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Brazilian Journal of Infectious Diseases

Imprimir versin ISSN 1413-8670


Braz J Infect Dis vol.15 no.3 Salvador Mayo / Junio 2011
http://dx.doi.org/10.1590/S1413-86702011000300005

El diagnstico y la deteccin cuantitativa de ADN del HSV en muestras de pacientes con sospecha de herpes
simplex encefalitis
Mazyar Ziyaeyan I ; Abdolvahab Alborzi II ; Afshin Borhani Haghighi III; Marziyeh Jamalidoust IV ; Mahsa
Moeini V ; Bahman Pourabbas VI
Me

PhD; Profesor Adjunto, Profesor Alborzi Centro de Investigacin Clnica Microbiologa, Universidad de Shiraz de Ciencias
Mdicas, Shiraz, Irn IIMD; El profesor, el profesor Alborzi Centro de Investigacin Clnica Microbiologa, Universidad de
Shiraz de Ciencias Mdicas, Shiraz, Irn IIIMD; Profesor Asociado, Departamento de Neurologa, Universidad de Shiraz de
Ciencias Mdicas, Shiraz, Irn IV MSc; Doctorando Profesor Alborzi Clnica Centro de Investigacin de Microbiologa,
Universidad de Shiraz de Ciencias Mdicas, Shiraz, Irn V Maestra; El investigador Alborzi Microbiologa Clnica Centro de
Investigacin, Universidad de Shiraz de Ciencias Mdicas, Shiraz, Irn VI Profesor Adjunto, Profesor Alborzi Centro de
Investigacin Clnica Microbiologa, Universidad de Shiraz de Ciencias Mdicas, Shiraz, Irn

ABSTRACTO
El diagnstico de la encefalitis por herpes simple (HSE) se basa en la deteccin del ADN del virus herpes simplex (HSV) en
las muestras de LCR de los pacientes. HSV cuantificacin de ADN tiene el potencial para la estimacin de los efectos de la
terapia antiviral. El objetivo de este estudio fue diagnosticar ADN de VHS en pacientes HSE sospechosos y el anlisis
cuantitativo de su genoma mediante PCR en tiempo real para evaluar el valor de la carga viral en el curso del tratamiento
antiviral. Las muestras de LCR fueron recogidos de 236 pacientes sospechosos de HSE consecutivos desde noviembre de
2004 hasta mayo de 2008. Tras la extraccin de ADN, las muestras se analizaron mediante el ensayo de PCR en tiempo
real. Un conjunto de cebadores amplifica una secuencia comn de HSV gen de la glicoprotena B. El nmero de copias de
muestras desconocidas se expresaron a travs de una curva estndar dibujada con una cantidad conocida de plsmido
clonado amplificado. De las 236 muestras, 137 (58%) procedan de los varones y 99 (42%) de las mujeres. El genoma HSV
se detect en 22 (9,3%) pacientes por PCR, 13 varones / hembras 9. Muestras de LCR en serie estaban disponibles a partir
de 10 de los 22 pacientes. El rango de la ADN HSV nmero de copias en las muestras clnicas variaron de 2,5 10 2 a 1,7
10 6 copias / ml de CSF. Cuantitativos resultados de la PCR pueden ser tiles en la evaluacin de la eficacia de la terapia
antiviral en los pacientes antes mencionados.Existe una asociacin entre la carga viral inicial y la duracin del ciclo de
tratamiento.
Palabras clave: la encefalitis; Herpes Simple; la carga viral; aciclovir; anlisis cuantitativo.
INTRODUCCIN
La encefalitis por herpes simple (HSE) es la forma ms comn de encefalitis viral espordica; pero sigue siendo una
enfermedad poco frecuente, con una incidencia estimada de 1 en 250.000 a 1 de cada 500.000 personas por ao. 1,2 aguda
HSE se asocia con una alta morbilidad y mortalidad. En pacientes no tratados o los de la terapia antiviral ineficaz, la
mortalidad es aproximadamente 70% y de pacientes que sobreviven, secuelas neurolgicas importante se produce en casi
97%. 3 El diagnstico precoz y el uso de aciclovir como agente teraputico son altamente eficaces en la reduccin de la tasa
de mortalidad debido a HSE; Sin embargo, las complicaciones neurolgicas permanentes son comunes en los
supervivientes. 4 simplex virus (HSV) de deteccin de ADN por el ensayo de PCR del lquido cefalorraqudeo (LCR)
muestras del herpes es muy eficiente para establecer el diagnstico de HSE y se ha convertido en el mtodo diagnstico de
eleccin. 5-7 es un mtodo fiable, altamente sensible y especfica. Quantitative HSV-PCR se puede utilizar para controlar el
efecto de tratamiento, 8 pero su correlacin con no se ha establecido el pronstico. 9
El objetivo del presente estudio fue evaluar el ADN de HSV en el LCR de los pacientes sospechosos de HSE, as como el
efecto del tratamiento con aciclovir en el nmero de copias de ADN del HSV en el LCR por un Real-Time PCR TaqMan
sonda.

