PURIFICACIN DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS DE SANGRE PERIFRICA

HUMANA

Neider lozano,Yised ramires,Yessica avila,Yesid

SULJEY COCHERO BUSTAMANTE
UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGIA
V SEMESTRE
11-10-2016

RESUMEN
Es de gran importancia la obtencin de
(ADN) humano de alta pureza para la
aplicacin de mltiples estudios en
cualquier tipo de investigacin utilizando
las
tcnicas
posteriormente
empleadas.La separacin del ADN
desde los componentes celulares
est dividida dentro de 4 etapas: 1.
Destruccin 2. Lisis 3. Remocin de
protenas
y
contaminantes
4.
Recuperacin del ADN. Nota: En
algunos mtodos la fase 1 y 2 se
encuentran combinados..Se purific
ADN extrado por salting-out de dos
muestras de sangre de 500 L. Las
muestras fueron tratadas con buffer de
lisis y repetidas centrifugaciones a 12000
rpm.
Se
elimin
las
protenas
contaminantes
con
protenas
K
incubando las muestras, seguidamente
las protenas fueron separadas mediante
precipitacin salina y centrifugacin a
12000 rpm por 10 minutos. ya precipitado
el ADN con isopropanol y centrifugacin
a 12000 rpm por 10 minutos, fue lavado
con etanol al 70% y por ultimo se limino
con agua ultra pura. Ya empleadas las
tcnicas para la purificacin se procedio
a cuantificar el ADN extrado de las
muestras midiendo su absorbancia,

usando
un
espectrofotmetro
(NanoDrop): en la primera muestra la
concentracin de ADN fue de 4.3 ng/L,
con cociente de contaminacin por
protenas (A260/280) de -1.28 y cociente de
contaminacin por compuestos orgnicos
(A260/230) de -0.02; mientras que en la
segunda, la concentracin fue de
203.1ng/L,
con (A260/280) de 1.00 y
(A260/230) de 12.32. Con lo que se pudo
inferir que la segunda muestra fue ms
pura que la primera.

INTRODUCCION
La importancia del proceso de
obtencin y purificacin del material
gentico es recobrar el producto
mximo de ADN de alto peso
molecular libre de protenas, fenole
inhibidores de las enzimas de
restriccin, y de la taq polimerasa.
Una muestra de ADN, de calidad y
cantidad adecuadas, es crucial para
garantizar la correcta amplificacin
de secuencias de genes mediante
esta tcnica. Por lo tanto, la
eficiencia de los procedimientos de

extraccin se ha convertido en un
punto crtico para el xito de la
aplicacin del PCR3. El ADN de alta

calidad es un prerrequisito para su

uso ya que permiten la identificacin
gentica de las personas) y por PCR
(para la identificacin de las
secuencias especficas de ADN
mediante el uso de cebadores), no
as el ADN degradado que no
sustenta la integridad de los
fragmentos de restriccin para
producir bandas definidas. con el
menor nmero de contaminantes,
buscando as reducir los efectos de
inhibicin o disminucin de la
sensibilidad y la eficiencia de la
amplificacin de las secuencias del
ADN mediante la PCR13.

OBJETIVO
Viabilidad,
purificacin
y
cuantificacin del ADN mediante las
diferentes tcnicas.

- Buffer de lisis de clulas rojas (TEN:

0.1M NaCl, 10 mM Tris-Cl pH.8.0, 1
mM EDTA pH.8.0)
- Solucin amortiguadora de
eritrocitos (0.075M NaCl, 0.024M
EDTA)
- Solucin amortiguadora de TE
(10mM Tris, 1mM EDTA)
- SDS 10% (P/V)
- Proteinasa K
- Etanol absoluto fro
- Etanol 70% (V/V)
- NaCl (6M)
Primera sesin
-se

procedio a
Transferir un
volumen de 500 L de sangre
perifrica a un tubo eppendorf y se
adicion buffer de 0.075M NaCl; 0.024 M
EDTA para lavar, luego se agito varias
veces y se centrifug a 12000 rpm por 10
minutos.

