustancias orgnicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc. Las
protenas desnaturalizadas pierden su actividad, modifican su solubilidad y precipitan. Tal como existen en la
naturaleza se denominan protenas nativas. Las propiedades fisicoqumicas y biolgicas caractersticas de las
protenas se deben a los aminocidos que las constituyen y las reacciones coloridas que se utilizan para su
anlisis en realidad detectan la presencia de un aminocido especfico. Muchas de las propiedades qumicas
de las protenas son comunes a varias especies por que contienen el mismo tipo de aminocidos, por lo que
para caracterizar una protena es necesario estudiar sus propiedades fisicoqumicas las cuales dependen del
peso molecular, de su carga elctrica neta y de la conformacin que adopte la molcula.
REACCIONES QUMICAS.
REACCIN DE MILLN: Es especfica para el grupo fenlico y por lo tanto, la dan positiva todas las
sustancias que poseen esta funcin, como el fenol, cido saliclico, timol, tirosina y todas aquellas
protenas que contengan tirosina.
REACCIN DEL BIURET: Todas las molculas que contengan dos o ms uniones peptdicas, por lo tanto
todas las protenas y pptidos no menores de 3 unidades, dan positiva la reaccin del biuret. El nombre se
debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba. Cuando una protena o un
polipptido se hacen reaccionar con sulfato CuSO 4 en solucin alcalina se produce un color caracterstico
prpura o violeta. El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los tomos de
nitrgeno de los enlaces peptdicos. Esta reaccin nos sirve para diferenciar las protenas y pptidos de los
aminocidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrlisis, la reaccin ser negativa
cuando la hidrlisis sea completa.
REACCIN DE AMINOCIDOS AZUFRADOS: Las protenas que contengan los aminocidos cistena
y cistina cuando se tratan con lcalis concentrados, desprenden H2S, el cual se puede reconocer por su olor
21
desagradable y caracterstico, o bien, por la formacin de un precipitado negro de PbS al reaccionar con
(CH3COO)2Pb.
REACCIN XANTOPROTICA: Esta reaccin se debe a la formacin de nitroderivados aromticos por
reaccin del cido ntrico sobre grupos aromticos que poseen algunos aminocidos como la fenilalanina,
la tirosina y el triptfano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas protenas que tengan aminocidos
aromticos en su molcula.
REACCIN DE LA NINHIDRINA: Es una de las reacciones ms sensibles para identificar aminocidos
en general, ya que detecta una parte de aminocido en 1 500 000 partes de agua. Aminocidos y muchas
aminas primarias dan un color violeta caracterstico. La prolina da coloracin amarilla. Por su sensibilidad
esta reaccin se emplea para valoracin cuantitativa de aminocidos por colorimetra.
PROPIEDADES FISICOQUMICAS.
DESNATURALIZACIN DE PROTENAS: Cuando la estructura altamente ordenada de una protena se
somete a la accin de agentes fisicoqumicos desnaturalizantes, queda reducida al llamado polmero
estadstico o cadena de aminocidos y adems pierde toda actividad biolgica. Algunos de los agentes
desnaturalizantes ms importantes son los metales pesados, los cidos fuertes y el alcohol.
PRECIPITACIN DE PROTENAS POR METALES PESADOS: Las protenas cuando se encuentran en
solucin a pH superiores a su punto isoelctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados
formando los correspondientes proteinatos insolubles. Tomaremos como ejemplo dos protenas, la peptona
y la gelatina y observaremos su reaccin, en forma simultnea frente a los metales pesados: Fe, Ag, Hg, y
Pb.
PRECIPITACIN DE PROTENAS POR EFECTO DE CIDOS FUERTES: Los cidos fuertes son
capaces de desnaturalizar a las protenas formando productos de desnaturalizacin insolubles conocidos
como metaprotenas.
PUNTO ISOELCTRICO: Las protenas al igual que los aminocidos son molculas anfteras. Es decir,
pueden reaccionar con cidos o con lcalis. En medio cido las protenas se combinan con los iones hidrgeno
y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberan protones y quedan con carga negativa. El pH en el cual
una protena no posee carga elctrica neta se denomina punto isoelctrico, a este pH la protena presenta su
mnima solubilidad y generalmente precipita, teniendo adems una viscosidad mxima.
22
Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y enumerar del 1 al 5, colocar en cada tubo 2 mL de
las soluciones siguientes:
Tubo
1
2
3
4
5
Soluciones
Agua
Peptona al 2%
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparicin de un precipitado blanco el cual por
accin del calor se vuelve rojo. La presencia de sales y soluciones muy alcalinas, pueden interferir en esta
reaccin.
Evidencias de aprendizaje
1)
Escribir la composicin del reactivo de Milln y explicar cul es el mecanismo propuesto para esta
reaccin.
2)
Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5, aadir 1 mL de las siguientes
soluciones:
Tubo
1
2
3
4
5
Soluciones
Agua
Peptona al 2%
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
Agitar los tubos y observar la reaccin que se produce en cada caso. La aparicin de una coloracin
violeta o rosa en no ms de 20 minutos debe considerarse como prueba positiva.
23
Evidencias de aprendizaje
1)
Se puede considerar la reaccin de Biuret como caracterstica para todas las protenas? Por qu?
2)
Escribir la reaccin.
3)
Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5, aadir a cada uno 2 mL de las
soluciones siguientes:
Tubo
1
2
3
4
5
Soluciones
Agua
Peptona al 2%
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
Incubar en bao Mara a ebullicin durante 2 minutos. Observar una coloracin amarilla
caracterstica.
Enfriar y aadir 1 ml de NH 4OH concentrado, resbalar cuidadosamente por las paredes del tubo, para
estratificar.
Evidencias de aprendizaje
1)
Escribir la reaccin.
2)
3)
4)
Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5, aadir a cada uno 2 mL de las
soluciones siguientes:
Tubo
1
Soluciones
Agua
24
2
3
4
5
Peptona al 2%
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
Colocar los tubos en bao Mara a ebullicin por 10 min. El oscurecimiento de la solucin o la
formacin de un precipitado negro indica la presencia de aminocidos azufrados.
Evidencias de aprendizaje
1) Escribir la reaccin qumica que se ha efectuado.
2) Qu sustancias pueden interferir en esta reaccin?
3) Ilustrar sus resultados.
EXPERIMENTO 5. REACCIN DE NINHIDRINA.
Emplear 6 cuadros de papel filtro Whatman No. 1 de medidas 2 x 2 cm sobre una hoja blanca y
numerar del 1 al 6 sobre la misma hoja.
Soluciones
Agua
Prolina al 2%
Peptona al 2%
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
Evidencias de aprendizaje
1)
25
2)
3)
4)
EXPERIMENTO
6.
PRECIPITACIN
DE
PROTENAS
POR
METALES
PESADOS.
Preparar una serie de 4 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 4, agregar 1 mL de peptona al
2% a cada tubo. Rotlelos como P1P4 (P=peptona).
Preparar una serie de 4 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 4, agregar 1 mL de gelatina al
2% a cada tubo. Rotlelos como G1G4 (G=gelatina).
Observar y registrar los cambios; posteriormente agregar un exceso de 5 gotas a cada tubo y repita la
observacin.
Registrar sus resultados en la tabla, evaluando por medio de cruces (de x a xxx segn la turbiedad del
precipitado).
2 gotas
Solucin
Serie P
5 gotas
Serie G
Serie P
Serie G
FeCl3
AgNO3
HgCl2
Pb(CH3COO) 2
Evidencias de aprendizaje
1) Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las protenas?
2) Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las protenas?
3) Ilustrar sus resultados.
EXPERIMENTO 7a. PRECIPITACIN DE PROTENAS POR EFECTO DE CIDOS FUERTES.
Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5, aadir a cada uno 2 mL de las
soluciones siguientes:
Tubo
Soluciones
26
1
2
3
4
5
Agua
Peptona al 2%
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
Observar y registrar sus resultados valorando el grado de turbidez de cero a tres cruces en la siguiente
tabla:
Sustancia
Agua
Peptona al 2%
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
CCl3COOH
Evidencias de aprendizaje
1) Cmo puede explicar el efecto desnaturalizante del CCl3COOH y en general de cualquier cido?
2) Ilustrar sus resultados.
EXPERIMENTO 7b. PRECIPITACIN DE PROTENAS EN ORINA
Preparar 2 tubos de ensayo, etiquetar y marcar un tubo como orina normal y el otro como orina de
paciente nefrtico, agregar 3 mL de la orina correspondiente a cada tubo.
