Anlisis de protenas de una sola clula

Resumen
La heterogeneidad de los sistemas celulares ha sido ampliamente
reconocida, pero slo recientemente se han puesto a disposicin
herramientas que permiten el sondeo de genes y protenas en clulas
individuales para entenderlo. Mientras que el avance en el anlisis
genmico de clula nica ha sido enormemente ayudado por el poder de las
tcnicas de amplificacin (por ejemplo, PCR), el anlisis de protenas en
clulas individuales ha demostrado ser ms difcil. Sin embargo, los
recientes avances en citometra de flujo multiparamtrica, microfludica y
otras tcnicas han hecho posible medir gran variedad de protenas en
clulas individuales. En esta revisin, destacamos desarrollos recientes
clave en el anlisis de protenas en una sola clula, y discutimos su
importancia en la investigacin biolgica.
Introduccin
Las protenas son centrales en todos los procesos celulares, incluyendo
proporcionar estructura a las clulas, transportar molculas a travs de las
membranas celulares, controlar el crecimiento celular y la adhesin,
catalizar procesos bioqumicos funcionando como enzimas y regulando la
transduccin de seales. Por lo tanto, caracterizar la cantidad y la actividad
de las protenas es fundamental para comprender los mecanismos
moleculares de los procesos celulares, incluidos los que participan en la
progresin de la enfermedad, la diferenciacin celular y el destino, y para
descubrir y desarrollar nuevas terapias, vacunas y diagnsticos. Medir el
ADN y el ARN puede proporcionar informacin cualitativa sobre los
productos gnicos (protenas), pero no puede proporcionar informacin
sobre la ubicacin de protenas, modificaciones postraduccionales (PTMs) o
interacciones con otras protenas y por lo tanto, necesitamos herramientas y
ensayos para medir directamente las protenas, sus modificaciones Y las
interacciones. Numerosos mtodos analticos han sido desarrollados para
analizar protenas tales como electroforesis en gel, inmunoensayos,
cromatografa y espectrometra de masas. Sin embargo, estos mtodos
requieren un gran nmero de clulas para el anlisis, lo que resulta en una
poblacin promedio de medicin. Las clulas son de naturaleza heterognea
y, por lo tanto, los datos promediados por poblacin pueden enmascarar los
mecanismos moleculares subyacentes; datos ms deseables en muchos
casos podran ser los datos a nivel de clulas individuales [ 1 - 5 ]. Un
ejemplo bien conocido es la respuesta de las bacterias a los antibiticos, en
ciertas dosis muchos mueren, pero algunos sobreviven. Del mismo modo,
una de las preguntas sin respuesta en la terapia del cncer ha sido por qu
clulas esencialmente idnticas responden de manera diferente a un
frmaco. La medicin del nivel de una sola clula de protenas (y otras
molculas) ha proporcionado informacin valiosa sobre los mecanismos que
dictan la heterogeneidad en la respuesta celular a los frmacos y otros
estmulos internos y externos. Por ejemplo, se inform de que la respuesta

