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SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERA, TURISMO Y ALIMENTOS


LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

DETERMINACIN DE Salmonella sp. EN ALIMENTOS Y PRODUCTOS

1. OBJETIVO
Este procedimiento tiene por objeto explicar los pasos a seguir para realizar el ensayo Salmonella sp
en alimentos y productos; empleando la tcnica deteccin.

2. ALCANCE

Alimentos naturales y procesados


Aves.
Carnes de aves y productos derivados.
Crnicos crudos, maduros o ahumados y productos derivados.
Huevos.
Leche y productos lcteos.
Materias primas, productos en proceso y productos terminados.
Medicamentos: jarabes, cpsulas, tabletas y diferentes presentaciones farmacuticas.
Productos de la pesca.
Salsas.

3. DEFINICIONES
ALIMENTO: Todo producto natural o artificial, elaborado o no, que ingerido aporta al organismo
humano los nutrientes y la energa necesarios para el desarrollo de los procesos biolgicos. Estn
incluidas las bebidas no alcohlicas, y aquellas sustancias con que se sazonan algunos comestibles
y que se conocen con el nombre genrico de especia.
ALIMENTO CONTAMINADO: Alimento que contiene agentes y/o sustancias extraas de cualquier
naturaleza en cantidades superiores a las permitidas en las normas nacionales, o en su defecto en
normas reconocidas internacionalmente.
ALIMENTO DE MAYOR RIESGO: Alimento que, en razn a sus caractersticas de composicin
especialmente en sus contenidos de nutrientes, Aw actividad acuosa y pH, favorece el crecimiento
microbiano y por consiguiente, cualquier deficiencia en su proceso, manipulacin, conservacin,
transporte, distribucin y comercializacin, puede ocasionar trastornos a la salud del consumidor.
ALIMENTO PERECEDERO: Alimento, que en razn de su composicin, caractersticas
fisicoqumicas y biolgicas, pueda experimentar alteracin de diversa naturaleza en un tiempo
determinado y que, por lo tanto, exige condiciones especiales de proceso, conservacin,
almacenamiento, transporte y expendio.
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MATERIA PRIMA: Son sustancias naturales o artificiales, elaboradas o no, empleadas por la
industria de alimentos para su utilizacin directa, fraccionamiento o conversin en alimentos para
consumo humano.
Salmonella: Es un gnero de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por
bacilos gram negativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que no desarrollan cpsula
(excepto la especie Salmonella typhi) ni esporas. Son mviles y producen cido sulfhdrico (H2S).
Emplean la glucosa como fuente de carbono; por poseer una enzima especializada, pero no lactosa,
y no producen ureasa. No tienen metabolismo fermentativo.

4. DESARROLLO DE ACTIVIDADES
4.1. FUNDAMENTO
La determinacin de Salmonella sp. en un alimento se realiza mediante las siguientes etapas:
enriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, siembra en placas con agar selectivo y
diferencial, y por ltimo la identificacin. Salmonella sp, son bacilos gram negativos que degradan la
glucosa, generalmente con produccin de gas, mientras que la lactosa y sacarosa no pueden
degradarla.

4.2. INTERFERENCIAS

Contaminacin cruzada en el transporte, recepcin y almacenamiento de las muestras.


Baja concentracin del analito.
Inadecuada homogeneizacin.
Temperatura y tiempo de incubacin fuera del rango de especificacin para el analito.
Dilucin de nutrientes y pH inestable en los medios de cultivos.

4.3. TOMA Y PRESERVACIN DE MUESTRAS


Recolectar las muestras de alimentos con la ayuda de utensilios estriles (Cucharas, tenedores,
cuchillos, pinzas, etc.), e introducir en bolsas estriles con cinta color amarillo. Conservar en una
temperatura entre 2 y 8 C y transportar de inmediato al laboratorio para realizar los respectivos
anlisis.

4.4. EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.


4.4.1. Equipos.

Balanza cdigo.
Bao serolgico cdigo.
Cabina de flujo laminar.
Incubadoras 35 C.
Microscopio cdigo.
Nevera 2 8 C .
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4.4.2. Materiales.

