http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.

0103848

Korelasi

Molekuler

dan Pfcrt -K76T,

Marker, Pfmdr1 -N86Y

denganIn

Vitro Klorokuin

Tahan Plasmodium falciparum , Terisolasi di

Malaria

Endemik

Serikat

Assam

dan

Arunachal Pradesh, India Timur Laut

Sandeep Kumar Shrivastava ,

Ravi Kumar Gupta ,

Jagdish Mahanta,

Mohan Lal Dubey

Diterbitkan: 8 Agustus 2014

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0103848

Abstrak
Mekanisme chloroquine (CQ) resistensi di Plasmodium falciparum tidak jelas
dipahami.Namun, perlawanan CQ telah terbukti berhubungan dengan mutasi titik
di Pfcrt dan Pfmdr1 .Gen-gen ini mengkodekan untuk vakuola pencernaan

transmembran protein Pfcrt dan Pgh1, masing-masing. Penelitian ini dilakukan

untuk menganalisis asosiasi Pfcrt -K76T dan Pfmdr1 -N86Y mutasi dengan
resistensi CQ di Timur Laut India P. falciparum isolat. 115 P. falciparumisolat
menjadi sasaran in vitro CQ pengujian sensitivitas dan analisis PCR-RFLP
untuk Pfmdr1-N86Y

dan Pfcrt mutasi

-K76T. 100

isolat P.

falciparum yang

ditemukan resisten terhadap CQ oleh in vitro uji kepekaan (geometris berarti

EC 50 2.21 pM / L darah) sementara 15 yang ditemukan CQ sensitif (geometris
berarti EC 50 0.32 pM / L darah). Semua CQ isolat resisten menunjukkan
adanya Pfmdr1 dan Pfcrt mutasi. CQ isolat sensitif negatif untuk mutasi ini.Kuat
linkage disequilibrium diamati antara alel pada dua lokus ini ( Pfmdr1- N86Y
dan Pfcrt-K76T). Hasil

penelitian

menunjukkan

bahwa Pfmdr1 -N86Y

dan Pfcrt mutasi -K76T dapat digunakan sebagai penanda molekuler untuk
mengidentifikasi resistensi CQ di P. falciparum.Hasilnya membutuhkan evaluasi
CQ in vivo kemanjuran terapi di daerah endemik untuk strategi pengendalian
malaria yang lebih efektif.
pengantar
Malaria merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat yang utama dari negaranegara yang terkena malaria, termasuk India. Di India, sekitar 1,5 juta laboratorium
dikonfirmasi kasus malaria yang dilaporkan setiap tahun, dari yang 50% kasus
disebabkan oleh Plasmodium falciparum saja. Klorokuin (CQ) telah menjadi obat yang
paling efektif dalam pengobatan malaria non-rumit. Kenaikan tiba-tiba P. falciparum
kasus telah disebabkan oleh resistensi terhadap CQ, yang digunakan untuk waktu yang

lama sebagai baris pertama dari pengobatan kasus malaria [1] . Resistensi CQ dapat
menyebabkan morbiditas dan mortalitas yang tinggi di P. falciparum kasus, jika tidak
diobati tepat waktu. CQ bertindak dengan mengganggu metabolisme heme dalam
vakuola pencernaan dari P. falciparum hasil perlawanan dan CQ dari mengurangi
akumulasi obat oleh parasit [2] - [4] .
Berbagai perubahan genetik telah terbukti berhubungan dengan resistensi CQ.
Terutama, dua gen yang dikenal sebagai P. falciparum gen resistensi multidrug Pfmdr1 ,
yang kode untuk Pgh1, homolog P-glikoprotein, dan resistensi CQ transporter gen
Pfcrt , yang mengkode untuk resistensi CQ protein transporter telah diidentifikasi
sebagai kandidat potensial perlawanan CQ. Beberapa mutasi titik di Pfmdr1 gen pada
posisi 754, 1049, 3598, 3622 dan 4234 hasil perubahan asam amino pada kodon 86,
184, 1034, 1042 & 1246, masing-masing. Perubahan asam amino ini telah terbukti
berhubungan dengan resistensi CQ [5] - [12] . Dari beberapa mutasi dijelaskan, mutasi
pada kodon 86 (dari asparagin menjadi tirosin, N86Y), terlibat dalam kekhususan
substrat dari produk gen (P glikoprotein), tampaknya menjadi yang paling penting
karena hal ini dapat mengubah aktivitas pengangkutan protein [4] . Namun, beberapa
penelitian telah melaporkan kontras observasi berkenaan dengan peran Pfmdr1 mutasi
gen resistensi CQ [13] . Asia Tenggara CQ isolat resisten (K1 genotipe) telah
menunjukkan N86Y mutasi sementara CQ tahan isolat Amerika Selatan (7G8 genotipe)
negatif untuk N86Y, dan menunjukkan mutasi di posisi 184, 1034, 1042 dan 1246 [5] .
Mutasi dalam kodon 86 juga telah berkorelasi dengan ketahanan CQ di parasit yang
dipilih in vitro untuk ketahanan CQ [13] . Demikian pula, mutasi pada Pfcrt (kodon 74,
75, 76, 220, 271, 326, 371) juga telah terbukti berperan dalam in vitro resistensi CQ di