Aadir 2 mL de la mezcla HNO3-metanol resbalando lentamente por la pared a cada tubo, para
estratificar.
Evidencias de aprendizaje
1)
2)
Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5, aadir a cada uno 2 mL de las
soluciones siguientes:
Tubo
1
2
Soluciones
Agua
Peptona al 2%
27
3
4
5
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
Observar y registrar los resultados valorando la turbidez de cero a tres cruces en la siguiente tabla:
Sustancia
Agua
Peptona al 2%
Casena al 2%
Gelatina al 2%
Albmina al 2%
CH3CH2OH
Evidencias de aprendizaje
1)
2)
Agua destilada
mL 8.4
7.8
8.8
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0
7.4
cido actico 1N
mL
1.6
mL
0.2
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
mL 0.6
1.2
mL
Agitar los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitacin que se produce en el tiempo cero (en
el momento) y despus de 15 y 30.
28
Evidencias de aprendizaje
1)
2) Cul es el punto isoelctrico de la casena? Calcule y discuta sus resultados comparando con el terico.
3)
REACCIN
Millon
Biuret
Xantoprotica
Agua
Glicina
Prolina
Peptona
Gelatina
Casena
Albmina
29
a.a. azufrados
Ninhidrina
PRCTICA No. 6
CINTICA QUMICA Y CATLISIS
De acuerdo con la Ley de Accin de Masas, la velocidad de una reaccin qumica depende de la
concentracin de las sustancias que intervienen en la reaccin. Esta Ley establece que: La magnitud de
una reaccin es proporcional a la masa activa de las sustancias reaccionantes presentes en ese
momento. El trmino masa activa significa la concentracin molecular o sea, la cantidad presente por
unidad de volumen. Si reaccionan:
La velocidad V1 con que reaccionan A y B para producir C y D depende de la concentracin de cada reactivo
y de la afinidad que tengan para reaccionar entre s, pero como esto se puede considerar constante, podemos
decir que: V1 = k1[A][B].
La velocidad V2 con que reaccionan C y D para producir A y B depende a su vez, de la concentracin de C y
D y de la afinidad. Por lo tanto podemos decir tambin que: V2 = k2[C][D]. Cuando se alcanza el equilibrio
qumico, las dos velocidades son iguales. Es decir: V1 = V2
Sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos:
Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante podemos decir que:
Que es la expresin matemtica de la Ley de Accin de Masas y keq se conoce como Constante de Equilibrio.
30
Las reacciones qumicas de acuerdo al nmero de molculas que toman parte de ellas se clasifican en:
Monomoleculares: Cuando participa una sola molcula. Ejemplo: A B
Bimoleculares:
Cuando participan dos molculas. Ejemplo: A + B AB
Trimoleculares:
Cuando participan tres molculas simultneamente. Ejemplo: A + B + C ABC
Las reacciones trimoleculares son muy raras y reacciones de ms de tres reaccionantes no se conocen.
Cuando se estudia la cintica de una reaccin, tiene ms importancia conocer el orden de la reaccin que el
tipo. El orden de una reaccin nos indica la relacin entre la velocidad y la concentracin de los reactivos,
por lo que se clasifican en:
Reacciones de orden cero.
algn otro factor limitante como absorcin de luz, velocidad de difusin, etc.
Reacciones de primer orden. Su velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin
de una de las sustancias reaccionantes.
Reacciones de segundo orden. Su velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin de dos
Reacciones de tercer orden.
sustancias reaccionantes.
Su velocidad de reaccin es proporcional a la concentracin de tres
sustancias reaccionantes.
La mayor parte de las reacciones enzimticas se caracterizan por seguir el modelo correspondiente a las
reacciones de primer orden. Matemticamente la reaccin puede representarse as:
Donde t1/2 es el perodo de vida media, es decir, el tiempo necesario para que se descomponga la mitad de una
cantidad dada de material reaccionante.
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
31
Desde hace muchos aos se saba en forma emprica que la velocidad de muchas reacciones aumenta al
aumentar la temperatura. Arrhenius encontr una relacin que expresa matemticamente la forma como la
temperatura afecta la velocidad de una reaccin, la cual est dada por la siguiente ecuacin:
La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de velocidad de una reaccin es inversamente
proporcional al cuadrado de la temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases. E es la energa de
activacin. Actualmente se considera que para que las molculas puedan reaccionar deben ser primero activadas,
es decir, requieren una cantidad de energa E. Integrando entre lmites la ecuacin de Arrhenius:
Esto quiere decir que por cada 10C de aumento la velocidad de la reaccin se duplica. En la mayor parte de
las reacciones se observa este aumento bajo ciertas temperaturas lmites.
Se sabe que muchas reacciones qumicas son afectadas por el pH del medio o el aumento de [H+], sobre todo
aquellas en las que participan cidos. Actualmente se acepta que las molculas deben ser activadas antes de
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
32
que puedan reaccionar. Aparentemente el pH cido favorece la ionizacin y el estado inico se puede
considerar como un estado activado.
La velocidad de una reaccin qumica frecuentemente es afectada por la presencia de sustancias extraas
que permanecen inalteradas al terminar la reaccin. Cualquier sustancia que sea capaz de acelerar una
reaccin qumica y que no sea consumida por ellas, se denomina catalizador y el proceso se conoce con el
nombre de catlisis. La funcin de un catalizador es disminuir la energa de activacin, por lo que las
molculas son activadas con menor cantidad de energa producindose reacciones ms rpidas. En un
principio se supuso que los catalizadores actuaban por presencia. Es decir, que no intervenan en los
procesos que catalizaban. Sin embargo, actualmente se acepta que el catalizador se combina con el sustrato
formando un complejo intermediario inestable y altamente reactivo. Supongamos la reaccin: A + B AB.
Esta reaccin en condiciones normales se efecta muy lentamente pero si se aade un catalizador C
apropiado, tenemos: A + B + C (AC) + B AB + C. Estas reacciones son rpidas y el catalizador
puede ser usado una y otra vez. Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgnica o bien sustancias
orgnicas complejas producidas por las clulas y son denominadas enzimas. La sacarosa es un disacrido no
reductor, pero al hidrolizarse, cada molcula libera una molcula de glucosa y una de fructosa, ambas
reductoras. Basndose en esto es posible visualizar y cuantificar la hidrlisis de la sacarosa midiendo la
concentracin de azcares reductores con algn reactivo apropiado. Una de las principales diferencias entre
los catalizadores inorgnicos y las enzimas es que los primeros solo son capaces de acelerar un proceso que
ya est en marcha, mientras que las enzimas son capaces de iniciar una nueva reaccin. Para esta prctica
emplearemos como enzima la sacarasa, tambin conocida como invertasa o fructofuranosidasa la cual es
una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas. Acta hidrolizando los azcares que contienen fructosa. As
hidroliza la estaquiosa (tetrasacrido), la rafinosa (trisacrido), y alcanza su mxima velocidad con la
sacarosa (disacrido). Se puede medir la hidrlisis observando el cambio en la rotacin ptica o valorando el
poder reductor de los productos obtenidos.
33
Reactivo
FeCl3 0.2M en HCl 0.1N
0.5 mL
1.0 mL
-Testigo
1
2
3
4
NH4SCN 0.2M
0.5 mL
1.0 mL
--
NH4Cl
--5.0 mL
--
Frasco
1
2
3
4
Evidencias de aprendizaje
1)
2)
Describir que observ de acuerdo a la intensidad de la coloracin en cada frasco y segn a la Ley
de Accin de Masas y al principio de Le Chatelier, explique el fenmeno.
Calentar la mezcla en un soporte universal con tela de asbesto hasta casi ebullicin y en caliente
titule. El punto final de la titulacin lo observar cuando persista un ligero color rosa, por exceso de la
solucin de permanganato. El H2SO4 y el calentamiento tienen por objeto impedir la formacin de MnO2.
Haga esta determinacin por duplicado y calcule el promedio de las dos determinaciones (esta ser su
concentracin del problema al tiempo cero).
34
KMnO4 0.01M/mL
(a x) moles/litro
log a/(a-x)
Ke
Evidencias de aprendizaje
1)
Determinar el orden de reaccin grficamente. Para calcular la Ke a cada tiempo se debe utilizar la
ecuacin:
2)
Disponer de baos Mara a diferentes temperaturas (una por equipo) pregunte al Profesor.