Asa de inoculacin en aro.


Bandejas de transporte.
Botellas de vidrio con capacidad de 250, 500 ml.
Cajas Petri grandes.
Dispensador de pipetas.
Frascos y recipientes para descarte.
Gradillas.
Lminas portaobjetos.
Lminas cubreobjetos
Marcadores
Mechero de Bunsen.
Micropipetas de 100 y 1000 L.
Pipetas graduadas estriles de 1, 5 y 10 mL.
Tips para micropipetas, azules y amarillas.
Toallas de papel absorbente.
Tubos de ensayos tapa rosca 16 cm x 16 mm.

4.4.3. Medios de cultivos y reactivos

Agua destilada estril


Caldo Lactosado
Caldo Selenito cistina
Caldo Tetrationato
Caldo Rappaport- Vassiliadis
Agar Hecktoen para enterobacterias
Agares selectivos y diferenciales para Salmonella: Agar XLD (Agar xilosa, lisina desoxicolato)
y Agar Bismuto sulfito.
Agar TSI (Agar hierro triple azcar)
Agar LIA (Agar lisina descarboxilasa)
Tirillas de oxidasa
Agar Citrato de Simmons
Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
Rojo de metilo
Agar SIM
Caldo triptfano
Caldo nitratos
Reactivos para la coloracin de Gram (Cristal violeta, alcohol acetona, safranina y lugol).
Polvo de Zinc
Reactivo de Griess
API 20 E para la identificacin de Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram. negativos no
exigentes.

4.4.3.1. Preparacin.
Caldo Lactosado.
Disolver 13 g del medio en 1 L de agua destilada estril.
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Agitar suavemente con un agitador de vidrio.


Ajustar el pH 6.9 +/- 0,2.
Agregar 225 mL en frascos tapa rosca de 500 mL de capacidad estril.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Retirar de la autoclave, dejar enfriar y refrigerar.

Caldo Selenito cistina.

Tener precaucin al manipular este medio debido a que es muy toxico.


Disolver 23 g del medio en 1 L de agua destilada estril.
Agitar suavemente con un agitador de vidrio.
Ajustar el pH 7.0 +/- 0,2.
No tratar en autoclave.
Agregar 10 mL en tubos estril.

Caldo Tetrationato.

Disolver 46 g del medio en 1 L de agua destilada estril.


Agitar suavemente con un agitador de vidrio.
Ajustar el pH 7.2 +/- 0,2.
No tratar en autoclave.
Agregar 10 mL en tubos estril.
En el momento previo a la siembra adicionar a cada tubo; 0.1 mL de verde brillante al 0.1% y
0.2 mL de Solucin de yodo y yoduro de potasio al 40 %.

Caldo Rappaport- Vassiliadis.

Disolver 42.5 g del medio en 1 L de agua destilada estril.


Agite hasta disolver completamente, calentando eventualmente.
Ajustar el pH 5.2 +/- 0,1.
Agregar 10 mL en tubos estril.
Esterilizar en autoclave con cuidado a 115 C durante 15 minutos.
Retirar de la autoclave, dejar enfriar y refrigerar.
El medio de cultivo preparado puede almacenarse en refrigerador como mnimo durante 7
meses.

Agar Hektoen
Disolver 75 g del medio en 1 L de agua destilada estril.
Someter el medio a calor hasta que este complete su disolucin y ebulla.
Aadir 15 mg de Novobiosina por cada litro de medio (como solucin estril por filtracin)
aproximadamente a 50 C.
Ajustar el pH 7.7 +/- 0,1.
Agregar de 15 a 18 mL en cajas petri estriles.
Una vez solidificado el agar coloque las cajas en la cabina de flujo laminar para que la
superficie de este, si esta humedecida se seque.
No tratar en autoclave.
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Agar XLD.

Disolver 55 g del medio en 1 L de agua destilada estril.


Someter el medio a calor hasta ebullir y disolverse completamente.
Ajustar el pH 7.4 +/- 0,2.
No tratar en autoclave.
Agregar de 15 a 18 mL en cajas petri estriles.