garis laboratorium P. falciparum dari seluruh dunia [14] - [16] . Pfcrt K76T mutasi belum
diamati pada responden CQ, dan karena itu, telah diterima sebagai penanda yang baik
molekuler untuk ketahanan CQ di P. falciparum [10] , [17] - [19] .

Malaria merupakan masalah kesehatan yang serius di India, terutama di Timur Laut.
Namun, sampai saat ini, peran mutasi pada gen Pfmdr1 dan Pfcrt belum diteliti dalam
munculnya P. falciparum resistensi CQ. Meskipun studi dari bagian lain dari India telah
melaporkan hubungan yang buruk resistensi CQ dengan mutasi gen ini, tetapi tidak ada
studi ekstensif telah dilakukan, namun [20] . Di P. falciparum daerah endemis, CQ
adalah dianjurkan pengobatan lini pertama untuk malaria tanpa komplikasi. Namun,
sekarang hari ini telah diubah untuk terapi kombinasi berbasis artesunat. Meskipun
demikian, di banyak daerah malaria yang terkena dampak CQ masih digunakan untuk
malaria non-rumit [11] , [21] . Oleh karena itu, pengamatan konstan dari makeup yang
ada populasi parasit genetik dan penentuan adanya resistensi CQ penting [22] .
Menjaga ini dalam pikiran, penelitian ini direncanakan untuk mengeksplorasi hubungan
antara in vitro CQ sensitivitas dan Pfcrt -K76T dan Pfmdr1 -N86Y mutasi pada sejumlah
besar isolat klinis P. falciparum dari India Timur Laut. Sejak isolat segar sering memiliki
campuran klon dari kedua CQ klon sensitif dan tahan, garis budaya-diadaptasi berasal
dari isolat sering merespon secara berbeda. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, isolat
klinis segar yang digunakan. Keterkaitan disequilibrium antara alel di kodon 86 dari
Pfmdr1 (N86 & 86Y) dan kodon 76 dari Pfcrt (K76 & 76T) gen juga dianalisis.

Bahan dan metode

Pernyataan etika
Komite Etik dari Pasca Sarjana Institut Pendidikan & Penelitian Medis, Chandigarh
menyetujui protokol penelitian. Etika kelembagaan Komite berpegang pedoman badan
pengawas nasional yaitu ICMR untuk konduktansi dari percobaan pada manusia dan
hewan.
daerah penelitian dan pengumpulan sampel
Penelitian ini dilakukan di desa-desa terpencil (Tinsukhia, Assam dan Lohit, Arunachal
Pradesh) dari Timur Laut India. Ini daerah memiliki perkebunan besar teh dan hujan
deras sepanjang tahun, dan karenanya malaria juga. Peserta penelitian adalah pekerja
perkebunan teh miskin, kurang akses siap untuk layanan medis. Persetujuan tertulis
diinformasikan diperoleh dari pasien. Untuk kepekaan obat dan analisis molekuler,
sekitar 5 ml darah dikumpulkan dari pasien tanpa gejala (berusia 25-45 tahun) yang
dinyatakan positif P. falciparum menggunakan pewarnaan Giemsa. Darah itu disimpan
dalam botol yang mengandung sitrat dan disimpan di pada 2 o -8 C. Sebanyak 115
sampel darah dimasukkan dalam penelitian ini, dengan 65 dari Assam dan 50 dari
Arunachal Pradesh. Sampel dengan beberapa infeksi yang dikeluarkan dari penelitian.
Penelitian ini dilakukan sebagai bagian dari pekerjaan PhD dari Mr. Sandeep K.
Shrivastava dan data yang dihasilkan selama penelitian ini telah disampaikan kepada
Komite Akademisi Institut, dan juga dapat diakses dari lembaga perpustakaan pusat
setelah izin karena dari pihak berwenang.