Aadir 0.25 g de yoduro de potasio (KI) y agregar 25 mL (medir con PROBETA) de solucin de
H2SO4 1:6 en un vaso de precipitado de 100 mL.
Agitar hasta disolucin completa y agregar agua destilada completando a 50 mL (medir con
PROBETA). Esta solucin se denominar Solucin de cido yodhdrico (HI, rotlelo con este nombre).
Nota: Considere que se utilizar en este experimento (25 mL) y en el siguiente (25 mL).
Preparar una serie de 5 tubos de ensaye, etiquetar y numerar del 1 al 5, agregar los reactivos que se
muestra en la tabla siguiente y preincube cada tubo segn corresponda.
Tub
o
HI
mL
Na2S2O3 0.02N (tiosulfito de sodio)
mL
Almidn
No. de gotas
Preincubar 5 minutos a:
5
1.5
5
5 C
5
1.5
5
25 C
5
1.5
5
40 C
5
1.5
5
60 C
5
1.5
5
90 C
Solucin
35
Agregar a cada tubo H2O2 al 0.2% como se indica en la tabla. Nota: Considere realizar cada tubo por
separado con el objetivo de medir con mayor precisin el tiempo en que aparece sbitamente el color azul
intenso.
Tub
o
Solucin
H2O2 al 0.2%
mL
Tiempo de reaccin
(aparicin del color azul en segundos)
Evidencias de aprendizaje
1. Escribir las reacciones qumicas que se han efectuado.
2. Trazar la grfica de 1/tiempo de reaccin en las ordenadas contra la temperatura en las abscisas.
EXPERIMENTO 4. EFECTO DE LA [H+] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN QUMICA.
mL
mL
No. de gotas
mL
mL
mL
mL
mL
5
1.5
5
5
5
1.5
5
5
1.5
5
5
1.5
5
5
1.5
5
5
5
5
5
Agregar a cada tubo H2O2 al 0.2% como se indica en la tabla. Nota: Considere realizar cada frasco por
separado con el objetivo de medir con mayor precisin el tiempo en que aparece sbitamente el color azul
intenso.
Frasc
o
Solucin
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
36
H2O2 al 0.2%
mL
[H+]
1 x 10
1 x 10-2
1 x 10-1
1
2
Evidencias de aprendizaje
1) Trazar una grfica con el 1/tiempo en segundos en las ordenadas y la concentracin de H+ en las abscisas.
EXPERIMENTO 5. EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGNICO SOBRE LA VELOCIDAD
DE HIDRLISIS DE LA SACAROSA
Preparar dos tubos de ensayo y aadir en cada uno 2 mL de solucin de sacarosa 0.05M.
Un tubo quedar como testigo (etiquetar con la inicial T) y al otro agregar 3 gotas de cido sulfrico
1:6 (etiquetar como H2SO4).
El tubo que contiene H2SO4 neutralizar con 1 mL de NaOH (hidrxido de sodio) al 10%.
Incubar ambos tubos en bao Mara a ebullicin por 10 minutos al cabo de los cuales se retiran del
bao, dejndose enfriar.
Evidencias de aprendizaje
1) Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador? Por qu?
EXPERIMENTO 6. EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLOGICO (ENZIMA) SOBRE LA
VELOCIDAD DE HIDRLISIS DE LA SACAROSA
Preparar dos tubos de ensayo, aadir a un tubo 2 mL de solucin de sacarosa 0.05M y 1 mL de solucin
reguladora o buffer de acetato de sodio 0.05M a pH de 4.7. Repetir este mismo paso para el otro tubo.
Un tubo quedar como testigo (etiquetar con la inicial T) y al otro aadir 0.2 mL de solucin de invertasa
(etiquetar como invertasa), mezclando bien el contenido del tubo.
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
37
Incubar ambos tubos en bao Mara a ebullicin por 10 minutos al cabo de los cuales se retiran del
bao, dejndose enfriar.
Evidencias de aprendizaje
1) Comparar este experimento con el anterior y explique qu sucede.
38
PRCTICA No. 7
CINTICA ENZIMTICA
FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
La vida depende de una serie de reacciones qumicas cuyo curso y velocidad estn determinados por la
presencia de diversos catalizadores orgnicos denominados enzimas: (del griego en = en, zymo = fermento).
La mayor parte de las reacciones biolgicas seran cinticamente insignificantes si no fuera por las enzimas.
Las enzimas desde el punto de vista qumico son compuestos que pertenecen al grupo de las protenas
(aunque algunas solo funcionan asociadas a un grupo no proteico, grupo prosttico o coenzima). Debido a su
carcter protenico, las enzimas son muy sensibles a cualquier cambio fsico, qumico, o fisicoqumico. As,
cualquier cambio en la temperatura, en el pH, en la fuerza inica, la adicin de sales, la presencia de agentes
oxidantes o reductores, la presencia de metales pesados, etc., producen modificaciones profundas en su
actividad. En general, cualquier factor que sea capaz de desnaturalizar a las protenas ser capaz de alterar su
actividad.
NATURALEZA QUMICA DE LAS ENZIMAS
Estructuralmente todas las enzimas son protenas simples o complejas. La parte protenica de las enzimas se
denomina apoenzima, la parte no protenica puede ser coenzima, si se separa fcilmente de la protena. Las
coenzimas pueden ser comunes a varias enzimas y no actan como catalizadores ya que se transforman en la
reaccin que catalizan y requieren de otra enzima para regenerar su actividad. La mayor parte de las
coenzimas estn relacionadas con las vitaminas. Si la parte no protenica se encuentra firmemente unida a la
protena por enlace covalente y no es posible separarla por dilisis, se denomina grupo prosttico. Hay
varios factores que afectan la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas. Algunos de ellos son:
temperatura, pH, concentracin de sustrato, concentracin de enzima e inhibidores.
Temperatura. La velocidad de las reacciones qumicas aumenta al incrementar la temperatura, originando
aumento en la energa cintica y en las velocidades medias de las molculas con el resultado de una mayor
probabilidad de colisiones efectivas. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas
elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura ptima, en la cual catalizan con una
velocidad mxima.
pH. La actividad de la mayora de las enzimas depende del pH debido a la participacin de iones [H +] o iones
[OH-] en las reacciones, adems que se afecta la de los grupos funcionales. La mayora de las enzimas tienen
un pH ptimo en el cual su actividad es mxima.
39
V3 = K3 [ES]
40
La velocidad de formacin (Vf) del complejo [ES] depende de V1 mientras que la velocidad de degradacin
(Vd) depende de V2 + V3. Por lo tanto en el equilibrio tenemos:
Vf = Vd es decir: V1 = V2 + V3
Sustituyendo sus valores nos queda: K1[E ES] [S] = K2[ES] + K3[ES]. Dividiendo ambos miembros entre
K1 y [ES] nos queda:
Simplificando:
Constante de Michaelis-Menten
La constante de Michaelis-Menten se utiliza como una medida de la afinidad entre la enzima y el sustrato,
aunque no es propiamente la constante de afinidad. La constante de Michaelis-Menten (Km) se define como la
concentracin de sustrato cuando la reaccin adquiere la mitad de su velocidad mxima. Cuando esto sucede:
[E ES] = [ES]. Y por lo tanto, sustituyendo: Km = [S]. Si en una reaccin enzimtica se mantiene constante
la concentracin de la enzima y todos los dems factores que pueden modificar la actividad, se observa
experimentalmente que al aumentar la concentracin del sustrato, aumenta progresivamente la velocidad de
la reaccin hasta llegar a un mximo (velocidad mxima) despus del cual ya no se afecta la velocidad
aunque se trabaje a concentraciones ms altas de sustrato. En algunas enzimas se observa incluso una
disminucin en la actividad si se aumenta demasiado la concentracin de sustrato.
Durante mucho tiempo se pens que los catalizadores eran sustancias que actuaban por presencia debido a las
concentraciones tan pequeas y a que podan recuperarse inalterados al final de la reaccin. Sin embargo, se
sabe que la velocidad de reaccin de acuerdo a la Ley de Accin de Masas depende de su concentracin de
tal manera que la velocidad es directamente proporcional a la concentracin de enzima, lo que se expresa
como: V = K[E]. As que la grfica que se obtiene al expresar la velocidad de reaccin en funcin de la
concentracin de enzima es una recta con pendiente positiva.
