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TEMAS 7 Y 8
MANIPULACIONES
GENTICAS
(in vitro e in vivo )
Prof. Mara Ball
Semestre A-2012
Clonacin
Amplificacin
de la
secuencia de
ADN clonada
Purificacin de plsmidos
Lisis alcalina
Ultracentrifugacin
Cromatografa
Purificacin de plsmidos
Lisis alcalina
Purificacin de plsmidos
Cromatografa
Ultracentrifugacin
Vectores de clonacin
Clonacin y propagacin del ADN
gen de inters
ADNc genotecas
Clulas receptoras
Clulas receptoras
Para replicarse, el vector debe ser introducido en una clula
receptora.
La escogencia de la clula receptora depende del vector
utilizado.
Clulas procariotas
E. coli bacteria ms utilizada.
Tiempo de generacin corto, fciles de manipular, poco costosas,
no patgenas, manipuladas genticamente para evitar
diseminacin, res-, recA-. Otras especies: Bacillus subtilis,
Pseudomonas.
Clulas eucariotas
Clulas animales en cultivo, levaduras, plantas, insectos, humanas.
Manipulacin ms compleja, costosas. Vectores deben poseer
origen de replicacin eucariota. Se utilizan para estudios de
expresin y regulacin gentica in vivo, para expresar protenas
con modificaciones post-traduccionales.
Clulas receptoras
Clulas receptoras
Enzimas de restriccin
Son protenas homodmericas y reconocen secuencias
de ADN palindrmicas.
Extremos cohesivos
Enzimas de restriccin
Enlace fosfodister
entre un extremo 3OH
y un extremo 5PO4
de 2 nucletidos
Tipos de vectores
1. PLSMIDOS
Primera generacin: naturales. F, R, ColE1
Segunda generacin: pBR322
Tercera generacin: pUC, pBluescript
Cuarta generacin y otros
Fragmentos de aproximadamente 10-12 Kb
Plsmidos
Segunda
generacin
Tercera
generacin
Complementacin Alfa
El gen LacZ codifica un polipptido
de 1029 aminocidos. Este polipptido
forma un tetrmero funcional.
La polimerizacin depende de la
presencia de los 50 primeros
aminocidos (la regin N-Terminal).
La supresin de los 50 primeros
aminocidos
genera
un
pptido
(Omega o delta M15) incapaz de
polimerizar y no muestra actividad
enzimtica.
DH5: F- endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 deoR nupG lacZdeltaM15 hsdR17
Complementacin Alfa
Si se introduce la secuencia
que
codifica
el
pptido
faltante (pptido alfa), el
pptido omega se vuelve
funcional.
Si esta secuencia es portada
por un plsmido, ocurre la
complementacin alfa .
Cepas de E. coli expresan
constitutivamente nicamente
el
pptido
Omega.
No
muestran ninguna actividad
enzimtica (Lac-).
Tipos de vectores
2. FAGOS
El fago lambda tiene un tamao de ~50 kb, est constitudo de una molcula
de ADN db, se replica en E. coli en forma ltica o lisognica .
Fragmentos hasta 25 Kb
Fago
Fragmentos hasta 25 Kb
EMBL3, gt10, gt11, ZAP
Insertos pequeos (5 kb) o grandes (10-25 Kb)
Clonacin eficiente y fcil mantenimiento del ADNc y libreras
genmicas
Fago
Vector: Fago
Encapsidacin in vitro de
Encapsidacin in vitro de
Mutante no produce colas
Tipos de vectores
3. CSMIDOS
Fragmentos hasta
50 Kb
Tipos de vectores
4. CROMOSOMAS
ARTIFICIALES DE
BACTERIAS (BAC)
Fragmentos hasta
300 kb
Tipos de vectores
4. CROMOSOMAS
ARTIFICIALES DE
BACTERIAS (BAC)
Tipos de vectores
5. CROMOSOMAS
ARTIFICIALES DE
LEVADURA (YAC)
Clonacin en un pYAC
Tipos de vectores
6. CROMOSOMAS
ARTIFICIALES
HUMANOS (HAC)
Microcromosomas (6-10
megabases).
47 cromosomas, uno muy pequeo.
Actan como nuevo cromosoma en
la poblacin de clulas humanas.
