INTRODUCCIN

A mediados de la dcada de 1980 se introdujo el diagnstico del VIH para identificar

individuos con sospecha de infeccin por dicho virus. Durante estos 25 aos, las pruebas
diagnsticas han tenido un gran desarrollo como consecuencia del progreso en los
conocimientos de los mecanismos inmunopatognicos, de la relacin hospedador-virus,
de los mecanismos de replicacin vrica, y de la respuesta inmune que sucede en los
individuos infectados en el curso de la infeccin. Los adelantos en la tecnologa,
principalmente los avances en tcnicas de biologa molecular a travs de la incorporacin
de la PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa), sin duda han contribuido a
implementar mtodos de laboratorio de inestimable valor para el manejo del paciente VIH.
En este captulo se revisarn los principales mtodos disponibles para el diagnstico de
laboratorio de la infeccin por el VIH, y para la determinacin de las resistencias a los
antirretrovirales y del tropismo viral.
TCNICAS DE DETECCIN DE INFECCIN VIH
TCNICAS DE SCREENING: ELISA
La calidad diagnstica del ELISA viene determinada por una cuidada seleccin del punto
de corte o cut-off y sobre todo por la base antignica utilizada que captura los
anticuerpos especficos presentes en la muestra. Las primeras tcnicas se desarrollaron
en 1985, usaban como base antignica un lisado vrico, y se detectaban los anticuerpos a
los 40 das de la infeccin 1. En 1987 se introdujeron las tcnicas de segunda generacin
que incorporaban como antgenos protenas recombinantes y pptidos sintticos, y
nuevos antgenos que permitieron detectar anticuerpos frente a todos los subtipos M, y los
grupos N y O, y frente a VIH-2. Se consigui incrementar la sensibilidad, detectndose los
anticuerpos a los 33-35 das tras la infeccin 4. En 1994 las tcnicas de ELISA adquirieron
el formato en sndwich, se denominaron ELISA de tercera generacin, detectan
anticuerpos de clase IgG e IgM, y por ello se acorta el perodo ventana a 22 das 4. Estas
tcnicas se han modificado utilizando sustratos fluorescentes (ELFA) o formatos de
quimioluminiscencia, lo que permite la automatizacin, el procesamiento de un gran
nmero de muestras, la reduccin de manipulacin y de los costes 5. Recientemente se
han introducido las tcnicas de cuarta generacin que permiten la deteccin simultnea
de anticuerpos y antgeno p24, reducindose el perodo ventana a 13-15 das, es decir, se
aproxima casi a la deteccin de ARN-VIH4.

Con estas tcnicas la sensibilidad se incrementa hasta un 99,9% lo que reduce la

posibilidad de un resultado falsamente negativo, esto indica que en principio un resultado
negativo no requiere confirmacin ni seguimiento serolgico, excepto en personas con
alto riesgo de adquirir la infeccin6. Hay que tener en cuenta, que se pueden producir
falsos negativos en fases iniciales de la infeccin hasta que se produce la seroconversin,
en estadios finales de la misma, en pacientes con tratamiento inmunosupresor,
trasplantados de mdula sea, personas con alteraciones de linfocitos B, en pacientes
con hipogammaglobulinemia, infectados por tipos de VIH no detectados por la base
antignica, o por un error en la identificacin de la muestra 5. La especificidad se sita
entre el 99,5% y 99,9% y se pueden producir falsos positivos como consecuencia de
reconocimientos no especficos de sustancias del suero por los antgenos vricos de la
base antignica. Los factores que pueden estar implicados en la falsa reactividad son la
base antignica utilizada, la inactivacin de las muestras por calor, los errores en la
identificacin de las mismas, y la hemlisis, aspecto lipdico y contaminacin microbiana
del suero. Se han descrito falsos positivos en multparas, hemodializados,
multitransfundidos, pacientes con hepatitis alcohlica, personas con infecciones agudas
por otros virus como herpes y VHB, vacunados frente a VHB e Influenzavirus, pacientes
con enfermedades autoinmunes, lupus eritematoso diseminado, y personas con
anticuerpos frente a diversos antgenos HLA1,5,6. Debido a la posibilidad de estas
reactividades no especficas hay que recurrir a las pruebas confirmatorias para verificar
los resultados positivos de las tcnicas de screening.
TCNICAS RPIDAS
A veces se pueden plantear situaciones urgentes y por ello se han desarrollado tcnicas
de ejecucin rpida, que no necesitan aparataje y se pueden interpretar a simple vista. Se
basan en la aglutinacin de partculas sensibilizadas de ltex, o eritrocitos, tcnicas de
Dot-inmunoensayo y de inmunocromatografia capilar7. La sensibilidad oscila entre el 8599%8,9, y la especificidad entre el 93-99%. Se suelen producir falsos negativos en

