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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Fundada en 1551
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

UNIDAD DE POSTGRADO
BIODEGRADACIN DE CRUDO DE PETRLEO EN TERRARIOS

TESIS
Para optar el Grado de Magister en:
BIOTECNOLOGA
AUTOR
ROCO MILUSKA ESCALANTE GUZMN
LIMA PER
2002
DEDICATORIA
A Nuestro Padre Creador por su divina misericordia.
A mis padres Dr. Jos Angel y Mara Lila, por haberme guiado con amor y dedicacin.
A mis hermanos Giovanni, Daro y Fernando, por compartir los momentos ms valiosos de
mi vida.
AGRADECIMIENTOS
Mi sincero agradecimiento a:
Mg Fernando Merino por su amable disposicin en la asesora del presente trabajo y por
permitir el uso del
Laboratorio de Microbiologa y Biotecnologa Microbiana de la
Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Mg Susana Gutirrez por su constante ayuda y sugerencias en el desarrollo del trabajo.
Q.F. Fritz Choquesillo por su orientacin en la cuantificacin de hidrocarburos en suelos.
Blga. Alicia Diestro por brindar las instalaciones del Apiario de la Facultad de Ciencias
Biolgicas.
Todas las personas que han contribuido a la culminacin del trabajo.
Biodegradacin de crudo
Guzmn, Roco Miluska.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
RESUMEN
En Per se registran derrames de petrleo desde 1978, los cuales contaminan el medio ambiente. Ante este
problema surge la biorremediacin como alternativa de solucin, la cual es el tratamiento biolgico de suelos,
agua y aire, mediante la biodegradacin. En el trabajo se evalu la biodegradacin de crudo de la refinera La
Pampilla en suelos de cultivo de una zona aledaa a la huaca San Marcos contenidos en terrarios, con la
finalidad de determinar la importancia de consorcios bacterianos y factores ambientales en la degradacin de
hidrocarburos. En una primera etapa, se aislaron bacterias oleoflicas a partir de muestras de suelo de
Trompeteros, Iquitos, segn el mtodo planteado por Merino, 1998, para seleccionar un consorcio bacteriano
de elevada capacidad degradativa (C.D) en laboratorio, la C.D se determin mediante la prueba de actividad
emulsificante (A.E) planteada por Goldman y col. en 1982 y por la prueba de actividad degradativa (A.D)
segn Mills y col. en 1978. La biodegradacin de petrleo se evalu con la tecnologa Landfarming, utilizada
por Belloso y col. en 1998. El petrleo presentaba 95.77 % de hidrocarburos saturados acclicos y el suelo de
cultivo era frtil franco arenoso con 0.0015 % de Carbono, 2.6% de Nitrgeno, 0.005% de Fsforo y 0.49% de
Potasio. Se acondicionaron tres terrarios cada uno con 30 kg de suelo de cultivo contaminado con petrleo. El
control abitico donde se determin la degradacin por factores ambientales , el segundo donde se evalu la
degradacin
en
por bacterias nativas y
laboratorio.
Cada
treinta
das
el ltimo donde se inocul el consorcio bacteriano exgeno seleccionado

se
determin:
hidrocarburos
totales,
humedad,
microorganismos aerobios mesfilos, nmero de microorganismos oleoflicos, temperatura

terrarios fueron expuestos a la intemperie durante noventa das.
pH,
nmero
de
y tiempo. Los
Se aislaron cientoventinueve cepas
bacterianas, de las cuales, 99.22% presentaron A.E que fluctu entre 0.75 y 3.66 UAE/mL (unidades de
actividad emulsificante) Las cepas bacterianas de mayor A.E fueron: Pseudomonas aeruginosa 4k-1, Bacillus
sp. 6Bh-1
Serratia rubidae 6B9, las que presentaban una A.E de 3.66 UAE/mL, 1.676 UAE/mL y 2.72
UAE/mL respectivamente y una actividad de tres (3+) equivalente a una
A.D. buena. En cuanto a la
biodegradacin, a los noventa das se obtuvo, 92.5 % de degradacin en el terrario del consorcio bacteriano
exgeno, respecto a
60 % del terrario del consorcio nativo y a 55 % del terrario denominado control abitico.
Segn la Regresin mltiple de Stepwise, en la degradacin de hidrocarburos, influyeron los microorganismos

con un coeficiente estndar del 0.883 y una confiabilidad prxima al 100%. Se concluy que en suelos de
Trompeteros , Iquitos, existen bacterias oleoflicas, con las cuales se puede formar un consorcio bacteriano
capaz de degradar significativamente el crudo de petrleo a nivel de terrarios
con
una confiabilidad prxima
al 100 %.
Palabras
clave : biorremediacin, crudo, huaca, biodegradacin, consorcio, saturados acclicos, oleoflicos,
emulsificante,
tecnologa
landfarming,
terrarios,
control
abitico,
exgeno,
aerobios
mesfilos,
regresin
mltiple de Stepwise, coeficiente estndar, confiabilidad.
Elaboracin y diseo en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y
Biblioteca Central UNMSM
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
ABSTRACT
In Peru, oil spills that pollute the environment were registered since 1978, so the bioremediation was
proposed as biological treatment of soil, air and water based on biodegradation. At this work it was
tested the crude oil biodegradation of the La Pampilla refinery in field soils that were near San
Marcos huaca to determine the activity of microorganisms and environmental factors in
hydrocarbon degradation. First, the oleofilic bacteria were isolated from Trompeteros, Iquitos soils
with Merinos method, 1998, to select a high degradative capacity bacterial consortium at lab and
determine the degradative capacity by the assay of emulsificant activity of Goldman et al., 1982 and
the degradative activity of Mills et al. 1978. The crude biodegradation was tested with the
landfarming
technology used by Belloso et al., 1998. The oil had a 95.77% of saturated acyclic
hydrocarbons, at the same time the soil used was classified as fertile with
a concentration of
0.0015% of Carbon, 2.6% of Nitrogen, 0.005% of Phosphorus and 0.49% of Potassium. It was used
three containers each one with 30 kg of field soil polluted with oil: The abiotic control where it was
determined the environmental factors biodegradation, the second where it was tested the native
bacteria degradation and the last where the exogenous consortium chosed at lab was inoculated.
Each thirty days it was quantified: total hydrocarbons, moisture, pH, number of aerobia mesofilic
microorganisms, number of oleofilic microorganisms, temperature and time. The soils in the
containers were exposed at the environment during ninety days. In the isolation it was found 129
strains, 99.2% had a emulsificant activity since 0.75 until 3.66 UAE/mL, emulsificant activity units.
The strains with highest emulsificant activity were: Pseudomonas aeruginosa 4k-1, Bacillus sp.
6Bh-1 and
Serratia rubidae 6B9, wich had 3.66 UAE/mL, 1.676 UAE/mL and 2.72 UAE/mL
respectively and a degradative activity of three (3+) equal to good activity.

About the biodegradation, after ninety days we obtained 92.5% of biodegradation using the exogenous
consortium compared with a 60 % of biodegradation produced by the native consortium and 55 % of
degradation in the abiotic control. Besides it was applied the Stepwise Regression Model for the
Variables Selection and found that only the microorganisms were important in the biodegradation
process, with a standardized coefficient of 0.883 and about 100% of reliability. It was found that there
are oleofilic bacteria at Trompeteros, Iquitossoil , and that its posible to get a bacterial consortium
wich is able to oil biodegradation with a reliability of 100 %.
Key
words:
emulsificant,
bioremediation,
crude
landfarming technology,
oil,
huaca,
containers,
biodegradation,
abiotic
control,
consortium,
saturated
acyclic,
oleofilic,
exogenous, aerobia mesofilic, Stepwise
Regression Model, Standardized coefficient, reliability.
INDICE GENERAL
RESUMEN....................................................................................................................................................................... 3
ABSTRACT..................................................................................................................................................................... 4
1.INTRODUCCIN........................................................................................................................................................ .6
2.ANTECEDENTES ........................................................................................................................................................ 9
3.MATERIALES Y MTODOS .................................................................................................................................. 12
3.1MATERIALES.......................................................................................................................................................... 12
3.2 MTODOS............................................................................................................................................................... 12
3.2.1 MUESTREO ......................................................................................................................................................... 12
3.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS........................................................................................................ 13
3.2.2.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS.................................................................................. 13
3.2.2.2 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE LAS BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETRLEO................. 13
3.2.2.3 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DEGRADATIVA DE LAS CEPAS BACTERIANAS.............. 14
3.2.2.4 IDENTIFICACIN TAXONMICA............................................................................................................... 15
3.2.2.5 SELECCIN DEL CONSORCIO BACTERIANO EXGENO...................................................................... 18
3.2.2.6 PREPARACIN DEL INCULO .................................................................................................................... 18
3.2.2.7 DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN QUMICA DEL CRUDO DE PETRLEO ........................... 18
3.2.2.8 CARACTERIZACIN DEL SUELO DE CULTIVO ....................................................................................... 18
3.2.2.9 ESTERILIZACIN DEL SUELO CON LUZ ULTRAVIOLETA................................................................... 19
3.2.2.10 BIODEGRADACIN DE CRUDO DE PETRLEO EN TERRARIOS....................................................... 19
3.2.2.11 CUANTIFICACIN DE HIDROCARBUROS TOTALES............................................................................ 20
3.2.2.12 RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESFILAS Y OLEOFLICAS POR DISEMINACIN..... 21
3.2.2.15 ANLISIS ESTADSTICO............................................................................................................................. 22
4. RESULTADOS.......................................................................................................................................................... 24
4.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE HIDROCARBUROS ............ 24
4.2 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE LAS BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETRLEO ....................... 24
4.3 ACTIVIDAD DEGRADATIVA DE LAS CEPAS BACTERIANAS.................................................................... 26
4.4 IDENTIFICACIN TAXONMICA ..................................................................................................................... 27
4.5 SELECCIN DEL CONSORCIO BACTERIANO EXGENO............................................................................ 27
4.6 BIODEGRADACIN DE HIDROCARBUROS.................................................................................................... 27
4.6.1 REGRESIN MLTIPLE POR PASOS.............................................................................................................. 31
5. DISCUSIN............................................................................................................................................................... 34
6. CONCLUSIONES...................................................................................................................................................... 36
7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS....................................................................................................................... 37
8. ANEXOS.................................................................................................................................................................... 39
8.1 COMPOSICIN DE MEDIOS DE CULTIVO....................................................................................................... 39
8.2 CARACTERSTICAS DEL DESTILADO DE CRUDO DE PETRLEO ............................................................ 42
8.3 CARACTERSTICAS DEL SUELO DE CULTIVO .............................................................................................. 45
8.4 BIODEGRADACIN DE CRUDO EN TERRARIOS........................................................................................... 47
8.5 DETERMINACIN DE LA REGRESIN MLTIPLE POR PASOS CON EL PROGRAMA
SPSS 9.0 WINDOWS ................................................................................................................................................. 48
8.6 ESCALA MC. FARLAND...................................................................................................................................... 51
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
1. INTRODUCCIN
La industria petroqumica es importante en una sociedad moderna, no obstante la falta de un
programa de proteccin ambiental, hace que el medio ambiente se contamine al producirse
derrames de petrleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los oleoductos, descargas
de efluentes contaminados, afloramientos naturales a travs de fisuras de la corteza terrestre
y debido a la produccin, transporte y almacenamiento de este recurso natural (20).
A nivel mundial, el volumen de derrame de petrleo es de 1.7 a 8.8 millones de toneladas
mtricas por ao (12) y en nuestra regin (Pacfico Sudeste) es de 6000 toneladas mtricas
al ao (15) En el Per se registran derrames de petrleo desde 1978, uno de ellos fue el
producido en el oleoducto marino de Talara, hasta uno de los ltimos ocurrido el ao 2000
en el ro Maran que afect la Reserva Pacaya-Samiria. Pero no slo derrames mayores
causan contaminacin sino tambin los constantes derrames accidentales en suelos de
nuestra selva, los que se producen por el rompimiento del Oleoducto Nor-Peruano, debido a
accidentes naturales y por la actividad extractiva (13).
Los dispersantes qumicos utilizados para favorecer la remediacin de los ambientes