41
Reactivos
Sustrato almidn 8 mg/mL en Buffer
de fosfatos 0.02M, pH=7
mL
---
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
mL
---
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
Agua destilada
mL
5.5
25C
5C
25C
40C
50C
60C
90C
Preincubar 5 minutos a
Posterior a este tiempo, agregar la enzima conservada en hielo, como se indica en la tabla siguiente:
Tubo
s
Reactivos
Enzima (sol. de amilasa)
mL
---
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Agitar todos los tubos y colocar nuevamente cada tubo en su respectivo bao como se indic en la
primera tabla, incubar durante 15 minutos.
Agregar a todos los tubos, 1 mL del reactivo de cido 3,5 dinitrosaliclico (este reactivo desarrolla un
color rojo caoba en presencia de azcares reductores).
Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco.
Temperatura
Absorbancia
25 C
Blanco
5 C
25 C
40 C
50 C
60 C
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
42
90 C
Evidencias de aprendizaje
1) Trazar una grfica con los datos obtenidos, donde la absorbancia sern las ordenadas y la To las abscisas.
EXPERIMENTO 2. EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
Reactivos
Sustrato (sol. de almidn 8 mg/mL)
mL
Buffer de fosfatos al pH indicado
m
---
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
L
Preincubar a 40C por 5 minutos
Reactivos
Enzima (sol. de amilasa)
mL
---
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Agitar los tubos e incubar nuevamente en el bao Mara a 40oC, durante 15 minutos.
Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco
pH
Absorbancia
Blanco
8
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
43
Evidencias de aprendizaje
1) Trazar la grfica correspondiente donde las absorbancias sern las ordenadas y el pH las abscisas.
2) Basndose en sus resultados diga Cul es el pH ptimo de la amilasa?
3) Cul es el azcar que se libera en la hidrlisis de este polisacrido?
EXPERIMENTO 3. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA
VELOCIDAD DE REACCIN
o
1
2
3
4
5
Reactivos
Sustrato almidn 8 mg/mL en Buffer de
mL 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0
fosfatos 0.02M, pH=7
Buffer de fosfatos 0.02M, pH=7
mL 7.0 6.5 5.5 4.5 3.5
Preincubar a 40C por 5 minutos
5.0
7.5
---
2.5
0.0
8.0
Tub
o
Reactivos
Sol. de enzima (amilasa)
mL
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
---
Agitar todos los tubos e incubar nuevamente en el bao Mara a 40oC, durante 15 minutos.
Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm, empleando el tubo 8 como blanco
44
3
4
5
6
7
8
2
3
4
5
7.5
------
Blanco
Evidencias de aprendizaje
1)
Trazar una grfica con los resultados obtenidos donde las absorbancia sern las ordenadas y las
concentraciones del sustrato las abscisas.
2)
Reactivos
Tubos
mL
---
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
mL
Agua destilada
mL 5.5 4.9
4.8
4.6
4.2
3.4
Tubos
mL
---
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
Agitar todos los tubos e incubar nuevamente en bao Mara a 40oC, durante 15 minutos.
Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm, empleando el tubo 1 como blanco.
Concentracin de enzima
mg/mL
Absorbancia
45
-------
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
Blanco
Evidencias de aprendizaje
1) Trazar una grfica con base en sus resultados con los valores de absorbancia en las ordenadas y la
concentracin de enzima expresada en mg/mL en las abscisas e interpretar la grfica obtenida.
46
PRCTICA No. 8
GLCIDOS
Los glcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehdicos o cetnicos reales o en potencia de
alcoholes polivalentes que poseen en su molcula uno o ms carbonos asimtricos. Estos compuestos se
encuentran presentes en todos los seres vivos, en cantidades variables, desempeando importantes funciones
estructurales y energticas. Debe recordarse que todas las propiedades qumicas de los glcidos dependen
de sus grupos funcionales, o sea, grupos alcohol y grupo carbonilo (aldehdico o cetnico). Los glcidos se
clasifican, segn el nmero de compuestos hidrocarbonados simples que los constituyen, en 3 grupos;
monosacridos, oligosacridos y polisacridos. Los monosacridos no se pueden desdoblar por hidrlisis en
compuestos ms sencillos. A su vez se subdividen, segn el nmero de carbonos que contengan, en: triosas,
tetrosas, pentosas, hexosas, etc. Los oligosacridos, por hidrlisis, dan pocas molculas de monosacridos.
En la naturaleza existen varios disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa etc.) y unos cuantos trisacridos,
tetrasacridos y pentasacridos libres. Se pueden obtener por sntesis qumica en el laboratorio o por
degradacin hidroltica de polisacridos. Los oligosacridos poseen propiedades fsicas similares a las de los
monosacridos. Los polisacridos, por hidrlisis dan muchas molculas de monosacridos. Desde el punto
de vista fisiolgico se dividen en dos grupos; polisacridos estructurales y polisacridos de reserva. Entre
los primeros tenemos en vegetales: la celulosa, los cidos pecticos y las hemi celulosas. En animales los ms
importantes son los llamados mucopolisacridos, tales como el cido hialurnico y el condroitin sulfato,
abundantes en varios tejidos y lquidos como el cuerpo vtreo del ojo, el cordn umbilical, el lquido sinovial,
tendones, cartlagos, etc. Entre los polisacridos nutrientes o de reserva los ms importantes son, en
vegetales, los almidones e inulina y en animales, el glucgeno.
Los glcidos reciben este nombre debido a que la mayor parte de ellos se caracterizan por tener sabor dulce.
Sin embargo, esta propiedad la presentan solamente los mono y oligosacridos, ya que los polisacridos son
generalmente inspidos. Otras propiedades que nos permiten diferenciar glcidos de bajo peso molecular
(monosacridos y oligosacridos) de los de elevado peso molecular (polisacridos), son su solubilidad en
agua y su capacidad para cristalizar.
Las propiedades qumicas de los glcidos dependen de sus grupos funcionales. Todos los glcidos poseen en
su molcula grupos alcohol y grupos carbonilo, ya sean aldehdicos o cetnicos. Sin embargo, en algunos
glcidos estos grupos pueden estar bloqueados y por lo tanto, su reactividad qumica estar ausente. Una
caracterstica qumica de los aldehdos y cetonas es su carcter reductor, todos los monosacridos u
oligosacridos que tengan libre el grupo aldehdico o cetnico sern reductores, mientras que los
polisacridos y oligosacridos que tengan bloqueados estos grupos sern no reductores. Todos los glcidos
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ENERO-JUNIO 2016
=
=
47
formados por varios azcares (oligo o polisacridos) se pueden hidrolizar por accin enzimtica o de cidos
dando como producto final los monosacridos y liberando los grupos reductores bloqueados. Existen varias
reacciones qumicas que se utilizan para la identificacin de los glcidos, algunas son generales y otras son
especficas para determinar tipo o incluso especficas para cada azcar. Entre las ms utilizadas tenemos: la
formacin de osazonas, esta reaccin es una de las de mayor utilidad para la identificacin de azcares por
ser especfica para cada azcar. La dan positiva tanto los monosacridos como los disacridos reductores
sirviendo para identificarlos el tiempo que tardan en formar la osazona correspondiente, la forma cristalina de
ellas, la solubilidad en caliente o en fro y los puntos de fusin.
Existen mtodos para la determinacin de las propiedades de los glcidos. Molish-Udranski es una reaccin
general para todos los glcidos, debido a que el cido sulfrico concentrado que contiene el reactivo hidroliza y
deshidrata a los azcares obtenindose furfural o hidroximetil furfural como producto final y estas sustancias
son capaces de reaccionar con el alfa naftol formando un compuesto colorido (violeta): Esta prueba es una de
las ms sensibles, la dan positiva soluciones de glucosa al 0.001%. Sin embargo, la reaccin no es especfica,
ya que la dan positiva los aldehdos, las cetonas, y algunos cidos orgnicos tales como el frmico, oxlico,
ctrico, etc. La reaccin de Fehling, se emplea para el anlisis cualitativo y cuantitativo de azcares se basan
en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no sea especfica de ellos. Se sabe que los azcares
reductores son capaces de reducir diversos iones metlicos como el cobre, bismuto, mercurio, plata, etc.,
cuando se encuentran estos en solucin alcalina. Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los
reactivos son estables, existe poca interferencia con otras sustancias, las reacciones son sensibles y puede usarse
la misma reaccin para un anlisis cualitativo o cuantitativo. El mecanismo de reaccin se lleva a cabo debido
a que algunos compuestos orgnicos que contienen uno o ms grupos alcohlicos en su molcula, en este
caso el tartrato de sodio, reaccionan en solucin alcalina con los hidrxidos metlicos, formando un complejo
soluble, el cual se disocia muy poco, pero los iones que deja en libertad son suficientes para que produzcan
las reacciones de coloracin. La formacin de este complejo es esencial para que se produzca un precipitado
con la mayor parte de los metales pesados. El reactivo de Barfoed es una solucin de acetato cprico en cido
actico y una vez ms, se determina la capacidad de los azcares para reducir el in cprico a cuproso (Cu2O).