muestras con bajo nivel de anticuerpos o estadios recientes de infeccin 10, y falsos
positivos en regiones con alta prevalencia de anticuerpos11.
ENSAYOS PARA LA DETECCIN DE INFECCIONES RECIENTES POR VIH
La identificacin de infecciones recientes es importante para conocer el patrn de
transmisin de VIH en una comunidad o poblacin. En la primera fase de la infeccin
existen ttulos bajos de anticuerpos y anticuerpos de baja avidez; cuando la infeccin
progresa la concentracin de anticuerpos y la avidez de los mismos se incrementa. Los
mtodos que permiten diferenciar una infeccin reciente de una crnica basados en la
deteccin de anticuerpos se agrupan bajo el trmino STARHS (algoritmo serolgico para
la deteccin de infeccin reciente por el VIH) que se basa en la aplicacin de dos tcnicas
de ELISA para detectar anticuerpos VIH, una de ellas modificada para que sea menos
sensible. Se considera una infeccin reciente si la muestra es positiva para ELISA
convencional y negativa en el ELISA modificado de baja sensibilidad9. Tambin se pueden
identificar infecciones recientes usando el ndice de avidez. Para ello se procesa el suero
por duplicado (diluido con PBS y tratado con guanidina que interfiere en la unin antgenoanticuerpo de baja avidez). Tras el procesamiento de ambos sueros se calcula el ndice
de avidez dividiendo la seal obtenida del suero tratado con PBS/guanidina. Si el ndice
es < 0,6 se puede considerar con una probabilidad elevada que la infeccin ha ocurrido en
los 6 meses anteriores15. Hay que destacar, que estas tcnicas se utilizan con fines
epidemiolgicos, para conocer el patrn de transmisin de VIH y poder disear medidas
preventivas adecuadas.

PRUEBAS DE DIAGNSTICO SEROLGICO DE LA INFECCIN POR EL VIH

El diagnstico serolgico del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) trasciende en
importancia a otros diagnsticos de laboratorio por la gravedad de la enfermedad que este
virus produce, la existencia hoy en da de tratamientos mucho ms eficaces que los
iniciales y el conocimiento que tienen los mdicos y sanitarios sobre esta infeccin.
Adems, buena parte de ese conocimiento ha tenido una gran difusin entre la poblacin
general, sobre todo el referido a los mecanismos de transmisin y a las posibilidades
diagnsticas. El cribado de anticuerpos en muestras de suero es el mtodo ms
comnmente empleado para el diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH. Las
pruebas estn basadas en distintos principios tcnicos que han ido evolucionando con el
tiempo, la experiencia adquirida y las recomendaciones nacionales e internacionales. A
pesar de los avances logrados en el desarrollo de estas pruebas, se siguen produciendo
casos de falsos positivos y, con menor frecuencia, falsos negativos. Estos errores son
atribuibles, en parte, al enorme crecimiento de esta demanda analtica dentro de la
asistencia clnica hospitalaria y extrahospitalaria. La importancia de estos errores es
obvia, pudiendo provocar situaciones que generan ansiedad en los pacientes y
desconcierto en los profesionales encargados de dicho diagnstico. En este artculo se
pretende dar orientaciones conceptuales, sugerencias y recomendaciones prcticas sobre
los mtodos de deteccin serolgica de la infeccin por VIH, con el fin de evitar o reducir
al mnimo los errores en la determinacin de anticuerpos frente al VIH.