contaminados pueden causar un mayor impacto ecolgico que el
mismo derrame, por su
toxicidad y recalcitrancia a la biodegradacin (18) Por tanto, una mejor alternativa de

solucin es el proceso de biorremediacin, que es el tratamiento biolgico del suelo, aire y
agua, mediante la biodegradacin de compuestos txicos para transformarlos en compuestos
de menor o ningn impacto ambiental. As en la biodegradacin de hidrocarburos, se
utilizan bacterias con alta capacidad degradativa, entre estas: Brevibacterium, Spirillum,
Xanthomonas,
Alcaligenes,
Arthrobacter,
Nocardia,
Flavobacterium,
Vibrio,
Achromobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia rubidae,

Bacillus sp,, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aureofasciens,
etc., las cuales
disminuyen la concentracin de hidrocarburos presentes en el ambiente y al mismo tiempo

son inocuas para la salud y el medio ambiente (3). Estas
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
bacterias producen bioemulsificantes y biosurfactantes que disminuyen la tensin superficial

entre el petrleo y el medio acuoso facilitando el acceso microbiano a la fuente de carbono
insoluble para su degradacin (13).
La finalidad del
presente estudio es evaluar la biodegradacin de crudo de petrleo en
suelos contenidos en terrarios expuestos a la intemperie, los suelos de cultivo proceden de

un terreno aledao a la huaca San Marcos y son contaminados intencionalmente con crudo
de petrleo proveniente de la refinera La Pampilla.
El estudio de la biodegradacin a nivel de terrarios nos permite comparar la capacidad
degradativa de un consorcio bacteriano nativo y uno exgeno, el primero se refiere a los
microorganismos autctonos presentes en el suelo y el segundo a microorganismos
previamente aislados y evaluados en laboratorio, introducidos en el suelo en forma
intencional. Adems conocer en que medida intervienen en el proceso de biodegradacin los
factores ambientales.
El trabajo aporta una
posible solucin a la contaminacin por derrames de petrleo, dando
inicio a un programa de proteccin ambiental adecuado.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
HIPTESIS
En los suelos contaminados con crudo de petrleo procedentes de Trompeteros, Iquitos,
existen bacterias con capacidad de degradar hidrocarburos, a partir de las cuales se puede
aislar un consorcio bacteriano capaz de eliminar los hidrocarburos del crudo, a nivel de
terrario.
OBJETIVOS
1. Aislar cepas bacterianas con capacidad degradativa y emulsificante de petrleo a partir
de suelos procedentes de Trompeteros, Iquitos.
2. Evaluar la capacidad degradativa de los consorcios bacterianos nativos y exgenos en
suelos con crudo de petrleo adicionado intencionalmente, a nivel de terrarios.
3. Demostrar que la biodegradacin bacteriana de hidrocarburos constituye un mecanismo
importante para la recuperacin de suelos contaminados con petrleo.
4. Reducir la concentracin de hidrocarburos en suelos contaminados con crudo de
petrleo utilizando un consorcio bacteriano exgeno.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
2. ANTECEDENTES:
Sabirova, en el 2000, en Rusia, realiz un estudio en el cual primero aisl microorganismos

halotolerantes a partir del suelo contaminado, luego hizo un ensayo previo en laboratorio
cultivando los microorganismos aislados en un medio que contena una mezcla de hidrocarburos
y cloruro de sodio. Despus de comprobar la tolerancia a las sales, inocul el consorcio
microbiano halotolerante en el suelo contaminado, evaluando a su vez un control abitico.
Despus de un mes de haber introducido la comunidad halotolerante en el suelo, la
concentracin de hidrocarburos disminuy a un 22 % y al cabo de cinco meses a un 50%. En
cambio en el control abitico, la disminucin en la concentracin de hidrocarburos fue de 22%
al cabo de ocho meses. Sabirova concluy que en el suelo existen
numerosos factores que
pueden limitar el nmero y la actividad de los microorganismos en el suelo. Entre ellos est la
salinidad, la cual ha demostrado tener un fuerte efecto inhibitorio sobre microorganismos
autctonos y en la tasa de degradacin de petrleo en suelos. Sin embargo la inoculacin de
microorganismos
halotolerantes
adaptados
altas
concentraciones
salinas
aumentan
significativamente la tasa de degradacin del petrleo en el suelo.
Daz y col., en 1999, en Mxico, evaluaron la biodegradacin de hidrocarburos por un consorcio

microbiano de la rizsfera de Cyperus laxus Lam. Primero sembraron el consorcio microbiano
en un medio mineral lquido que contena hidrocarburos (35 000 ppm) como nica fuente de
carbono y energa, luego lo incubaron a 30 C en agitacin a 125 r.p.m. durante trentaicuatro
das con su control respectivo, al cabo de ese tiempo cuantificaron la concentracin de
hidrocarburos , obteniendo una biodegradacin del 62.28%.
Arenas, en 1999, en Lima, aisl 262 cepas bacterianas, a partir de muestras de suelo y agua de la
refinera La Pampilla, de las cuales se seleccionaron 55 cepas bacterianas, que fueron las de
mayor actividad emulsificante, a las cuales se les evalu su actividad degradativa. El 100 %
crecieron sobre el petrleo y mostraron crecimientos comparables a las escalas dos, tres, cuatro
y cinco de Mc. Farland. Los microorganismos aislados fueron Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aureofasciens, Listonella damsela, Bacillus sphaericus,
Bacillus brevis, Enterobacter cloacae, Acinetobacter calcoaceticus var.
Anitratus,
Hafnia
alvei,
Citrobacter
de
freundii,
petrleo
Citrobacter
en
terrarios.
amalonaticus,
Escalante
Sphingobacterium
multivorum, Staphylococcus Sp., Neisseria Sp., Micrococcus sp.
Merino, en 1998, en Lima, realiz el estudio de microorganismos nativos productores de

emulsificantes de petrleo aislando microorganismos a partir de muestras de suelo y agua
procedentes de la refinera La Pampilla y evaluando la capacidad degradativa de la mismas
mediante la actividad degradativa y emulsificante
y concluy que existe un elevado porcentaje
de microorganismos nativos con capacidad de degradar hidrocarburos de petrleo y de producir

emulsiones de este producto en agua en ambientes contaminados, y que los microorganismos
con mayor capacidad degradativa fueron Pseudomonas aeruginosa KT1-1 y Serratia rubidae II
BT5-4.
Rentera y Miranda, en 1998, en Trujillo, realizaron el aislamiento y seleccin primaria de

microorganismos capaces de utilizar petrleo como nica fuente de Carbono. Ellos evaluaron el
crecimiento sobre petrleo de noventa cepas bacterianas provenientes de muestras de agua y
suelo contaminadas con petrleo crudo, cinco cultivos mostraron mayor actividad: Micrococcus,
Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter y Flavobacterium, los que fueron evaluados a travs
de los parmetros cinticos velocidad especfica de crecimiento y tiempo generacional.
Tantalen y Altamirano, en 1998, en Ica, realizaron el aislamiento y evaluacin del crecimiento

de Pseudomonas spp. hidrocarburoclsticas en petrleo diesel 2 (D2) y compararon el
crecimiento de tres cultivos puros y uno mixto de Pseudomonas sp. nativas que tuvieron la
mayor capacidad para utilizar el petrleo D2. La mejor capacidad de biodegradacin de petrleo
D2 se logr en el cultivo mixto.
Belloso y col., en 1998, inocularon suelos landfarming con tres tipos de cepas
W1,W2,W3 aisladas del mismo suelo contaminado y
bacterianas:
propagadas en el laboratorio. Ellos
aplicaron dos tipos de fertilizantes de tipo NPK( Nitrgeno, Fsforo y Potasio):
Z1 con una
relacin C/N (Carbono - Nitrgeno) de veinte, la relacin NPK: 20:2:1, fuente de Nitrgeno
NH4 (amonio) y Z2 con una relacin C/N 100, la relacin NPK: 20:20:1, fuente de Nitrgeno
NH4 y
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
mantuvieron los suelos a la intemperie durante noventa das. Ellos observaron una
mayor reduccin en la concentracin de hidrocarburos en los primeros treinta das, la cual fue 45
% en uno de los terrarios, que contena la cepa W2 y fertilizante Z2. El porcentaje
de
degradacin en el terrario control abitico fue 8 %, mientras que el terrario que contena el
consorcio nativo, present un porcentaje de biodegradacin del 12 %.
Sirvins y Tramier, en 1993, afirm que en la isla de Embiez, se ha evaluado la eliminacin de

