UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

SIMN RODRGUEZ
NCLEO FELIX ADAM - CANOABO
INGENIERA DE ALIMENTOS
II. LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

FACILITADOR:
Ing. Molina Tedder.

(PRCTICA 2)
I.

PARTICIPANTE:

AISLAMIENTO DE SALMONELLA SSP.

Nhayr Carrillo.
Edgar Garcia.
Daniela Rodrguez.

I.

Determinacin e identificacin de salmonella

presente en una muestra de alimentos.

INTRODUCTION

Los alimentos que el hombre consume son

procedentes de origen animal y vegetal, por esta razn es
importante conocer los fundamentos biolgicos de la flora
microbiana asociada a cada uno de ellos, para as tener en
cuenta que estamos consumiendo y cmo podemos evitar
posibles intoxicaciones por los mismos.
La Salmonella es un bacilo Gram negativo, la cual
fermenta algunos carbohidrato, y es un microorganismo
aerobio y anaerobio facultativo esta es considerada como uno
de los microorganismos con mayor nivel de contaminacin en
los alimentos produciendo en el hombre diversos tipos de
enfermedades. Los alimento vehiculizados con esta bacteria
son las carnes, las aves, productos pesqueros, leches y sus
derivado entre otros.
Para ello es necesario separar las bacterias unas de
otra, y activarlas al estado puro para su reconocimiento
exhaustivo; empleando los mtodos descritos que permiten
aislar los microorganismos para estudiarlos (en medios de
cultivo especiales, tanto su morfologa
como sus
caractersticas fisiolgicas y bioqumicas). En dicha
experiencia se estudiara el control microbiano que existe sobre
una muestra de carne procesada en una carnicera comercial de
la comunidad.

Especficos

-Observar las reacciones tpicas en varios medios

seleccionados para salmonella.
-Aislamiento e identificacin de microorganismos
patgenos.
-Familiarizar al participante con las pruebas bioqumicas
que se realizan para identificar M.O. patgenos.
METODOLOGIA

Aislamiento de salmonella ssp

Fase de pre enriquecimiento

Se pesaron 10 gr de muestra (carne molida) y se

colocaron en un medio de 90 ml de caldo nutritivo el cual no
posee sustancias inhibidoras su funcin es rehidratar las
bacterias presentes en la muestra y ayudar a proliferacin. Esta
fase se incubo a una temperatura de 37 C durante 24 Horas.

OBJETIVOS DE LA PRCTICA

Fase de enriquecimiento

Al observar presencia turbidez y descomposicin del

medio se pipete 10 ml de muestra y estos fueron agregados a
diferentes caldos de cultivo selectivos para el desarrollo del
microorganismo, estos caldos fueron el Selenito Cistina y el
Rappaport Vassiliadis (a 37 C por 24 horas).

General

Fase de aislamiento

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NCLEO FELIX ADAM - CANOABO
INGENIERA DE ALIMENTOS
II. LABORATORIO
DE MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
Formacin
leve
Aislamiento de
cultivo puro:
Agar nutritivo

de colonias de
salmonella, de
Color
Positivo
blanquecino,
redondeadas y
semi convexa.
Se tomaron muestras de la prueba anterior, estos
fueron aislados en cepas que contenan los siguientes medios
de cultivo Agar Salmonella Shigella y Agar BVB. Esto con el
propsito de usar medios en el cual esta bacteria se
desarrollara de forma adecuada. Del desarrollo observado se
tomaron colonias tpicas, las cuales para su posterior
confirmacin se realizaron siembras en agar nutritivo. Se
incub por 24 horas a 37 C. y como paso final se realizaron
las pruebas bioqumicas a dichas colonia crecidas en el agra
nutritivo.
MATERIALES Y MTODOS
Materiales:

Tubos de ensayo.
Mechero.
Asa y aguja de platino.
Balanza.
Estufa.
Placas de petri.
Gradillas.
Pinzas.
Frasco de dilucin mayor.

gr): agregarla al frasco de agua peptonada y homogenizar,

dejando que repose en condiciones adecuadas para el
crecimiento bacteriano de Salmonella ssp. (A 37C/24Hrs. En
la estufa).
Tabla 1. Aislamiento de Salmonella en una muestra de carne.
Medio
PreEnriquecimien
to:
Caldo nutritivo
Enriquecimien
to selectivo:
caldo Selenito
cistina y
Rapapport
vasiliadis:

Aislamiento:
agar
Salmonella
Shigella y bilis
verde
brillantes

Medios de cultivo:

Caldo Nutritivo.
Caldo Rapapport Vassiliadis.
Caldo Selenito cistina.
Agar Bilis verde brillante.
Agar Hierro lisina.
Agar Citrato de Simons.
Agar Salamonella-Shigella
Agar Nutritivo.
Caldo Urea.