MATERIALES Y METODOS
- Tubos eppendorf de 1.5 mL
- Freezer -20 C
- Centrfuga refrigereda
- Vortex
- Micropipetas
- Puntas
REACTIVOS

Se descart el el sobrenadante y al
pellet se le adicionar 500l de buffer
de lisis.luego de esto se procedio a
agitar y agregar 3l de proteinasa K,
incubar
por 40 minutos a 55C
Despus se le agreg al tubo 3 L de
protena k. Posteriormente, se llev el
tubo a un bloque seco por 3 minutos y
se centrifug a 12000 rpm por 10
minutos. Se Tomo el sobrenadante en
un nuevo vial y se le adicionan
500l de Acetato de Potasio 5M

luego se llevo al congelador esta

muestra por 15 minutos..

Una vez ms se centrifug el contenido a

12000 rpm por 10 minutos y se llev el
sobrenadante a un nuevo vial en donde
se le agreg una porcin de alcohol. Este
incub hasta la prxima clase.

Segunda sesin
Se procedi a centrifug el contenido
incubado a 12000 rpm por 10 minutos, y
se descart el sobrenadante
por
inversin. Se lav el pellet de ADN con 1
mL de etanol al 70%. Para luego
centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos y
se descart el etanol . Luego, se sec
en un agitador . Despus del secado, se
re suspendi el pellet en 50 L solucin
agua ultra pura. Finalmente, se cuantific
el contenido de ADN purificado de las
muestras
de
sangre
con
un
espectrofotmetro NanoDrop.

Tabla 1. Concentracin, A260, A280, A260/280

y A260/230 del ADN de las muestras.
[ADN] (ng/L)
A260
A280
A260/280
A260/230

Muestra I
4.3
0.085
-0.065
-1.28
-0.02

Muestra 1

RESULTADOS
En la Tabla 1,
se representan los valores que estan
relacionados con la concentracin de
ADN en la muestras, la relacin de
absorbancia
con
respecto
a
la
contaminacin del material gentico
(A260/280) y la relacin de absorbancia del
ADN contaminado por compuestos
orgnicos (A260/230) como se muestra en la
grafica 1, adems se presenta la
absorbancia del ADN (A260) y la de las
protenas contaminantes (A280) para .
Muestra 1 y 2

[ADN] (ng/L)
A260
A280
A260/280
A260/230

Muestra 2

Muestra II
203.1
4.062
4.059
1.00
12.32

En la anterior centrifugacin, produjo

la deshidratacin del ADN, porque el
isopropanol
compite
por
las
molculas de agua que rodean a este
ltimo, provocando total precipitacin
de los cidos nucleicos en el fondo
del tubo.

DISCUSION
para la purificacin de ADN humano
las tcnicas empleadas tienen
muchas diferemcias mediante la
tcnica modificada de Miller y
colaboradores. En breve, este
protocolo se basa en la lisis celular
con un detergente no aninico como
SDS, digestin con proteinasa K en
un buffer de baja fuerza inica,
durante un periodo prolongado a
56C,
centrifugacin
a
bajas
velocidades por periodos de 30
minutos y desproteinizacin por altas
concentraciones de sal.
Mientras que la solucin Tris que se
utiliza durante la lisis celular, para la
eliminacin y la precipitacin de
componentes celulares no deseados,
para mantener un pH estable, cuando
al buffer de lisis se le adiciona EDTA
para formar el buffer TE (Tris, EDTA).
La adicin de acetato de potasio al
sobrenadante
resultado
de
la
centrifugacin, aument el poder
inico de la solucin y ocasion la
precipitacin de protenas debido a
que las cargas negativas de estas
son atradas y neutralizadas por los
cationes K+ de la solucin salina.

La centrifugacin es llevada a cabo

para acelerar el proceso de
sedimentacin despus de lavar el
ADN con etanol permitino
la
elevacin y eliminacin del etanol
contaminante, y el pellet fue secado
por la misma razn: eliminar el etanol
que posiblemente haya quedado en
la muestra de ADN despus de la
centrifugacin.
la cuantificacin del ADN y purificado
fue realizada por medio de
un
espectrofotmetro NanoDrop que
puede cuantificar ADN partiendo de
solo 1 L de muestra con la ayuda de
la absorbancia que representa la
contaminacin de este.

El espectrofotmetro determina la
cantidad de ADN presente en una
muestra. Por esa razn la relacin de
absorbancia 260/280 expresa la
cantidad de ADN y protenas
presentes en la muestra.

CONCLUSIN

El ADN purificando de las muestras de

sangre
estuvo
contaminado
con
compuestos orgnicos y protenas. La
mxima concentracin de ADN obtenida
de una de las muestras fue de 203.1 por

lo que se puede constatar que hubo un

nivel de contaminacin.

BIBLIOGRAFA
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