Determinacin de actividad enzimtica de la tirosinasa por mtodo

espectrofotomtrico.

Resumen

El objetivo principal de la practica fue la determinacin de la actividad
enzimatica de la tirosinasa, para la determinacin de esta se utilizo el mtodo de
espectrofotometria, por medio de este fue posible determinar la absorbancia de la
tirosinasa a distintas concentraciones. Ya teniendo la absorbancia de estos se
pudo llegar a determinar el comportamiento de la enzima tirosinasa, a partir de la
grfica se puede llegar a determinar la actividad de esta enzima. Para llevar acabo
la experimentacin de utilizo _DOPA como sustrato, ya que el dopacromo posee
un mximo de absorcin de 475nm, por lo que la absorcin a esta longitud de
onda se utilizo para medir la actividad enzimatica. Las enzimas se caracterizan
por sen especificas por el tipo de reaccin y el sustrato. Algunos de los factores
que las influyen son la presencia de inhibidores, activadores, temperatura pH y
concentracin del sustrato.
Introduccin
La tirosinasa es una enzima catecoloxidasa,
segn
la
moderna
nomenclatura moderna y clasificacin
de enzimas es EC 1.14.18.1, tambin
es
llamada
monofenol
monooxigenasa. Esta enzima cataliza
la oxidacin de los orto-difenoles en
orto-quinonas utilizando como su
cofactor
el
DOPA
(dihidroxifenilalanina), mediante la
actividad cresolasa, que consiste en
la hidroxilacin de monofenoles en la
posicin orto para obtener odifenoles, o la actividad catecolasa,
que consiste en la oxidacin de ofenoles a sus respectivas o-quinonas.
La tirosinasa se encuentra en los
tejidos vegetales, principalmente en
las mitocondrias y cloroplastos de las
clulas, tambin se encuentra en las
vacuolas como parte soluble. Esta
enzima es la responsable del
pardeamiento enzimtico, la cual es
una reaccin de oxidacin en la cual
acta como sustrato el oxgeno
molecular.1

La actividad de una enzima determina

la capacidad de dicha enzima para
provocar
una
reaccin
qumica
determinada, y se expresa en moles o
unidades de actividad enzimtica. La
velocidad de la reaccin catalizada
enzimticamente es directamente
proporcional a la concentracin del
sustrato que interacta en la
reaccin, por lo tanto la velocidad de
una reaccin puede ser medida,
mediante
la
disminucin
de
concentracin de sustrato en un
determinado tiempo, o el aumento de
la
concentracin
del
producto,
midiendo dichas concentraciones por
el mtodo espectrofotomtrico. La
actividad enzimtica tambin puede
expresarse como cierta cantidad de
sustrato
convertido
en
un
determinado tiempo y volumen,
utilizando tambin para calcular la
cantidad de sustrato reaccionado la
Ley de Beer-Lambert.2
Las enzimas se clasifican bajo una
secuencia numrica conformada por
4 secciones en especfico bajo el
sistema EC. El primer nmero hace

referencia al tipo de reaccin qumica

que desempea la enzima, el
segundo nmero se refiere a la
subclase de la enzima, el tercero
determina
la
subclase
con
informacin sobre el sustrato afn a la
enzima y el cuarto indica el numero
serial de la enzima en el grupo
correspondiente. 1
Esta numeracin permite clasificar a
las enzimas en cinco grupos: 1
1. Oxidorreductoras
2. Transferasas
3. Hidrolasas
4. Liasas
5. Isomerasas
El cambio de color producido en los
vegetales al cortarlos se produce por
medio
del
oscurecimiento
o
pardeamiento enzimtico. Esto se
debe a una disrupcin a nivel celular
en donde se exponen los sustratos
tipo fenlico al oxigeno del aire.2
Metodologa