In vitro pengujian sensitivitas

Sebuah in vitro tes mikro (Mark III) protokol yang direkomendasikan oleh WHO [23] diikuti untuk
pengujian sensitivitas. CQ uji sensitivitas dilakukan segera setelah pengumpulan darah.Tes ini dianggap
sah dan diinterpretasi jika 10 persen dari parasit dalam kontrol baik (obat juga gratis) telah berkembang
menjadi skizon setelah 24-36 jam inkubasi. Isolat dianggap tahan jika mereka menunjukkan kematangan
skizon pada konsentrasi CQ 8 pmol / baik (1,6 umol / L darah). Untuk mengevaluasi respon obatparasit, nilai EC50 (50% penghambatan) dihitung dengan analisis Probit.

isolasi DNA
DNA diisolasi sesuai dengan metode Foley et al. [24] dengan sedikit modifikasi. Secara
singkat, sel-sel dari 100 ml darah utuh segaris dengan 1 ml es-dingin 5 mM
Na 2 HPO 4 (pH 8,0) dan pelet dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 10000 X g selama
10 menit. Langkah ini diulangi dua kali lagi. Akhirnya, pelet yang diperoleh kembali
ditangguhkan di 50 ml steril, air suling ganda. Pelet ulang ditangguhkan dipanaskan
dalam bak air mendidih selama 10 menit, diikuti dengan pendinginan sampai suhu
kamar dan sentrifugasi seperti di atas. Untuk analisis PCR, 3 ml supernatan digunakan
sebagai template DNA.

Deteksi N86Y mutasi di Pfmdr1 gen

Bersarang PCR, seperti dilaporkan sebelumnya dilakukan untuk memperkuat kodon 86
dariPfmdr1 [21] . Selama reaksi nest1, primer P1- 5'ATGGGTAAAGAGCAGAAAGA3
'dan P2-5'AACGCAAGTAATACATAAAGTCA3' digunakan untuk memperkuat wilayah
mengapit kodon 86. primer Bersarang P3 5'TGGTAACCTCAGTATCAAAGAA3 'dan P4
5'ATAAACCTAAAAAGGAACTGG3' digunakan untuk memperkuat produk PCR di nest2

reaksi.Di sarang 1, parameter PCR yang, denaturasi awal pada 94 C selama 3 menit,
diikuti dengan 45 siklus, masing-masing 30 detik pada 92 C, 45 detik pada 48 C, 1
menit pada 65 C diikuti dengan ekstensi akhir pada 65 C selama 5 menit. Dalam
sarang 2, hanya 20 siklus PCR dijalankan (Mastercycler, Eppendorf, USA).

Pembatasan Pencernaan dengan Apoi dan Afl III

produk akhirnya diperkuat menjadi sasaran pembatasan pencernaan dengan Afl III
(mutasi alel) dan Apo I (alel wild type) (New England Biolabs, UK) dengan
menginkubasi pada 37 C selama satu jam dengan satu unit masing-masing
enzim. Mencerna diselesaikan atas 3% agarose gel, diwarnai dengan etidium bromida,
dan hasilnya dicatat pada sistem dokumentasi gel (UVITEC, UK).

Deteksi mutasi K76T di Pfcrt gen

Untuk

mutasi

K76T,

selama

'CCGTTAATAATAAATACACGCAG3'

dan

nest1,
CRTP2

primer

CRTP1

5'GCATGTTACAAAACTATA

GTTACC3 'digunakan, dan untuk CRTD1 nest2: 5'TGTGCTCATGTGTTTAAACTT3' dan

CRTD2: 5'CAAAACTATAGTTACCAATTTT3 'digunakan[25] . Parameter PCR nest1
yang, denaturasi awal pada 95 C selama 5 menit diikuti dengan 45 siklus, masingmasing 30 detik pada 92 C, 56 detik pada 30 C, 1 menit pada 60 C diikuti dengan
ekstensi akhir pada 60 C selama 3 menit. Dalam nest2 PCR, denaturasi awal pada 95
C selama 5 menit diikuti dengan 25 siklus, masing-masing 30 detik pada 92 C, 30
detik pada 48 C, 30 detik pada 65 C diikuti dengan ekstensi akhir pada 65 C untuk

3 menit dilakukan. Produk PCR nested itu dicerna dengan Apoi seperti dijelaskan di
atas.