dinmica del supresor de tumores p53 red de protenas derivadas de los

estudios de poblacin se [engaoso 4 ]. En lugar de las oscilaciones
amortiguadas observadas en los datos promediados por poblacin, las
clulas individuales muestran series de pulsos p53 no amortiguados con
amplitud y duracin fija, independientemente de la cantidad de irradiacin
. Del mismo modo, imgenes en tiempo real del factor de transcripcin
translocacin de RelA en clulas individuales revel la variabilidad en la
dinmica de oscilatorios de RelA translocacin entre las clulas individuales,
y que la dinmica de RelA translocacin determina el grado y el tiempo de la
expresin gnica aguas abajo [ 3 ]. La utilidad de las mediciones de clulas
individuales es obvia para la investigacin con clulas madre, ya que las
decisiones en clulas individuales determinan su destino. Para las clulas
madre hematopoyticas, el estudio de los diversos niveles de la protena
Sca-1 en las clulas individuales revel que Sca-1 abundancia de protenas
determina el momento y el tipo de diferenciacin [ 6 ]. En un contexto
clnico, se encontr que el nivel de una sola clula examen de las
poblaciones de clulas T que anteriormente se consideraban homogneos
para contener subpoblaciones con diferentes perfiles de citoquinas [ 25 ], y
estas diferencias puede servir para predecir la respuesta inmune del
paciente al tratamiento farmacolgico.
Desafos en el anlisis de protenas de una sola clula
Los mayores desafos para medir protenas en clulas individuales
(suponiendo que han sido exitosamente aislados de un tejido, comunidad
microbiana o cultivo) son una pequea cantidad de protena en una sola
clula y la enorme complejidad del proteoma. La adaptacin de los mtodos
tradicionales de anlisis de protenas a granel para aplicaciones de una sola
clula se ha reunido con diversos grados de xito, siendo el anlisis
cuantitativo especialmente difcil de alcanzar. Mediciones protemicos
pueden ser bastante complejos ya que hay varios tipos de mediciones para
ser abundancia o niveles de expresin de protenas hecho, modificaciones
post-traduccionales, la translocacin de protenas, interacciones con otras
protenas, ADN, etc., y actividad de la protena ( Figura 1 ). Ningn mtodo
analtico nico puede medir todos estos parmetros proteicos en una sola
clula, por lo tanto, se ha desarrollado una serie de mtodos bioqumicos y
biofsicos como se discute en las siguientes secciones.
Anlisis de protenas de una sola clula mediante citometra de
flujo
El mtodo ms establecido y fcil de usar para el anlisis de protenas de
una sola clula es la citometra de flujo. Su eficacia se deriva del hecho de
que mientras que las cantidades absolutas de protenas en una clula
pueden ser muy pequeas, las concentraciones de protenas localizadas
pueden ser mayores y medibles si las clulas se mantienen intactas. Desde
su invencin a finales de los aos sesenta, la citometra de flujo se ha
transformado de una tcnica limitada a medir 1-2 especies fluorescentes en
una clula a 10-15 especies en la actualidad, permitiendo perfilar rutas

completas en clulas individuales. Esta mejora ha sido posible gracias a los

avances tanto en la instrumentacin como en la disponibilidad de
anticuerpos altamente especficos. Roederer [ 7 , 8 ] y Nolan [ 9 ] grupos
fueron pioneros en el uso del anlisis de mltiples parmetros utilizando
citmetros de flujo de mltiples colores para medir 10-15 protenas clave en
las vas de sealizacin de forma simultnea en clulas individuales. La
capacidad de realizar mediciones correlacionadas de mltiples protenas en
las clulas individuales se ha convertido en citometra de una poderosa
herramienta para analizar semi-cuantitativamente las vas subyacentes
muchas enfermedades [ 10 , 11 ]. Tiramida amplificacin de la seal, que ha
sido utilizado como medio para amplificar la deteccin de cido nucleico en
protocolos de hibridacin in situ, se ha aadido a las tcnicas tradicionales
de la tincin de anticuerpos para el anlisis de las protenas de baja
abundancia [ 12 ]. Mientras que la citometra multiparamtrica permiti una
alta seleccin de contenido (por ejemplo, de mltiples quinasas) en clulas,
su rendimiento era todava demasiado limitado para ser til para la
deteccin de frmacos. Esta limitacin fue superada por el desarrollo de un
mtodo de codificacin de barras en las clulas tratadas de manera
diferente etiquetados con una combinacin de tres colorantes [ 13 ]. Cada
colorante, dependiendo de la dilucin, permite hasta 7 niveles de intensidad
y, por lo tanto, la combinacin de los 3 colorantes permite procesar hasta
343 muestras de un grupo de clulas.
Aunque la citometra de flujo ha sido ms comnmente utilizada para el
anlisis de quinasas y fosfatasas, tambin es til para otros tipos de
mediciones de protenas, tales como niveles de glicosilacin y produccin de
citoquinas. Venable et al. usado un panel de 14 lectinas para caracterizar los
glicanos presentes en la superficie celular como posibles marcadores de
pluripotencia en clulas madre embrionarias humanas [ 14 ].
Un factor que limita la aplicacin ms amplia de la citometra de flujo a la
protena glicolisilada es que hay muy pocas lectinas disponibles. La
citometra de flujo tambin puede usarse para el anlisis de protenas
secretadas tales como citoquinas. Esto requiere el tratamiento de las clulas
con un inhibidor de la formacin de vesculas para atrapar citoquinas
sintetizadas en el Golgi, seguido por la fijacin y permeabilizacin para teir
las citoquinas atrapados con anticuerpos fluorescentes para el anlisis de
citometra de flujo [ 15 ].
Citometra de flujo microfludica
Mientras que los citmetros de flujo comerciales permiten la interrogacin
de las clulas una a la vez, la preparacin de la muestra todava se hace
manualmente y por lo tanto, requiere un gran nmero de clulas. Esto hace
que sea difcil analizar muestras que estn limitadas en cantidad tal como
clulas recuperadas de una muestra de biopsia, muestras de tejido o
pequeos volmenes de sangre. Para permitir el anlisis de pequeo
nmero de clulas (100 a 1000), las plataformas de microfluidos se han
desarrollado que integran muestra manejo con citometra de flujo y