Para llevar a cabo el anlisis de
la enzima primero fue necesario
primero la extraccin de la enzima, la
cual fue posible pesando 20g de
muestra y luego se trituro, ya
triturado se le aade 10ml de buffer
de fosfato de sodio. Esto se lleva a la
centrifugadora.
Ya
teniendo
lo
centrifugado se preparo una dilucin
de 1:10 con buffer de fosfato de
sodio 0.1M, en un tubo de ensayo se
aadi 0.1ml del extracto diluido, se
le agrego 3.9ml de buffer de fosfato y
1ml de DOPA, esto se llevo a una
cubeta del espectrofotometro y se
midi la absorbancia a 420nm cada 5
minutos por 25 minutos. Este mismo
procedimiento se llevo a cabo con un
extracto diluido de 0.2, 0.5 y 1.0ml y

con 3.8, 3.5 y 3.0ml del solucin

buffer con 1ml de DOPA.

Resultados
En base a los resultados obtenidos,
se
pudo
observar
el
distinto
comportamiento de la enzima en las
distintas concentraciones en el
mismo intervalo de tiempo, en el cual
los datos obtenidos no fueron del
comportamiento lineal inicial de la
enzima esperada, deduciendo as
varios factores que pudieron afectar
en base a los clculos obtenidos.
Grfica no. 1 Actividad enzimtica de
tirosinasa
0.1mL
Linear.(0.1mL)
0.2mL
Linear.(0.2mL)
0.5mL
Linear.(0.5mL)
1.0 mL
Linear.(1.0 mL)

y = 0.60
0.0022x + 0.1532
y = 0.0051x + 0.2159
y = 0.45
0.008x + 0.1806
y = 0.0212x + 0.4812
0.30
0.15
0
1

Discusin
El objetivo principal de la practica fue
el anlisis de la enzima tirosina, la
cual se extrajo de una manzana, esta
enzima es la protena bsica de la
pigmentacin,
se
encuentra
clasificada como una enzima oxido
reductora y tienen como funcin la
oxidacion de fenoles. Este anlisis se
llevo a cabo a partir de un anlisis
espectrofotometrico, el cual nos
mostr
la
absorbancia
de
la
tirosinasa, en la grfica No. 1 se
puede observar el comportamiento
de la absorbancia de la enzima,
cuando se encuentra a distintas
concentraciones. En la grfica se
puede observar que entre un
incremento en la absorbancia, esta
nos indica que entre mayor es el
tiempo de reaccin de la oxidacin
mayor es su capacidad de absorber
luz.

momento que la temperatura va

subiendo la enzima se inhibe, de
igual manera otro factor pudo haber
sido
factores
contaminantes
presentes en la cristalera que
intervinieron en la precisin y
exactitud de nuestros resultados.

La determinacin de la actividad dopa

oxidada de la tirosinasa, se baso
como producto de oxidacin de la LDopa este sigui su formacin hasta
475nm. La unidad de actividad dopa
oxidasa se defini como la cantidad
de enzima que cataliza en la
formacin
de
micromol
de
dopacromo por minuto.

Referencias
1. Koolman, J. 2005. Bioqumica.
Ed.
Mdica
Panamericana.
Madrid, Espaa. 488pp
2. Ferscht, A. 1980. Estructura y
Mecanismo de Enzimas Ed.
Revert. Barcelona, 370pp.
3. Prctica 7. 2013. Enzima,
Tirosinasa. Manual de

La actividad de la dopa oxidasa se

puedo llegar a medir a partir de la
formacin
de
dopacromo
con
respecto a su tiempo, esto se puede
observar en la grfica. En este
ocurrieron diversos factores que
pudieron intervenir en nuestros
resultados, un factor pudo haber sido
la temperatura del ambiente, al

Para la elaboracin de esta practica

se recomienda una manipulacin
cuidadosa de la enzima, ya que un
mal manejo de esta se pude llegar a
ver afectados nuestros resultados
cuantitativos y cualitativos.
Conclusin
En base a los resultados obtenidos se
puede concluir que es posible la
determinacin
de
la
actividad
enzimtica a partir de la absorbancia
de esta y que la absorbancia se ve
directamente afectada por la reaccin
de oxidacin de la tirosinasa.