Analisis statistik
Semua percobaan diulang tiga kali untuk memvalidasi reproduktifitas tersebut. Hasilnya
dinyatakan sebagai sarana geometris dan dilaporkan dengan interval kepercayaan
95%. Untuk analisis statistik (Chi kuadrat test), SPSS 10 dan Epi-Info 6,04 (CDC,
Atlanta, GA, USA) yang digunakan. Analisis probit digunakan untuk menghitung CQ
EC 50 untuk setiap mengisolasi[22] , [26] . Linkage disequilibrium konstanta (D 'dan r 2 )
juga dihitung [27] - [28] .

hasil
Sebanyak 115 P. falciparum isolat yang digunakan dalam penelitian ini. The in vitro CQ
kerentanan isolat tersebut dilakukan sesuai dengan pedoman WHO dan isolat
dikategorikan sebagai strain sensitif dan resisten. Dari 65 isolat dari Assam, 50
ditemukan menjadi CQ tahan dalam in vitro uji sensitivitas dengan geometris rata
EC 50 nilai 1,06 umol / L darah (Chi 2 nilai 68,44, P <10 -5 dengan 95% interval
kepercayaan) , dan 15 menunjukkan kepekaan terhadap CQ dengan geometris rata
EC 50 0,32 umol / L darah (Chi 2 nilai 161,07, P <10 -5 dengan 95 interval%
confidence). Di sisi lain, semua 50 isolat yang dikumpulkan dari Arunachal Pradesh juga
menunjukkan tingkat tinggi resistensi CQ dengan geometris rata EC
darah

(chi 2 atau

nilai

tidak

dapat

dihitung

karena

50

dari 2,94 umol / L

keseragaman

satu

parameter). Secara total, 100 P. falciparum isolat yang ditemukan menjadi CQ tahan

(geometris berarti EC 50 2.21 umol / L darah) dan 15 isolat yang ditemukan CQ sensitif
(geometris berarti EC 50 0.32 umol / L darah) (Chi 2 nilai 161,07, P <10

-5

dengan 95

interval% confidence).
Untuk memastikan polimorfisme genetik yang mengarah ke resistance CQ, PCR
untuk Pfmdr1dan Pfcrt gen dilakukan. Untuk mengkonfirmasi status amplikon, produk
PCR dicerna dengan Apo1 dan Afl III. Pada PCR untuk Pfmdr1 , semua isolat
menunjukkan Pfmdr1- kodon 86 wilayah amplikon dengan ukuran produk dari 501
bp. Pada pencernaan dengan Apoi dalam kasus CQ isolat sensitif, Apoi dicerna
amplikon pada kodon 86, dan menghasilkan tiga fragmen dari 250 bp, 226 bp dan 25
bp, masing-masing. AFL III tidak mampu mencerna amplikon dari isolat sensitif ( Tabel
1 ; Gambar 1 ). Namun, Afl III dihasilkan dua fragmen 279 bp dan 222 bp, masingmasing dari amplikon dari semua isolat resisten CQ menunjukkan alel mutan pada
kodon 86 (86T). Apoi tidak mencerna amplikon dari strain resisten CQ di situs ini, dan
fragmen

476

bp

dan

25

bp

yang

dihasilkan

( Tabel

1 ; Gambar

2 ). PCR

bersarang Pfcrtgen menunjukkan amplikon dari 145 bp. Dalam kasus CQ isolat sensitif,
yang Apoi pencernaan amplikon menghasilkan dua fragmen 111 bp dan 34 bp masingmasing, menunjukkan adanya K76 alel pada kodon 76. Di sisi lain, mutan alel 76T
diamati di semua CQ tahan isolat dengan fragmen tercerna dari 145 bp ( Tabel
1 ; Gambar 3 ).

Download:

PPT

PowerPoint Slide

PNG

gambar

BERTENGKAR

gambar asli

Gambar 1. fotomikrograf Perwakilan menunjukkan hasil RFLP setelah pencernaan PCR

diamplifikasi produk dengan endonuklease, Apo1 dan AFI III untuk Pfmdr1gen (86Y) di klorokuin
tahan Plasmodium falciparum isolat.

Dalam foto, (M) adalah 100 bp DNA ladder; (C) adalah produk tercerna
sebagai kontrol;(P) adalah Apo1; (F) adalah Afl III dan (R1- R4) adalah
klorokuin resisten P. falciparumisolat.
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0103848.g001

Download:

PPT

PowerPoint Slide

PNG

gambar

BERTENGKAR

gambar asli

Gambar 2. fotomikrograf Perwakilan menunjukkan hasil RFLP setelah pencernaan PCR

diamplifikasi produk dengan endonuklease, Apo1 dan AFI III untuk Pfmdr1gen (N86) di klorokuin
sensitif Plasmodium falciparum isolat.

Dalam foto, (M) adalah 100 bp DNA ladder; (C) adalah produk tercerna
sebagai kontrol;(P) adalah Apo1; (F) adalah Afl III dan (ST1-ST4) adalah
klorokuin sensitif P. falciparumisolat.
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0103848.g002

Download:

PPT

PowerPoint Slide

PNG

gambar

BERTENGKAR

gambar asli

Gambar 3. fotomikrograf Perwakilan menunjukkan hasil RFLP setelah pencernaan produk

diperkuat PCR dengan endonuklease, Apo1 untuk Pcfrt gen (K76T) di klorokuin tahan dan
sensitif Plasmodium falciparum isolat.