CONDICIONES DEL LABORATORIO Y PRECAUCIONES CON LAS MUESTRAS

Los laboratorios que realicen el diagnstico de los anticuerpos anti-VIH en suero deben
observar las normas de seguridad de nivel 2. Todas las muestras debern considerarse
como potencialmente infecciosas, para evitar la manipulacin de algunos sueros con
precauciones menos estrictas. Esto supone trabajar con guantes en todos los procesos,
pipeteado mecnico, utilizacin de contenedores de seguridad biolgica para los
desechos, as como la observacin de aquellas normas y precauciones consideradas
como de buena prctica. Las superficies de trabajo debern ser descontaminadas con
desinfectantes activos contra el VIH, tales como ciertos detergentes, incluido el jabn,
alcohol-acetona al 70% v/v, leja diluida, etc. Los sueros se deben recoger en la forma
habitual y evitar mantenerlos ms de 24 horas a temperatura ambiente. Para minimizar
las contaminaciones microbianas que podran alterar las muestras, se recomienda usar
tubos estriles y no conservarlos a +4C ms all de 72 h. Para perodos de conservacin
ms prolongados, hay que utilizar temperaturas de 20 y 70C, sobre todo si se prev la
necesidad de detectar el antgeno p24 u otros componentes estructurales del VIH, ya que
estos ltimos se desnaturalizan paulatinamente a temperaturas superiores a 70C. Los
sueros no deberan ser inactivados con calor, por las razones expuestas. Existen centros
que realizan la extraccin de sangre en el mismo laboratorio por personal entrenado para
ello; en otros se confa dicha tarea a equipos de extraccin comunes para todos los
laboratorios y, en casi todos, se reciben muestras que han sido obtenidas sin que el
laboratorio que realiza las pruebas diagnsticas del VIH tenga posibilidad de supervisar
los mtodos y pautas de extraccin, la conservacin o el tratamiento previo de los sueros.
A este respecto, cabe sealar la importancia de una correcta y cuidadosa identificacin de
los pacientes que son objeto del anlisis y de su correspondiente suero. La relacin de
confianza entre los pacientes y el personal sanitario hace que, en ocasiones, no se
verifique de forma fehaciente la identidad de la persona que acude a realizarse el anlisis.
Este proceder cuando se refiere a las pruebas de diagnstico de VIH, basadas en el
consentimiento informado por parte del paciente, tiene gran trascendencia para evitar lo
que denominamos errores en la extraccin e identificacin de sueros y pacientes. Los
laboratorios que reciben y almacenan gran nmero de sueros para realizar
determinaciones de anticuerpos anti-VIH deben asegurarse de tener un sistema de
registro que evite coincidencias y confusiones. Todas estas condiciones y precauciones,
observadas de forma sistemtica, constituyen el primer peldao para evitar errores en la
ejecucin de las pruebas para el diagnstico de la infeccin por el VIH.
OBJETIVOS DE LAS PRUEBAS DE DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH
La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) ha definido de manera clara y sucinta cules
son los objetivos de las pruebas de deteccin de anticuerpos frente al VIH. La mayora de
casos o situaciones en la prctica diaria del laboratorio puede ser incluida en uno de los
objetivos contemplados.
1. Objetivos de las pruebas de deteccin de anticuerpos anti-VIH
Seguridad biolgica (cribado de donantes de sangre, rganos, semen, vulos, etc.).
Diagnstico de la infeccin por el VIH.