Nombre del alimento

Nota: Preparacin de la
muestra de carne molida (10

Procedencia

Resultado

Positivo

Positivo

Positivo

Tabla 2.
Pruebas Bioqumicas para el aislamiento de Salmonella ssp.
Prueba bioqumica

Resultado

Citrato de
Simmons

Positivo: cambio de
coloracin
a
azul
intenso
en
la
superficie.

HOJA DE REGISTRO.
Anlisis microbiolgicos:
Determinacin de Salmonella.

Caracterstica
Turbidez en el
medio
y
formacin
de
una
capa
Presencia
blanquecina de
en
turbidez
en del
los
la superficie
tubos
y un ligera
cultivo.
palidez del color
en los mismos
(hubo
menor
turbidez en el
caldo
selenito
cistina)
Formacin de
colonias
sobre
las
estras,
de
color rosadas
con
centro
rojo
y
blancas con
centro negro
(produccin
de SH2).

Carne de res.
(Carne molida)

Urea
Carnicera La popular
Caractersticas Organolpticas
Color
Rojo
Consistencia
Blanda - heterognea
Transporte
Bolsa SIPLOG
Olor
Caracterstico
Recepcin
Capsulas de petri

Negativo: formacin
de un anillo rojo
sobre la superficie

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del caldo.

Hierro Lisina

Negativo:
bisel
violeta, profundidad
amarilla
(fermentadores
de
glucosa).

DISCUSIN DE RESULTADOS
El procedimiento realizado para el aislamiento de
Salmonella ssp. Dieron resultados positivos a la presencia de
esta bacteria en los diferentes medios empleados desde su
enriquecimiento hasta su aislamiento. Este proceso se inicio
con tres fases sucesivas; el primer paso fue el preenriquecimiento el cual se hizo en con el caldo nutritivo para
reanimar la bacteria. Segn la AOAC (2003), el objetivo de
esta etapa es normalizar metablicamente las clulas de
Salmonella spp. que se encuentren en determinada matriz para
su perfecto desarrollo. Se realiza a partir de medios de cultivo
no selectivos como agua peptonada, caldo nutritivo, otros.
El la fase de enriquecimiento selectivo se emplearon caldos
selectivos como el caldo Selenito Cistina y Rapapport
Vassiliadis, los cuales son idneos para trabajar con la
salmonella, Gonzlez et al. (2014) los componentes de cada
medio ayudan al crecimiento de esta especie bacteriana. En el
caldo SC, la selenita inhibe el crecimiento de gran parte de la
flora intestinal competitiva (E. coli, Enterococos), sin afectar a
Salmonella, Shiguella, Pseudomonas o Proteus, mientras que
la Cistina acta favoreciendo el crecimiento de Salmonella.
En dichos medios se observo posterior a las 24 Hrs/ 37C de
incubacin una turbidez y una ligera palidez en los tubos (el
caldo Selenito C. hubo poca presencia de turbidez).
En la etapa de aislamiento en medios selectivos se
visualizo el crecimiento de colonias de color rasa con centros
rojos, negras y transparentes con centro negro lo que indica el
crecimiento efectivo de salmonella, ya que en los medios

usados (Agar Salmonella-Shigella y Bilis verde brillante)