Dalam foto, (M) adalah berat molekul penanda pUC mix8; (R1-R3) resisten
klorokuin P. falciparum isolat dan (ST1-ST2) adalah klorokuin sensitif P.
falciparum isolat.
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0103848.g003

Download:

PPT

PowerPoint Slide

PNG

gambar

BERTENGKAR

gambar asli

Tabel 1. Klorokuin Status sensitivitas dan kehadiran pfmdr1 -N86Y dan pfcrt -K76T mutasi pada P.
falciparum isolat dari India Timur Laut.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0103848.t001
Secara total, 100 CQ isolat resisten (dari in vitro ) menunjukkan mutasi pada kodon
86Y, sedangkan di CQ isolat sensitif, alel wild type (N86) diamati. Dalam isolat tersebut,
N86Y mutasi ditemukan terkait dengan in vitro CQ Status sensitivitas (Chi 2 tes, P <10 5

). The K76T mutasi juga ditemukan terkait dengan in vitro CQ kerentanan di semua

isolat (Chi 2 tes, P <10 -5 ). Hubungan disequilibrium (LD) antara alel dari dua lokus ini
( Pfmdr1- N86Y danPfcrt -K76T) dianalisis dengan menghitung konstanta LD D

' [23] dan r 2 [24] . Konstanta LD menunjukkan LD kuat antara lokus ini (D '= 1.00; r 2 =
1.00) ( Tabel 2 ).

Download:

PPT

PowerPoint Slide

PNG

gambar

BERTENGKAR

gambar asli

Tabel 2. Linkage disequilibrium antara alel dari Pfmdr1 kodon 86 (pada kromosom) lima
dan Pfcrt kodon 76 (pada kromosom tujuh).

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0103848.t002

Diskusi
Sejak laporan pertama di tahun 1950-an, resistensi CQ telah menyebar di
seluruh dunia [29] .Di India, kasus pertama perlawanan CQ dilaporkan pada
tahun 1973 dari kabupaten Karbi-Anglong di Assam [30] . Sejak itu, secara
bertahap menyebar Barat dan Selatan [11] . Tingkat cepat dari munculnya
resistensi CQ telah menjadi rintangan utama dalam pengendalian malaria.
Perkembangan teknik molekuler untuk identifikasi cepat dari parasit yang
resisten obat penting besar untuk epidemiologi, dan informasi pada pilihan
rejimen pengobatan antimalaria. Dalam penelitian ini, in vitro CQ pola

kerentanan dari 115 isolat yang dibandingkan dengan mutasi titik dalam
gen Pfmdr

1 dan Pfcrt. Perkembangan

fenotipe

resistensi

CQ

adalah

fenomena yang kompleks dan mungkin kumulatif di mana lebih dari satu gen
dengan satu atau lebih mutasi (s) / polimorfisme (s) mungkin berkontribusi
terhadap perkembangan resistensi CQ [4] .
Dalam penelitian ini, sensitivitas CQ assay dan DNA isolasi dilakukan dengan
isolat klinis segar P. falciparum , segera setelah pengumpulan darah. Terus
menerus in vitro kultur menginduksi pemilihan sub populasi parasit, dan
karenanya

tidak

benar-benar

mewakili

parasit

dari in

vivo infeksi [33] . Dalam penelitian sebelumnya, isolat budaya-diadaptasi

atau klon mutasi di Pfmdr1 digunakan [20] . Strain resisten CQ menjadi CQ
sensitif

penarikan

obat

atau ayat-ayat

yang

terus

menerus

selama

budaya [34] . Oleh karena itu, genotip isolat budaya-diadaptasi seperti itu
akan menyesatkan. Hasil in vitro uji kepekaan CQ menunjukkan bahwa dari
total 115 isolat klinis, 100 isolat resisten terhadap CQ sementara hanya 15
isolat menunjukkan kepekaan terhadap CQ. Menariknya, 100% dari isolat
dari Arunachal Pradesh dan 77% isolat dari Assam menunjukkan in
vitro resistensi CQ menunjukkan situasi yang mengkhawatirkan resistensi CQ
di P. falciparum .
Pada deteksi molekuler mutasi titik dalam Pfmdr1, hubungan yang kuat
diamati antara kodon 86Y mutasi dan in vitro resistensi CQ pada isolat
tersebut. Temuan