 Vigilancia seroepidemiolgica
Investigacin.
Los objetivos que persigamos con el diagnstico van a influir en la eleccin de la tcnica
apropiada, en la actitud del profesional de laboratorio ante un resultado y en la estrategia
o algoritmo de confirmacin. De forma conceptual, se denominan pruebas diagnsticas
las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona bajo los
principios clnicos del consentimiento informado, y sirven para detectar o descartar la
infeccin por este virus. Cuando las pruebas se aplican en virtud de criterios de seguridad
biolgica, vigilancia epidemiolgica o investigacin y el objetivo principal no es el
diagnstico clnico de la infeccin por el VIH, las denominamos pruebas de deteccin de
anticuerpos anti-VIH en sentido estricto. Como veremos ms adelante, esta distincin,
aparentemente semntica, condiciona la utilizacin de las pruebas de deteccin de
anticuerpos VIH de una forma coordinada y secuencial. En todo caso, las pruebas
habituales de deteccin de anticuerpos frente al VIH constituyen un primer escaln en el
diagnstico de la infeccin por este virus y se aplican en la prctica clnica a un gran
nmero de sueros. As, la sencillez y la posibilidad de automatizacin son cualidades que
deben tenerse en cuenta a la hora de elegir un prueba en particular.
CARACTERSTICAS OPERACIONALES DE LAS PRUEBAS DE ANTICUERPOS ANTIVIH
La sensibilidad y la especificidad son los parmetros ms importantes para valorar una
prueba y, en el caso de la aplicacin clnica de las pruebas VIH, son muy importantes el
valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN). La sensibilidad de los
equipos actuales ha alcanzado lmites mximos; es frecuente leer artculos en los que se
mencionan sensibilidades de un 99-100% para el conjunto de muestras ensayadas.
Conviene sealar, sin embargo, las dificultades de alcanzar una sensibilidad real del
100% en una infeccin en la que la seroconversin ocurre en un lapso de tiempo de 2 a 4
semanas en la mayora de los casos y, a veces, hasta varios meses (perodo ventana).
Cabe recordar a este respecto la posibilidad de encontrar individuos infectados por el VIH
que son seronegativos debido a causas orgnicas o defectos inmunes (falsos negativos).
Es bien conocido que el incremento de la sensibilidad lleva aparejado un descenso de la
especificidad (falsos positivos); aunque las tcnicas actuales ofrecen cifras de
especificidad en torno al 99%, el aumento espectacular que ha experimentado la
demanda analtica posibilita que los resultados falsos positivos sean ms frecuentes, a
pesar de las mejoras tcnicas introducidas en las pruebas primarias de deteccin de
anticuerpos frente al VIH. Otro aspecto importante a la hora de valorar las caractersticas
operacionales de una prueba diagnstica para el VIH es la prevalencia de la infeccin
entre la poblacin estudiada. A menor prevalencia, el VPP disminuye o, dicho de otra
manera, mayor es la probabilidad de que se produzcan resultados positivos falsos en una
poblacin con tasas de infeccin VIH bajas. En muchos hospitales o laboratorios en los
que se realizan las pruebas del VIH el porcentaje de sueros positivos ha descendido en
los ltimos aos hasta 2 y 4 veces respecto a los encontrados hace 12 14 aos cuando
se inici el diagnstico de este virus. Las causas de este fenmeno son variadas y cabra
citar la mayor sensibilizacin respecto de la infeccin por parte de los sanitarios y la

existencia de protocolos especficos de cribado serolgico en los enfermos renales,