segn Laboratorios Britania (2010), el crecimiento de colonias
de esta bacteria se caracteriza por ser de color blanco-rosadas
con centro o fondo rojo (agar Bilis verde brillante) y
tranparentes con centro negro (Agar Salmonella- Shigella).
Adems, la produccin de cido sulfhdrico se evidencia como
colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de
hierro. De acuerdo con lo sealado por Laboratorios Britania
se puede acotar que si hubo proliferacin de salmonella.
Gonzlez et al. (2014) Las salmonellas presuntivas
de las placas de los medios selectivos deben ser confirmadas
mediante pruebas bioqumicas y serolgicamente mediante
aglutinacin con anticuerpos polivalentes. Siguiendo con el
procedimiento acotada por Gonzlez et al. para el aislamiento
de cepas puras se utiliz agar nutritivo inclinado en tubo,
donde se vio crecimiento leve de colonias blanquecinas luego
del perodo de incubacin (24 Hrs/ 37C) y posterior a esto, se
llevaron a cabo las pruebas bioqumicas de citrato, urea y
lisina. En la prueba de citrato (agar Citrato de Simmons) el
resultado fue positivo ya que, la superficie del agar se torno
azul intenso, lo que significa que esta enterobacteria tiene la
capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y
energa con medio alcalino. Laboratorios Britania (2010) El
metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias
poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido
tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato genera
progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en
presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos
que al ser utilizados como fuente de carbono, producen
carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al
azul y esto es indicativo de la produccin de citrato
permeasa.
Para la prueba en agar Hierro Lisina los resultados
son dudosos ya que al darse el cambio de color en el tubo:
bisel amarillo con superficie violeta despus de pasadas las 24
horas de incubacin, es considerable que tal coloracin se
debe a que el cultivo aislado no posee la enzima capaz de
descarboxilar aminocidos especficos (lisina) ya que no se
torno totalmente violeta como se indica tericamente;
Laboratorios
Britania
(2010)
seala
que
Los
microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero
que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la
totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de
incubacin se observa el pico de color violeta debido al

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consumo de las peptonas, y el fondo amarillo y que

resultados positivos para descarboxilacin son: superficie
alcalina / profundidad alcalina (pico violeta / fondo violeta).
Sin embargo este medio se emplea en la diferenciacin de
microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la
descarboxilacin y desaminacin de la lisina y en la
produccin de cido sulfhdrico, por lo cual es curioso dichos
resultados. Por tales motivos se puede acotar que los
resultados no son positivos totalmente, pero en cierto grado
por existir color purpura caracterstico, existe duda de los
mismos.
La ltima prueba bioqumica realizada fue en caldo
urea el cual arrojo resultados positivos falsos al formarse un
anillo rojo en la superficie del lquido y segn bases tericas
este medio Se utiliza solamente para la deteccin de la
actividad de la ureasa en especies del gnero Proteus que dan
la prueba positiva despus de una incubacin de 8 hrs,
cambiando el caldo de amarillo a rasado-rojizo. Mndez et al
(2006) menciona que la salmonella es una bacteria mvil que
produce acido sulfhdrico (H 2S), emplean glucosa por poseer
una enzima especializada, pero no lactosa y no producen
ureasa. Por esto se considera que la prueba es negativa en su
totalidad.

CONCLUSIONES

En los medios de aislamiento selectivos pudo

existir presencia de otros microorganismos que
no eran salmonella (E. coli, proteus, otros), que
tambin son capaces de proliferar en dichos
medios.
A travs de la utilizacin de los diferentes
medios selectivos para la multiplicacin y
aislamiento de Salmonella se pudo poner en
evidencia la contaminacin de la muestra (carne
molida) por dicho microorganismo.
El crecimiento de salmonella en el agar
Salmonella Shigella (medio selectivo) pudo
evidenciar colonias caractersticas capaces
producir de acido sulfhdrico por la formacin de
centros negros.

Los resultados obtenidos en la prueba

bioqumicas, denotaron un valor positivo (citrato
de Simmons) y dos negativos (hierro lisina y
caldo urea) en las tres pruebas realizadas, por lo
que se podra dudar de la especie de salmonella
ssp presente.
RECOMENDACIONES

Mantener una rigurosa manipulacin

durante todo el proceso de aislamiento
de salmonella, por ser esta una bacteria
patgena peligrosa.
Emplear todo el equipo de seguridad
(guantes, tapa bocas, gorro) para
evitar contaminaciones cruzadas o con el
microorganismo directamente
(salmonella ssp.).

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Detection of Salmonella in Fresh Cheese, Poultry Products,
and Dried Egg Products.
(2003). AOAC Official
Method: Collaborative Study. J.
AOAC Int.; (86): 275-295.
GONZALEZ J. et al. (2014). Aislamiento microbiolgico de
Salmonella spp. Y
herramientas
moleculares para su deteccin. Artculo de revisin, Salud
Uninorte. Vol. 30, N 1, 2014 ISSN 0120- 5552. Barranquilla,
30 (1): 73-94.
Laboratorios Britania (2010). Salmonella Shigella Agar.
Caba Argentina.
Mndez et al. (2006). Epidemiological relationships among
strains
of Salmonella
enterica subsp. enterica is
olated from humans, poultry
and food. Universitas
Scientiarium - Revista de la Facultad de Ciencias. Vol. 11, No.
1, 5-13.

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