ini

menguatkan

baik

dengan

temuan

sebelumnya [12] , [17] , [19] , [32] . Dalam penelitian ini, semua CQ isolat
resisten menunjukkan perubahan mutasi pada posisi 86Y mengkonfirmasikan
peran mutasi ini dalam perlawanan CQ. Sangat mungkin bahwa alel 86Y
dari Pfmdr1 adalah relevansi fungsional. Sebuah mutasi titik di Pfmdr1 hasil
gen dalam perubahan asam amino pada kodon 86, 184, 1034, 1042 dan
1246. Namun, pengamatan kontras yang tersedia dalam hal ini. Telah
diamati bahwa isolat resisten Asia Tenggara CQ memiliki perubahan dalam
asam

amino

pada

kodon

86

dari

asparagin

menjadi

tirosin

(N86Y) [31] . Sementara tahan CQ isolat Amerika Selatan telah menunjukkan

perubahan mutasi pada kodon 184, 1034, 1042 dan 1246. Dari ini, mutasi
pada kodon 86 muncul menjadi penting karena terlibat dalam kekhususan
substrat dari produk gen (P glikoprotein) , dan karenanya dapat mengubah
aktivitas transportasi dari protein[31] , [38] . Demikian pula, karena mutasi
pada Pfcrt gen, mutasi yang melibatkan substitusi dari lisin (K) ke treonin (T)
pada posisi 76 (K76T) juga telah diamati secara konsisten dalam strain
resisten CQ [4] , [11] .
Analisis K76T mutasi di Pfcrt gen mengungkapkan asosiasi 100% dengan
yang di vitroresistensi CQ. Dalam penelitian sebelumnya, hubungan yang
signifikan (linkage disequilibrium, LD) antara alel Pfmdr1 86Y dan Pfcrt 76T
diamati [12] , [35] - [36] . Hubungan yang signifikan antara Pfmdr1 86Y dan
EC

50

dari CQ antara klon dengan Pfcrt alel 76T menunjukkan peran dari

kedua mutasi resistensi CQ. Hasil penelitian ini menguatkan dengan studi

sebelumnya,

yang

menunjukkan

hubungan

yang

signifikan

antara Pfmdr1 N86Y dan Pfcrt K76T [19] , [23] ,[37] .

Uji ini mengukur LD hubungan antara gen / alel pada kromosom yang
berbeda di bawah satu set ketat kondisi atau pengaruh eksternal (seleksi di
bawah tekanan obat) [21] - [22] . Untuk menganalisis LD antara alel pada
kodon 86 dari Pfmdr1 gen pada kromosom 5 dan alel pada kodon 76
dari Pfcrt gen pada kromosom 7, LD konstanta (D 'dan r
LD tinggi antara kedua lokus (D '= 1,00 dan r

) dihitung. Sebuah

= 1.00) diamati. Temuan ini

sesuai dengan temuan Adagu dan Warhurst, [38] , di mana nilai-nilai LD

tinggi yang diamati antara dua alel tersebut.CQ telah menjadi obat lini
pertama untuk pengobatan malaria tanpa komplikasi di Assam dan
Arunachal Pradesh. Dengan demikian, temuan kami dalam kombinasi
dengan

bukti

sebelumnya

menunjukkan

bahwa

LD

antara Pfcrt- K76T

dan Pfmdr1 alel -N86Y mungkin disebabkan karena pemilihan directional

kuat dari alel oleh tekanan obat CQ dalam populasi daerah penelitian. Hasil
ini

lebih

lanjut

menunjukkan

bahwa Pfmdr1 (N86Y)

dan Pfcrt (K76T)

berpotensi penanda berguna penilaian in vitro resistensi CQ di India Timur

Laut. Ini dapat digunakan untuk diagnosis cepat dan pengawasan resistensi
CQ dan mungkin memiliki potensi untuk digunakan dalam pemantauan in
vivo kemanjuran terapi CQ di daerah endemik malaria.

penulis Kontribusi
Disusun dan dirancang percobaan: SS JM MLD. Melakukan percobaan:
SS. Menganalisis data: SS RKG. Kontribusi reagen / bahan / alat analisis: SS
MLD. Menulis kertas: SS RKG.