Permiten la introduccin de
nuevos genes humanos en las
clulas.
Utilizados en terapia gnica.
Vector transbordador
Origen de replicacin
procariota.
Origen de replicacin
eucariota.
Marcador de seleccin
en procariotas.
Marcador de seleccin
en eucariotas.
Promotor eucariota.
Vector transbordador
Origen de replicacin
procariota.
Origen de replicacin
eucariota.
Marcador de seleccin en
procariotas.
Marcador de seleccin en
eucariotas.
Promotor eucariota.
Vectores de expresin
Vector de expresin
Genotecas
Conjunto de fragmentos de ADN clonados que representan el
genoma completo de un organismo (librera Genmica) o los genes
transcritos en un tipo de clula particular (librera de ADNc).
Genotecas
Genoteca de ADN Genmico
La coleccin de clones que incluyen todas las secuencias de
ADN de una especie determinada se denomina biblioteca
de ADN genmico, o simplemente biblioteca genmica
(Genoteca).
Genotecas
BamHI
BamHI
EcoRI
Promotor
Exn 1
HindIII
Exn 2
BamHI
Exn 3
Pre-ARNm
ARNm
Purificacin ARNm poliA+
EcoRI
Sntesis de ADNc in vitro
Plsmido recombinante ADNc
HindIII
Librera Genmica
Los fragmentos de ADN son generados con enzimas de restriccin.
Los fragmentos obtenidos se ligan con el vector apropiado.
Se construyen generalmente en fagos vectores en lugar de plsmidos.
La eficiencia de transformacin de un fago vector es 1.000 veces
mayor que la de un plsmido.
ln(1-f)
N=nmero requerido de clones
P=probabilidad de encontrar en la biblioteca el fragmento deseado
f=fraccin del genoma contenida en un solo clon
Organismo
Tamao
del genoma
Tipo de
Vector
Tamao
de inserto
Tamao de
la biblioteca
(clones)
Bacterias
4x106 bases
Plsmido
4kb
0.99
4.6x103
Lambda
18kb
0.99
1.0x103
Csmido
40kb
0.99
458
BAC
300kb
0.99
59
Plsmido
4kb
0.99
3.5x106
Lambda
18kb
0.99
7.7x105
Csmido
40kb
0.99
3.5x105
BAC
300kb
0.99
4.6x104
Mamferos
3x109 bases
Los valores mostrados aqu del tamao de los genomas de bacterias y mamferos son ejemplos
utilizados solo para el propsito de estos clculos. El tamao de los genomas vara ampliamente de un
organismo a otro. Los tamaos de los insertos tambin varan.
Ejemplo:
Genoma humano = 3.2 x 106 kbp = 3.2 x 109 bp
Vector Lambda puede aceptar insertos de aprox. 17 Kbp
N = ln (1 0.99)
ln [1 (1.7 x 104 bp inserto)
3.2 x 109 bp genoma]
N = 8.22 x 105 placas requeridas en la librera
Usualmente se hacen libreras genmicas de 2 2.5x el tamao de lo
requerido usando esta ecuacin.
Libreras de ADNc
El ARNm representa genes que son activamente transcritos
(o expresados) en algn momento dado en un tipo particular
de clula.
Biblioteca de ADNc, o Biblioteca de Expresin: la coleccin
de clones que incluyen todas las secuencias de ADNc de
todos los ARNm de un tipo celular determinado.
El ARNm eucariota: poliadenilado y con intrones que deben
ser removidos. Este es el punto de partida!
1. Southern blot
1. Southern blot
2. Deteccin inmunolgica
mediante anticuerpos
Genoteca de expresin
4. Complementacin de funciones
Maxam-Gilbert (qumico)
Sanger (Dideoxy, enzimtico)
Mtodos alternativos (pirosecuenciacin, arreglos cclicos,
hibridizacin, microelectroforesis, espectrometra de masa,
nanoporos, )
dideoxyribonucletidos
trifosfatos
dideoxy
Mtodo de Sanger
(Dideoxy)
Secuenciacin
Secuenciacin
Secuenciacin
Electroferograma
Pirosecuenciacin
A diferencia del sistema de Sanger, capaz de resolver 67.000 bases cada hora, el
mtodo 454 puede determinar la secuencia de 20 millones en 4,5 horas, lo cual
abarata enormemente el costo del proceso.