hemodializados, exposicin accidental, control de la gestante e, incluso, en las pruebas
analticas preoperatorias, estrategia esta ltima de cuestionable utilidad. Todas estas
situaciones clnicas han propiciado un aumento sustancial de la demanda analtica de
estas pruebas y un descenso en la tasa de positividad total, por lo que el riesgo de tener
resultados falsos positivos en el escaln primario del diagnstico del VIH es ms elevado
que antes. Por ello, cualquier laboratorio que ponga en marcha este tipo de tcnicas
deber contar entre sus procedimientos de laboratorio con una estrategia o estrategias de
confirmacin.
PRUEBAS DE CRIBADO DE ANTICUERPOS FRENTE AL VIH
Las pruebas de deteccin habituales han experimentado un considerable desarrollo y
mejoras desde su desarrollo inicial. Bsicamente las mejoras han afectado,
principalmente, al antgeno o antgenos utilizados en el ensayo y al principio tcnico en el
que se fundamentan dichas reacciones. La mayora de las primeras tcnicas utilizaron
antgenos virales crudos ms o menos purificados, denominados lisados virales. Estos
antgenos contenan gran cantidad de protenas procedentes del sistema celular en el que
se haba cultivado el virus. La posibilidad de una reaccin inespecfica del suero con
algunos de estos componentes constituy un problema que hizo obligado el empleo de
pruebas de confirmacin. En la tabla 2 aparece la evolucin de los antgenos que se han
ido incorporando a los equipos de deteccin de anticuerpos VIH.

Entre las pruebas de cribado de anticuerpos VIH, las denominadas pruebas rpidas han
experimentado un desarrollo importante; los antgenos que emplean son similares a los
EIA y ELFA y el tiempo en el que se puede obtener un resultado oscila entre 5 y 20
minutos. Aunque las caractersticas operacionales son inferiores a los EIA y ELFA, deben
tenerse en cuenta para situaciones de urgencia. Combinadas con otras pruebas de
deteccin de anticuerpos constituyen una estrategia que mejora la especificidad de los
resultados de forma asequible en trminos de costes laborales y de tiempo. En la tabla 3

se exponen algunas de la ms utilizadas; son preferibles aquellas que permiten detectar

anticuerpos frente al VIH-1 y VIH-2 de forma separada. Su mayor inconveniente reside en
la lectura, que siempre es subjetiva, lo que puede generar dudas de interpretacin de la
reactividad de ciertos sueros. En los ltimos aos, han aparecido pruebas rpidas
basadas en el principio de la inmunocromatografa capilar que han mejorado de forma
importante la sensibilidad y la especificidad de stas respecto a las de Dot-EIA. Se deben
elegir aqullas que tengan controles internos que verifiquen el correcto funcionamiento de
la reaccin.
PRUEBAS DE CONFIRMACION DE ANTICUERPOS La trascendencia de la infeccin por
el VIH hace necesaria la confirmacin de los resultados positivos obtenidos en las
pruebas de deteccin primaria de anticuerpos; este paso es inexcusable cuando el
objetivo de las pruebas sea el diagnstico (Tabla 1) y puede ser obviado cuando aqullas
se realicen para seguridad biolgica. Sin embargo, en el mbito hospitalario es cada vez
ms frecuente que se confirmen todos los resultados positivos de sueros u otras
muestras, incluidos aqullos en los que el objetivo principal no es el diagnstico de la
infeccin. Existen diferentes pruebas de confirmacin; entre ellas cabe citar las basadas

en la inmunoelectrotrasferencia o western blot (WB), inmunofluorescencia indirecta (IFI),

radioinmunoprecipitacin (RIPA) e immunoblot con antgenos recombinantes (LIA). La
tcnica ms ampliamente utilizada es el WB. Las tcnicas de IFI y RIPA, por razones
distintas (subjetividad de la lectura, requerimientos de laboratorio, etc.), se emplean cada
vez menos, de tal forma que los resultados del WB son considerados el estndar de
confirmacin de la presencia de los anticuerpos anti-VIH. Existen distintos criterios de
positividad propuestos por organismos o sociedades involucrados en el diagnstico del
VIH (tabla 4). De ellos, el de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) es el ms
especfico cuando se manejan sueros de diversa procedencia poblacional.
aFDA: Food and Drug Administration; CRSS: Consortium for Retrovirus Serology and
Standardization; CDC/ASTPHLD: Centers for Disease Control/Association of State and
Territorial Public Health Laboratory Directors