hidrocarburos mediante varias pruebas en medio natural, utilizando el nutriente INPOL EAP 22
en estanques de 16 m3 , alimentados con agua de mar, en las pruebas se hicieron variar algunos
parmetros como el tipo de hidrocarburo, el grosor de la capa de petrleo o la cantidad de
hidrocarburo contaminante. Los resultados demostraron que la adicin del nutriente INPOL
EAP 22, hizo aumentar la tasa de eliminacin del petrleo hasta el 62-70%, la cual en ausencia
de este nutriente lleg slo a 14-20%.
Leahy y Colwell, en 1990, segn varias publicaciones de estudios taxonmicos sobre los
gneros de cepas bacterianas degradadoras, aisladas de suelos y aguas marinas, concluyeron que
los gneros ms importantes de bacterias degradadoras son: Achromobacter, Acinetobacter,
Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia y Pseudomonas sp.
Hayes y col., en 1986, indicaron que existen microorganismos productores de emulsificantes

como
Acinetobacter calcoaceticus el cual produce un bioemulsificante de elevado peso
molecular,
denominado
emulsan
que
fue
clasificado
como
un
lipoheteropolisacrido
polianinico.
Atlas, en 1983, afirm que los gneros ms importantes de microorganismos degradadores de

hidrocarburos
Vibrio,
son:
Pseudomonas,
Acinetobacter,
Achromobacter,
Brevibacterium,
Arthrobacter,
Corynebacterium,
Micrococcus,
Nocardia,
Flavobacterium,
Candida,
Rhodotorula y Sporobolomyces, todos estos microorganismos fueron aislados de ambientes

acuticos.
Dibble y Bartha, en 1979,
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
realizaron un estudio del efecto de los parmetros ambientales en la
biodegradacin del crudo de petrleo y analizaron la humedad, el pH, los nutrientes minerales,
los micronutrientes, suplementos orgnicos, tasa de tratamiento, frecuencia de tratamiento y la
temperatura de incubacin. La degradacin de crudo de petrleo fue ptima a una humedad del
30-90%, un pH de 7.5 a 7.8, una concentracin de C:N y C:P de 60:1 y 800:1, respectivamente,
y a una temperatura de 20 C. El porcentaje de degradacin despus de cientochenta das fue 57
%.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
3. MATERIALES Y MTODOS
3.1 MATERIALES
Medios de cultivo (Ver anexos 8.1, Pg 39)
Suelo contaminado con crudo de petrleo, procedente de Trompeteros, Iquitos.
Suelo de cultivo, procedente de una zona aledaa a la huaca San Marcos.
Petrleo crudo procedente de la refinera La Pampilla.
3.2 MTODOS
3.2.1 MUESTREO
a) Muestreo de suelos para el aislamiento de microorganismos con capacidad degradativa.

Se obtuvieron seis muestras de aproximadamente 1 kg de suelo contaminado con crudo de
petrleo, procedentes de la zona de Trompeteros, Iquitos y fueron llevadas al laboratorio en
bolsas de polietileno etiquetadas, para realizar el aislamiento de microorganismos oleoflicos.
b)Muestreo de suelos para evaluar la biodegradacin de crudo en terrarios.

Se obtuvieron tres muestras de 30 kg de suelo de cultivo de alfalfa procedente de una zona
aledaa a la huaca San Marcos, para determinar la biodegradacin en terrarios. Cada muestra de
30 kg fue introducida en un terrario y una vez contaminada con crudo de petrleo
intencionalmente, de cada terrario se tomaron
muestras de aproximadamente 1 kg en el tiempo
inicial y cada treinta das durante noventa das, para determinar: hidrocarburos totales, humedad,
pH, nmero de microorganismos aerobios mesfilos, nmero de microorganismos oleoflicos,
temperatura y tiempo.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
3.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
3.2.2.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE

HIDROCARBUROS.
Se obtuvieron muestras de suelo de 1kg de una zona contaminada con crudo de petrleo de
Trompeteros, Iquitos, para aislar cepas bacterianas por el Mtodo de aislamiento de bacterias
degradadoras y emulsificantes de petrleo utilizado por Merino en 1998. Para lo cual se
suspendieron cinco gramos de suelo en 25 mL de solucin salina estril al 0.85% y a partir de la
suspensin se sembr en 25 mL de medios de pre-enriquecimiento: Caldo Palleroni y Caldo
Acetato Mineral, ambos medios se incubaron a 30 C con agitacin constante a cientocincuenta
revoluciones por minuto durante setentaidos horas. Al cabo de ese tiempo, se sembr por estra
en agar King-B a partir de caldo Palleroni y en agar Cerebro Corazn (BHI) a partir de caldo
Acetato Mineral, se incub a 30 C por venticuatro a cuarentaiocho horas, posteriormente se
aislaron colonias de las diferentes placas, tomando en cuenta su morfologa de crecimiento y la
procedencia de la muestra. Las colonias seleccionadas se resembraron para su purificacin en
tubos que contenan 2 mL de caldo nutritivo. Cada colonia fue rotulada. Transcurridas las
cuarentaiocho horas de incubacin, para verificar la pureza de las cepas bacterianas se procedi
a sembrar por estra en Agar nutritivo, incubando a 30C por 48 horas.
Despus se seleccionaron las colonias aisladas y se sembraron en viales por triplicado
conteniendo agar nutritivo en plano inclinado, se volvi a incubar a 30 C por 48 horas. Una vez
observada la pureza de las cepas bacterianas, se procedi a taponar los viales con tapones de
goma estriles y a sellar con parafina. El cepario fue mantenido en refrigeracin a 4 C hasta que
se realizaron las pruebas de capacidad degradativa.
3.2.2.2 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE LAS BACTERIAS DEGRADADORAS DE

PETRLEO.
Se realiz segn la metodologa propuesta por Goldman y col. (1982) Se procesaron ciento
veintinueve cepas bacterianas aisladas de seis muestreos, para evaluar la capacidad que tienen de
producir emulsificantes de petrleo en agua. Se emple el Medio Mnimo de Goldman.
(Ver anexos, Pg 41 ),
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
al cual se le adicion extracto de levadura al 3% P/V (peso sobre
volumen) Se utiliz petrleo crudo, proporcionado por la refinera
La Pampilla. Se esteriliz
el medio a 121 C por quince minutos, excepto el etanol, el cual fue agregado posteriormente en
condiciones de esterilidad.
Las cepas bacterianas se reactivaron en 2 mL de caldo Nutricio y se les incub a 37 C por

venticuatro horas. Luego se reparti en matraces de 100 mL, 18 mL de medio Mnimo con
Extracto de Levaduras al 3 %. Se adicion despus los 2 mL de cultivo. Los matraces se
incubaron a 30 C por setentaidos horas en agitacin constante. Transcurrido el tiempo de
incubacin, se procedi a centrifugar el cultivo a 5000 r.p.m por treinta minutos.
Se obtuvieron 10 mL del sobrenadante en tubos de prueba de 16 x 150 mm, previa decantacin,

luego se le agreg a cada tubo con sobrenadante 0.2 mL de petrleo crudo y se agit
manualmente por cinco minutos (esto facilit la posible produccin de una emulsin) Se
trasvasaron 5 mL, de la preparacin anterior a tubos de Spectronic de 13 x 100 mm. para la
lectura de la absorbancia a 540 nm. de longitud de onda en el Espectrofotmetro "Spectronic
20D" Milton-Roy.
El blanco fue un tubo conteniendo el medio de cultivo sin inoculacin, y se procedi de la

misma manera que con las otras muestras.
La absorbancia leda se convirti en unidades de actividad emulsificante por mililitro
(UAE/mL), siendo 0.816 de absorbancia equivalente a una unidad de actividad emulsificante por
mililitro.
3.2.2.3
DETERMINACIN
DE
LA
ACTIVIDAD
DEGRADATIVA
DE
LAS
CEPAS
BACTERIANAS.
La actividad degradativa sobre el petrleo se evalu segn la metodologa de Mills y col.

(1978).
El anlisis semicuantitativo se aplic a las cepas bacterianas con actividad emulsificante. Las
cepas bacterianas se reactivaron en Caldo Nutricio y se les incub a 30 C por doce horas. Se
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
utiliz el Medio Mineral propuesto por Mills y col. (1978).(Ver anexos pgina 40), al cual se le
aadi petrleo crudo como nica fuente de carbono.
Se repartieron 9 mL del medio en tubos de 16 x 150 mm. y se le aadi 1 mL de cultivo,

incubando por treinta das a temperatura ambiente. El crecimiento se midi por la turbidez
visible en el medio de cultivo. Se consider como blanco negativo un tubo conteniendo los
componentes del medio descrito sin inoculacin. Las lecturas se hicieron tomando en cuenta que
una turbidez de (2+) , equivalente a una poblacin superior a 6 x 10
m.o/mL ,en la escala
Turbidimtrica de Mc. Farland, corresponde a un crecimiento regular, una turbidez de tres (3+)
con una poblacin superior a 9x 10
m.o/mL, equivale a un crecimiento bueno, y una turbidez
de cinco (5+) con una poblacin superior a 15 x 10
m.o/mL, igual a un crecimiento muy
bueno.
3.2.2.4 IDENTIFICACIN TAXONMICA
Para la identificacin taxonmica, primero se efectu la coloracin de Gram de todas las cepas
bacterianas seleccionadas, y segn esto se les agrup en bastones y cocobacilos gramnegativos,
bastones y cocobacilos grampositivos, cocos gramnegativos y cocos grampositivos. Para
diferenciar entre bastones grampositivos y cocos grampositivos, se realiz la prueba de catalasa,
mientras que la prueba de oxidasa fue aplicada a todas las cepas bacterianas grampositivas y
gramnegativas. (Manual de Bacteriologa Determinativa de Bergeys, 1997). Los bastones
cocobacilos
gramnegativos
oxidasa
negativos,
fueron
identificados
mediante
pruebas
bioqumicas segn Bergey, 1997 y para la identificacin taxonmica de los bastones y

cocobacilos gramnegativos, positivos a la prueba de oxidasa, se utiliz el Sistema API 20 NE 1
(9), el cual es un sistema estandarizado que combina ocho pruebas bioqumicas y doce pruebas
de asimilacin, adems de la prueba de oxidasa. Este sistema
se aplica a cepas bacterianas que
no pertenecen a la Familia de las Enterobacterias. La galera API 20 NE est compuesta de

veinte microtubos que contienen medios y/o substratos en forma deshidratada. Ver flujograma
N 01. Pg 17.
Analytab Products, Division of Sherwood Medical 200 Express Street Plainview, New York 11803
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
PREPARACIN DE LA GALERA API 20 NE.
Se deposit aproximadamente 5 mL, de agua destilada en los alvolos de la cmara, para

proporcionar una atmsfera hmeda a la cmara de incubacin.
Se rotul la cmara con la clave de la cepa respectiva. Luego , la galera de la bolsa hermtica
estril fue incubada.
Preparacin del inculo.