Slo puede generar unas pocas decenas de pares de bases por experimento. Muy
valiosa cuando se quiere generar muchas secuencias cortas lo ms rpidamente
posible.
Pirosecuenciacin
Se basa en la deteccin de la actividad de la ADN polimerasa con otra enzima
quimioluminescente.
Secuenciacin de un ADN simple cadena sintetizando la complementaria un
par de bases a cada vez, y detectando cual base es aadida en cada paso.
El molde est inmovilizado y las soluciones de A, C, G, y T son aadidas y
removidas despus de la reaccin, secuencialmente.
La luz es producida solo cuando la solucin de nucletidos complementa el
primer par de bases desapareado del molde.
La secuencia de soluciones que produce seales de quimioluminescencia lleva a
la determinacin de la secuencia del molde.
Pirosecuenciacin
Etapas del proceso:
Un cebador especfico se une a una cadena de ADN sencilla en presencia de dNTPS,
ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa as como de los sustratos APS
(adenosina 5 fosfosulfato) y luciferina.
El primero de los cuatro dNTPs se aade a la reaccin. La ADN polimerasa cataliza su
incorporacin a la cadena; si este dNTP es complementario de la secuencia del ADN
molde se libera PPi en una cantidad equimolar a la cantidad de nucletido incorporado.
Pirosecuenciacin
La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente el PPi en ATP en presencia de APS (adenosina 5
fosfosulfato). Este ATP media la conversin de luciferina en oxiluciferina por parte de la
luciferasa, producindose luz visible en intensidad proporcional a la cantidad de ATP. Esta luz es
detectada por una cmara y se visualiza en el pirograma como un pico, siendo la altura del pico
proporcional al nmero de nucletidos incorporados.
La apirasa degrada de forma continua tanto el ATP como los dNTPs no incorporados apagando
de esta forma la emisin de luz y regenerando las condiciones para que pueda ser aadido un
nuevo nucletido en la reaccin.
Pirosecuenciacin
Su bajo costo y velocidad, que permiti a la
compaa secuenciar el cdigo de un adenovirus en
el ao 2003 en un slo da, plantea la posibilidad
de secuenciar genomas completos de forma
rutinaria, lo cual es de especial inters en
biomedicina.
El genoma de James Watson, co-descubridor de
la estructura del ADN, fue descrito y publicado
mediante esta tcnica.
Pirosecuenciacin
Anlisis de la secuencia
complementarios
4 dNTP
ADN Polimerasa (Taq polimerasa )
Iones (Mg++)
de
cada
Elongacin
300)
(72-75C/30-
Terminacin (72-75C/3-10)
Variantes de la PCR
PCR asimtrica
PCR en colonia
PCR degenerada
PCR in situ
PCR inversa
PCR larga
Multiplex PCR
Nested PCR
Variantes de la PCR
PCR-Elisa
PCR-RFLP (PCR restriction fragment length polymorphism)
PCR-SSCP (PCR-single stranded conformational polymorphism)
QC-PCR (quantitative competitive-PCR)
Real time-PCR
Rep-PCR (repetitive extragenic palindromic-PCR)
El molde es ADNc
PCR in situ
PCR de colonias
Oncologa
Northern Blot
RT-PCR, PCR en tiempo real
Fusiones gnicas
MicroArray o microarreglos
Estudio de la
regulacin de la
expresin gentica
(in vitro)
ADN: Southern Blot
ARN: Northern Blot
Genes reporteros
(in vivo)
Genes reporteros
lacZ (B-gal), gus (glucuronidasa), lux (luciferasa), gfp (protena
fluorescente verde GFP)
LUX
GFP
GUS
Genes reporteros
GFP
ALBA
Genes reporteros
Genes reporteros
Fusiones gnicas
Fusiones transcripcionales
Transcripcin del gen reportero bajo
el control de un promotor. GR posee
su propio sitio de iniciacin de
traduccin. Traduccin del gen
mutado se para antes del GR y se
reinicia en el GR. Dos productos:
protena truncada y protena del GR
Fusiones traduccionales
Transcripcin y traduccin del GR
bajo el control del promotor. No hay
codn de terminacin. GR no posee
sitio de iniciacin de traduccin.