El WB contiene los antgenos del propio VIH, algunas de sus protenas precursoras y
antgenos de origen celular. Existen sistemas que incorporan en un extremo diferenciado
de la tira un pptido sinttico especfico del VIH-2 (gp36), que facilita la sospecha de la
infeccin por el VIH-2 en aquellos WB indeterminados para el VIH-1. Debido a que las
tiras de nitrocelulosa en las que se depositan los antgenos del VIH contienen, en mayor o
menor cantidad, protenas de la clula husped en la que se ha cultivado el virus, a
menudo se observan bandas de reactividad contra dichas protenas, de ah la necesidad
de adiestramiento en la lectura e interpretacin de las bandas de origen viral. Es muy
conveniente adoptar una disciplina metodolgica en la lectura e interpretacin de bandas
(Tabla 5), que deber ser uniforme y sistematizada para cada laboratorio.

Los sueros se consideran positivos cuando cumplen el criterio de positividad adoptado por
el laboratorio, negativos cuando no se observa ninguna banda de reactividad, e
indeterminados cuando se observan reactividades distintas a las del criterio de
positividad. Los resultados indeterminados de la prueba WB son la mayor fuente de
ansiedad en pacientes y los que pueden llegar a generar desconcierto en los
responsables del diagnstico. Las causas de estas reactividades anormales en la prueba
WB son muy variadas y no estn totalmente explicadas. Se han descrito resultados
indeterminados en personas con factor reumatoide en el suero, lupus eritematoso,
hiperbilirrubinemias, infeccin por otros retrovirus, parasitosis y por otras causas. Si
tenemos en cuenta que en la cubierta del VIH estn presentes antgenos HLA podemos
entender que hasta el 30% de los individuos multitransfundidos presenten reactividades
en el WB y que se hayan descrito en ellos falsos positivos con dicha tcnica.
PROBLEMAS EN EL CRIBADO Y CONFIRMACIN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-VIH
Los problemas que se presentan con estas prueba son similares a los de otras pruebas
de diagnstico serolgico aunque, en este caso, adquieren una importancia mayor por las
posibles consecuencias y la transcendencia clnica de la infeccin. Desde el punto de
vista serolgico, en la infeccin por el VIH ocurren cambios en la dinmica de produccin
de anticuerpos desde el momento de la seroconversin. El perodo ventana de dos a
cuatro semanas de duracin se caracteriza por la ausencia de anticuerpos y la presencia
del antgeno p24, protena mayoritaria de la nucleocpside (core) del VIH. En estadios

finales de la infeccin desaparecen los anticuerpos contra algunas de las protenas

estructurales internas del virus (p24, p17, p55, etc.). En ciertas personas se ha observado
la ausencia de criterios diagnsticos de positividad por WB en los meses finales de la
enfermedad, como consecuencia del intenso deterioro inmunitario. En el laboratorio de
virologa tienden a preocupar ms los resultados falsos positivos, tanto en las pruebas de
cribado como en las de confirmacin (menos frecuente), sobre todo cuando stos se
producen en personas sin ningn factor de riesgo como ocurre generalmente. Las causas
de los falsos positivos son variadas (Tabla 7) y dependen bsicamente de dos elementos,
la tcnica (antgenos y principio tcnico empleado) y las condiciones derivadas del
paciente.

ALGORITMO DIAGNSTICO
Cuando el objetivo de las pruebas de deteccin de anticuerpos frente al VIH es el
diagnstico de infeccin y la prevalencia de la misma es inferior al 10%, se recomienda el
uso de tres tcnicas con distinto principio o base antignica, siendo obligado que una de
ellas sea el Western Blot. Para diagnosticar a una persona como positiva las tres pruebas
deben ser positivas. En la Figura 2 se refleja el algoritmo diagnstico de la infeccin VIH.

Pginas web:
http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28articulo-diagnostico-laboratorio-infeccion-por-el-90002592#f0005

https://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/serologia/vihrev.pdf