Agar Bismuto sulfito.

Disolver 47.5 g del medio en 1 L de agua destilada estril.


Someter el medio a calor hasta ebullir y disolverse completamente.
Ajustar el pH 7.6 +/- 0,2.
No tratar en autoclave.
Agregar de 15 a 18 mL en cajas petri estriles.

Agar hierro triple azcar (TSI).

Disolver 65 g del medio en 1 L de agua destilada estril.


Someter el medio a calor hasta ebullir y disolverse completamente.
Ajustar el pH 7.4 +/- 0,2.
Agregar de 5 a 7 mL en tubos tapa rosca estriles.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Retirar de la autoclave, ubicar en posicin inclinada de tal manera que se forme bisel, dejar
enfriar y refrigerar.

Caldo Triptfano.
Disolver 16 g del medio en 1 L de agua destilada.
Agitar hasta disolver con un agitador de vidrio.
Ajustar el pH 7.2 +/- 0,2.
Agregar 5 mL en tubos estril.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Retirar de la autoclave, dejar enfriar y refrigerar.
Caldo MR-VP segn Voges-Proskauer.

Disolver 15 g del medio en 1 L de agua destilada.


Ajustar el pH 6.9 +/- 0,1.
Agregar de 5 a 7 mL en tubos tapa rosca estriles.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Agar citrato de Simmons.

Disolver 22.5 g del medio en 1 L de agua destilada estril.


Ajuste el pH 6.6 +/- 0,1.
Agregar de 5 a 7 mL en tubos tapa rosca estriles.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Retirar de la autoclave, colocar en posicin inclinada de tal manera que se forme bisel, dejar
enfriar y refrigerar.
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Agar Hierro lisina (LIA).

Disolver 34.5 g del medio en 1 L de agua destilada estril.


Someter el medio a calor hasta ebullir y disolver completamente.
Ajustar el pH 6.7 +/- 0,2.
Agregar de 5 a 7 mL en tubos tapa rosca estriles.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Retirar de la autoclave, colocar en posicin inclinada de tal manera que se forme bisel, dejar
enfriar y refrigerar.

Agar SIM.

Disolver 30 g del medio en 1 L de agua destilada.


Someter el medio a calor hasta ebullir y disolver completamente.
Ajustar el pH 7.3.+/- 0,2.
Agregar de 5 a 7 mL en tubos tapa rosca estriles.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Caldo nitratos.

Disolver 16. 5 g del medio en 1 L de agua destilada.


Ajustar el pH 7.2 +/- 0,1.
Agregar de 5 a 7 mL en tubos tapa rosca estriles.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Retirar de la autoclave, dejar enfriar y refrigerar.

Rojo de metilo.
Disolver 0.1 g de rojo de metilo en 300 mL de alcohol etlico y diluir con 200 mL de agua
destilada.
Mezclar y envasar en un recipiente de color mbar.
4.4.4. Soluciones.
Agua de peptona tamponada.
Solucin acuosa de verde brillante al 0.1%.
Solucin de yodo y yoduro potsico.
Solucin acuosa de hidrxido de potasio al 40%.
Solucin de alfa-naftol.
4.4.4.1. Preparacin.
Agua peptonada tamponada.
Disolver 10 g de peptona y 5 g de cloruro de sodio, 9 g de hidrgeno ortofosfato disdico, 1.5
hidrgeno ortofosfato potsico mediante calentamiento en 1 L de agua destilada.
Ajustar el pH final a 7.0 +/- 1.0.
Distribuir 225 mL en frascos con capacidad de 500 mL.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Retirar de la autoclave, dejar enfriar y refrigerar.
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Solucin acuosa de verde brillante al 0.1%.