En un tubo conteniendo 2 mL de cloruro de sodio al 0.85%, se realiz una suspensin
bacteriana, la turbidez deba ser igual al patrn 0.5 de la Escala Mc. Farland.
Las colonias fueron obtenidas del cultivo puro en agar nutritivo.
Inoculacin de la Galera
Se llenaron los microtubos, (no las cpulas) de las pruebas Nitrato de Potasio o NO3 a P-nitrofenil-BD galactopiranosido o PNPG, con la suspensin bacteriana utilizando una pipeta Pasteur,
evitando que se formen burbujas. Luego se transfiri cuatro a ocho gotas de la suspensin
bacteriana a una ampolla de medio Auxiliar (AUX Medium). Se homogeniz con la pipeta
evitando la formacin de burbujas. Despus se llenaron los microtubos y las cpulas de las
pruebas Glucosa (GLU) a
Fenil-acetato (PAC) , de tal manera que el nivel del lquido quedaba
horizontal o ligeramente convexo en la cpula, nunca cncavo.

Se llen luego con aceite de parafina estril las cpulas de las tres pruebas subrayadas (GLU;
Arginina (ADH); Urea (URE), de tal manera que se form un menisco convexo. Luego se
cubri la cmara y se incub a 30 C durante veinticuatro horas.
Lectura de la Galera
Despus de veinticuatro horas de incubacin, la lectura se llev a cabo utilizando la tabla de
lectura del API 20 NE. Se anotaron todas las reacciones espontneas: GLU, ADH, URE,
Esculina ( ESC), Gelatina (GEL), PNPG y se registraron en las fichas respectivas segn el
catlogo analtico. Las pruebas de NO 3 y Triptfano (TRP) se realizaron protegindolas de la
contaminacin.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
Prueba de reduccin de Nitratos a Nitritos

Se aadi una gota del reactivo Nitrato uno NIT1 y Nitrato dos NIT2 en la cpula de NO 3 . El
viraje al color rojo, despus de cinco minutos, indic una reaccin positiva.
Prueba de produccin de indol.(TRP).

Se aadi una gota del reactivo para Indol. La presencia de un color rosa en la cpula indicaba
una reaccin positiva.
Prueba de asimilacin.
Se observ el crecimiento bacteriano, el cual se evidencia por la turbidez de la cpula. En
algunos casos, fue necesario una reincubacin por veinticuatro horas ms, excepto las pruebas
de NO3 , TRP, y GLU que deban ser ledas nicamente a las veinticuatro horas. Ver Flujograma
N 01.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
FLUJOGRAMA N 01
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS OLEOFLICAS.
Reactivacin de las
cepas bacterianas
Coloracin de Gram
Cocos
grampositiv
os
Bastones y
Cocobacilos
grampositivos
Cocos
gramnegativo
s
Bastones y
cocobacilos
gramnegativos
Catalasa
Oxidasa
Pruebas Bioquimicas
Oxidasa
positivos
Sistema
API 20 NE
Oxidasa
negativos
Pruebas
Bioqumicas
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
3.2.2.5 SELECCIN DEL CONSORCIO BACTERIANO EXGENO
Se seleccionaron como miembros del consorcio bacteriano exgeno a las cepas bacterianas que
presentaron mayor actividad emulsificante y degradativa.
3.2.2.6 PREPARACIN DEL INCULO.
Las cepas integrantes del consorcio bacteriano exgeno fueron reactivadas y a las veinticuatro
horas fueron inoculadas cada una por separado en 3.5 mL de caldo nutritivo, al cabo de
veinticuatro horas, nuevamente fueron inoculadas en 35 mL de medio mineral el cual contena,
como nica fuente de carbono, extracto etreo de crudo de petrleo, n-hexadecano o crudo de
petrleo al 5 % . Finalmente, despus de un da fueron inoculadas en 350 mL de medio mineral
con las fuentes de carbono mencionadas.
Este procedimiento se realiz por triplicado para cada cepa hasta alcanzar un volumen
aproximado de tres litros, cantidad adecuada por ser el 10% del volumen del terrario.
El recuento de la poblacin bacteriana de cada cepa se realiz, utilizando cmara Neubauer.
3.2.2.7
DETERMINACIN
DE
LA
COMPOSICIN
QUMICA
DEL
CRUDO
DE
PETRLEO.
Se determin la composicin qumica porcentual del destilado de crudo de petrleo procedente

de la refinera La Pampilla a 200 C mediante cromatografa de gases, determinando las
diferentes clases de hidrocarburos: saturados acclicos, saturados cclicos, insaturados olefnicos.
El anlisis fue realizado en la Unidad de Servicios de Anlisis Qumicos (USAQ) de la Facultad
de Qumica e Ingeniera Qumica de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.(Ver anexos
Pg 42)
3.2.2.8 CARACTERIZACIN DEL SUELO DE CULTIVO.
Se determinaron las principales caractersticas fisicoqumicas del suelo de cultivo, entre ellas:
textura, salinidad, materia orgnica, Carbono, Nitrgeno, Fsforo, Potasio y pH, mediante
diversos anlisis efectuados en el Laboratorio de Agua y Suelo de la Facultad de Ingeniera
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
Agrcola de la Universidad Nacional Agraria La Molina. (Ver Pg 45 ).
3.2.2.9 ESTERILIZACIN DEL SUELO CON LUZ ULTRAVIOLETA.
Los treinta kilogramos de suelo fueron separados en porciones de aproximadamente 5 kg y se

extendieron sobre bandejas de 60 cm de largo por 38 cm de ancho, recubiertas con bolsas de
polietileno de boca ancha, el suelo no deba tener una profundidad mayor a cinco centmetros, la
esterilizacin con luz ultravioleta (intensidad de 253-260 nm) se realiz a una distancia de
20 cm. Durante treinta minutos, removiendo el suelo cada quince minutos. La esterilidad del
suelo se comprob mediante una prueba de esterilidad, en la cual 5 g de suelo fueron
suspendidos en solucin salina estril al 0.85% y a partir de la suspensin se sembr en 25 mL
de caldo nutritivo y a su vez en agar nutritivo, al cabo de venticuatro horas de incubacin, no
hubo crecimiento mic robiano, por tanto, despus de la esterilizacin con luz ultravioleta, el
suelo fue inoculado inmediatamente para evitar cualquier contaminacin.
3.2.2.10 BIODEGRADACIN DE CRUDO DE PETRLEO EN TERRARIOS.
Se evalu con la tecnologa Landfarming, utilizada por Belloso y col.,1998. Se acondicionaron

tres terrarios o recipientes metlicos de aproximadamente 50 kg de capacidad, los cuales fueron
cubiertos interiormente con una capa gruesa de pintura epxica no biodegradable para evitar el
contacto del suelo de cultivo con el metal. Posteriormente, las tres muestras de suelo de cultivo
de 30 kg fueron introducidas en cada terrario y se adicion intencionalmente crudo de petrleo
a estas muestras hasta una profundidad aproximada de 5 cm., el crudo de petrle o se mantuvo en
la superficie del suelo. Cuadro N 01. Se determin al comienzo del ensayo y cada treinta das
en cada suelo contenido en los terrarios los siguientes parmetros: temperatura, pH, humedad,
contenido de hidrocarburos, recuento de microorganismos aerobios totales y microorganismos
degradadores de hidrocarburos hasta los noventa das.
Los terrarios fueron:
TERRARIO N 01.- Denominado control abitico, este primer terrario fue tratado con un litro
de hipoclorito de sodio al 5.25 %, para inhibir el crecimiento microbiano y poder evaluar
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
nicamente la influencia de los factores ambientales en la degradacin de hidrocarburos.
TERRARIO N 02.- En este terrario el suelo se mantuvo en

observ
nicamente
la
influencia
de
los
condiciones normales,
microorganismos
nativos
del
y se
suelo
en
la
biodegradacin.
TERRARIO N 03.- En el tercer terrario se introdujo suelo previamente esterilizado con luz
ultravioleta, ver esterilizacin del suelo con luz U.V. (3.2.2.9 Pg 19 ). Posteriormente se
inocul en el suelo el consorcio bacteriano exgeno seleccionado.
Los tres
terrarios se mantuvieron a la intemperie durante noventa das airendose semanalmente
mediante mezclado de todo el contenido. Cuadro N 01. (Ver foto N 01, anexos Pg 47 ).
CUADRO N 01
REMEDIACIN POR TECNOLOGA LANDFARMING*
TERRARIO
SUELO CONCENTRACIN
HIPOCLORITO
*CONSORCIO
AGUA
kg
AL 5.25%
BACTERIANO
DESTILADA
DE CRUDO DE
PETROLEO 5 %
Litros
kg/kg
1.Control
30
1 litro
--
30
--
--
30
--
Exgeno
abitico
2 . Consorcio
bacteriano
nativo
3. Consorcio
bacteriano
(3 litros de
exgeno.
cultivo)
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
3.2.2.11 CUANTIFICACIN DE HIDROCARBUROS TOTALES
Los hidrocarburos de cada muestra se extrajeron mediante soxhlet por el mtodo 3540 EPA
(Agencia de Proteccin Ambiental de Estados Unidos) que consiste en mezclar 25 g de muestra
con 25 g de sulfato de sodio anhidro y proceder a la extraccin de hidrocarburos por soxhlet
utilizando como solvente ter etlico a una temperatura constante de 60 C durante doce horas,
luego de ese tiempo reducir el volumen del solvente en un rota vapor hasta obtener un volumen
menor a 10 mL Secar el extracto adicionando 0.1 g de sulfato de sodio anhidro y transferir
mediante enjuagues a un vial previamente pesado. Despus de la evaporacin del solvente a 25
C, cuantificar gravimtricamente el hidrocarburo extractable.
3.2.2.12 RECUENTO DE BACTERIAS AEROBIAS MESFILAS Y OLEOFILCAS