clasificacin [ 16 , 17 ]. Srivastava et. Alabama. [ 18 ] desarroll un

dispositivo de microfluidos integrado, retro-instalado en microscopios
comerciales, que pueden realizar el cultivo de clulas, la estimulacin y la
preparacin de muestras en combinacin con imgenes de fluorescencia
convencional y citometra de flujo de microfluidos ( Figura 2 ) para controlar
la respuesta inmune en macrfagos. Este dispositivo microfludico no slo
redujo drsticamente la cantidad de muestra y reactivo requerida, sino que
tambin proporcion un medio para realizar dos modos ortogonales de
mediciones, imgenes y citometra, en un experimento. De manera similar,
McKenna et al. Aprovecharon la microfludica para implementar un citmetro
de flujo de 384 canales para clulas de imagen. Este enfoque permite
superar el bajo rendimiento de los citmetros de flujo de imgenes basados
en CCD mediante la recopilacin de una sola dimensin, imgenes de baja
de pxeles (~ 1/1000 de informacin en comparacin con una imagen de
CCD) en hasta 384 canales de fluidos al mismo tiempo [ 19
Anlisis de protenas de clula nica por citometra de masa
El anlisis basado en citometra de flujo de clulas individuales ha permitido
el anlisis de hasta 15 protenas simultneamente como se describi
anteriormente. Sin embargo, la interrogacin a nivel de sistema de las vas
biolgicas requiere la capacidad de hacer muchas ms mediciones
correlacionadas. Un desarrollo prometedor ha sido un enfoque llamado
masa citometra donde el rendimiento de la citometra de flujo se combina
con la ultra-alta dimensionalidad y la sensibilidad de la espectrometra de
masas [ 20 ]. En cytomtery masa, las clulas se tieron con anticuerpos
conjugados con 20-30 diferentes polmeros istopo de metal que contienen [
21 ]. Las clulas etiquetadas se inyectan y se nebulizan y las etiquetas
metlicas se cuantifican usando espectrometra de masas de tiempo de
vuelo de plasma acoplado inductivamente. Esta poderosa tcnica se utiliz
para el perfil simultneamente 34 parmetros en clulas de mdula sea
individuales, incluyendo la unin de anticuerpos 31, viabilidad, contenido de
ADN, y el tamao relativo de clulas [ 22 ]. Esta tcnica debera ser capaz
de medir nmeros incluso ms altos de marcadores simultneamente
considerando que la precisin de la deteccin de espectrometra de masas
supera la cuestin de la superposicin espectral que confunde las
mediciones de fluorescencia.
Analisis de afinidad para el anlisis de protenas de una sola clula
Las plataformas de anticuerpos inmovilizados en superficie tambin pueden
adaptarse para detectar protenas secretadas a partir de clulas
individuales. Por ejemplo, disponible comercialmente mtodo ELISPOT [ 23 ],
que se basa en una membrana de PVDF revestido con anticuerpo para
unirse protena diana seguido de la deteccin con un segundo anticuerpo,
fue modificado para usar la deteccin basada en la fluorescencia de las
citoquinas secretadas por las clulas individuales [ 24 ]. Sin embargo, puede
tomar muchas horas, incluso das antes de que las citoquinas sean
detectables y el multiplexado se limite a 1-3 citoquinas. Un importante paso