Pesar 0.1 g de verde brillante en un recipiente de 100 mL, adicionar de 20 a 50 mL de agua
destilada estril.
Transferir la solucin a un matraz volumtrico.
Enjuagar con agua destilada estril y agregar hasta completar un volumen de 100 mL.
Solucin de yodo y yoduro de potasio al 40 %.
Pesar 1.0 g de yodo metlico.
Pesar 2.0 g de yoduro potsico.
Colocar las cantidades pesadas en un mortero, triturar y aadir pequeas cantidades de agua
mientras se tritura.
Pasar la mezcla a un matraz volumtrico.
Enjuagar el mortero y agregar al matraz el residuo generado hasta completar un volumen de
100 mL.
Solucin acuosa de hidrxido de potasio al 40%.
Disolver 40 g de hidrxido de potasio en 100 mL de agua destilada estril.
Mezclar y envasar en un recipiente de color mbar.
Solucin de alfa naftol.
Disolver 5 g de alfa naftol (punto de fusin 92,5 o mayor) en 100 mL de alcohol etlico
absoluto.
Mezclar y envasar en un recipiente de color mbar.

4.5. CONSIDERACIONES DE SALUD, SEGURIDAD Y MANEJO AMBIENTAL.

Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de proteccin.


Lavarse las manos antes y despus de manipular.
Desinfectar el rea de trabajo antes y despus de realizar una tarea.
No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el rea de trabajo.
No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los medios de
cultivos, reactivos, soluciones y materiales de trabajo.
Tener en cuenta los avisos de advertencia en lo relacionado con las lmparas UV. No ingresar
al rea mientras se encuentre encendida.
Al salir del laboratorio, verificar que las llaves del gas se encuentren cerradas.

4.6. PROCEDIMIENTO
La determinacin de Salmonella sp, se realiza en cuatro etapas: Enriquecimiento no selectivo,
enriquecimiento selectivo, siembra en placa en agar selectivo y diferencial, y por ltimo la
identificacin.
4.6.1. Enriquecimiento no selectivo
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Pesar 25 g de la muestra y agregar en un frasco con 225 mL de Caldo Lactosado o Caldo