POR DISEMINACIN.
De cada muestra de suelo se pes 10 gramos que se suspendieron en 90 mL de solucin salina

estril al 0.85%, esta fue la dilucin 1:10 o 10
, de la dilucin 1:10 se obtuvo 1 mL y se llev a
un tubo con 9 mL de dilucin, y as sucesivamente hasta la dilucin 10
. Las diluciones podan
continuar dependiendo del experimento. Par a hacer el recuento de bacterias aerobias mesfilas,
de cada tubo de dilucin se transfiri 0.1 mL a cada placa petri que contena agar Plate Count,
este procedimiento se hizo por duplicado y para el recuento de las bacterias oleoflicas tambin
se obtuvo 0.1 mL de cada dilucin y se inocul a cada placa petri que contena agar Cetrimide
ms petrleo al 1 % por duplicado.
El inculo fue depositado en un margen del agar y con
la varilla
horizontal de la esptula
Drigalsky, se distribuy por toda la superficie del agar evitando pasar dos veces por el mismo
plano. La tapa de la placa se levant slo lo necesario para evitar contaminacin. Las placas
fueron incubadas en posicin invertida de veinticuatro a cuarenta y ocho horas.
Al cabo de ese tiempo se escogieron las placas que contenan de treinta a trescientas colonias
para el recuento. Para expresar el resultado final, el nmero total de microorganismos se
multiplic
por la inversa del volumen de inculo y por la inversa de la dilucin y se report
como unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL)
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
3.2.2.13 MEDICIN DEL pH DEL SUELO
Para determinar el pH se obtuvo una muestra de 1 kg de suelo, el pH se determin en

suspensiones del suelo al 40% peso sobre volumen (P/V) en una solucin de bicloruro de Calcio
al 0.01 molar ( CaCl2 0.01 M), utilizando potencimetro.
3.2.2.14 DETERMINACIN DE LA HUMEDAD DEL SUELO
Antes de determinar la humedad se obtuvo una muestra de 1 kg de suelo, la humedad se

determin gravimtricamente por secado de 25 g de suelo a 105 C hasta obtener peso constante.
3.2.2.15 MEDICIN DE LA TEMPERATURA
La temperatura se determin utilizando un termmetro digital en el suelo contenido en cada

terrario.
3.2.2.16 ANLISIS ESTADSTICO POR REGRESIN MLTIPLE
En el presente estudio, la biodegradacin de crudo en terrarios cuantificada en concentracin de

hidrocarburos (variable Y), puede depender del tiempo, temperatura, pH, humedad, bacterias
oleoflicas, tipo de suelo 1: suelo del control abitico, tipo de suelo 2: suelo del consorcio
bacteriano nativo, tipo de suelo 3: suelo del consorcio bacteriano exgeno y bacterias aerobias
mesfilas. (X1,X2,X3 ,X4 ,X5 ,X6, X7,X8 ,X9 ). Por tanto la ecuacin de regresin mltiple es:
Y = B1 X1 + B2 X2 + B3 X3 +B4 X4 + B5X5+ B6 X6 + B7X7+ B8 X8 + B9 X9.
Donde:
Y=
Concentracin de hidrocarburos (HIDROCARBUROS)
X1 =
Tiempo
X2 =
Temperatura
X3 =
pH
X4 =
Humedad
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
X5 =
Microorganismos oleoflicos (MICROORGANISMOS)
X6 =
Suelo 1
X7 =
Suelo 2
X8 =
Suelo 3
X9 =
Bacterias aerobias mesfilas.
B1 , B2, B3, B4 , B5 , B6 B7 , B8, B9.
Coeficientes de regresin neta
Para obtener el modelo final, se utiliz el programa SPSS
9.0
Windows con anlisis de
Regresin Mltiple por Pasos o Stepwise, (ver anexos Pg 48) con seleccin de variables, el
cual permiti seleccionar las variables independientes de influencia significativa en el proceso
de degradacin, mediante la regresin por pasos, se puede manejar un gran nmero de variables
en ejecucin y calcular una secuencia de ecuaciones de regresin, incorporando o eliminando en
cada paso una variable independiente, el programa de cmputo SPSS registra las variables en
pasos individuales de la mejor a la peor, siempre que cumplan con el criterio estadstico
establecido.
En el programa, se registra primero la variable independiente que explica la mayor cantidad de

varianza en la variable dependiente. La siguiente variable por registrar, explica la mayor
cantidad de varianza en conjuncin con la primera y as sucesivamente. En cada paso, se registra
en la ecuacin la variable que explica la mayor cantidad de varianza no explicada por la variable
que ya est incluida en el modelo.
En la validacin del modelo, la hiptesis nula se rechaza
cuando el coeficiente de regresin es diferente de cero en forma significativa, el valor F es

elevado y el nivel de significacin es menor que 0.10, 0.05 y 0.01. La hiptesis nula indica que
los coeficientes que acompaan a las variables seleccionadas son iguales a cero en forma
simultnea.
Si se rechaza la hiptesis nula, se afirmara que las variables elegidas son importantes en el
proceso de biodegradacin. Entonces se tiene:
H0 : B1= B2 = 0
Ha: B1
B2
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
Donde:
H0 : hiptesis nula.
Ha: hiptesis alterna.
B1 : coeficiente de la primera variable seleccionada.
B2 : coeficiente de la segunda variable seleccionada.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
4. RESULTADOS
4.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE
HIDROCARBUROS.
Se aislaron ciento veintinueve cepas bacterianas a partir de seis muestras de suelo contaminado
con crudo de petrleo procedentes de Trompeteros, Iquitos. El 81.39% (105) de las cepas
bacterianas aisladas fueron gramnegativas, de las cuales 25.71% (27) fueron bastones
gramnegativos (BG-), 60% (63) fueron cocobacilos gramnegativos (CBG-) y 14.28% (15)
fueron bastones cortos gramnegativos (BCG-). Entre las 24 bacterias grampositivas 18.60% del
total, se encontr que 37.5% (9) fueron bastones grampositivos (BG+) y 62.5% (15) fueron
cocos grampositivos (CG+) Grfico N 01.
Porcentaje de cepas bacterianas.
70
60
50
40
30
20
10
Grfico N 01: Porcentaje y tipo de cepas bacterianas identificadas.

Bastones gramnegativos
Bastones grampositivos
Cocobacilos gramnegativos
Cocos grampositivos
Bastones cortos gramnegativos
4.2 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE LAS BACTERIAS DEGRADADORAS DE

PETRLEO.
Segn la prueba de actividad emulsificante, del total de cepas bacterianas, el 99.22% (128) de
las cepas aisladas, presentaron actividad emulsificante y 0.77% (1) no la present. La actividad
emulsificante fluctu entre 0.75 UAE/mL y 3.66 UAE/mL
En el cuadro N 02, se observan las cepas bacterianas de mayor A.E , las cuales fueron tres:
Pseudomonas aeruginosa 4k-1, Serratia rubidae 6B9, Bacillus sp. 6Bh-1.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
CUADRO N 02
ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE LAS CEPAS BACTERIANAS OLEOFLICAS
IDENTIFICADAS
ACTIVIDAD
N
ESPECIE
EMULSIFICANTE
UAE/mL
Acinetobacter calcoaceticus lwoffi 1Bh-2
1.07
Pseudomonas aeruginosa 1B-3
1.12
Acinetobacter calcoaceticus anitratus 1B-5
1.10
Aeromonas salmonicida salmonicida 2B-1
1.18
Pseudomonas aeruginosa. 4Bh2
1.13
Acinetobacter calcoaceticus anitratus 4Bh3
1.01
Hafnia alvei 4Bh4
1.03
Hafnia alvei 4Bh7
1.59
Pseudomonas aeruginosa 4Bh12
1.15
10
Hafnia alvei 4Bh14
0.92
11
Pseudomonas aeruginosa 4K-1
3.66
12
Enterobacter agglomerans 4K-3
1.072
13
0.75
14
Pseudomonas aeruginosa 5Bh-1
0.78
15
Pseudomonas acidovorans 5Bh-6
1.16
16
Enterobacter agglomerans 5K2
1.11
17
Bacillus Sp. 6Bh-1
1.676
18
1.40
19
Enterobacter agglomerans 6Bh-3
1.11
20
Hafnia alvei 6Bh-4
1.00
21
1.05
22
Pseudomonas cepacia 6K1
1.10
23
Pseudomonas aeruginosa 6K3
1.46
24
1.04
25
1.41
26
1.28
27
1.02
28
Pseudomonas pseudomallei 6B4
1.5
29
Pseudomonas aeruginosa 6B6
1.01
30
Serratia rubidae 6B9
2.72
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
4.3 ACTIVIDAD DEGRADATIVA DE LAS CEPAS BACTERIANAS.
El 97.67 % (126) de las cepas bacterianas evaluadas, presentaron A.D, mientras que 2.32% (3)
no la presentaron. La actividad degradativa de las treinta cepas bacterianas identificadas fue de
regular (2+) a buena (3+). Cuadro N 03.
CUADRO N 03
ACTIVIDAD DEGRADATIVA DE LAS CEPAS BACTERIANAS OLEOFLICAS IDENTIFICADAS
N
ESPECIE
ACTIVIDAD
DEGRADATIVA
2+
Pseudomonas aeruginosa 1B-3
2+
Acinetobacter calcoaceticus anitratus 1 B-5
2+
Aeromonas salmonicida salmonicida 2B-1
2+
2+
Acinetobacter calcoaceticus anitratus 4Bh3
2+
Hafnia alvei 4Bh4
2+
Hafnia alvei 4Bh7
2+
2+
10
Hafnia alvei 4Bh14
3+
11
Pseudomonas aeruginosa 4K-1
3+
12
2+
13
3+
14
3+
15
Pseudomonas acidovorans 5Bh-6
2+
16
Enterobacter agglomerans 5K2
3+
17
Bacillus Sp. 6Bh-1
3+
18
2+
19
Enterobacter agglomerans 6Bh-3
2+
20
Hafnia alvei 6Bh-4
3+
21
2+
22
3+
23
2+
24
2+
25
2+
26
2+
27
2+
28
Pseudomonas pseudomallei 6B4
3+
29
Pseudomonas aeruginosa 6B6
3+
30
3+
de
petrleo
en
terrarios.
actividad
emulsificante
Escalante
4.4 IDENTIFICACIN TAXONMICA
Las
treinta
cepas
bacterianas
de
mayor
fueron
identificadas
taxonmicamente. Del total de cepas bacterianas identificadas 13.3% (4) pertenecan al gnero
Acinetobacter , 50% (15) al gnero Pseudomonas, 13.3% (4) al gnero Hafnia, 3.3% (1) fue
Aeromonas , 3.3% (1) fue Bacillus,3.3% (1) fue Serratia y
Cuadros
13.3% (4) al gnero Enterobacter.
N 02 y 03. Las especies del gnero Pseudomonas, fueron: Pseudomonas aeruginosa
(36.67%), Pseudomonas acidovorans (3.33%),
Pseudomonas cepacia (6.67%), Pseudomonas
pseudomallei (3.33%).
4.5 SELECCIN DEL CONSORCIO BACTERIANO EXGENO.
Las cepas bacterianas seleccionadas para formar el consorcio bacteriano exgeno fueron:
Pseudomonas aeruginosa 4k-1, Bacillus sp.6Bh-1
Serratia rubidae 6B9, las que presentaron
una A.E de 3.66 UAE/mL, 1.676 UAE/mL y 2.72 UAE/mL respectivamente y una actividad de tres
(3+) equivalente a una
A.D. buena. La poblacin del consorcio bacteriano exgeno se observa en
el cuadro N 04.
CUADRO N 04
POBLACIN DEL CONSORCIO BACTERIANO EXGENO
ESPECIE
POBLACIN (Bact/mL)
1.92 x 10 7
Pseudomonas aeruginosa 4k-1
2.69 x 10 7
Bacillus Sp. 6Bh-1
4.93 x 10 7
4.6 BIODEGRADACIN DE HIDROCARBUROS
En el cuadro N 05, se observa la temperatura, humedad y pH del suelo en los diferentes terrarios:
control abitico (C.A), consorcio bacteriano nativo (C.N) y consorcio bacteriano exgeno (C.E).
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
La temperatura no tuvo mucha variacin y fue similar en los tres terrarios, la mayor temperatura se
present en el suelo del C.N, la cual alcanz 19.3 C a los sesenta das, temperatura similar a la del
C.E (19 C) y a la del C.A (18.4C).
En cambio la humedad tuvo variaciones durante los noventa das, la humedad ms alta se observ a
los treinta das en el terrario C.E, la cual fue 84 mL/kg, que fue mayor a la del C.N (64mL/kg) y
similar a la del C.A (80mL/kg).
El pH, generalmente se mantuvo cercano a la neutralidad, sin embargo, present una ligera
disminucin al cabo de tres meses de 7.5 a 6.0 en los terrarios: C.N y C.E, pero en el C.A
permaneci en siete.
CUADRO N 05
TEMPERATURA, HUMEDAD Y pH DEL SUELO CONTENIDO EN LOS TERRARIOS.
DAS
0
30
60
90
TEMPERATURA
C
C.A1
16.8
17.1
18.4
15.7
C.N 2
17.7
18.2
19.3
16.3
C.E 3
17.6
19.2
19.0
16.1
HUMEDAD
mL/kg
C.A
0.005
80.0
28.0
52.0
C.N
0.0053
64.0
28.0
16.0
pH
C.E
0.0045
84.0
48.0
8.0
C.A
7.45
8.0
7.58
7.0
C.N
7.5
7.54
7.88
6.0
C.E
7.55
7.64
7.9
6.0
1. C.A: Control abitico.