MATERIALES Y MTODOS
Los pacientes
En el presente estudio, 236 pacientes consecutivos mayores de 16 aos con sospecha de HSE se realiz un estudio
prospectivo. La muestra de pacientes incluy 137 (58%) hombres y 99 (42%) mujeres, con edades comprendidas entre 16 y
81 aos (media desviacin estndar: 44.24 15,45 aos). Las muestras de LCR de los pacientes fueron sometidos al
Centro de Investigacin Clnica Profesor Alborzi Microbiologa, Hospital Namazi, Shiraz, Irn entre noviembre de 2004 a
mayo de 2008 para el diagnstico de la infeccin por el VHS.Los criterios de inclusin fueron de anomala del
comportamiento, alteracin progresiva del sensorio, focal o convulsiones generalizadas con o sin dficit neurolgico focal,
precedido por una historia de la fase prodrmica de dolor de cabeza, fiebre y otros sntomas constitucionales. Las muestras
iniciales se obtuvieron de 0 a 5 das despus de la aparicin de los sntomas clnicos, antes del tratamiento. En los
pacientes de PCR positivos, se obtuvieron muestras de LCR antes del tratamiento, as como siempre que sea posible
durante el tratamiento.Las muestras de LCR se mantuvieron a -20C hasta el ensayo de PCR.
El tratamiento emprico con aciclovir se inici para todos los pacientes con sospecha de HSE, mientras se espera el
resultado de la PCR. tratamiento con aciclovir continu para los pacientes con resultados positivos de PCR y tambin para
algunos pacientes cuyos mdicos decidieron administrar un tratamiento basado en hallazgos clnicos y otros workups como
centro de coordinacin electroencefalogrfica (EEG), tomografa computarizada (TC) y / o resonancia magntica (RM)
resultados (aciclovir por va intravenosa, 30 - 40 mg / kg / da, durante 8 - 21 das).
Extraccin de cido nucleico
Se extrajo el ADN a partir de 200 l de CSF utilizando basado spin-columna QIAamp Mini Kit (Quiagen, Hilden, Alemania). se
utiliz protocolo de extraccin para CSF como se indica por el fabricante.
Real-Time PCR
El Real-Time PCR cuantitativa se realiz con pares de cebadores de oligonucletidos y la sonda especfica para la regin
de tipo comn de HSV-1 y HSV-2 glicoprotena B (gB), como se inform anteriormente. 10 Los cebadores utilizados fueron
HSV-FP (5 ' - TCC CGG TAC GAA GAC CAG-3 ') y HSV-RP (5'-AGC AGG CCG CTG TCC TTG-3'), y la sonda era HSV-TCP
(5'-FAM-TGG TCC TCC AGC ATG GTG ATG TTG / C AGG TCG-TAMRA-3 '). La amplificacin se llev a cabo en un 7,500
mquina Applied Biosystem Sequence Detector, programado para un protocolo de cuatro pasos: 2 min de incubacin a
50C para la activacin de AmpErase, 10 min a 95C para la activacin de la polimerasa y durante 45 ciclos: 15 s a 94 C
para la desnaturalizacin, 60 s a 58C para la hibridacin, extensin y recogida de datos. Cada mezcla de PCR contena 50
l 10 l de ADN purificado, 840 nM concentraciones de cada cebador y sonda de 100 nM en 1x TaqMan PCR Universal Master
Mix (Applied Biosystems, Branchburg, Nueva Jersey, EE.UU.). Los controles negativos fueron incluidos en el proceso de
extraccin entre cada 20 muestras clnicas. Todas las muestras negativas fueron probados dos veces.
Amplicones diana se producen sobre la base de un protocolo estndar de PCR por los conjuntos de cebadores
anteriormente mencionados y se separaron en gel de agarosa y despus se extrajo y se purific en gel y se clonaron en el
vector pTZ57R (Fermentas UAB, Vilnius, Lituania). 11 El plsmido que contiene la diana secuencias se purific utilizando un
kit comercial (Fermentas UAB, Vilnius, Lituania) y se determin su concentracin espectrofotomtricamente. La
cuantificacin se llev a cabo mediante la elaboracin de las curvas de calibracin utilizando el plsmido pTZ57R diluido en
serie que contiene el producto de amplificacin objetivo.Seis estndares positivos de control en 10 1 , 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 y
10 6 se utilizaron copias / reaccin. La curva estndar fue lineal dibujado en 10 a 10 6 copias / reaccin del virus (R2 =
0,98). El nmero de copias de las muestras clnicas se calcularon automticamente por biosistema aplicada deteccin de
secuencias de software v 1.3.1.
Anlisis estadstico
Estadstica descriptiva, Pearson Chi-cuadrado de ensayo, prueba t de dos colas independientes, emparejado t-test y test de
rangos signados de Wilcoxon se utilizaron para el anlisis de los datos; p-valor inferior a 0,05 fue considerado
significativo. SPSS versin 15 (Chicago, IL, EE.UU.) se utiliz para el anlisis estadstico.
RESULTADOS
Entre los 236 pacientes incluidos en este estudio, 22 (9,3%) tuvieron resultados positivos de PCR. Trece pacientes PCR
positivos eran masculinos y 9 eran mujeres. Las muestras de LCR secuenciales estaban disponibles para 10 pacientes. Se
detect ADN de VHS en un total de 34/42 (81%) muestras de LCR de estos 22 pacientes. Los datos demogrficos y
resultados de laboratorio se muestran en la Tabla 1 . No se encontr correlacin entre la edad, el gnero y los resultados
positivos de PCR (p> 0,05).