Peptonado.
Cuando se analice leche en polvo, sustituya el Caldo Lactosado por agua destilada estril mas
5 mL de solucin verde brillante al 0.1%.
Homogeneizar la preparacin e incube a 35 C durante 24 +/- 2 horas.
Realizar los controles de medios de cultivo.
4.6.2. Enriquecimiento selectivo
Transferir desde el frasco de enriquecimiento no selectivo; 1 mL y agregar en un tubo con 10
ml de Caldo Tetrationato, adicionado con 0.2 mL de solucin de yodo y 0.1 mL de solucin de
verde brillante al 0.1%.
Incubar en el bao de agua con circulacin termosttica a 43 +/- 0.2 C durante 24 +/- 2 horas.
Adicionar 0.1 mL del cultivo obtenido del enriquecimiento no selectivo, en un tubo que
contenga 10 mL de caldo Rappaport- Vassiliadis e incubar a 42 +/- 2 C durante 24 +/- 2
horas en circulacin termosttica en el bao de agua.
Realizar los controles de medios de cultivo.
4.6.3. Siembra en placa con medios selectivos y diferenciales
A partir de cada uno de los cultivos obtenidos del enriquecimiento y selectivo, sembrar por
agotamiento en cajas con Agar XLD, Agar Bismuto sulfito y Agar Hektoen.
Realizar los controles de medios de cultivo.
Incubar las cajas a 35 C durante 24 +/- 2 horas. Si no se observa crecimiento, examinar las
cajas hasta cumplir las 48 horas de incubacin.
Luego del tiempo de incubacin, realizar la lectura de acuerdo a la morfologa de las colonias
tpicas de Salmonella sp. en los medios selectivos y diferenciales. Ver Tabla N 1.
Escoger 2 ms colonias tpicas de Salmonella sp, para iniciar la identificacin.
Realizar los controles de medios de cultivo.
4.6.4. Identificacin de Salmonella sp.
Realizar un frotis con cada una de las colonias presuntivas y realizar la tincin de Gram.
Respuesta a la tincin: Bacilo Gram negativo no esporulado.
Realizar la prueba oxidasa: Extienda con un palillo de madera; una colonia tpica sobre la
tirilla. La presencia de color azul o violeta indica un resultado oxidasa positivo. La ausencia del
viraje indica una prueba negativa. (Salmonella sp.: Oxidasa (+).
Inocular de una a tres colonias tpicas en tubos con Agar TSI, realizar esta operacin
sembrando por picadura la columna del medio y por estra la parte inclinada (Bisel); incubar a
35 +/- 2 C durante 24 +/- 2 horas.
Inocular de una a tres colonias tpica en tubos con Agar LIA, realizar esta operacin
sembrando por picadura doble la columna del medio y por estra la parte inclinada (Bisel);
incubar a 35 +/- 2 C durante 24 +/- 2 horas. Simultneamente inocular las mismas colonias en
cajas con agar nutritivo e incubar de la misma forma.
Luego de transcurridos los tiempos de incubacin, realizar la lectura e interpretacin con base
en la informacin de la Tabla N 2.
Retener todos los cultivos que muestren reacciones caractersticas para Salmonella sp. en los
medios TSI y LIA con el fin de realizar pruebas adicionales.
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Los cultivos con reaccin negativa en TSI, pero que presentan reaccin positiva en LIA, deben
trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA puede
detectar Salmonella arizonae y cepas atpicas de Salmonella sp. que degradan la lactosa o
sacarosa. Descarte solamente los cultivos que muestren reacciones negativas en ambos
medios.
Luego de transcurrido el tiempo de incubacin, someter las colonias inoculadas en agar
nutritivo a cada una de las siguientes pruebas bioqumicas:
Movilidad e Indol: Inocular con asa recta y por puncin central, tubos con 6 mL de agar SIM, incubar
a 35 C +/- 2 C 24 - 48 horas. Considerar positiva la prueba para movilidad, si se observa
crecimiento en la lnea de siembra difundido a travs de la superficie del medio (En forma de
sombrilla) y negativa si observa crecimiento del microorganismo slo en la lnea de siembra.
Produccin de Indol: Aadir al medio de 3 a 5 gotas del reactivo de Kovacs, si observa la formacin
de un anillo rojo cereza en la superficie la reaccin es positiva.
MR-VP (Rojo de Metilo Voges Proskauer): Inocular 2 tubos; cada uno con 6 mL de caldo MR-VP.
Incubar a 35 C +/- 2 C durante 24 48 horas; adicionar a uno de los tubos de 4 a 6 gotas de rojo de
metilo; un color rojo indica una reaccin positiva. Aadir en el otro tubo, 0.6 mL de solucin alfa naftol
al 5% y 0.2 mL de solucin acuosa de hidrxido de potasio al 40%. Agite el tubo cuidadosamente y
deje en reposo durante 10 minutos, considerar la reaccin como positiva si observa un color rojo en
el tubo.
Reaccin en agar Urea: Inocular un tubo de agar urea, realizar esta operacin sembrando por
picadura la columna del medio y por estra la parte inclinada (Bisel), incubar a 35 C +/- 2 C durante
24 - 48 horas; en caso de observar una coloracin rosado violeta, la reaccin es positiva.
Reduccin de nitratos: Inocular con asa recta, tubos con caldo nitrato, incubar a 35 C +/- 2 C
durante 24 - 48 horas. Aadir unos miligramos del reactivo de Gress y observar la coloracin. La
aparicin de un color rojo indica la presencia de nitritos en caso contrario aada unos miligramos de
polvo de Zinc para determinar la presencia de nitratos residual. Si se observa un color rojo indicara la
presencia de nitrato residual en el medio y por lo tanto la reaccin es negativa.
Realizar los controles de medios de cultivo.
Realizar la lectura e interpretacin con base en la informacin de la Tabla N 2. De acuerdo a las
lecturas e interpretaciones realizadas; reportar Salmonella sp. como ausencia/presencia en 25 g de
muestra.
Tabla N 1: Caractersticas morfolgicas de Salmonella sp, en Agar XLD, Hektoen y Bismuto
Sulfito.
AGAR XLD
Caractersticas
Amarillas, con zona amarilla alrededor, opacas;
halo de precipitacin.
Amarillas, con zona amarilla alrededor, opacas,
mucosas; halo de precipitacin.
Amarillas con zona amarilla alrededor, opacas, a
veces con centro negro

Microorganismo.
Escherichia coli, Enterobacter, Aeromonas.