2. C.N: Consorcio bacteriano nativo
3. C.E: Consorcio bacteriano exgeno.
El mayor porcentaje de biodegradacin fue 92.5% a los noventa das y se obtuvo en el terrario que
contena el consorcio bacteriano exgeno, en el cual hubo una reduccin de la concentracin de
hidrocarburos de 1.2 g de hidrocarburos /25 g de suelo a 0.09 g /25 g a los noventa das. Cuadro
N 06. Los parmetros de este terrario fueron: temperatura de 16.1 C, pH igual a 6.0, humedad de
8 mL/kg, (Cuadro N 05), un promedio de 1.85 x
10
UFC/mL de microorganismos aerobios
mesfilos y un promedio de bacterias oleoflicas de 2.12 x 10 UFC/mL
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
CUADRO N 06
PORCENTAJE DE REDUCCIN DE HIDROCARBUROS EN TERRARIOS.
TIEMPO
Das
CONTROL ABITICO CONSORCIO
CONSORCIO
BACTERIANO NATIVO
BACTERIANO EXGENO
Hidrocarburos % parcial de
g/25 g
G/25 g
g/25 g
reduccin de
reduccin de
hidrocarburos
reduccin de
hidrocarburos
hidrocarburos
0.4
0.15
1.2
30
0.18
55
0.27
-80
0.44
63.4
60
0.18
0.25
13.4
0.21
19.1
90
0.18
0.06
126.6
0.09
10.0
TOTAL
55
60
92.5
Segn el primer recuento de bacterias oleoflicas, no se observ crecimiento bacteriano en el suelo

del terrario del consorcio nativo, sin embargo al cabo de treinta das, la poblacin bacteriana
aument a 3.30 x 10
UFC/mL Ver grfico N 02, en cambio la poblacin de bacterias oleoflicas
del consorcio exgeno fue mayor en el tiempo inicial ( 8.08 x 10

de treinta das la poblacin bacteriana disminuy a 9.63 x 10
UFC/mL), sin embargo al cabo
UFC/mL Ver grfico N 03. A partir
de los treinta das, tanto en el consorcio nativo como en el exgeno, la cantidad de bacterias
oleoflicas, disminuy progresivamente, en forma directamente proporcional a la disminucin en la
concentracin de hidrocarburos. Ver grficos N 02 y 03. En el control abitico en el tiempo
inicial, el crecimiento bacteriano fue bajo (2.5 x 10
UFC/mL), sin embargo a los noventa das no
se observ crecimiento.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
3.50E+05
Bacterias oleoflicas en UFC/ml
3.00E+05
2.50E+05
2.00E+05
1.50E+05
1.00E+05
5.00E+04
0.00E+00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
-5.00E+04
Das
Grfico N 02: Poblacin bacteriana del consorcio nativo respecto al tiempo

Consorcio bacteriano nativo
9.00E+08
8.00E+08
Bacterias oleoflicas en UFC/ml
7.00E+08
6.00E+08
5.00E+08
4.00E+08
3.00E+08
2.00E+08
1.00E+08
0.00E+00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
-1.00E+08
Das
Grfico N 03: Poblacin bacteriana del consorcio exgeno
Consorcio bacteriano exgeno
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
4.6.1 REGRESIN MLTIPLE POR PASOS
De acuerdo a la regresin mltiple por pasos o Stepwise se encontr un modelo para el anlisis de
datos, el cual, selecciona a la variable microorganismos como variable independiente de influencia
significativa en el proceso de biodegradacin de hidrocarburos y excluye a las otras variables
independientes. Cuadro N 07.
CUADRO N 07
VARIABLES INTRODUCIDAS Y ELIMINADAS POR EL MTODO DE REGRESIN
MLTIPLE POR PASOS O STEPWISEa
Modelo
1
Variables introducidas
MICROORGANISMOS
Variables eliminadas
Mtodo
Das, humedad, pH, suelo 1, Por pasos (criterio: Probabilidad

suelo 2, suelo 3 y temperatura. de F para entrar <= 0.050,
probabilidad de F para salir >=
0.100)
a. Variable dependiente: HIDROCARBUROS

El modelo fue elegido por el programa SPSS, por no tener intercepto y tener un coeficiente de
determinacin o R cuadrado del 78% aproximadamente, es decir que el modelo se ajusta bien a los
datos por que el R cuadrado es alto. Cuadro N 08.
CUADRO N 08
RESUMEN DEL MODELO
Modelo
0.883 b
R Cuadrado R Cuadrado Error tpico de

Cambiar los estadsticos
corregida la estimacin Cambio en R Cambio en gl1 gl2 Sig del
cuadrado
F
cambio
en F
0.780
0.760
8071.7585
0.780
39.016 1
11 0.000
a. Para la regresin a travs del origen (el modelo sin interseccin), R cuadrado mide la
proporcin de la variabilidad en la variable dependiente acerca del origen explicado por la
regresin. No es posible comparar esto con R cuadrado para los modelos que incluyen una
interseccin.
b.
Variable predictora: MICROORGANISMOS.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
Segn el cuadro N 09, el modelo es vlido porque se rechaza la hiptesis nula debido a que el
coeficiente de regresin es diferente de cero en forma significativa y el valor de F es elevado
(F = 39.016), adems la significancia es menor que 0.01, por tanto se afirma que la variable
microorganismos es importante en el proceso de biodegradacin de crudo en suelos.
CUADRO N 09
ANOVA
Modelo
1 Regresin
Residual
Total
Suma de
cuadrados
2.54E+09
7.17E+0.8
3.26E+09b
gl
1
11
12
Media
cuadrtica
2.54E+09
65153286
Sig
39.016
0.000 a
a. Variable predictora: MICROORGANISMOS

b. Esta suma total de cuadrados no se ha corregido para la constante porque la constante es
cero para la regresin a travs del origen.
En el cuadro N 10, la variable microorganismos participa en la explicacin de la variable

dependiente concentracin de hidrocarburos (HIDROCARBUROS) con un coeficiente estndar del
0.883 y una confiabilidad prxima al 100%. Segn el estadstico t se rechaza la hiptesis nula, es
decir existe una alta relacin entre la variable HIDROCARBUROS y la variable independiente
MICROORGANISMOS.
CUADRO N 10
COEFICIENTES DE REGRESIN
Modelo
1 MICROORGANISMOS
Coeficientes no
estandarizados
B
Error tpico
6.158E-04
0.000
Coeficientes
estandarizados
Beta
0.883
Sig
6.246 0.000
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
En el cuadro N 11 se observan las variables que han sido excluidas por no tener significancia
estadstica en el modelo.
CUADRO N 11
VARIABLES EXCLUIDAS
Modelo
1 DIAS
HUMEDAD
pH
SUELO 1
SUELO 2
SUELO 3
TEMPERATURA
Beta dentro
0.279
0.323 a
0.441 a
0.301 a
0.211 a
0.211 a
0.437 a
t
2.336
2.971
5.726
2.642
1.597
1.597
5.572
Sig
0.042
0.014
0.000
0.025
0.141
0.141
0.000
Correlacin parcial
0.594
0.685
0.875
0.641
0.451
0.451
0.870
a. Variable predictora en el modelo: MICROORGANISMOS
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
5. DISCUSIN
De manera similar a Arenas en 1999, quien aisl doscientas sesentaidos cepas bacterianas de
agua y tierra procedentes de la refinera La Pampilla, de las cuales 68% fueron
gramnegativas, en el trabajo, tambin se obtuvo un elevado nmero de cepas bacterianas
oleoflicas (cientoventinueve), aisladas de suelos procedentes de Trompeteros, Iquitos, de las
cuales el 81.39% fueron gramnegativas. Por tanto, se confirma que existen bacterias capaces de
metabolizar hidrocarburos. Arenas, aisl mayor cantidad de bacterias consumidoras de
hidrocarburos, porque las muestras que evalu procedan de una zona con mayor concentracin
de hidrocarburos. Atlas, en 1983, afirm que la poblacin de bacterias oleoflicas aumenta
despus de derrames de petrleo y es directamente proporcional a la concentracin de
hidrocarburos.
Se encontr adems, que el 99.22% de cepas bacterianas presentaron actividad emulsificante,
este resultado corrobora lo afirmado por Hayes y col., en 1986, quienes indicaron que muchos
microorganismos sintetizan biosurfactantes y bioemulsificantes, que permiten asimilar los
hidrocarburos. La actividad emulsificante y degradativa de las cepas bacterianas aisladas, fue
menor a la obtenida por Arenas, debido a las caractersticas genticas de las cepas bacterianas,
as la mayor actividad degradativa alcanzada fue
tres (3+), en cambio, Arenas, obtuvo una
actividad degradativa de cinco (5+)