Esta reaccin sirve para diferenciar un monosacrido de un disacrido, ya que los primeros a los tres minutos
reducen el reactivo y los disacridos necesitan ms tiempo para que se lleve a cabo la reaccin de reduccin,
ms o menos unos 15 minutos. La reaccin de Bial, sirve para diferenciar pentosas de hexosas, el reactivo
consiste en una solucin de orcinol en cido clorhdrico (HCl) concentrado con una pequesima cantidad de
cloruro frrico (FeCl3). El fundamento de esta reaccin, igual que la reaccin de Molisch, Seliwanoff y otras, se
basa en la produccin de furfural o hidroximetil furfural cuando se calienta con cidos concentrados y la
reaccin de estos con otras sustancias dando productos coloridos, en este caso las pentosas dan color azul y
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
48
las hexosas dan color amarillo o caf. La reaccin de Seliwanoff sirve para diferenciar aldosas de cetosas.
Las cetosas reaccionan rpidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El reactivo es una
solucin de resorcinol 0.05% en HCl 1:3 recin preparado. Este compuesto es el que se condensa con el
furfural o sus derivados dando productos coloridos. El reactivo de lugol es una solucin de yodo en yoduro
de potasio. Este reactivo reacciona con algunos polisacridos como los almidones, glucgeno y ciertas
dextrinas formando un complejo de inclusin termolbil que se caracteriza por ser colorido, dando un color
diferente segn las ramificaciones que presenta la molcula.
EXPERIMENTO 1. ESTRUCTURA CRISTALINA
Evidencias de aprendizaje
1) Cules de estos glcidos tienen estructura cristalina? Por qu?
EXPERIMENTO 2. FORMACIN DE OSAZONAS DE ARABINOSA, GLUCOSA, FRUCTOSA,
GALACTOSA, MALTOSA Y LACTOSA (PROPIEDADES DE LOS GLCIDOS).
Agitar y cubrir el tubo con un tapn de papel procurando que no quede muy cerrado.
Determinar el tiempo en que tardan en aparecer los precipitados y si lo hacen en fro o en caliente. La
arabinosa, glucosa, fructosa y galactosa precipitan en caliente, pero la maltosa y la lactosa en fro por lo
que despus de 20 minutos de calentamiento se deben retirar del fuego e inmediatamente enfriar en el hielo.
Observar al microscopio los cristales de la osazona que se le asign y la de los otros equipos.
Registrar sus resultados a travs de dibujos o esquemas de cada uno de los cristales.
Evidencias de aprendizaje
1)
2)
49
Solucin
Formaldehdo
Glucosa
Fructosa
Arabinosa
Sacarosa
Almidn
Agregar a todos los tubos 2 gotas del reactivo de Molisch-Udransky (solucin de alfa-naftol al 5% en
alcohol) y agitar para mezclar.
Solucin
Formaldehdo
Glucosa
Fructosa
Arabinosa
Sacarosa
Almidn
Resultado
(positivo o negativo)
Evidencias de aprendizaje
1) Diga por qu la solucin de formaldehdo da positiva la reaccin.
2) Se puede considerar como una reaccin til para diferenciar un glcido de otro? Por qu?
3) Qu utilidad puede tener la reaccin de Molisch-Udransky?
4) Escribir la reaccin que se efecta.
50
Solucin
Glucosa
Fructosa
Arabinosa
Sacarosa
Almidn
Fructosa
Arabinos
a
Sacarosa
Almidn
Evidencias de aprendizaje
1) Qu azcares dan positiva la reaccin de Fehling?
2) Explicar por qu algunos azcares dan negativa la reaccin.
3) Mencionar 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la reaccin de Fehling y no sean azcares.
4) Escribir la reaccin que se efecta.
EXPERIMENTO 5. REACCIN DE BARFOED.
Aadir al tubo 1 del reactivo de Barfoed un volumen de 3 mL. Repetir este mismo paso para los tubos 2
al 4.
51
Tubo
1
2
3
4
Solucin
Glucosa
Arabinosa
Lactosa
Maltosa
Observar y registrar el tiempo que tarda en aparecer el precipitado rojo de xido cuproso durante la
incubacin.
Tubo
Solucin
1
2
3
4
Glucosa
Arabinosa
Lactosa
Maltosa
Resultado
Propiedad de
(precipitado rojo en minutos) reductor o no reductor
Clasificacin:
monosacrido o disacrido
Evidencias de aprendizaje
1) Escribir la reaccin que se efecta.
EXPERIMENTO 6. REACCIN DE BIAL.
Solucin
Glucosa
Arabinosa
Agua
Solucin
Clasificacin
(pentosa o hexosa)
1
Glucosa
2
Arabinosa
3
Agua
Evidencias de aprendizaje
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
52
Resultado
(azul o amarillo)
Solucin
Glucosa
Fructosa
Agua
Colocar los tubos en bao Mara a ebullicin, mida el tiempo exactamente 60 segundos.
Solucin
1
2
3
Glucosa
Fructosa
Agua
Resultados
color
minutos
Clasificacin
(aldosa o cetosa)
Evidencias de aprendizaje
1) Observar alguna diferencia en las soluciones?
2) Escribir la reaccin que se efecta.
EXPERIMENTO 8. REACCIN DEL LUGOL
Agregar una gota de lugol y registrar el color producido en cada uno de los tubos.
Colocar el tubo que contiene el almidn en bao Mara a ebullicin durante 5 a 10 minutos.
Evidencias de aprendizaje
1) Por qu el complejo almidn-yodo es termolbil?
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
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=
=
53
54
PRCTICA No. 9
OXIDACIONES BIOLGICAS
La Bioenergtica es la manera en que el ser vivo, utiliza y transforma la energa del medio ambiente. A estos
procesos qumicos y fsicos se les denominaba respiracin. Sin embargo para evitar ambigedades con el proceso de
la entrada y salida de aire de un compartimiento a otro, se aplica el concepto bioqumico de bioenergtica,
incluyendo este trmino los procesos fotosintticos. Todos los procesos qumicos que constituyen la respiracin
conducen a la oxidacin de sustancias denominadas metabolitos, hasta CO2 y H2O. Por regla general todas las
reacciones de oxidacin son exergnicas, es decir, liberan energa cuando se efectan; en ocasiones toda la energa
se libera en forma de calor, como cuando se quema u oxida un pedazo de madera. Sin embargo un organismo
viviente no es una mquina trmica y, por tanto, debe poseer un mecanismo enzimtico que le permita capturar y
almacenar la energa liberada en los procesos de oxidacin. La utilizacin o captura de la energa involucra la
participacin de enzimas especficas capaces de catalizar la conversin del ADP en ATP (reaccin endergnica).
2Cu + O2 2CuO
H2S S0 + H2
-1e
++
Fe Fe+++
Siempre que se efecta una oxidacin, simultneamente se efecta una reduccin. Es decir, cuando un compuesto
se oxida, otro forzosamente debe reducirse. Como son fenmenos que ocurren simultneamente se denominan
fenmenos de xido reduccin o reacciones REDOX.
La accin de una sustancia reductora como el hidrosulfito de sodio (NaHSO3), forma leucobases (incoloras)
cuando acta sobre colorantes oxidados como el azul de metileno (indicador de xido-reduccin). El proceso
inverso (oxidacin por prdida de hidrgeno) se puede realizar en diferentes condiciones y determinar el tiempo de
reaccin.