El nmero de copias de ADN del HSV, medida por el ensayo de PCR en tiempo real, vari de 2,5 10 2 a 1,7 x 10 6 copias /
ml en las muestras iniciales de CSF; la mediana de 4,8 10 4 copias / ml. La carga viral en las muestras de LCR inicial de
los pacientes 29 y 77, con ms de una muestra para cada uno, apareci ms baja que en la segunda muestra obtenida. En
ambos pacientes, el virus se hizo indetectable, despus de un tratamiento antiviral 21 das. Sin embargo, la comparacin de
las cargas virales entre la primera y segunda muestras, obtenidas de todos los pacientes, mostr una disminucin en el
segundo (p = 0,047).
En los pacientes con muestras seriadas la carga viral inicial en el LCR se correlacion positivamente con la duracin del
ciclo de tratamiento con aciclovir (p = 0,014). Aunque no se encontr correlacin estadsticamente significativa entre la
carga viral inicial en CSF y el nmero de resultados de PCR positivos, los datos mostrados en la Tabla 1 son de alguna
manera indicativa de una correlacin tal, es decir, mayor es la carga, el ms largo es el PCR sigue siendo positivo durante
el curso del tratamiento.
DISCUSIN
En este informe, se utiliz un tiempo real de la casa de PCR cuantitativa para detectar el ADN del HSV en muestras de LCR
de 236 pacientes sospechosos de HSE, y la cantidad de ADN de VHS en las muestras de LCR de 22 pacientes se midi
HSE. La edad, el sexo y la duracin del tratamiento con aciclovir con positividad y / o niveles de cargas virales de ADN de
PCR fueron comparados. Adems, el efecto de la terapia de aciclovir de la carga de ADN del HSV se muestra para 10
pacientes.
Como se inform en estudios anteriores, si las muestras de LCR se recogen en un par de das despus de la aparicin de
manifestaciones clnicas y cuando la protena CSF y recuento de glbulos blancos no son muy elevados, la prueba de PCR
en pacientes HSE puede resultar negativo. 12,13 en el presente estudio, hubo algunos casos con una prueba negativa de
PCR para la que se persigue el tratamiento antiviral, sobre la base de los motivos clnicos, magntica o tomografa
computarizada hallazgos de la gammagrafa. Aunque en la mayora de los casos el resultado de HSE PCR es positiva,
tambin se han descrito infecciones negativos de PCR. 14,15En vista del hecho de que los hallazgos clnicos y de imagen no
siempre pueden servir como base para un diagnstico definitivo de HSE, 16,17 lo posible se sugiri que una segunda muestra
se recoge y se examin dos das despus, si la prueba inicial HSV PCR fue negativa. De este modo, se reduce la
probabilidad de resultados falsos negativos en el diagnstico HSE. Tratamiento con aciclovir para los pacientes HSE suele
tener xito y mejora la evolucin del paciente. 18 Por otra parte, la resistencia al aciclovir en un individuo inmunocompetente
de nuestra regin no ha sido reportado. 19 De los 10 pacientes con muestras de LCR secuenciales, el tratamiento con
aciclovir llev a exitosa eliminacin de virus en ocho pacientes y en los dos restantes se reducen de forma importante la
carga viral. Por lo tanto, todos ellos respondieron a la terapia clnicamente aciclovir. Los resultados tambin mostraron que
la duracin de la terapia antiviral de menos de 8 das no se enciende resultados negativos de la PCR positivo.
Hay algunos informes que indican una correlacin entre la carga inicial de ADN de VHS y los resultados de las
patentes. 16 Sin embargo, la mayora de la literatura sobre los pacientes HSE revela ninguna asociacin entre la carga inicial
de ADN de HSV en el LCR y los respectivos resultados. 8, 9,20,21 Aunque el presente estudio se evita el anlisis de los
resultados de los pacientes, los resultados podran ser indicativos de alguna asociacin entre la carga viral inicial y el
nmero de resultados positivos de PCR posteriores y, ms importante, la duracin del tratamiento. Tambin, se podra
sugerir que la terapia antiviral, no se debe interrumpir a menos que el resultado de la PCR se hace negativo durante el
tratamiento.

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