En la identificacin taxonmica se verific la existencia de especies del gnero Pseudomonas:
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas acidovorans, Pseudomonas mallei, Pseudomonas
cepacia, Pseudomonas pseudomallei, especies identificadas tambin por otros investigadores,
quienes afirman que los microorganismos del gnero Pseudomonas sp., tienen un rol
importante en la degradacin de petrleo, as Leahy y Colwell en 1990, indicaron que los
microorganismos degradadores de hidrocarburos ms importantes, tanto en aguas como en
suelos son: Pseudomonas sp., Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter,
Bacillus, Flavobacterium y Nocardia, Rentera y Miranda, en 1998, encontraron cinco
cultivos
de
mayor
actividad
de
biodegradativa:
petrleo
en
Micrococcus,
terrarios.
Escalante
Pseudomonas,
Alcaligenes,
Acinetobacter y Flavobacterium y Tantalen y Altamirano, en 1998, encontraron un cultivo

mixto de Pseudomonas sp. nativas que tuvieron la mayor capacidad para utilizar el petrleo
diesel D2.
En cuanto a la biodegradacin de crudo en terrarios, el consorcio bacteriano exgeno produjo

mayor biodegradacin en los suelos evaluados, debido a la numerosa poblacin de bacterias
oleoflicas
y a la capacidad degradativa elevada que presentaba, con respecto al consorcio
bacteriano nativo, el cual degrad en menor cantidad los hidrocarburos debido a que el suelo
de cultivo en el cual se realiz el ensayo de biorremediacin proceda de una zona que no haba
sido anteriormente contaminada con hidrocarburos, por tanto inicialmente, no presentaba
bacterias oleoflicas, as segn el primer recuento realizado en laboratorio, no existan bacterias
oleoflicas en el suelo, sin embargo despus de un mes de la adicin intencional de crudo de
petrleo al suelo, se encontr un aumento en la poblacin bacteriana a 3.30 x 10
UFC/mL,
esto indica que se estimul el crecimiento de bacterias oleoflicas, al adicionar el crudo de

petrleo, en cambio la poblacin de bacterias exgenas fue disminuyendo progresivamente, a
medida que los hidrocarburos eran degradados, la
disminucin
de bacterias oleoflicas fue
directamente proporcional a la disminucin en la concentracin de hidrocarburos, esto se

atribuye a que cuanto menos sustrato tienen las bacterias hidrocarburoclsticas,
encuentran en menor cantidad.
estas se
No se puede afirmar que el 55 % de degradacin hallada en el
control abitico se deba a factores ambientales puesto que se encontr cierta cantidad de
microorganismos debido a una contaminacin, en cambio Belloso y col.,1998, en el control
abitico, lograron inhibir completamente la microbiota del suelo utilizando bicloruro de
mercurio.
El porcentaje de biodegradacin de hidrocarburos producido por el consorcio bacteriano

exgeno a los treinta das fue 63.4%, porcentaje mayor al obtenido por Belloso y col. quienes
lograron una degradacin de 45% a los treinta das, esto debido a que inocularon una sola cepa
bacteriana oleoflica, en cambio en el presente estudio se inocul un consorcio bacteriano
exgeno conformado por tres cepas bacterianas oleoflicas, tambin Belloso y col encontr
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
menor reduccin de hidrocarburos en el terrario donde se encontraban las bacterias nativas

(12%) y en el control abitico (8%) Sabirova en el 2000, obtuvo an menor porcentaje de
biodegradacin (22%) a los treinta das, despus de aplicar un consorcio bacteriano
halotolerante para la biodegradacin de hidrocarburos en suelos, esto se debe a que la salinidad
inhibe la actividad microbiana en
suelos, mientras que en el control abitico encontr un
proceso degradativo lento de 22% de degradacin al cabo de ocho meses, esto reafirma la
importancia que tienen los microorganismos en la biodegradacin de crudo de petrleo en
suelos as en la presente investigacin, se encontr que los microorganismos oleoflicos
participaron directamente en la variacin de la concentracin de hidrocarburos en los terrarios
con un coeficiente estndar de 0.883 y una confiabilidad prxima al 100 %, Daz y col. en
1999, evaluaron la biodegradacin de hidrocarburos utilizando un
rizsfera de Cyperus laxus Lam.
consorcio microbiano de la
en condiciones de laboratorio y encontraron una
biodegradacin del 62.28% a los treintaicuatro das, aunque el estudio no fue realizado a nivel
de terrarios, el porcentaje de biodegradacin fue similar al alcanzado en el presente trabajo, el
cual fue 63.4 % a los treinta das.
La fertilidad del suelo de cultivo evaluado favoreci el proceso biodegradativo. Sirvins y
Tramier en 1993, afirman que la tasa de eliminacin del petrleo despus de siete das, en la
naturaleza aumenta a 62-70% e incluso 79% cuando se aade nutrientes.
A los noventa das del experimento, se alcanz mayor porcentaje de biodegradacin (92.5 %)
que el encontrado a los cientochenta das (57%) por Dibble y Bartha en 1979, quienes
evaluaron el efecto de los parmetros ambientales en la biodegradacin del crudo de petrleo
en suelos frtiles.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
6. CONCLUSIONES
1. Se aislaron cientoventinueve cepas bacterianas capaces de degradar hidrocarburos, de las

cuales, el 99.22% presentaron actividad emulsificante y el 97.67% presentaron actividad
degradativa.
2. El porcentaje de biodegradacin producido por el consorcio bacteriano exgeno (92.5%)

fue mayor al del consorcio bacteriano nativo (60%) a los noventa das.
3. Los microorganismos oleoflicos
influyeron significativamente en la biodegradacin de
crudo de petrleo en los terrarios con una confiabilidad prxima al 100 %.
4. A los noventa das, se logr biodegradar el 92.5 % de los hidrocarburos en el ter rario que
contena el consorcio bacteriano exgeno conformado por Pseudomonas aeruginosa 4k-1,
Serratia rubidae 6B9 y Bacillus sp.6Bh-1.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
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hydrocarbons in groundwater, in situ augmented bioreclamation with enrichment isolates in
California. Water Science and Technology. 20 (11/12): 501-530.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
8. ANEXOS
8.1 COMPOSICION DE MEDIOS DE CULTIVO
CALDO ACETATO MINERAL

Fosfato cido di sdico dodecahidratado.
2.25 g
Fosfato dicido monopotsico
0.345 g
Sulfato de Magnesio heptahidratado
0.05 g
Cloruro de Amonio
0.25 g
Acetato de Sodio
0.000125 g
Bicloruro de Calcio dihidratado
0.00025 g
Solucin de elementos traza
0.75 mL
Carbonato de Sodio al 0.05%
0.11 mL
Agua destilada
250 mL
pH final
7.0
Esterilizacin a 121 C por 15 min.
MEDIO AUXILIAR ( AUX MEDIUM)
Sulfato amonaco
2g
Base
82.8 mg
Aminocidos.
250 mg
Vitaminas y sustancias nutritivas
35.9 g
Tampn fosfato
0.04 M pH= 7.1 1000 mL
Agar
1.5 g
pH final
7.0-7.2
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
CETRIMIDE AGAR
Peptona de gelatina
20 g
Cloruro de Magnesio
1.4 g
Sulfato potsico
10 g
N-cetil-N,N,N,-trimetilamoniobromuro(Cetrimide)
0.3 g
Agar-agar
13 g
Glicerina
10 mL
Petrleo al 1 %
AGAR KING-B
Peptona de carne
4g
Glicerol
2g
Fosfato dicido de Potasio
0.3 g
Sulfato de Magnesio
0.3 g
Agar
3g
Agua destilada
200 mL
pH final
7.0

MEDIO MINERAL
Cloruro de Sodio
24 g
Cloruro de Potasio
0,7 g
2,0 g
1,0 g
Fosfato cido di sdico
3,0 g
Nitrato de Amonio
1,0 g
Agua destilada
1000
Petrleo crudo
mL
pH final
10 mL
7.0
Esterilizacin a 121C por 15 minutos.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
MEDIO MNIMO DE GOLDMAN

Fosfato cido di potsico
18 g
6g
Sulfato de Magnesio
0.02 g
Sulfato diamnico
4g
Etanol
20 mL
Agua destilada.
1000 mL
pH final
7.0
Esterilizacin a 121C por 15 minutos.