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
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=
=
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La mayor parte de la energa que utilizan los seres vivos deriva de los procesos de oxidacin, y en cada
oxidacin se desprende una determinada cantidad de energa que el organismo aprovecha para realizar las
funciones vitales y para efectuar fenmenos sintticos endergnicos. Todas las oxidaciones biolgicas se
caracterizan por su rapidez y por la suavidad con que se realizan, todas se llevan a cabo en medio acuoso, a pH
generalmente neutro y a bajas temperaturas. Esto hace pensar que todos estos procesos estn catalizados por
enzimas. Warburg fue uno de los primeros investigadores que trat de explicar las oxidaciones biolgicas
suponiendo una activacin del oxgeno. Actualmente se sabe que en los tejidos existe un sistema de enzimas
que contienen hierro, mediante el cual el oxgeno molecular se activa y acta como un agente oxidante. Wieland
Consideraba que el proceso bsico en la oxidacin de los metabolitos es la activacin del hidrgeno por la
accin de enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales transportan el hidrgeno a diferentes aceptores
que pueden ser el oxgeno u otros agentes oxidantes. Szent Gyrgyi concili las dos teoras al suponer que es
necesaria la activacin del hidrgeno y tambin la del oxgeno. Keilin supuso que interviene como eslabn
intermediario el citocromo. Sin embargo, las oxidaciones biolgicas no son tan sencillas, pues se ha
comprobado que en la oxidacin de cada metabolito interviene una gran cantidad de aceptores de hidrgeno. La
glucosa es el ms comn de los metabolitos debido a que es una molcula altamente reducida. Cuando se oxida
y pierde sus hidrgenos, la liberacin de energa de oxidacin no se realiza en forma brusca, sino que intervienen
varios transportadores de hidrgeno y se inicia por la accin de una deshidrogenasa especfica que no reacciona
directamente con el oxgeno sino que requiere de intermediarios como el NAD+, flavoprotenas y
citocromos. La DESHIDROGENASA SUCCNICA (DHS) cataliza la siguiente reaccin:
Por otro lado para la obtencin de la fraccin mitocondrial del hgado de ratn, se tiene que conocer que
el tejido heptico se dispersa en soluciones isotnicas, el ncleo y las mitocondrias permanecen relativamente
inalterados y pueden separarse con facilidad por centrifugacin diferencial.
La citocromo-oxidasa es la ltima enzima de la cadena respiratoria y es la responsable de la activacin del
oxgeno para oxidar a los citocromos. Tanto los citocromos como la citocromo-oxidasa son metaloprotenas
(porfirinas). La citocromo-oxidasa se caracteriza por su elevada sensibilidad al cianuro (CN) y al monxido de
carbono (CO). En el ao de 1885 Ehrlich report la reaccin del indofenol. Observ que inyectando alfa naftol y
dimetil-para-fenilendiamina en animales se formaba en los tejidos una sustancia azul llamada azul de indofenol. La
enzima se denomin indofenol-oxidasa, pero posteriormente se ha podido comprobar que esta enzima slo oxida al
citocromo c, el cual a su vez oxida al indofenol; por lo cual ahora se le conoce como citocromo-oxidasa.
EXPERIMENTO 1. OXIDACIN POR PRDIDA DE ELECTRONES
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
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=
=
56
En un matraz provisto de tapn con vlvula de BUNSEN, agregar 0.5g de fibra de hierro (Fe) y 5
mL de H2SO4 al 10%.
Calentar a ebullicin y observar la disolucin parcial del Fe, formando con el H2SO4 al 10% el
producto sulfato ferroso (FeSO4). Dejar enfriar a temperatura ambiente.
Diluir el FeSO4 obtenido, con 50 mL de agua destilada. La vlvula deja escapar el hidrgeno, pero
impide la entrada de aire evitando as la oxidacin de la sal ferrosa formada mediante la siguiente
reaccin:
Fe + H2SO4 FeSO4 + H2 .
Cuadrante
superior
izquierdo
Cuadrante superior
derecho
Cuadrante inferior
izquierdo
Cuadrante inferior
derecho
Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal frrica, repetir las reacciones con ferricianuro de potasio
K3[Fe(CN)6] al 0.5% y sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5% en los cuadrantes inferiores del mosaico.
57
Registrar los resultados (positivo, si observa presencia de sales ferrosas o frricas o negativo si no
observa nada) en la tabla siguiente.
Solucin
Sulfato ferroso
Sulfato frrico
K3[Fe(CN)6]
KSCN
Evidencias de aprendizaje
1) Escribir las reacciones de identificacin que se han efectuado en cada caso.
2) Si el KMnO4 es capaz de oxidar al sulfato ferroso, Qu compuesto se reduce?
3) Escribir la reaccin de xido-reduccin que se ha efectuado.
EXPERIMENTO 2. OXIDACIN POR DESHIDROGENACIN
Preparar una serie de 5 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 5.
Aadir a cada tubo 5 mL de una solucin diluida de azul de metileno.
Aadir al tubo 1 gota por gota una solucin recin preparada de hidrosulfito de sodio y contar el nmero
necesario para decolorar completamente la solucin de azul de metileno. Repetir este paso para los tubos 2 al 5.
Someter los tubos a los tratamientos fsicos siguientes:
1
2
Tubo
Testigo
Calor
Temp. Amb.
H2O2
FeCl3
Tratamientos
Dejar en reposo y registrar el tiempo hasta la reoxidacin del azul de metileno.
Colocar en bao Mara a ebullicin y registrar el tiempo para recuperar su color azul.
Agitar enrgicamente a temperatura ambiente y registrar el tiempo hasta recuperar
su color azul.
Sin agitar y a temperatura ambiente, agregar gotas de perxido de hidrgeno (H2O2)
al 0.4%, contando el nmero de stas necesario para reoxidar al azul de metileno.
Agregar gotas de cloruro frrico (FeCl3) al 1%, contando el nmero de stas
necesario para reoxidar al azul de metileno
Testigo
Calor
Temp. Amb.
H2O2
FeCl3
58
mL
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
mL
---
0.5
0.5
---
0.5
0.5
mL
---
---
0.5
---
---
0.5
Agua destilada
mL
1.5
1.0
0.5
1.5
1.0
0.5
Suspensin de hgado
mL
0.5
0.5
0.5
---
---
---
Sobrenadante de hgado
mL
---
---
---
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
mL
0.5
0.5
0.5
Una vez agregada la vaselina no agitar el contenido de los tubos e incubar en bao Mara de 37-40C.
Registrar sus resultados, realizando lecturas en los tiempos 0, 5, 10 y 15 minutos, considerando el grado
de decoloracin con cruces (de una a tres) en la tabla siguiente:
59
Tubo
Tiempo
0 min.
5 min.
10 min.
15 min.
Evidencias de aprendizaje
1) En cul de las fracciones de hgado deben encontrarse las mitocondrias y por qu?
2) Describir cmo acta el malonato de sodio en esta reaccin.
3) Explicar sus resultados sobre la base del anlisis del contenido de cada tubo.
EXPERIMENTO 4. LOCALIZACIN Y DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA
CITOCROMO-OXIDASA
Preparar una serie de 10 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 10.
Agregar los reactivos segn se indica en la tabla siguiente:
Reactivo
Alfa naftol al 0.15% en etanol al 10%
Dimetil-para-fenilendiamina al 0.15%
Agua destilada
KCN al 0.01% NO PIPETEAR
0.5 mL = 10 gotas
Sobrenadante de hgado
Suspensin de hgado
Tubo 1
mL 0.5
mL 0.5
mL 1.0
mL
---
2
--0.5
1.5
3
0.5
--1.5
4
0.5
0.5
2.0
5
0.5
0.5
0.5
6
0.5
0.5
1.0
7
--0.5
1.5
8
0.5
--1.5
9
0.5
0.5
2.0
10
0.5
0.5
0.5
---
---
---
0.5
---
---
---
---
0.5
mL 1.0
mL ---
1.0
---
1.0
---
-----
1.0
---
--1.0
--1.0
--1.0
-----
--1.0
0 min.
5 min.
10 min.
15 min.
Evidencias de aprendizaje
1) Escribir la reaccin de formacin del azul de indofenol.
2) Explicar por qu no se us vaselina en este experimento.
3) Explicar sus resultados sobre la base del anlisis del contenido de cada tubo.