hacia la multiplexacin se hizo recientemente en la forma de una sola clula

de chip de cdigo de barras de alto rendimiento [ 25 ]. El chip contiene 1040
micropocillos de 3-nl volmenes que contienen anticuerpos de ADN con
cdigos de barras a ms de 10 citoquinas, con los estndares de
cuantificacin en la resolucin de nmero de copias de protenas
incorporados en los cdigos de barras de anticuerpos. Se aslan de 1 a 40
clulas en cada micropocillo y se evalan sus secreciones de citoquinas
mediante ensayo de inmunoensayo de fluorescencia. El chip se us con
xito para perfilar la secrecin de citoquinas de clulas T citotxicas
especficas de antgeno tumoral y podra ser til para perfilar otras vas
inmunitarias. Otra mejora a la matriz de afinidad fue hecha por Choi et. al.,
en donde las citocinas liberadas de las clulas individuales se detectaron
mediante anticuerpos con oligmeros fluorescentes unidos covalentemente
que se pueden amplificar para aumentar la sensibilidad de deteccin de
hasta 200 veces [ 26 ].
Anlisis de protenas monocelulares basadas en espectrometra de
masas
La espectrometra de masas de clulas nicas (MS) tiene el potencial de
proporcionar un anlisis cuantitativo sin etiqueta de todo el proteoma de
una sola clula, incluyendo protenas, pptidos y PTMs. La ventaja de la MS
es que no hay necesidad de etiquetas moleculares, y la sensibilidad
femtomolar se alcanza rutinariamente para protenas puras. Las tcnicas de
espectrometra de masas utilizadas para estudios de clulas nicas incluyen
MS de electronespray, lser / desorcin / ionizacin (LDI-MS) y MS de iones
secundarios (SIMS). Desorcin por lser asistida por matriz (MALDI) -MS se
ha utilizado para analizar neuropptidos en neuronas individuales [ 27 ].
Usar MS para estudiar protenas en las clulas individuales tiene sus
limitaciones. El mayor inconveniente es la falta de sensibilidad (baja seal /
ruido) para detectar la baja cantidad de protenas que normalmente se
encuentran en las clulas individuales. Los mtodos de preparacin de
muestras que pueden fraccionar las protenas antes de la espectrometra de
masas pueden ayudar. En un artculo reciente, la integracin de la lisis
celular de microfluidos y la separacin electrofortica capilar con
espectrometra de masas por electrospray se utiliz para la deteccin de
alto rendimiento de la hemoglobina en los eritrocitos individuales [ 28 ]. Un
reciente informe de la combinacin de microarrays con el anlisis de MS es
una promesa para aumentar el rendimiento de anlisis de protenas de
clulas individuales [ 29 ].

Anlisis de protenas monocelulares basadas en separacin

Una clula tpicamente tiene miles de protenas expresadas y una
separacin de alta resolucin del contenido celular en protenas individuales
por electroforesis o cromatografa puede ayudar en gran medida a las
mediciones de esas protenas. La ventaja de los mtodos de separacin,

especialmente las separaciones multidimensionales, es que permiten una

medicin imparcial de todo el proteoma en un experimento. Esto permite a
los investigadores monitorear los cambios en el proteoma de una clula a
nivel global como una funcin de un estmulo externo. Las separaciones
convencionales de incrustaciones tales como HPLC o electroforesis en gel de
placas son impracticables para clulas individuales debido a su incapacidad
para procesar diminutas cantidades de protenas. La electroforesis capilar,
implementada en capilares que imitan las dimensiones de las clulas (10100s de m id) o ms recientemente en chips microfludicos con canales de
tamao micromtrico, es ms prometedora, ya que tiene el potencial de
separar y analizar el proteoma de una sola clula, especialmente las
grandes clulas de mamfero [ 30 ]. Para mejorar la capacidad de punta, la
separacin de dos dimensiones se ha tratado de perfilar los cambios en las
clulas del cncer [ 31 ]. Un dispositivo microfludico que integra la captura,
la lisis, la electroforesis capilar de las clulas individuales con recuento de
fluorescencia de una sola molcula se utiliz para cuantificar especies de
protenas raras (<1000 copias por clula) [ 32 ]. A pesar de estos avances,
los mtodos basados en separacin no se usan rutinariamente en el anlisis
de clulas individuales debido a dos factores principales: las separaciones
basadas en chips capilares o microfludicos no tienen la capacidad mxima
para resolver miles de protenas en una clula y la mayor parte de la
deteccin Los mtodos utilizados no tienen la capacidad de detectar
protenas de baja abundancia.