Extracto de levaduras al 3%.
MEDIO PALLERONI
Fosfato cido di sdico
9.37 g
8.976 g
Cloruro de Sodio
1.7 g
Cloruro de Amonio.
0.2 g
0.1 g
Citrato amnico frrico
0.01 g
Cloruro de Calcio
0.001 g
Agua destilada
200 mL
pH final
6.8
Esterilizacin a 121 C por 15 min., excepto el Citrato amnico frrico y Cloruro de Calcio el cual se
esteriliza por filtracin y se adiciona en condiciones estriles a partir de una solucin concentrada.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
8.2 CARACTERSTICAS DEL DESTILADO DE CRUDO DE PETRLEO A 200 C
CUADRO N 01
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
Tiempo
de
retencin
(TR)
1.33
1.55
2.07
2.69
3.17
3.87
4.28
4.43
5.09
7.74
8.28
10.76
15.83
16.86
17.79
19.64
22.34
24.88
24.88
25.90
27.30
29.60
31.80
33.91
35.94
37.87
39.73
41.51
43.23
44.89
46.47
48.08
49.97
52.22
Componentes
Peso
Frmula
molecular
(PM)
n-pentano
n-hexano
n-heptano
2 metil pentano
3 metil hexano
1,1,2trimetil
ciclohexano
1-hexeno
2 metil hexano
2 etil hexano
2 metil decano
4 metil decano
n-nonano
2 metil undecano
3,5 dimetil octano
2 metil undecano
dodecano
n-tridecano
n-tetradecano
tetradecano
2 metil tridecano
n-pentadecano
pentadecano
n-hexadecano
n-heptadecano
n-octadecano
octadecano
n-eicosano
n-heneicosano
n-dodocosano
n-pentacosano
n-octacosano
n-nonacosano
n-triacontano
n-dotriacontano
76
86
100
72
100
126
84
86
114
114
156
128
170
142
170
170
184
198
198
198
212
212
226
240
254
254
282
296
310
352
394
408
422
450
0.49
0.77
0.57
0.64
1.82
2.18
2.14
2.05
7.58
9.52
0.38
13.17
5.95
9.39
2.55
8.56
7.86
5.09
3.48
3.90
3.93
1.37
1.22
0.96
0.85
0.77
0.71
0.55
0.43
0.37
0.20
0.20
0.20
0.10
C5H12
C6H14
C7H16
C6H14
C7H14
C9H28
C6H12
C7H16
C8H18
C11H24
C12H26
C9H20
C12H26
C10H22
C12H26
C12H26
C13H28
C14H30
C14H30
C14H30
C15H32
C15H32
C16H34
C17H36
C18H38
C18H38
C20H42
C21H44
C22H46
C25H52
C28H58
C29H60
C30H62
C32H66
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
INTERPRETACIN:
Saturados aciclicos
95.77% (37.38% parafnico)
Saturados cclico
2.18
Insaturados-olefnico
2.05
Aromticos
0.00
100.00
PROPIEDADES FISICOQUMICAS
GRAVEDAD API A 60 F
19.0
DESTILACIN
%DESTILADO
Hasta 200 C
15
Residuo
pesado 85
CONDICIONES CROMATGRAFO DE GASES: GC/MS
Columna:
Medianamente polar SUPELCO 608
T. Horno:
80 C (8,5); 45 C/min hasta 150 C (1) 8 C/min hasta 280 C (12)
Injector:.
80 C (0,2); 50 C/min hasta 100 C (5); 50 C/min hasta 300 C hasta el final de
Vol.inj:
corrida.
Split:
1,5 l
Gas arrastre:
[50:1]
Helio 20.8psi (1,73 mL/min)
NOTAS:
TR: Tiempo de retencin, secuencia en que se separan los componentes en el cromatograma.
PM: Peso molecular
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
Grfico N 01:Tiempo de retencin en la columna y porcentaje de cada componente del

destilado de crudo.
Grfico N 01: Tiempo de retencin en la columna y porcentaje de cada componente del

destilado de crudo.
Grafico N 01:
Tiempo de retencin en la columna y porcentaje de cada componente del destilado de crudo.
8.3 CARACTERISTICAS DEL SUELO DE CULTIVO.

CUADRO N 02
Conductivida Anlisis Mecnico

d (C.E)
Ds/m
P.S*
Arena Limo
%
%
Arcill
a%
1.03
69.45
8.28
22.3
pH
Carbonat
o de
Calcio
CaCO3
Textura P.S %
Materia
Fsforo xido
Orgnica P
dipotsic
(M.O)
o K2O
Cationes Cambiables
Cationes
Ca++
intercambiabl
es (CIC)
Cmol (+)/kg
Franco 6.4
Arenoso
2.6
0.00
ppm
kg/ha
49.45
585.60
(0.005% (0.49%)
)
P.S*: Pasta Saturada
13.72
Mg++
K+
Na
9.60
3.20
0.46
0.17
(0.038% (0.0077%) (0.0017%) (0.0004%)
)
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
INTERPRETACIN:
CONDUCTIVIDAD :
Muy ligeramente salino:
Ligeramente salino:
Moderadamente salino:
Fuertemente salino:
Extremadamente salino:
MATERIA ORGANICA (M.O)
Bajo:
Medio:
Alto:
CALCAREO TOTAL CaCO3%
C.E. (sales). Segn respuesta de los cultivos (dS/m)

<2
2-4
4-8
8-16
>16
Bajo:
Medio:
Alto:
FSFORO P (ppm)
Bajo:
Medio:
Alto:
POTASIO K2O (kg/ha)
Bajo:
Medio:
Alto:
REACCION DEL SUELO (pH)
Fuertemente cido:
Moderadamente cido:
Ligeramente cido:
Neutro:
Ligeramente alcalino:
Moderadamente alcalino:
EQUIVALENCIAS
1 mmhos/cm =
1 cmol (+) kg =
< 1%
1-5%
> 5%
< 2%
2-4%
>4%
< 7%
7-14%
>14 %
< 300
300-600
> 600
5.1-5.5
5.6-6.0
6.1-6.5
6.6-7.3
7.4-7.8
7.9-8.4
1 dS/m
1 me/100g
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
8.4 BIODEGRADACIN DE CRUDO EN TERRARIOS

FOTO N 01
CONSORCIO BACTERIANO EXGENO
NATIVO
CONSORCIO BACTERIANO
CONTROL ABITICO
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
8.5 DETERMINACIN DE LA REGRESIN MLTIPLE POR PASOS CON EL

PROGRAMA SPSS 9.0 WINDOWS.
Grfico N 02. Ingreso de datos al SPSS.
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
Grfico N 03. Seleccin de mtodo de regresin lineal mltiple
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
Grfico N 04.Seleccin de variables y del mtodo de regresin lineal mltiple: Stepwise.
8.6
de
petrleo
en
terrarios.
Escalante
ESCALA TURBIDIMTRICA MC. FARLAND

Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cloruro de cido
Millones de
Bario (1%) sulfrico(1%) m.o/mL
0.1
9.9
300
0.2
9.8
600
0.3
9.7
900
0.4
9.6
1200
0.5
9.5
1500
0.6
9.4
1800
0.7
9.3
2100
0.8
9.2
2400
0.9
9.1
2700
1.0
9.0
3000
Fuente: Microbiologa de laboratorio (Bradshaw, 1976)

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

BIODEGRADACIN DE CRUDO DE PETRLEO EN TERRARIOS

Laboratorio de Microbiologa y Biotecnologa Microbiana de la

Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

por bacterias nativas y

el ltimo donde se inocul el consorcio bacteriano exgeno seleccionado

microorganismos aerobios mesfilos, nmero de microorganismos oleoflicos, temperatura

Se aislaron cientoventinueve cepas

UAE/mL respectivamente y una actividad de tres (3+) equivalente a una

A.D. buena. En cuanto a la

Segn la Regresin mltiple de Stepwise, en la degradacin de hidrocarburos, influyeron los microorganismos

una confiabilidad prxima

clave : biorremediacin, crudo, huaca, biodegradacin, consorcio, saturados acclicos, oleoflicos,

mltiple de Stepwise, coeficiente estndar, confiabilidad.

respectively and a degradative activity of three (3+) equal to good activity.

exogenous, aerobia mesofilic, Stepwise

Regression Model, Standardized coefficient, reliability.

Los dispersantes qumicos utilizados para favorecer la remediacin de los ambientes

mismo derrame, por su

toxicidad y recalcitrancia a la biodegradacin (18) Por tanto, una mejor alternativa de

Achromobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia rubidae,

etc., las cuales

disminuyen la concentracin de hidrocarburos presentes en el ambiente y al mismo tiempo

bacterias producen bioemulsificantes y biosurfactantes que disminuyen la tensin superficial

presente estudio es evaluar la biodegradacin de crudo de petrleo en

suelos contenidos en terrarios expuestos a la intemperie, los suelos de cultivo proceden de

posible solucin a la contaminacin por derrames de petrleo, dando

inicio a un programa de proteccin ambiental adecuado.

Sabirova, en el 2000, en Rusia, realiz un estudio en el cual primero aisl microorganismos

numerosos factores que

significativamente la tasa de degradacin del petrleo en el suelo.

Daz y col., en 1999, en Mxico, evaluaron la biodegradacin de hidrocarburos por un consorcio

multivorum, Staphylococcus Sp., Neisseria Sp., Micrococcus sp.

Merino, en 1998, en Lima, realiz el estudio de microorganismos nativos productores de

y concluy que existe un elevado porcentaje

de microorganismos nativos con capacidad de degradar hidrocarburos de petrleo y de producir

Rentera y Miranda, en 1998, en Trujillo, realizaron el aislamiento y seleccin primaria de

Tantalen y Altamirano, en 1998, en Ica, realizaron el aislamiento y evaluacin del crecimiento

propagadas en el laboratorio. Ellos

aplicaron dos tipos de fertilizantes de tipo NPK( Nitrgeno, Fsforo y Potasio):

Sirvins y Tramier, en 1993, afirm que en la isla de Embiez, se ha evaluado la eliminacin de

Hayes y col., en 1986, indicaron que existen microorganismos productores de emulsificantes

Acinetobacter calcoaceticus el cual produce un bioemulsificante de elevado peso

Atlas, en 1983, afirm que los gneros ms importantes de microorganismos degradadores de

Rhodotorula y Sporobolomyces, todos estos microorganismos fueron aislados de ambientes

Dibble y Bartha, en 1979,

realizaron un estudio del efecto de los parmetros ambientales en la

Medios de cultivo (Ver anexos 8.1, Pg 39)

Suelo contaminado con crudo de petrleo, procedente de Trompeteros, Iquitos.

Suelo de cultivo, procedente de una zona aledaa a la huaca San Marcos.

Petrleo crudo procedente de la refinera La Pampilla.

a) Muestreo de suelos para el aislamiento de microorganismos con capacidad degradativa.

b)Muestreo de suelos para evaluar la biodegradacin de crudo en terrarios.

muestras de aproximadamente 1 kg en el tiempo

3.2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

3.2.2.1 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE

3.2.2.2 ACTIVIDAD EMULSIFICANTE DE LAS BACTERIAS DEGRADADORAS DE

al cual se le adicion extracto de levadura al 3% P/V (peso sobre

volumen) Se utiliz petrleo crudo, proporcionado por la refinera

Las cepas bacterianas se reactivaron en 2 mL de caldo Nutricio y se les incub a 37 C por

Se obtuvieron 10 mL del sobrenadante en tubos de prueba de 16 x 150 mm, previa decantacin,

El blanco fue un tubo conteniendo el medio de cultivo sin inoculacin, y se procedi de la