Referensi
1. 1.Kebijakan Obat Nasional pada Malaria (2013) Direktorat Jenderal Vector Borne
Program Pengendalian Penyakit Nasional, Departemen Kesehatan dan
Kesejahteraan Keluarga, Pemerintah India. New Delhi: 1-15.
2. 2.Fitch CD (1970) Plasmodium falciparum pada monyet burung hantu: resistensi
obat dan kapasitas pengikatan klorokuin. Ilmu 169 (942): 289-90.
o

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

3.Douki JBL, Boutamba SDD, Zatra R, Edou SEZ, Ekomy H, et al. (2011)
Peningkatan prevalensi dari Plasmodium falciparum 86N genotipe Pfmdr1
antara bidang isolat dari Prancis ville, Gabon setelah penggantian
klorokuin dengan artemeter-lumefantrine dan artesunatmeflokuin. Menginfeksi Gen Evo 11: 512-517.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

4.Sanchez CP, Dave A, Stein WD, Lanzer M (2010) Pengangkut sebagai

mediator resistensi obat di Plasmodium falciparum . Int J Parasitol 40:
1109-1118.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

5.Foote SJ, Kyle DE, Martin RK, Oduola AM, Forsyth K, et al. (1990)
Beberapa alel dari gen multidrug-resistance terkait erat dengan resistensi
klorokuin di Plasmodium falciparum . Nature 17 345 (6272): 255-58.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

6.Basco LK, Le Bras J, Rhoades Z, Wilson CM (1995) Analisis pfmdr1 dan

kerentanan obat pada isolat segar Plasmodium falciparum dari subSahara Africa.Mol Biochem Parasitol. 74 (2): 157-66.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

7.Cox-Singh J, Singh B, Alias A, Abdullah MS (1995) Penilaian hubungan

antara mutasi titik tiga pfmdr1 dan resistensi klorokuin in vitro dari
Malaysia Plasmodium falciparumisolat. Trans R Soc Trop Med Hyg 89 (4):
436-7.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

8.Adagu IS, Dias F, Pinheiro L, Rombo L, do Rosario V, Warhurst DC

(1996) Guinea-Bissau: Asosiasi resistensi klorokuin dari Plasmodium
falciparum dengan Tyr86 alel dari gen beberapa obat-resistance
Pfmdr1. Trans R Soc Trop Med Hyg 90 (1): 90-91.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

9.Duraisingh MT, Drakeley CJ, Muller O, Bailey R, Snounou G, et

al. (1997) Bukti untuk seleksi untuk tirosin-86 alel dari gen pfmdr 1
dari Plasmodium falciparum oleh klorokuin dan amodiakuin. Parasitol 114:
205-11.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

10.Chaijaroenkul W, Ward SA, Mungthin M (2011) Sequence dan ekspresi

gen resistensi klorokuin transporter (pfcrt) di asosiasi in vitro resistensi
obat dari Plasmodium falciparum . Malaria J 10: 42.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

11.Murambiwa P, Masola B, Govender T (2011) Anti-malaria formulasi

obat dan sistem pengiriman baru: Ulasan A. Acta Tropica1 18: 71-79.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

12.Atroosh WM, Mekhlafi HM, Mahdy MAK, Surin J (2012) Deteksi pfcrt
dan pfmdr1point mutasi sebagai penanda molekuler resistensi obat
klorokuin, Pahang, Malaysia.Malaria J 11: 251.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

13.Pickard AL, Wongsrichanalai C, Purfield A, Kamwendo D, Emery K, et

al. (2003) Resistensi terhadap antimalaria di Asia Tenggara dan
polimorfisme genetik padapfmdr1 . Antimicrob Agen Chemother 47 24182423.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

14.Fidock DA, Nomura T, Talley AK (2000) Mutasi pada P.

falciparum pencernaan vakuola transmembran protein Pfcrt dan bukti
untuk peran mereka dalam perlawanan klorokuin.Mol Sel 6 (4): 861-71.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

15.Sidhu AB, Verdier-Pinard D, Fidock DA (2002) resistensi Klorokuin

di Plasmodium falciparum parasit malaria yang diberikan oleh mutasi
pfcrt. Ilmu 298 (5591): 210-3.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

16.Vathsala PG, Pramanik A, Dhanasekaran S (2004) terjadinya luas

dari Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (Pfcrt) gen
haplotipe SVMNT di P. falciparum malaria di India. Am J Trop Med Hyg 70
(3): 256-9.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

17.Ojurongbe O, Ogungbamigbe TO, Beyioku AFF (2007) deteksi cepat

dari Pfcrt dan Pfmdr1 mutasi pada Plasmodium falciparum isolat oleh fret
dan di respon vivo terhadap klorokuin di antara anak-anak dari Osogbo,
Nigeria. Malaria J 6: 41.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

18.Mekhlafi AMA, Mahdy MAK, Mekhlafi HM (2011) frekuensi tinggi

dari Plasmodium falciparum klorokuin resistance penanda (pfcrt T76
mutasi) di Yaman: Kebutuhan mendesak untuk memeriksa kembali
kebijakan obat malaria. Parasit vect 4: 94.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