60
10
PRCTICA No. 10
LPIDOS
Este es un conjunto heterogneo de molculas orgnicas cuyas propiedades comunes son su insolubilidad en
agua y solubilidad en solventes no polares como el benceno, cloroformo, ter, etc. Por lo que este grupo
incluye sustancias de muy diversa estructura. Suelen ser molculas de nmero relativamente alto de tomos
de carbono e hidrgeno y bajo en tomos de oxgeno; ciertos lpidos tambin poseen tomos de fsforo,
nitrgeno y azufre en su molcula. Cualquier clasificacin presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede
producir falsas interpretaciones ya que idntica terminologa ha sido empleada por diferentes autores para
denominar a distintos grupos de lpidos. Los lpidos son los compuestos ms recientemente estudiados por
ejemplo: prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc., ya que este tipo de sustancias hace poco se
consideraban complejas y de poco inters. Las funciones de los lpidos son muy variadas y las ms aceptadas
actualmente son las siguientes:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
61
de 25% a 40% de lpidos. En este experimento se usarn monocapas lipdicas como modelos de membrana.
Al estratificar butanol sobre agua y agregar un lpido, ste se situar en la interfase, orientandose la parte
polar lipdica a la fase acuosa, y la parte hidrofbica a la fase orgnica. Si ahora se coloca un colorante
se puede observar la difusin pasiva a travs de la membrana.
La reacin de LIEBERMANN-BURCHARDS, es a travs de que el anhdrido actico se puede condensar
con los grupos OH en posicin 3 de los esteroles como en el colesterol y dar los correspondientes steres. Si
el esterol tiene un doble enlace en posicin 5, se produce adems una epimerizacin y una deshidratacin
en presencia de cido sulfrico (H2SO4) concentrado, dando como resultado una serie de compuestos de
estructura desconocida que se caracterizan por tener colores que van del rojo al azul y del azul al verde.
Esta reaccin es por lo tanto especfica para todos los esteroles que contengan un OH en posicin 3 y un
doble enlace en posicin 5.
EXPERIMENTO 1. REACCIN DE HANUS.
Preparar una serie de 4 tubos de ensayo etiquetar y numerar del 1 al 4.
Solucin
Aceite de algodn
Lecturas
20 min.
40 min.
60 min.
80 min.
Aceite de algodn
Aceite de Crtamo
Monoestearilglicerol
Aceite de ricino
Nota: Puede interpretar la decoloracin de la siguiente forma: +++++= Rosa intenso, +++=Rosa plido += decolorado
62
Macerar completamente la muestra de cerebro en un mortero, hasta obtener una consistencia homognea.
En este paso NO AGREGAR NINGN TIPO DE SOLUCIN, hasta obtener la consistencia deseada.
Agregar gradualmente 20 mL de una mezcla 200:100:1 de cloroformo-metanol-cido clorhdrico y con
el pistilo del mortero mezclar perfectamente bien.
Agregar 2 mL de HCl 1N (NO OLVIDAR), mezclar y centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos.
Despus de centrifugado el tubo, separar la fase metanlica, el paquete celular y la clorofrmica.
Desechar el paquete celular. La fase Clorofrmica se usar para la identificacin del colesterol,
(separacin cromatogrfica de fosfolpidos y la formacin de membranas) y la Metanlica servir para la
identificacin de cerebrsidos.
Registrar sus resultados.
EXPERIMENTO 3. IDENTIFICACIN DE FOSFOLPIDOS DE CEREBRO POR CROMATOGRAFA
EN CAPA FINA.
De la fase clorofrmica obtenida, con la ayuda del Profesor aplicar una gota con una pipeta Pasteur en
una cromatoplaca, aproximadamente a 2 cm de altura de la base Repetir el mismo procedimiento en otra
cromatoplaca.
Permitir que el cloroformo se evapore e introducir en una cmara de vidrio que contenga como solvente
de elucin, una mezcla de cloroformometanolcido acticoagua (65:25:8:4).
Dejar desarrollar las cromatoplacas hasta el frente del solvente ya marcado; retirar las cromatoplacas y
dejarlas secar.
Una cromatoplaca se revelar con ninhidrina que pondr de manifiesto a los fosfoaminolpidos, la
reacccion se lleva a cabo al calentarse a 100C por 10 minutos.
La otra cromatoplaca ser revelado con Iodo sublimado.
Registrar sus resultados.
EXPERIMENTO 4. REACCIONES DE IDENTIFICACIN DE LPIDOS Y DE CEREBRSIDOS
Utilizar 1 mL de la fase metanlica obtenido en la extraccin de lpidos de cerebro y compruebe la
presencia de cerebrsidos utilizando la reaccin de MolischUdransky cuya tcnica y fundamento ya han
sido descritos anteriormente.
Registrar sus resultados.
63
64
Tubo
Agua destilada
mL
mL
---
---
---
mL
---
---
---
mL
---
---
---
mL
---
---
---
*NOTA: A 2 mL de la fase clorofrmica (exp. 2) evaporar hasta sequedad en Bao Mara a ebullicin
(cuidando que no se queme), el residuo disolver con 2 mL de azul de metileno en butanol y agregar este
contenido al tubo 2 de la serie.
Dejar los tubos en reposo procurando moverlos lo menos posible y haga observaciones a las 2, 4, y 24 horas.
Registrar los resultados.
Evidencias de aprendizaje
1) Observ el paso del colorante en todos los tubos? Explique a qu se debe esa diferencia.
65
PRCTICA No. 11
CIDOS NUCLEICOS
El control de todos los procesos vitales en la forma tan ordenada que realiza una clula, como son la
transformacin de energa en sus diferentes formas, la sntesis de molculas propias, la degradacin de los
metabolitos, el transporte de diferentes materiales a travs de sus membranas, la formacin de nuevas clulas, la
diferenciacin celular, la creacin de nuevos seres, etc.; se puede explicar debido a la existencia de protenas
especficas, fundamentalmente enzimas. Sin embargo, para la biosntesis de protenas las molculas que
poseen la informacin necesaria son el cido desoxirribonuclico (DNA) y el cido ribonuclico (RNA). Estas
molculas son los llamados cidos nuclicos. Rompiendo la mxima bioqumica de que todas las enzimas son
protenas, se descubri que algunos RNA pueden funcionar como catalizadores. Los cidos nuclicos reciben
este nombre debido a que en el ao de 1871 el qumico suizo Friedrich Miescher logr aislar del ncleo
celular una sustancia que llam nuclena, la cual debido a su carcter cido se denomin posteriormente cido
nucleico.
Sin embargo, existen otros tipos de cidos nuclicos. El cido desoxirribonuclico se encuentra
fundamentalmente en el ncleo y es el que posee la informacin gentica y la transmite al citoplasma y por ser
capaz de replicarse puede transmitir la informacin de padres a hijos. En la clula, fuera del ncleo,
normalmente existen tres tipos de cidos ribonuclicos que son: el cido ribonuclico ribosomal (RNAr), el
cido ribonuclico mensajero (RNAm), y el cido ribonuclico soluble o de transferencia (RNAt). El RNAr se
encuentra en los ribosomas y su peso molecular es de 2 000 000. El RNAm tiene un peso molecular de 300 000,
se forma en el ncleo y lleva la informacin al citoplasma. El RNAt tiene un peso molecular de 25 000 a 30
000 y se encuentra disuelto en el citoplasma. El DNA es una de las biomolculas ms grandes que se conocen
hasta ahora y su peso molecular es mayor a un billn.
Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con protenas fuertemente bsicas (histonas o
protaminas) formando las llamadas nucleoprotenas. La estructura qumica es similar en todos los cidos
nuclicos, todos estn constituidos por bases pricas, bases pirimdicas, pentosa y cido fosfrico. El DNA
tiene como bases pricas adenina y guanina, como bases pirimdicas, citosina y timina, como pentosa la 2desoxiribosa y cido fosfrico H3PO4. Los cidos ribonuclicos tienen como bases pricas la adenina y
guanina y como bases pirimdicas uracilo y citosina, como pentosa la Dribosa y H3PO4.
Los cidos nuclicos son macromolculas formadas por la unin de varios nucletidos. Un nucletido se puede
considerar como un ster fosfrico de un nuclesido, que es la unin de una base prica o pirimdica con
una pentosa. Los mononucletidos se unen entre s por medio de un enlace fosfodiester 3- 5, formando los
polinucletidos.