Sondas genticas y qumicas para anlisis de protenas de una sola

clula
La exactitud y la sensibilidad de las mediciones de protenas dependen en
gran medida de la disponibilidad y funcionalidad de las sondas moleculares
que pueden enlazarse selectivamente a protenas de inters. Los
anticuerpos gozan de popularidad generalizada debido a su alta
especificidad, pero no son el remedio universal para todas las aplicaciones
de anlisis de protenas. Los anticuerpos no entran en las clulas vivas, por
lo que no pueden ser utilizados en los estudios de clulas vivas. Tambin
son engorrosos para generar contra nuevos antgenos, y demasiado caros
cuando muchas protenas deben ser perfiladas simultneamente.
Alternativas a anticuerpos incluyen sondas genticas - la familia GFP de
protenas fluorescentes que se pueden genticamente fusionado a la
protena de inters, y traducen en protenas de fusin fluorescentes que son
detectable y cuantificable, incluso para gran escala perfiles protemicos
[ 33 ]. Los inconvenientes de GFP y otras sondas genticas son a) que
requieren ingeniera gentica de la clula, limitando su aplicacin a clulas
cultivadas, yb) su gran tamao puede interferir con la funcin de la
protena. Para marcar las protenas con sondas ms pequeas en una clula
viva, se ha desarrollado una nueva clase de molculas qumicas,
denominadas sondas bio ortogonales. La qumica bio-ortogonal utiliza la

propia maquinaria de la clula para incorporar covalentemente sondas

abiticas a componentes celulares especficos incluyendo protenas y sus
modificaciones postraduccionales. Algunos de los aspectos ms destacados
en el desarrollo de la sonda bioorthogonal incluyen el flash colorante
fluorescente biarsnico, que reacciona especficamente con protenas diana
genticamente fusionado con el motivo de tetracistena [ 34 ]; la
condensacin de carbonilo de cetona funcionalizado Amono cidos en
protenas y deteccin de una sonda fluorescente hidrazida-funcitonalized
[ 35 ]; y las sondas qumicas selectivas bioorthogonal para el etiquetado
metablico de glicanos [ 36 ].

Perspectiva futura
El futuro del anlisis de protenas de clulas individuales depender de
varios factores. En primer lugar, se necesitan un mayor repertorio de sondas
de alta afinidad (aparte de los anticuerpos monoclonales) para detectar
protenas de baja abundancia, modificaciones postransacionales e
interacciones proteicas. Algunos candidatos prometedores incluyen
aptmeros, fragmentos variables de una sola cadena y reporteros
biorthogonal. En segundo lugar, las tcnicas que pueden aislar de forma
efectiva y fiable clulas individuales de cultivo, tejidos, muestras clnicas y
ambientales debern mejorar an ms su rendimiento, facilidad de uso y
reproducibilidad. En tercer lugar, la mayora de las tcnicas descritas
anteriormente usan experimentos a nivel de poblacin seguido por anlisis
a nivel de clula nica. Tambin ser til contar con tecnologas que
permitan la experimentacin, as como el posterior anlisis a nivel de clula
nica. Por ejemplo, la introduccin de un virus a una clula inmunolgica y
la grabacin de la interaccin en tiempo real. Si bien este tipo de
experimentos no representan necesariamente los fenmenos biolgicos in
vivo, se pueden simplificar las interacciones suficiente como para hacer
observaciones bsicas que estn ocultas de otro modo en un experimento
de poblacin. Por ltimo, para que las nuevas tecnologas de una sola clula
sean ampliamente utilizadas, tambin necesitamos desarrollar herramientas
informticas y de modelado que sean personalizadas para clulas
individuales y puedan integrar las mediciones de protenas con otros tipos
de mediciones de clulas individuales como genmica, transcriptmica y
Metabolmica.