Traduccin contina directamente del
gen mutado al GR. Un producto:
protena hbrida con el N-ter de la
protena del gen truncado y C-ter de
la protena del GR
Fusiones
Transcripcional
(opernica)
Traduccional
(gnica)
Fusiones gnicas
Fusiones opernicas:
Transposn derivado del fago
Mu: MudJ
Fusiones gnicas:
Transposn derivado del fago
Mu: MudK
Microarreglos de ADN
Chip de ADN (del ingls DNA microarrays) es una superficie slida a la cual se unen
una serie de fragmentos de ADN (vidrio, plstico e incluso chips de silicio).
Los arreglos de ADN son utilizadas para analizar la expresin de genes,
monitorizndose los niveles de miles de ellos de forma simultnea.
Microarreglo de ADN: portaobjeto de vidrio en la cual se ha colocado mediante un
robot cientos de muestras de ADN, ADNc u oligonucletidos de identidad conocida y de
manera ordenada. La gota es menor de 200 micrones y en el orden de sub-nanomoles.
Microarreglos de ADN
Cada
punto
del
microarreglo
contiene
mltiples
secuencias
idnticas de ADN.
La secuencia de ADN de cada punto
es nica.
Cada punto representa un gen.
Biochip
Tipos de microarreglos
1. Microarreglo para anlisis de expresin: muestra inmovilizada es ADNc
derivado de ARNm de genes conocidos. Ej. Genes de un tejido normal y
de un tejido enfermo. Marca ms intensa del tejido enfermo si el gen es
sobre-expresado en la condicin enferma.
2. Microarreglo para anlisis de mutaciones: se utiliza ADN genmico.
Genes pueden diferir en un nucletido.
3. Microarreglo para hibridizacin comparativa del genoma: se utiliza
para la identificacin del aumento o disminucin de fragmentos
importantes del cromosoma (codificando genes involucrados en una
enfermedad).
Polimorfismo
Presencia en una poblacin de al menos dos variantes allicas de
un locus gentico
Anlisis: polimorfismo del ADN (polimorfismo genotpico) o del
producto proteico (polimorfismo fenotpico)
RFLP
Microsatlites
Microsatlites
PCR-RFLP
Combina la amplificacin mediante PCR y
la digestin con enzimas de restriccin.
Cebadores especficos.
Polimorfismo: inserciones, deleciones y
mutaciones puntuales que afecten a los
sitios de restriccin.
Estudios de
poblaciones.
filogenia,
gentica
de
AFLP
(Polimorfismo en
la Longitud de los
Fragmentos
Amplificados)
Marcadores Moleculares
Aplicaciones
1. Estudio de la diversidad gentica.
2. Obtencin de huellas genticas (fingerprinting) genmicas de
individuos, variedades y poblaciones.
3. Anlisis de la estructura y diversidad gentica en poblaciones naturales.
4. Establecimiento de relaciones filogenticas entre diferentes individuos y
especies.
5. Construccin de mapas genticos de alta cobertura genmica.
6. Localizacin de genes de inters econmico.
7. Mapeo de caractersticas de herencia cuantitativa QTL (Quantitative
Trait Loci ).
8. Relaciones de paternidad y parentesco.
9. Procesos que ocurren en las poblaciones: migracin, deriva gentica.
Clonacin de mamferos
DOLLY
Animales transgnicos
POLLY
Izquierda:
clon transgnico de Polly.
Se incorpor el gen para
una protena humana, el
factor IX (coagulacin)
Terapia gnica
Somtica
Germinal
Terapia gnica
In-vivo
Ex-vivo
Terapia gnica
Vectores para
Terapia Gnica
Vector: Adenovirus
replicar
recombinar
expresar
mutar
reprimir
silenciar
GEN
dominar
transmitir
detectar
multiplicar
transferir
fusionar
modificar
clonar
Microbiologa
Bioqumica
Inmunologa
Biologa
Molecular
Biologa
Celular
Vegetales
Gentica
Biotecnologa
Molecular
Drogas
Vacunas
Diagnstico
Investigacin
Ingeniera
Qumica
Animales