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
ENERO-JUNIO 2016
=
=
66
Por otro lado cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las clulas o tejidos que se van a
utilizar como materia prima. En el caso del DNA esta seleccin es en especial importante porque el contenido
de DNA es pequeo en la mayor parte de las clulas. La clula ideal ser aquella que tenga una relacin
ncleo/citoplasma alta, como en los linfocitos y clulas del tumor asctico de Ehrlich. Sin embargo, no es
fcil obtener este tipo de clulas por lo que frecuentemente se usan rganos tpicamente linfoides como el timo
y el bazo. El primer paso en la extraccin del DNA es la homogeneizacin del tejido. Este paso puede
degradar en parte la molcula del DNA si no se toman las precauciones necesarias, la solucin reguladora es de
citrato 0.01M y NaCl 0.14M, a pH de 7.2 a 7.4; la fuerza inica de esta solucin hace insoluble a la
desoxirribonucleoprotena. Si se centrifuga este homogeneizado, en el residuo quedarn los restos celulares y
las desoxirribonucleoprotenas insolubles. En el sobrenadante se encuentran compuestos solubles como la
mayor parte de los cidos ribonuclicos.
Al homogeneizar el tejido se liberan las enzimas de los lisosomas, entre ellas la DNAasa, la cual hidroliza el
DNA. Se sabe que el Mg++ es indispensable para la actividad de esta enzima; si en la solucin existe citrato,
ste se une al Mg++ e impide la accin de la DNAasa. Otra forma de evitar la accin hidroltica de la enzima
es trabajar a temperaturas bajas (0C a 2C). El siguiente paso en la purificacin est basado en que las
desoxirribonucleoprotenas y el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, mientras que la
mayor parte de las protenas precipitan en estas condiciones. Si el residuo se suspende en solucin de NaCl
2.6M y se centrifuga, el residuo insoluble estar formado fundamentalmente por protenas, mientras que el
DNA permanecer en solucin. Este DNA se puede precipitar selectivamente por la adicin selectiva de 2
volmenes de alcohol etlico al 95% formndose un precipitado blanco fibroso, el cual se puede recoger por
rotacin de un agitador de vidrio con pequeos salientes.
Existen varios mtodos para identificar y cuantificar a los cidos nuclicos. El mtodo ms utilizado es el
espectrofotomtrico, el cual est basado en que tanto el DNA como el RNA absorben a 260 nm. La absorbancia
es proporcional a la concentracin del cido, por lo tanto, el medir la absorbancia es un mtodo cuantitativo
muy sensible y sencillo, pero no distingue entre DNA y RNA. Es de gran utilidad cuando las muestras estn
puras. Una reaccin muy utilizada para identificar y cuantificar DNA es la llamada reaccin de Dische, la cual
est basada en que el reactivo de difenilamina reacciona especficamente con el DNA dando una coloracin
azul cuya intensidad es proporcional a la concentracin de DNA. En realidad, la especificidad de esta
reaccin no es absoluta, ya que la difenilamina es un reactivo especfico para las 2-desoxipentosas en general,
pero en condiciones normales la cantidad de azcares capaces de interferir es despreciable.
EXPERIMENTO 1. OBTENCIN DEL DNA DE BAZO.
Agregar 300 mL de solucin reguladora de Citrato 0.01M-NaCl 0.14M, pH=7.2 fra, en un vaso de
licuadora previamente enfriado.
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
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=
=
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Hacer funcionar la licuadora a baja velocidad y aadir los trozos de bazo de todos los equipos, esperar a
que se homogeneice completamente el primero antes de aadir el segundo y as sucesivamente.
Terminada la adicin, continuar homogeneizando por 30-60 segundos ms.
Vaciar a tubos Falcon de 50 mL teniendo cuidado de tarar perfectamente los tubos opuestos
PRECAUCIN! (CONSULTE A SU MAESTRO).
Centrifugar a 5 000 rpm durante 15 minutos.
Al terminar la centrifugacin, DESECHAR EL SOBRENADANTE, tener cuidado de NO DESECHAR
EL RESIDUO INSOLUBLE O BOTN.
Aadir al botn 15 mL de solucin de Citrato 0.01M-NaCl 0.14M, pH=7.2 fra, homogenizar y
centrifugar a 5,000 rpm durante 5 min para lavar el DNA.
Desechar el sobrenadante cuidando de no perder el botn de precipitado.
Aadir 15 mL de solucin de NaCl 2.6 M fra al residuo insoluble que contiene el DNA y residuos celulares.
Agitar el tubo hasta obtener un completo homogenizado. El DNA es soluble en esta solucin mientras que
la mayor parte de las protenas son insolubles.
Centrifugar a 8 000 rpm durante 30 minutos.
Al terminar la centrifugacin, SEPARAR EL SOBRENADANTE que contiene el DNA en solucin en
unvaso de precipitados de 100 mL y DESECHAR EL RESIDUO INSOLUBLE, que contiene restos
celulares y protenas insolubles.
Al sobrenadante que se encuentra en el vaso de precipitados aadir lentamente 30 mL de alcohol etlico
al 95%, procurando que la fase alcohlica quede en la parte superior.
Observar la formacin de un precipitado blanco, denso, en la interfase.
Registrar los resultados.
Evidencias de aprendizaje
Explicar por qu se utiliz bazo como materia prima y no otro rgano cualquiera.
2)
Sera conveniente utilizar solucin reguladora de fosfatos para la extraccin del DNA? Por qu?
3)
68
Tubo
s
1
2
3
4
5
6
Solucin[DNA] mg/mL
1
mL
2
0.5
mL
2
0.25*
mL
2
0.125*
mL
2**
Problema
mL
2
Agua destilada
mL ---2
2
2
2
--Volumen final mL
2
2
2
2
2
2
Nota: *Estas concentraciones son a partir de la transferencia de 2 mL de la mezcla
anterior del tubo.
**En este tubo del volumen final de 4 mL, pipetear 2 mL y descartarlo.
Aadir a todos los tubos 4 mL de reactivo de Dische y agitar vigorosamente.
Incubar los tubos en bao Mara a ebullicin por 10 minutos.
Enfriar los tubos en bao de hielo-agua para leer en el espectrofotmetro.
Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 600 nm, empleando el tubo 5 como blanco.
Registrar los resultados en la tabla siguiente.
Tubo
[DNA]
Absorbancia
mg/mL
0.5
0.25
0.125
--------
Problema
Blanco
Evidencias de aprendizajes
1) Construir la curva tipo con los datos de la tabla, donde las absorbancias sern las ordenadas y los mg de
DNA las abscisas.
2) Interpolar la absorbancia del tubo No. 6 para encontrar la concentracin de DNA (mg/mL) y calcular la
cantidad total de DNA en su problema.
EXPERIMENTO 3. CARACTERIZACIN Y ANLISIS CUANTITATIVO DEL RNA
Preparar una serie de 6 tubos de ensayo, etiquetar y numerar del 1 al 6.
Aadir a cada tubo las soluciones segn se indica en la tabla siguiente:
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA MDICA I
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=
=
69
Tubo
s
1
2
3
4
5
6
Solucin[RNA] mg/mL
0.1
mL
3
0.05
mL
3
0.025*
mL
3
0.0125*
mL
3**
Problema
mL
1
Agua destilada
mL ---3
3
3
3
--Volumen final mL
3
3
3
3
3
3
Nota: *Estas concentraciones son a partir de la transferencia de 3 mL de la mezcla
anterior del tubo.
**En este tubo del volumen final de 6 mL, pipetear 3 mL y descartarlo.
Aadir a todos los tubos 6 mL del reactivo de orcinol cido y 0.4 mL del reactivo de orcinol-alcohol y
agitar vigorosamente.
Incubar los tubos en bao Mara a ebullicin por 10 minutos.
Enfriar los tubos en bao de hielo-agua para leer en el espectrofotmetro.
Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 660 nm, empleando el tubo 5 como blanco.
Registrar los resultados en la tabla siguiente.
Tubo
[RNA] mg/mL
0.1
0.05
0.025
0.0125
-------
Problema
Absorbancias
Blanco
Evidencias de aprendizajes
1) Construir la curva tipo con los datos de la tabla, donde las absorbancias sern las ordenadas y los mg de
RNA las abscisas.
2) Interpolar los valores de absorbancia de su problema y determinar la concentracin real en mg/mL.
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Tubo
Reactivo
mL
mL
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
mL
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Agua destilada
mL
Problema DNA
Problema RNA
[FOSFATO]
Absorbancia
M/mL
1
-------
2.5
Problema DNA
Problema RNA
Blanco
Evidencias de aprendizajes
1) Construir la curva tipo para fosfato con los datos de la tabla, donde las absorbancias sern las ordenadas y
los M/mL de las soluciones tipo las abscisas.
2) Cmo afecta el medio cido al enlace 3-5dister fosfato?
3) Cmo afecta el medio alcalino al enlace 3-5dister fosfato?
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