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Klebsiella
Citrobacter (Cepa lactosa positiva)

Serratia, Hafnia
Amarillas con zona amarilla alrededor, opaca.
Rosadas con o sin centro negro, algunas pueden
Salmonella.
aparecer con centro negro o totalmente negras.
Algunos cultivos atpicos presentan colonias
amarillas con o sin centro negro.
Amarillas, con zona amarilla alrededor,
Proteus vulgaris; la mayora de proteus mirabilis
transparente, centro negro.
Del mismo color del medio de cultivo,
Shigella, providencia y Pseudomona
transparentes.
Salmonella typhi (xilosa positiva)
Anaranjadas, ligeramente opacas
AGAR HEKTOEN.
Caractersticas
Microorganismo.
Salmonella, Paracolobactrum, Proteus.
Azul verdosas o azul con o sin centro negro
brillante parcial o total.
Shigella, Providencia.
Verdes, hmedas, planas, transparentes.
Pseudomonas
Verdes hasta azuladas, planas, borde irregular.
Coliformes.
De color salmn, con halo de precipitado.
AGAR BISMUTO SULFITO.
Caractersticas
Microorganismo.
Centro negro, borde claro, precipitado negro con
Salmonella, con excepcin de Salmonella
brillo metlico alrededor de las colonias (ojo de
paratiphy A y Salmonella poyorum
conejo, ojo de pez).
Colonias pequeas verdes y hasta pardas, a
Bacterias coliformes, serratia, proteus y otras.
veces mucosas.

Tabla N 2: Reaccin de Salmonella sp.


Prueba
Oxidasa
Glucosa
Lactosa
TSI

Reaccin
Negativa
Positiva
Negativa
Alcalino/Acido con gas y H2S
Positivo (S. entiritides)
Negativo (S. tiphy)
Alcalino/Alcalino
Positivo/negativo
Negativa
Positivo
Negativo

Citrato
LIA
MR-VP
Urea
Movilidad
Indol

Tabla N 3: Fundamento de Agar TSI y LIA.


Agar Triple Azucar (TSI)
FUNDAMENTO:
La degradacin de azucares
(glucosa, lactosa y sacarosa) con
formacin de cido se manifiesta

Agar Hierro Lisina (LIA)


FUNDAMENTO:
La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos lisina
descarboxilasa positivas que la transforman en la amina
cadaverina. Esta produce un viraje al violeta del indicador
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por un cambio de color del


indicador rojo de fenol, que vira a
anaranjado rojizo a amarillo, o por
un viraje a rojo intenso en caso de
alcalinizacin. El tiosulfato es
reducido
por
algunos
microorganismos
a
cido
sulfhdrico, el cual reacciona con
la sal frrica produciendo sulfuro
de hierro de color negro.

prpura de bromocresol. Puesto que la descarbolxilacin solo


tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6,0), es necesario que
se produzca previamente la acidificacin del medio de cultivo
solo puede utilizarse para la diferenciacin de cultivos que
fermentan la glucosa.
Los microorganismos LD negativos pero fermentadores de
glucosa producen un viraje al amarillo de la tonalidad del medio
de cultivo. La incubacin prolongada puede ocasionar una
alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de cultivo y
se produce viraje al violeta. La formacin de H2S produce una
coloracin negra debido al H2S producido.
Las cepas del grupo Proteus, Providencia con excepcin de
algunas cepas de Proteus morgani desaminan a la lisina a cido
alfa ceto carbnico. Este forma compuestos pardo rojizos en la
regin superficial del medio de cultivo con la sal de hierro y bajo
la influencia del oxigeno.

4.7. BIBLIOGRAFA
AOAC Official methods of analysis (2005), subchapter 9, method 969.25, 995.20.

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