19.Veiga MI, Ferreira PE, Jornhagen L (2011) polimorfisme Novel

di Plasmodium falciparum gen transporter ABC berhubungan dengan
resistensi obat ACT antimalaria utama. PLoS ONE 6 (5): e20212.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

20.Bhattacharya PR, Pillai CR (1999) asosiasi yang kuat, tetapi korelasi

tidak lengkap, antara resistensi klorokuin dan variasi alel pada gen pfmdr1 dari Plasmodium falciparum isolat dari India. Ann Trop Med Parasitol 93
(7): 679-84.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

21.Ranjitkar S, Schousboe ML, Thomsen TT (2011) Prevalensi penanda

molekuler resistensi obat anti-malaria di Plasmodium
vivax dan Plasmodium falciparum di dua kabupaten Nepal. Malaria J 10:
75.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

22.Alam MT, Souza DK, Vinayak S (2011) menyapu Selektif dan garis
keturunan genetikPlasmodium falciparum obat alel -tahan di Ghana. J
Infect Dis 203: 220-227.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

23.Organisasi Kesehatan Dunia (2001) in vitro mikro-test (mark III) untuk

penilaian respon dari P. falciparum terhadap klorokuin, meflokuin, kina,
amodiakuin, sulfadoksin / pirimetamin dan artemisinin.

24.Foley M, Ranford-Cartwright LC, Babiker HA (1992) metode cepat dan

sederhana untuk mengisolasi DNA malaria dari sampel jari tusukan
darah. Mol Biochem Parasitol 53 (2): 241-4.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

25.Djimd A, Doumbo OK, Cortese JF (2001) Sebuah penanda molekuler

untuk klorokuin malaria falciparum resisten. New Engl J Med 344 (4): 25763.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

26.Wernsdorfer & Wernsdorfer (1995) Evaluasi in vitro tes untuk penilaian

respon obat diPlasmodium falciparum . Mitt sterr Ges Trop Med Paras
17: 221-228.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

27.Smith JM (1968) Evolusi Genetika. Oxford University Press, Oxford.

28.Bukit WG, Robertson A (1968) Efek dari perkawinan sedarah pada

lokus dengan keuntungan heterozigot. Genetika 60 (3): 615-28.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

29.Moore DV, Lanier JE (1961) Pengamatan pada dua Plasmodium

falciparum infeksi dengan respon abnormal terhadap klorokuin. Am J Trop
Med Hyg 10: 5-9.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

30.Sehgal PN, Sharma MID, Sharma SL (1973) Resistensi terhadap

klorokuin di malaria falciparum di Assam Negara, India. J Com Dis 5 (4):
175-80.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

31.Choi KH, Chen CJ, Kriegler M, Roninson IB (1988) Pola diubah

resistansi silang di multidrug-resistant sel manusia hasil dari mutasi
spontan di MDR1 (P-glikoprotein) gen.Sel 53 (4): 519-29.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

32.Figueiredo P, Benchimol C, Lopes D (2008) Prevalensi pfmdr1, pfcrt,

pfdhfr dan pfdhps mutasi terkait dengan resistensi obat, di Luanda,
Angola. Malaria J 7: 236.
Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

33.Le Bras J, Deloron P, Ricour A (1983) Plasmodium falciparum :

kepekaan obat in vitro isolat sebelum dan sesudah adaptasi budaya terus
menerus. Exp Parasitol 56 (1): 9-14.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

34.Walliker D, berburu P, Babiker H (2005) Pusat parasit malaria yang

resistan terhadap obat. Acta Trop 94 (3): 251-9.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

35.Costanzo MS, Kyle M, Brown D, Hart L (2011) Pusat Trade-offs dalam

Evolusi dihydrofolate Reductase dan Resistance Narkoba di Plasmodium
falciparum . PLoS ONE 6 (5): e19636.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

36.Ghanchi NK, Ursing J, Beg M (2011) Prevalensi resistensi terkait

polimorfisme difalciparum Plasmodium bidang isolat dari Pakistan
selatan. Malaria J 10: 18.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

37.Dajem SM, Ahmed A (2010) Analisis mutasi gen yang terlibat dalam
resistensi klorokuin di Plasmodium falciparum parasit diisolasi dari pasien
di barat daya Arab Saudi. Ann Saudi Med 30 (3): 187-192.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google

38.Adagu IS, Warhurst DC (2001) Plasmodium falciparum : linkage

disequilibrium antara lokus dalam kromosom 7 dan 5 dan chloroquine
tekanan selektif di Nigeria Utara.Parasitol 123 (3): 219-24.

Lihat Pasal

PubMed / NCBI

beasiswa Google